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B978-3-437-43690-1.10011-7

10.1016/B978-3-437-43690-1.10011-7

978-3-437-43690-1

Struktur eines DNA-Stranges. Die DNA besteht aus einem Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat und vier verschiedenen Basen.

Synthese und Abbau von Nucleinsäuren.

a) Bildung von Nucleinsäuren aus ihren aktivierten Bausteinen.

b) Abbau von Nucleinsäuren durch hydrolytische Spaltung der Phosphodiesterbindung.

R H bei DNA, R OH bei RNA

Modell der DNA.

a) Die gewundenen Bänder stellen das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA dar, die Basen sind nach innen gerichtet. Eine Windung der Doppelhelix hat eine Länge von 3,6 nm. Der Abstand zwischen den übereinandergestapelten Basen beträgt 0,34 nm. Die Pfeile geben die Polarität der DNA-Stränge an.

b) In dieser Darstellung sieht man, dass die Basenpaare planar übereinandergestapelt sind.

Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen in doppelsträngigen Nucleinsäuren. Dieser Typ von Basenpaaren wird als Watson-Crick-Typ bezeichnet. Beim Übereinanderstapeln der Nucleotidpaare entstehen in der DNA-Doppelhelix zwei Furchen; diese sind enger (kleine Furche) oder weiter (große Furche), weil die Zucker-Phosphate nicht diametral entgegengesetzt stehen, sondern in einem Winkel

< 180.

Reversible Trennung der Stränge einer DNA-Doppelhelix durch Erhitzen und Abkühlen.

Kalottenmodell der A-, B- und Z-DNA. In der B- und

Z-DNA sind die Basen im rechten Winkel zur Helixachse angeordnet, in der A-DNA weichen sie um 20 von der waagerechten Lage ab. In der A-DNA ist die kleine Furche stark verengt. In der Z-DNA verläuft das Zucker-Phosphat-Rückgrat zickzackförmig.

Atome des Zucker-Phosphat-Rückgrats: grün; Atome der Basen: violett.

Struktur der RNA. RNA-Moleküle sind in der Regel einzelsträngig. Sie können aber durch Faltung partiell doppelsträngige Bereiche ausbilden, wenn komplementäre Sequenzen vorhanden sind.

Gummi-Modell superhelikaler DNA. Ein Gummiband stellt die topologischen Eigenschaften einer DNA recht gut dar. Das entspannte Gummiband (a) wird mit Daumen und Zeigefinger verdrillt und festgehalten (b); die Finger spielen dabei die Rolle von Ankerproteinen im Zellkern, die die freie Drehbarkeit der DNA einschränken. Es entstehen zwei Domänen: Oben laufen die Windungen im Uhrzeigersinn (linksgängig), unten in entgegengesetzter Richtung (rechtsgängig). Bringt man die als Anker dienenden Finger beider Hände näher zueinander (c), bilden sich zur Kompensation der Torsionsspannung im oberen Teil rechtsgängige, im unteren Teil linksgängige Superhelices aus.

Dieses Modell verdeutlicht auch, dass Superhelizität nicht notwendigerweise eine Eigenschaft des gesamten Moleküls, sondern einzelner Abschnitte (Domänen) im Makromolekül ist.

Verschiedene topoisomere Formen einer 210 bp langen zirkulären DNA. Die DNA ist zunächst spannungsfrei (a). Um Spannung in den DNA-Ring einzuführen, müssen beide Stränge der DNA durchtrennt, die Zahl der Windungen verringert (b) oder erhöht (d) und die DNA wieder zum Ring verschweißt werden. Die Zahl der Windungen lässt sich verändern, indem man das eine Ende der linearisierten DNA festhält und das andere Ende einmal oder mehrmals um 360 dreht. Die DNA steht jetzt unter Torsionsspannung (b, d) und liegt nur dann in der gezeichneten planaren Form vor, wenn sie auf der Unterlage fixiert wird. Lässt man sie los, dann wird die Spannung durch Bildung von negativen (c) bzw. positiven (e) Superhelices abgebaut.

L Linking number, L0 Linking number der DNA in spannungsfreiem Zustand, T Twist number, W Writhing number

Wirkungsmechanismus der Topoisomerase I.

a) Eine zirkuläre, doppelsträngige DNA, die unter Torsionsspannung steht (sie enthält zu viele Windungen) gleicht diese Spannung durch Ausbildung von drei negativen Superhelices aus (links): Die Topoisomerase I bindet an die superhelikale DNA (1). Sie führt einen Einzelstrangbruch in die DNA ein und verbindet sich vorübergehend kovalent mit dem 3'-Ende des gespaltenen DNA-Strangs (2). Das freie Ende wird unter dem roten Strang durchgezogen; der Bruch wird wieder verschweißt (3). Die Topoisomerase dissoziiert von der DNA ab, die jetzt eine Windung weniger enthält (4). Dies führt zu einer Entspannung der Doppelhelix, die jetzt eine negative Superhelix weniger ausbildet (5).

b) Bei der Einwirkung der menschlichen Topoisomerase I auf die DNA wird einer der DNA-Stränge durchtrennt und das Ende vorübergehend kovalent mit einem Tyrosinrest der Topoisomerase verknüpft.

Topo I Topoisomerase I

Wirkungsweise der Topoisomerase II. Sie spaltet vorübergehend beide DNA-Stränge (a). Außerdem ist sie in der Lage, Catenate aufzulösen, da sie vorübergehend Doppelstrangbrüche in die DNA einfügt (b).

Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen über funktionelle Gruppen von Aminosäuren. Zwei Beispiele zeigen, wie die Amidgruppe von Asparagin bzw. Glutamin über die kleine (a) bzw. große (b) Furche mit Basenpaaren in der DNA Wasserstoffbrücken ausbilden kann.

Ausbildung von Tripelstrang-DNA. Einzelsträngige Nucleinsäure (a) kann sich an einen DNA-Doppelstrang durch Hoogsteen- (b, c) oder Anti-Hoogsteen-Basenpaarung (nicht gezeigt) anlagern. Die Ausbildung von Tripelstrang-DNA ist sequenzspezifisch.

Semikonservative Replikation. Beide Doppelhelices enthalten einen elterlichen und einen neu synthetisierten Strang.

Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase um einen Baustein. Die 3'-OH-Gruppe des wachsenden Strangs verbindet sich mit dem eintretenden Nucleosidtriphosphat an der mit einem Stern gekennzeichneten Stelle. Bei der Reaktion wird Pyrophosphat freigesetzt.

Bidirektionale Wanderung der Replikationsgabeln.

a) und b) Die Replikation beginnt an einer spezifischen Stelle (Blase, a) und setzt sich bidirektional über zwei Replikationsgabeln fort (b, schematische Zeichnung einer elektronenmikroskopischen Aufnahme).

c) Vergrößerte Darstellung einer Replikationsgabel. Der untere neu synthetisierte Strang wächst in 5'3'-Richtung, bei niedriger Auflösung scheint der obere Strang in 3'5'-Richtung zu wachsen. Tatsächlich werden beide Stränge in 5'3'-Richtung verlängert.

d) Schematische Darstellung der Vorgänge an einer Replikationsgabel. Beide DNA-Stränge werden in 5'3'-Richtung synthetisiert, der Leitstrang (unten) kontinuierlich, der Folgestrang (oben) diskontinuierlich in Form kurzer Fragmente (Okazaki-Fragmente).

Die einzelnen Schritte bei der Synthese des Folgestrangs.

Schematisches Modell der Replikation durch die DNA-Polymerase III (Holoenzym). Eine Schleifenbildung der Folgestrangmatrize ermöglicht einem dimeren DNA-Polymerase-III-Holoenzym die Synthese beider Tochterstränge in der gleichen Richtung, in die sich die Replikationsgabel weiterbewegt. Dargestellt sind nur einige der Proteinuntereinheiten des Holoenzyms.

Initiation der Replikation in einer Hefezelle. Am Replikationsursprung (Ori) binden Proteine und bilden einen Komplex namens ORC. Dieser wird auch als molekulare Landeplattform bezeichnet, denn er bindet die Proteine (1), die für die Vorbereitung der Replikation gebraucht werden (Mcm2 – Mcm7; Cdc6). Ein aktivierender Faktor (Cdk) bindet (2), und die Replikation wird initiiert (3). Nach Ende der Replikation werden die Proteine des Präreplikationskomplexes abgelöst, während beide Tochterstränge je einen ORC neu aufbauen (4).

Mechanismus der Telomerase. Chromosomenenden werden durch die Telomerase verlängert, eine spezielle reverse Transkriptase, die ihre eigene Matrize mitbringt.

Struktur der vier Kernhistone. Die zentrale globuläre Domäne ist als Ellipsoid dargestellt. Die gerade und die wellenförmige Linie repräsentieren die C-terminalen bzw. N-terminalen Arme. Die basischen Aminosäuren der N-terminalen Arme, Arginin (R) und Lysin (K), sind gekennzeichnet.

Nucleosomen. Der Nucleosomenkern besteht aus einem Histon-Oktamer, um das 146 bp der DNA gewickelt sind (a). Nucleosomen bestehen aus dem Nucleosomenkern (engl. nucleosome core particle) und einem Anteil an der Linker-DNA. Histon H1 bindet sowohl an die Linker-DNA als auch an den Nucleosomenkern (b).

Filament- und Faserstruktur. 11-nm-Filament und die 30-nm-Faser, die durch Spiralisierung (wie hier gezeichnet) oder durch Faltung des Filaments entsteht. Die Wicklung der DNA um Histon-Oktamere und Histon H1 wurden der Übersichtlichkeit halber nicht gezeichnet.

Verschiedene Ebenen der DNA-Organisation.

a) Nackte DNA

b) Wicklung der DNA um Histon-Oktamere unter Ausbildung von Polynucleosomen

c) Bildung der 30-nm-Faser durch Spiralisierung oder – nach einem anderen Modell – Faltung von Nucleosomen

d) Faltung der Faser zu Chromatinschleifen

e) Dichte Organisation der Schleifen

f) Faltung oder Spiralisierung zu Metaphasechromosomen.

Lampenbürstenchromosom. Lichtmikroskopische Aufnahme eines Lampenbürstenchromosoms (oben) und schematische Darstellung (unten). Die Packung der zentralen Achse entspricht wahrscheinlich der Stufe (e), die Packung der Schleifen der Stufe (b) aus Abb. 11.24.

Prinzipien der Zielsteuerung von Chromatin-Remodellierungskomplexen (ChRC).

a) Zielsteuerung durch ein DNA-bindendes Protein, beispielsweise durch einen Transkriptionsfaktor (TF)

b) Zielsteuerung an eine Region mit häufiger DNA-Methylierung (-CH3)

c) Zielsteuerung durch acetylierte Histone (-Ac)

d) Zielsteuerung an eine Kernmatrix, die Actin und actinverwandte Proteine (ARP, actin related proteins) enthält.

Wirkungsweise von Chromatin-Remodellierungskomplexen. An das Nucleosom bindet im 1. Schritt ein Chromatin-Remodellierungskomplex (ChRC). Im 2. Schritt wird durch ATP-Hydrolyse ein Übergangszustand erzeugt, bei dem die Bindung zwischen DNA und dem Histon-Oktamer stellenweise aufgelockert ist. Ohne weitere Energiezufuhr kann sich nun die ausgestülpte DNA entlang dem Histon-Oktamer fortbewegen (Schritt 3a), wobei etwa die TATA-Box (orange) in die Linker-Region wandert. Ein anderer Typ eines Chromatin-Remodellierungskomplexes tauscht Kernhistone gegen seltene Histonvarianten aus (Schritt 3b), welche die Faltung des Chromatins und damit die Zugänglichkeit bestimmter DNA-Abschnitte (orange) verändern. Andere Chromatin-Remodellierungskomplexe sind wiederum in der Lage, durch Entfernung eines Histon-Oktamers (Schritt 3c) und Übertragung auf einen anderen DNA-Abschnitt eine nucleosomenfreie Stelle im Chromatin zu erzeugen.

Vergleich eines bakteriellen mit einem eukaryontischen Gen. Das bakterielle Gen besteht aus einer durchgehenden Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Proteins verschlüsselt. Die kodierenden Sequenzen (Exons, orange) der meisten eukaryontischen Gene sind von nichtkodierenden Sequenzen (Introns, hellorange) unterbrochen. Weitere nichtkodierende Sequenzen (hellorange) befinden sich stromaufwärts vom Promotor (grün). Regulatorische Sequenzen (Enhancer, Silencer) sind rot, nichtkodierende DNA zwischen Genen grau gekennzeichnet.

Genkarten eines ca. 80 kb langen DNA-Abschnitts aus dem Hefechromosom 3 und zwei gleich lange Abschnitte aus dem -Globin- und dem HNF-1-Locus des Menschen. Im Hefechromosom sitzt Gen an Gen in beiden Transkriptionsrichtungen, während im menschlichen Genom die Gene wie Inseln im Meer zwischen vermutlich funktionsloser DNA vereinzelt vorkommen. Die Introns der Globingene wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen. Der griechische Buchstabe bezeichnet Pseudogene.

Duplikation des INK4-Gens führt zur Bildung weiterer Tumorsuppressoren. Das Tumorsuppressorprotein p15INK4 (rot) wird von zwei Exons (E1, E2) kodiert und existiert bereits bei Fischen. Nach der Trennung von Fischen und Vögeln wurde das Gen dupliziert (grün). Bei Hühnern degenerierte die zweite Kopie des Gens zu einem Pseudogen. Ein weiteres Exon (orange) wurde neben das INK4b-Gen inseriert. Im menschlichen Genom führte die Genduplikation und Insertion zur Generierung zweier weiterer Tumorsuppressorgene (ARF orange und INK4a grün), wobei Exon 2 des INK4a-Gens auch von ARF genutzt wird. Blau gezeichnet sind nicht translatierte 3'-Regionen des INK4a- und INK4b-Gens.

MTAP Gen für Methylthioadenosin-Phosphorylase

Evolution der menschlichen intrazellulären Hormonrezeptor-Genfamilie. Vor etwa 1 Mrd. Jahren duplizierte sich ein Vorfahre der Rezeptorgene, was zur Entstehung der heutigen Steroidhormonrezeptor-Genfamilie und anderer intrazellulärer Rezeptoren führte. Das hier abgebildete Schema entstand aus dem Vergleich der DNA-Sequenzen vieler Vertebraten und Wirbelloser.

GR Glucocorticoid-, MR Mineralocorticoid-, PR Progesteron-, AR Androgen-, VDR Vitamin-D3- und TR Thyroidhormon-Rezeptor, COUP Chicken ovalbumin upstream promoter binding protein, RXR trans-Retinsäure-Rezeptor, HNF-4 Hepatocyte nuclear factor-4, PPAR Peroxisome proliferator activator, RAR cis-Retinsäure-Rezeptor, ER Östradiolrezeptor

Ein typischer Minisatellit mit einer repetitiven Einheit von 63 Basenpaaren (unten), der sich vermutlich aus dem simple sequence repeat GGAT, einem sog. Mikrosatelliten (oben), durch Punktmutationen und eine Nucleotiddeletion entwickelte. Bei dem untersuchten Individuum war die repetitive Einheit, die in einem Intron des HNF-1-Gens gefunden wurde, achtmal in Folge wiederholt. Diese repetitive DNA kommt in mehreren anderen chromosomalen Loci vor, wahrscheinlich mit leicht abgeänderter Sequenz und mit einer variablen Anzahl von Wiederholungen der repetitiven Einheit.

Transposons im menschlichen Genom. Autonome Elemente sind aufgrund ihrer Genausstattung in der Lage, im Genom zu springen; nichtautonome benötigen die Enzyme von autonomen Elementen für ihre Transposition. Die LTRs sind rot gekennzeichnet.

ORF (open reading frame) offenes Leseraster (Gen des Transposons), pol (Polymerase) Reverse Transkriptase; env (envelope) Hüllglykoprotein der Retroviren; AAA Poly-A-Sequenz; A, B regulatorische DNA-Sequenzen. Das gag-Gen kodiert für das gruppenspezifische Antigen des Virus.

Der Infektionszyklus des HIV als Beispiel für einen retroviralen Zyklus. Virale RNA ist rot gezeichnet, virale DNA blau, Kapsidproteine grün. Die virale reverse Transkriptase ist als gelber Punkt dargestellt.

Strategie der Viren, ihr Genom zu exprimieren. DNA: blau, RNA: rot.

Die antiviralen Agenzien Aciclovir und Azathymidin.

Organisation des menschlichen mitochondrialen Genoms. Der äußere Ring repräsentiert den schweren (H), der innere den leichten (L) DNA-Strang. Die für Proteinuntereinheiten kodierenden Gene sind hellorange markiert; ND1–ND6 sind die NADH-Reduktase-Untereinheiten 1–6. Die Gene für die Untereinheiten 6 und 8 der ATPase überlappen. Die tRNA-Gene sind rot markiert, ihre Spezifität ist durch die Aminosäuren, die sie übertragen, gekennzeichnet. OH Replikationsursprung des schweren Strangs, OL Replikationsursprung des leichten Strangs, HSP H-Strang-Promotor, LSP L-Strang-Promotor

Verschiedene Typen von RNA-Molekülen in Eukaryontenzellen

Tab. 11.1
RNA-Typ Funktion
hnRNA (heterogene nucleäre RNA) Vorstufe der mRNA; direkte RNA-Kopie proteinkodierender Gene; Lokalisierung im Zellkern (Kap. 12.9.3)
mRNA (Messenger-RNA) entsteht durch Prozessierung aus der hnRNA; wird aus dem Zellkern in das Zytosol transportiert (Kap. 12.9 und 12.10Kap. 12.9Kap. 12.10)
rRNA (ribosomale RNA) RNA-Komponenten der Ribosomen; Stützfunktion, Erkennung von RNA-Molekülen und z.T. katalytische Aktivität (z.B. Peptidyl-Transferase; Kap. 13.3.1)
tRNA (Transfer-RNA) Übersetzung der Nucleinsäuresprache in die Proteinsprache bei der Proteinsynthese (Translation; Kap. 13.2)
snRNA (Small nuclear RNA) Komponenten von Ribonucleoproteinpartikeln (snRNPs), die beim Spleißen (Splicing), einem Vorgang bei der Prozessierung von hnRNA zu reifer mRNA, eine Rolle spielen (Kap. 12.9.3)
snoRNA (Small nucleolar RNA) helfen bei der Modifizierung anderer RNA-Typen, hauptsächlich der rRNA und snRNA (Kap. 12.11)
scRNA (Small cytoplasic RNA) auch 7SL-RNA genannt; spielen bei der Zielsteuerung von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum eine wesentliche Rolle (Kap. 17.5)
miRNA (MicroRNA) Regulation der Genexpression; bewirkt eine Hemmung der Translation durch spezifische Bindung an mRNA (Kap. 13.5.3 und 15.5.1Kap. 13.5.3Kap. 15.5.1)
siRNA (Small interfering RNA) Regulation der Genexpression; bewirkt den Abbau von mRNA durch spezifische Basenpaarung (Kap. 12.10.2 und 15.5.1Kap. 12.10.2Kap. 15.5.1)

Einige Proteine, die für die Replikation benötigt werden

Tab. 11.2
Protein bei E. coli Protein bei Eukaryonten Funktion
DnaA ORC-Proteine Erkennung des Replikationsursprungs
DnaB Mcm DNA-Helicase windet die Ausgangshelix auseinander
DnaC ? befestigt die Helicase an der DNA
Gyrase Topoisomerase I/II Auflösung positiver Überspiralisierung vor der Replikationsgabel
SSB RPA (replication protein A) einzelstrangbindende Proteine halten einzelsträngigen Zustand der DNA aufrecht
-Komplex RFC (replication factor C) Untereinheiten des DNA-Polymerase-Holoenzyms (Klammerlader) setzt die -Klammer (Gleitring) an die Stelle der DNA, wo der Primer sitzt
-Klammer PCNA ringförmige Untereinheit des DNA-Polymerase-Holoenzyms befestigt die Polymerase an der DNA und verleiht ihr Prozessivität wirkt bei E. coli mit Pol III und bei Eukaryonten mit Pol und zusammen
Pol III core Pol / Hauptreplikationsenzym(e) synthetisieren den Leitstrang und die Okazaki-Fragmente besitzen Korrekturlesefähigkeit
DnaG (Primase) Primase synthetisiert die RNA-Primer Bei Eukaryonten ist die Primase eine Untereinheit der Polymerase
Pol arbeitet mit der Primase zusammen und verlängert die RNA-Primer um wenige Desoxyribonucleotide; danach übernimmt wieder die Pol / die weitere Verlängerung des Strangs
DNA-Ligase DNA-Ligase verknüpft die Okazaki-Fragmente zu einem ununterbrochenen Strang
Pol I (5'3'-Exonuclease-Aktivität) FEN-1 (Endonuclease) entfernt die RNA-Primer und füllt die Lücken auf Bei Eukaryonten entfernt FEN-1 den RNA-Primer. Die Lücke wird durch die -Polymerase gefüllt

DNA-Polymerasen von Pro- und Eukaryonten

Tab. 11.3
Polymerase Aktivitäten Untereinheiten physiologische Funktion
Bakterien (E. coli)
I DNA-Polymerase 3'5'-Exonuclease 5'3'-Exonuclease 1 Polypeptid DNA-Replikation Korrekturlesen Primer entfernen
II DNA-Polymerase 3'5'-Exonuclease 1 Polypeptid Reparatur
III DNA-Polymerase 3'5'-Exonuclease 10 Untereinheiten DNA-Replikation Korrekturlesen
Eukaryonten
DNA-Polymerase (eine der Untereinheiten ist die Primase) 5 Untereinheiten (Mensch) Synthese von RNA-Primern und anschließende Verlängerung der Primer durch einige wenige Desoxyribonucleotide
DNA-Polymerase 1 Polypeptid DNA-Reparatur
DNA-Polymerase 3'5'-Exonuclease 1 Polypeptid mitochondriale Replikation
DNA-Polymerase 3'5'-Exonuclease 2 Untereinheiten DNA-Replikation Korrekturlesen Reparatur
DNA-Polymerase 3'5'-Exonuclease 5 Untereinheiten DNA-Replikation Korrekturlesen Reparatur

Das genetische Material

T. Igo-Kemenes

  • 11.1

    Struktur und Funktion der Nucleinsäuren308

  • 11.1.1

    Funktionen und Eigenschaften der Nucleinsäuren308

  • 11.1.2

    Struktur der Desoxyribonucleinsäure310

  • 11.1.3

    Struktur von Ribonucleinsäuren313

  • 11.1.4

    Superhelikale Struktur und Topoisomerasen314

  • 11.1.5

    Wechselwirkungen der DNA-Doppelhelix mit Proteinen und Nucleinsäuren318

  • 11.2

    Replikation320

  • 11.2.1

    Semikonservative Replikation320

  • 11.2.2

    Teilprozesse der Replikation321

  • 11.2.3

    Funktion der DNA-Polymerasen325

  • 11.2.4

    Die DNA-Replikationsmaschine325

  • 11.2.5

    Regulation der Replikation327

  • 11.2.6

    Das Telomerproblem328

  • 11.3

    Verpackung der DNA329

  • 11.3.1

    Chromatin und Histone329

  • 11.3.2

    Aufbau des Chromatins330

  • 11.3.3

    Chromatin-Remodelling333

  • 11.4

    Organisation von Genen und Genomen335

  • 11.4.1

    Aufbau von Genen335

  • 11.4.2

    Nichtkodierende DNA341

  • 11.4.3

    Transposons342

  • 11.4.4

    Viren344

  • 11.4.5

    Mitochondriales Genom348

Praxisfall

Nach dem Ende des Vietnamkriegs hatten die amerikanischen Streitkräfte viele an Malaria erkrankte Soldaten zu versorgen. Weitere Fälle wurden erwartet, da die amerikanischen Streitkräfte in den 70er Jahren des 20. Jahrhunderts auch in malariaverseuchten Urwaldgebieten Mittel- und Südamerikas eingesetzt waren. Große Summen an Fördermitteln flossen damals in die Malariaforschung. Eines der gesetzten Ziele war es, die Empfindlichkeit der damaligen, auf immunologischen Tests basierenden Nachweismethoden für den Erreger im Blut erheblich zu verbessern, um im Verdachtsfall mit einer Therapie möglichst früh, am besten noch vor Einsetzen der ersten Symptome, beginnen zu können. Am Ende der ersten Förderungsperiode von fünf Jahren wurde der Stand der Bemühungen überprüft: Die beteiligten Forschergruppen erhielten Blutproben mit variierenden Mengen an Erregern und Kontrollproben ohne Erreger. Das Ergebnis der ersten Testreihen war ernüchternd. Die unabhängig voneinander in etwa einem Dutzend Laboratorien entwickelten Nachweisverfahren brachten nicht die erhofften Ergebnisse. Nur Proben mit hohen Titern konnten mit Sicherheit positiv identifiziert werden. Proben mit niedrigen Titern, wie man sie kurz nach einer Infektion beim Menschen erwartet, wurden häufig als negativ gedeutet. Umgekehrt hatte man bei nicht infizierten Proben die schwachen Signale, die im Rahmen der Messungenauigkeit immer auftreten, häufig als positiv gewertet. Obwohl in dieser Zeit sehr viel Wissen über Malaria angesammelt wurde, konnte kein empfindlicher Test für den Erreger erarbeitet werden.

Mitte der 80er Jahre wurde von Kary Mullis die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelt, die in Kap. 15.1.3 genau beschrieben ist. Die angesammelten Kenntnisse über die DNA-Replikation nutzte Mullis aus, um die Verdopplung einer spezifischen DNA-Sequenz im Reagenzglas nahezu beliebig oft und in kürzester Zeit zu wiederholen. Mit der PCR-Technik lassen sich im Prinzip aus einem einzigen DNA-Molekül beliebig viele identische Kopien herstellen. Diese Technik hat die Molekularbiologie revolutioniert – u.a. auch den denkbar empfindlichsten Test für Malaria gebracht.

Fortschritte auf naturwissenschaftlichen Gebieten, ob es sich um Physik, Chemie, Biochemie, Genetik, Molekular- oder Zellbiologie handelt, haben der Medizin immer einen deutlichen Schub gebracht. Unsere heutige Medizin ist deshalb so erfolgreich, weil sie streng auf den Gesetzen der Naturwissenschaften begründet ist und die Erkenntnisse aus diesen Wissenszweigen für ihre Zwecke konsequent einsetzt.

Zur Orientierung

Nahezu 90% der Nucleinsäuren einer menschlichen Zelle bestehen aus RNA, nur etwa 10% aus DNA. Letztere befindet sich in eukaryontischen Zellen im Zellkern, von basischen Proteinen, den Histonen, zu Chromatin verpackt und in den Mitochondrien. Die Bildung neuer DNA-Stränge wird von DNA-Polymerasen katalysiert und bedarf der Mithilfe einer größeren Zahl an weiteren Proteinen. DNA ist eine Art Urschrift der genetischen Information. In verschiedenen Zelltypen eines Organismus werden unterschiedliche Abschnitte der DNA in RNA umgeschrieben (transkribiert). Die Transkripte der Gene, die Arbeitskopien der Gene, sind RNA-Moleküle und haben in der Zelle unterschiedliche, in vielen Fällen noch unerforschte Funktionen. Die Messenger-RNA (mRNA) wird gemäß den Regeln des genetischen Codes in eine Polypeptidkette translatiert. Man kann daher ein Gen als den Abschnitt des Genoms definieren, der notwendig ist, um die Bildung eines funktionellen Proteins zu verschlüsseln. Dennoch gibt es auch DNA-Abschnitte, die transkribiert werden, obwohl sie nicht für Proteine kodieren. Ribosomale RNA (rRNA), Transfer-RNA (tRNA) sowie viele andere RNA-Moleküle sind selbst biologisch aktiv, ohne dass sie in Proteine übersetzt werden. Somit kann ein Gen auch Bauplan für eine biologisch aktive RNA sein.

Die ribosomale RNA (rRNA) ist struktureller Bestandteil der Ribosomen, der Proteinsynthesemaschinerie der Zelle. Sie dient als Grundgerüst für die Ribosomen und geht zahlreiche Wechselwirkungen mit (ribosomalen) Proteinen ein. Die Transfer-RNA (tRNA) wirkt als Adaptor bei der Übersetzung der Nucleinsäuresequenz in der Proteinsynthese, die Messenger-RNA (mRNA) als Matrize bei der Proteinsynthese (Translation). Im Zellkern befinden sich darüber hinaus zahlreiche stabile kleine RNA-Moleküle (snRNA small nuclear RNA), von denen manche eine Funktion beim Spleißvorgang haben. Andere funktionelle RNA-Moleküle, wie beispielsweise das Signalerkennungspartikel (SRP signal recognition particle), sind im Zytosol als Bestandteile der Ribonucleoproteine zu finden. Kleine interferierende RNA (siRNA small interfering RNA) und MicroRNA (miRNA) sind an der Transkriptions- bzw. Translationsregulation beteiligt. Das Enzym Telomerase wirkt der Verkürzung der Chromosomenenden entgegen und enthält ebenfalls eine kurze Ribonucleinsäure. RNA kann in Form von Ribozymen auch ohne Beteiligung von Proteinen katalytische Funktionen ausüben.

Die DNA von Eukaryonten ist mit Proteinen assoziiert. Der Komplex aus DNA und Protein wird Chromatin genannt. Die Proteine verleihen dem Chromatin eine kompakte und dynamische Struktur. Diese ermöglicht den Replikationsmaschinen, Reparaturenzymen, Transkriptionsfaktoren und anderen Proteinen den Zugang zum Replikationsursprung, zu schadhaften Stellen in der DNA, Promotoren, Enhancern bzw. Silencern etc. und damit die Speicherung, den Schutz und die Nutzung der Erbinformation. In den lichtmikroskopisch sichtbaren Chromosomen bei der Zellteilung (Mitose) liegt das Chromatin in der höchsten Verdichtung vor.

Struktur und Funktion der Nucleinsäuren

Funktionen und Eigenschaften der Nucleinsäuren

Die Funktion der Nucleinsäuren umfasst die Speicherung, Weitergabe und Realisation der genetischen Information. Nucleinsäuren sind an allen bedeutenden Vorgängen des Lebens mittelbar oder unmittelbar beteiligt. So ist das Leben von der Fähigkeit der Zelle abhängig, genetische Information zu speichern, abzurufen, zu übersetzen und schließlich von einer Generation zur nächsten unverändert weiterzuvererben. Alle diese Fähigkeiten sind in Genen verschlüsselt, die letztlich die charakteristischen Eigenschaften einer Art sowie ihrer einzelnen Individuen bestimmen.
Mitte des 20. Jahrhunderts wurde erkannt, dass genetische Information v.a. aus Bauplänen für Proteine besteht (Ein-Gen-ein-Protein-Hypothese). Heute weiß man, dass ein Gen, etwa durch alternatives Spleißen, durchaus für mehrere Proteine kodieren kann. Proteine werden nach Instruktion der Gene synthetisiert und dienen allen möglichen physiologischen Funktionen: Sie bilden die Bausteine für Zellstrukturen, sie sind die Enzyme, die alle chemischen Reaktionen einer Zelle katalysieren, sie regulieren die Genexpression, ermöglichen Zellbewegungen und die Zellkommunikation.

Schon gewusst

Die Entdeckung der DNA als Träger der genetischen Information

Aus welchem Material aber bestehen die Gene selbst, die zu all diesen komplizierten Funktionen der Vererbung und Instruktion befähigt sind? Um 1940 wurde experimentell gezeigt, dass Gene aus Desoxyribonucleinsäure (DNA) bestehen. 1953 wurde durch die Aufklärung der DNA-Raumstruktur als eine Doppelhelix ein wichtiges Prinzip der Vererbung, nämlich die semikonservative Replikation, verstanden. Beide Stränge der elterlichen Doppelhelix dienen als Matrize für die Synthese der neuen Doppelhelices und ermöglichen damit die Bildung zweier identischer Kopien der elterlichen DNA in den Tochterzellen. In den 60er Jahren konnte der genetische Code entschlüsselt werden. Darauf wurde das zentrale Dogma der Molekularbiologie formuliert, das besagt, dass die in der DNA verschlüsselte Information in mehrere identische RNA-Kopien transkribiert (umgeschrieben) und dann in Proteine translatiert (übersetzt) wird; der Fluss der genetischen Information
läuft also von der DNA über RNA zum Protein (DNA RNA Protein). In den 70er Jahren wurden die Grundlagen der Gentechnologie etabliert, die in den 80er und 90er Jahren zur Aufklärung der Regulation der Genexpression und der Mechanismen der Embryonalentwicklung führten. Somit wurde in etwas mehr als einem halben Jahrhundert der Fluss der Information vom Bauplan des Lebens zu den vielfältigen Aspekten der Lebensfunktionen im Prinzip aufgeklärt. Dieser Fortschritt hat eine zunehmende Bedeutung nicht nur für das Verständnis des Lebens selbst, sondern auch für die praktische Anwendung in der medizinischen Diagnose, Prävention und Therapie.
Struktur und Polarität der Nucleinsäuren
Nucleinsäuren sind Makromoleküle, die aus der Verknüpfung von Nucleosidmonophosphaten entstehen (Abb. 11.1). Die Bindungen zwischen Nucleotiden werden als Phosphodiesterbindungen bezeichnet, denn die Phosphorsäure ist mit alkoholischen OH-Gruppen zweier Ribosemoleküle verestert. Da die Phosphorsäuregruppen in den Nucleinsäuren starke Säuren sind und leicht ein Proton abgeben, sind Nucleinsäuren bei physiologischem pH in der Zelle negativ geladen.
Nucleinsäuren besitzen eine Polarität, da die Struktur ihrer Bausteine asymmetrisch ist. Das linke Ende des abgebildeten einzelsträngigen DNA-Moleküls (Abb. 11.1) enthält eine OH-Gruppe am C5' der Pentose: Deshalb bezeichnet man dieses Ende auch als das 5'-Ende des Nucleinsäurestrangs. Das rechte Ende enthält eine OH-Gruppe am C3' der Pentose: Dieses wird als das 3'-Ende des Moleküls bezeichnet. Diese Direktionalität der Nucleinsäuren und die Tatsache, dass die natürliche Nucleinsäuresynthese vom 5'-Ende zum 3'-Ende hin erfolgt, führte zu der Übereinkunft, Nucleinsäuresequenzen generell von 5' nach 3' und von links nach rechts zu schreiben. Die Sequenz GATCGC impliziert also, dass es sich um 5'-GATCGC-3' handelt. Will man die Sequenz in der anderen Richtung schreiben, muss explizit die Polarität vermerkt werden; man schreibt also 3'-CGCTAG-5'.
Energiebedarf der Nucleinsäuresynthese
Die kleinste Einheit einer Nucleinsäure ist das Nucleotid – Ribonucleotid bei Ribonucleinsäure (RNA), Desoxyribonucleotid bei Desoxyribonucleinsäure (DNA). Bei der Biosynthese der Nucleinsäuren, die von RNA- bzw. DNA-Polymerasen katalysiert wird, werden Nucleotide zu langen Ketten aneinandergereiht (polymerisiert). Die Polymerisierung der Nucleotide zu Nucleinsäuren ist, wie die Bildung aller Biopolymere, ein energieverbrauchender Prozess. Zum Einbau der Nucleosidmonophosphate in die Nucleinsäure müssen sie deshalb in einer energiereichen Form, nämlich als Nucleosidtriphosphate, vorliegen. Nucleosidtriphosphate stellen die energiereichste Form der Nucleotide dar. Bei der Verknüpfung der Nucleotide reagiert die 3'-OH-Gruppe der Pentose des letzten Nucleotids der wachsenden Kette mit der -Phosphat-Gruppe am 5'-Ende des eintretenden Nucleosidtriphosphats (Abb. 11.2 a). Bei dieser Kondensationsreaktion wird Pyrophosphat freigesetzt, das von Pyrophosphatasen in zwei Phosphatmoleküle zerlegt und damit dem Gleichgewicht der Reaktion entzogen wird. Die umgekehrte Reaktion, nämlich die Spaltung von Nucleinsäuren, wird durch Nucleasen katalysiert und erfolgt hydrolytisch (Abb. 11.2b). Sie bedarf keiner Energiezufuhr.

MERKE

Nucleinsäuren sind Makromoleküle, die abwechselnd aus einer Pentose und einem Phosphat bestehen (Zucker-Phosphat-Rückgrat), mit Basen als funktionellen Gruppen. Nucleinsäuren werden, wenn nicht anders gekennzeichnet, von 5' nach 3' geschrieben.

Struktur der Desoxyribonucleinsäure

Die DNA-Doppelhelix
Ein wesentliches Merkmal der DNA ist, dass sie aus zwei Nucleotidsträngen besteht. Die doppelhelikale Struktur der DNA leiteten James Watson und Francis Crick 1953 aufgrund von Röntgenstrukturaufnahmen ab. Die Aufklärung der DNA-Struktur beeinflusste die Entwicklung der molekularen Biologie erheblich, denn sie gab unmittelbare Hinweise auf die damals noch unverstandene Frage, wie genetische Information weitervererbt wird (semikonservative Replikation).
Die DNA-Doppelhelix besteht aus zwei in entgegengesetzter Richtung laufenden, sog. antiparallelen DNA-Strängen, die um eine gemeinsame Achse gewunden sind (Abb. 11.3a). Die Windung ist rechtsgängig. Eine rechtsgängige Schraube dringt beim Drehen nach rechts (Uhrzeigersinn) in eine konventionelle Schraubenmutter hinein; eine linksgängige Schraube würde sich bei gleicher Drehrichtung aus der Mutter herausbewegen. Die Purin- und Pyrimidinbasen sind zum Inneren der Helix gerichtet, während das Zucker-Phosphat-Rückgrat beider Stränge außen liegt. Die Basen eines Strangs gehen Wechselwirkungen mit den Basen des anderen Strangs ein (Abb.11.3b). Die Geometrie dieser Wechselwirkungen ist so geartet, dass die N-glykosidischen Bindungen gepaarter Nucleotide nicht diametral entgegengesetzt stehen, sondern einen geringeren Winkel als 180 bilden (Abb. 11.4). Die gepaarten Nucleotide stapeln sich spiralförmig in der DNA-Doppelhelix übereinander, wobei zwei Furchen entstehen, eine große und eine kleine, die man beim Betrachten der Helix von der Seite sehr gut sieht. Stünden die N-glykosidischen Bindungen zwischen Zucker und Base in einem Winkel von 180 zueinander, dann wären beide Furchen gleich breit und nicht zu unterscheiden.
Wasserstoffbrücken
Die Wechselwirkungen zwischen den Basen der DNA-Doppelhelix erfolgen über Wasserstoffbrücken. Jeweils ein Purin bildet Wasserstoffbrücken zu einem Pyrimidin des Gegenstrangs, wobei sich zwischen A und T zwei, zwischen G und C drei Wasserstoffbrücken vom sog. Watson-Crick-Typ ausbilden können (Abb. 11.4).
Basen-Stacking
Die Basen der DNA-Stränge sind übereinandergestapelt (engl. stacked). In diesen Stapeln bilden sich Wechselwirkungen zwischen den übereinanderliegenden Basenpaaren aus, die zur weiteren Stabilisierung der Helix beitragen (sog. Stacking forces). Hier handelt es sich um hydrophobe Wechselwirkungen und um Van-der-Waals-Kräfte.

Blick ins Labor

Die Stapelung der Basen ist die Ursache der Hypochromizität in der DNA. Der Begriff Hypochromizität beschreibt die Tatsache, dass die Lichtabsorption der Helix bei 260 nm (Absorptionsmaximum der Nucleotide) um 20% niedriger liegt als die Absorption der Summe der Nucleotide, aus denen die Helix aufgebaut ist. Hebt man die geordnete Stapelung auf, etwa durch enzymatischen Abbau der DNA zu den Nucleosidmonophosphaten oder durch thermische Denaturierung, dann steigt die Absorption um 20% an. Diese Hypochromizität muss berücksichtigt werden, wenn man die Lichtabsorption zur Konzentrationsbestimmung von DNA-Doppelstrangmolekülen benutzen will.

MERKE

Die DNA-Doppelhelix besteht aus zwei in entgegengesetzter Richtung laufenden, sog. antiparallelen DNA-Strängen, die um eine gemeinsame Achse gewunden sind. Beide Stränge werden durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten (Standard-Watson-Crick-Basenpaare: G\C und A\T). Die übereinandergestapelten Basen bilden untereinander hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte aus (stacking forces), welche die Helix weiter stabilisieren.

Reversible Trennung von DNA-Doppelsträngen
Die beiden Stränge der Doppelhelix sind über Wasserstoffbrücken, also über nichtkovalente Bindungen, miteinander verbunden. Die Stabilität der Doppelhelix ergibt sich aus der Summe vieler dieser schwachen Wechselwirkungen. Diese lassen sich unter relativ geringem Energieaufwand aufheben; im Reagenzglas etwa durch Erhitzen auf ca. 90 C oder durch Zugabe von Lauge (ca. 0,4 mol L–1 NaOH). Unter diesen Bedingungen lösen sich die Wasserstoffbrücken, die Stränge trennen sich und bilden zufällige Faltungen (random coils). Diesen Vorgang bezeichnet man als Denaturierung. Beim Wiederherstellen günstiger Bedingungen, wie Raumtemperatur und neutraler pH, finden sich die komplementären Sequenzen nach einiger Zeit wieder (Renaturierung), und die ursprüngliche Doppelhelix bildet sich perfekt zurück (Abb. 11.5). Die Renaturierung ist ein langsamer Prozess und von mehreren Parametern abhängig: von der Zeit, der DNA-Konzentration und der Ionenstärke. Eine Doppelhelix bildet sich nur aus, wenn die DNA-Sequenz der Stränge zueinander komplementär ist; zwei nicht verwandte DNA-Stränge verbleiben als einzelsträngige DNA. DNA kann sich auch mit RNA zu einem Hybriddoppelstrang vereinigen, vorausgesetzt, die Nucleotidsequenzen sind komplementär zueinander. Solche Hybridstränge bilden sich z.B. während der Transkription in der Zelle.
In der Zelle werden die DNA-Stränge bei diversen biologischen Prozessen, wie Transkription, Replikation oder DNA-Reparatur, getrennt. Die Funktion des Erhitzens übernehmen hier Proteine, wie Helicasen, die die komplementären Stränge unter ATP-Verbrauch lokal aufwinden und trennen.

Blick ins Labor

Hybridisierung

Die Bildung von DNA-RNA-Hybridsträngen oder von Nucleinsäuredoppelsträngen allgemein (im Reagenzglas oder an Membranfilter gebunden) ist eine der wichtigen Analysetechniken der Molekularbiologie und wird Hybridisierung genannt. Die Komponenten können dabei radioaktiv oder mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert sein. Die Hybridisierung ist eine empfindliche analytische Methode zum Nachweis spezifischer Nucleinsäuren (etwa eines bestimmten Gens oder einer spezifischen mRNA) in komplexen Gemischen.

Schon gewusst

Die DNA-Doppelhelix ist eine dynamische Struktur

Der größte Teil, vielleicht sogar nahezu die gesamte DNA in der Zelle liegt in der sog. B-Form vor (Abb. 11.6). Durch die Geometrie der gepaarten Basen bilden sich bei der B-DNA zwei Furchen aus, eine kleine und eine große. Im Reagenzglas kann die DNA in Gegenwart organischer Lösungsmittel in die sog. A-DNA übergehen. Die A-Helix ist etwas kürzer, dafür aber etwas weiter als die B-Form, und die Basen sind um 20 geneigt; sie stehen somit nicht mehr senkrecht zur Helixachse wie bei der B-Form. Die kleine Furche ist in der A-Form stark verengt, ja sogar nahezu verschwunden. Bestimmte DNA-Abschnitte, wie beispielsweise (CG)n, eine alternierend aus Cytosin und Guanosin bestehende DNA, können eine linksgängige Helix ausbilden: die Z-DNA. Die Phosphatgruppen im Rückgrat zeigen keinen ebenen Gang wie bei der A- oder B-DNA, sondern einen zickzackförmigen Verlauf (daher der Name Z-DNA). Wahrscheinlich ist weder die A- noch die Z-förmige DNA von physiologischer Bedeutung. Die Existenz dieser Formen zeigt jedoch, dass die DNA keine starre, sondern eine äußerst dynamische, biegsame und komprimierbare Struktur darstellt.

MERKE

Die beiden Stränge der DNA lassen sich unter relativ geringem Energieaufwand voneinander trennen. Diesen Vorgang bezeichnet man als Denaturierung. Beim Wiederherstellen günstiger Bedingungen finden sich die komplementären Sequenzen nach einiger Zeit wieder, und die ursprüngliche Doppelhelix bildet sich perfekt zurück (Renaturierung). Natürliche DNA liegt in der B-Form vor. Im Reagenzglas kann die DNA in Gegenwart organischer Lösungsmittel in die sog. A-Form übergehen. Bestimmte DNA-Abschnitte, wie beispielsweise (CG)n, können eine linksgängige Helix ausbilden, die Z-DNA.

Struktur von Ribonucleinsäuren

Ribonucleinsäuren (RNA) bestehen in der Regel aus einem Einzelstrang, der sich jedoch in partiell doppelsträngige Strukturen falten kann, wenn er komplementäre Sequenzabschnitte enthält (Abb. 11.7). Die Grundlage für die Ausbildung partiell doppelsträngiger Bereiche in einem RNA-Molekül sind prinzipiell dieselben Basenpaare vom Watson-Crick-Typ wie bei der DNA-Doppelhelix. Da RNA U statt T enthält, paart hier A mit U.
Bei der Faltung der RNA können sog. Haarnadel- oder Pfannenstielstrukturen entstehen: ein Stamm mit einer kleinen bzw. größeren Schleife. Besonders häufig kommen solche Formen in der ribosomalen RNA (rRNA) vor. Sie bilden auch die Grundlage für die Kleeblattstruktur der Transfer-Ribonucleinsäure (tRNA).
Die lineare Abfolge der Basen, die Nucleotidsequenz, wird als Primärstruktur bezeichnet. Die Struktur, die sich aus der Faltung der RNA ergibt, z.B. die abgebildete Haarnadel oder die Kleeblattform der tRNA, ist die Sekundärstruktur. Die räumliche Ausrichtung der Schleifen und der Stämme ergibt die Tertiärstruktur, die nicht aus der Sequenz abgeleitet werden kann, sondern durch Röntgenstrukturanalyse oder andere Verfahren experimentell bestimmt werden muss. Partiell doppelsträngige Elemente in der RNA üben häufig physiologische Funktionen aus.
Die verschiedenen Typen von RNA-Molekülen in Eukaryontenzellen sind in Tab. 11.1 dargestellt.

MERKE

Zelluläre RNA ist einzelsträngig, sie faltet sich jedoch häufig unter Ausbildung partiell doppelsträngiger Bereiche. Dabei paart G mit C und A mit U.

Superhelikale Struktur und Topoisomerasen

Die DNA-Doppelhelix wurde bisher als eine lange, reguläre Struktur dargestellt. Aufgrund von diversen biologischen Prozessen – v.a. durch Bindung von Proteinen, Einwirkung von Helicasen (Enzyme, die unter ATP-Hydrolyse die Stränge der Doppelhelix lokal trennen) oder als Folge der Replikation, Transkription, DNA-Reparatur etc. – kann die Regelmäßigkeit der Struktur lokal erheblich gestört sein. In der Regel führen solche Störungen zu Spannungen, die sich in irgendeiner Form zu entladen suchen. Ein lineares DNA-Molekül, das frei beweglich ist, würde diese Spannungen spontan durch eine oder mehrere Rotationsbewegungen um die Längsachse abbauen. Menschliche DNA ist zwar linear, sie geht jedoch eine Vielzahl von Bindungen mit Proteinen ein, die ihrerseits an größeren Strukturen des Zellkerns verankert sind. Solche Bindungen engen die Beweglichkeit der DNA stark ein, sodass sie Spannungen nicht mehr durch Rotation um die Längsachse des Moleküls abbauen kann. Sie verhält sich wie ein Gummiband, das sich bei starkem Verdrillen um sich selbst zu wickeln beginnt (Abb. 11.8). Sie bildet überspiralisierte DNA aus, sog. Superhelices (z.B. Abb. 11.9 c, e).
Superhelikale DNA stellt unterschiedliche topologische Formen einzelner DNA-Abschnitte dar, die unter Torsionsspannung stehen. Besonders anschaulich lassen sich die topologischen Formen von unter Spannung stehender DNA an zirkulärer DNA erläutern. Zirkuläre DNA verhält sich wie eine lineare, die an beiden Enden z.B. von Proteinen festgehalten wird.

MERKE

Lokales Aufwinden der DNA führt zu Torsionsstress, der sich durch Ausbildung von Superhelices entspannt.

Entstehung einer Torsionsspannung
Wenn ein lineares DNA-Molekül eine Mindestlänge von ca. 200 Basenpaaren (bp) überschreitet, lässt es sich nahezu spannungsfrei zu einem Ring biegen und mithilfe von DNA-Ligase zu einem zirkulären Molekül verschweißen (Abb. 11.9 a). Bei einer 210 bp langen DNA ohne Sequenzbesonderheiten enthält der Ring 20 helikale Windungen, denn die DNA-Doppelhelix hat in der B-Form durchschnittlich 10,5 bp pro Windung (210 : 10,5 20).
Linking number
Eine topologische Eigenschaft, die dieses Molekül (Abb. 11.9a) beschreibt, ist die sog. Windungszahl oder Verwindungszahl. Sie heißt auf Englisch linking number, abgekürzt L. Da sich die deutschen Bezeichnungen nicht durchgesetzt haben, wollen wir fortan die englischen benutzen. Die Zahl L gibt an, wie oft ein DNA-Strang den anderen kreuzt, wenn das Molekül flach auf einer ebenen Unterlage liegt. Im gegebenen Fall (Abb. 11.9a) ist diese Zahl 20. Enthält das DNA-Molekül keine Spannung, dann ist L L0, die Linking number entspannter DNA. L ist immer eine ganze Zahl. Sie kann sich nicht ändern, solange keine Phosphodiesterbindung chemisch oder enzymatisch geöffnet und wieder geschlossen wird.
Twist number
Eine andere Eigenschaft, die topologische Formen der DNA beschreibt, ist die Twist number, abgekürzt T (helikale Windungszahl). Sie kennzeichnet ebenfalls die Zahl der Windungen in einem DNA-Molekül, diese Zahl lässt sich jedoch durch verschiedene Manipulationen ändern, etwa durch lokales Entwinden der DNA, ohne dass Phosphodiesterbindungen geöffnet und wieder geschlossen werden müssen. Windet man die DNA-Doppelhelix an einer bestimmten Stelle auf (T wird kleiner), verdichtet sich dafür die Zahl der Windungen an anderer Stelle (T wird größer). Da es sich in Abb. 11.9a um entspannte DNA handelt, ist L T 20.
Topoisomerasen
Man kann die Zahl der Windungen in der DNA verringern, indem man die DNA durchschneidet, ein Ende festhält und das Molekül am anderen Ende entgegen der Gangrichtung der Doppelhelix (Abb. 11.9b) um 360 dreht, also in einer Weise, dass die Doppelhelix teilweise entwunden wird. Anschließend wird die DNA wieder verschweißt. Man kann die Zahl der Windungen in der DNA erhöhen, indem man die Drehung in der Gangrichtung ausführt (Abb. 11.9d). In unserem Beispiel wurde die DNA sogar zweimal um 360 gedreht. Solche Manipulationen werden in der Zelle von Enzymen, den Topoisomerasen, durchgeführt. Beide DNA-Moleküle stehen jetzt unter Torsionsspannung: zum einen, weil zwei Windungen aus der Doppelhelix entfernt, zum anderen, weil zwei Windungen zusätzlich eingeführt wurden. Das Molekül in Abb. 11.9b hat nur 18 (statt 20) helikale Windungen pro 210 bp an DNA; der Gang der Helix hat sich geweitet. Dadurch wurde der Winkel zweier benachbarter Basenpaare von 34,29 (20 360 / 210) auf 30,86 (18 360 / 210) verringert. Im anderen Molekül (Abb. 11.9d) hat sich der Winkel zweier benachbarter Basenpaare von 34,29 auf 37,71 (22 360 / 210) erhöht; der Gang der Helix wurde enger. Beide Winkel sind energetisch ungünstig, in beiden Fällen herrscht eine Torsionsspannung. Folglich streben die Basenpaare in die Normallage von 34,29 zurück.
Torsionsspannung in der DNA und die Bildung von Superhelices
Auf die Unterlage gepresst, enthält das obere Molekül (Abb. 11.9b) zwei Windungen weniger (L T 18; L < L0), das untere Molekül (Abb. 11.9d) zwei Windungen mehr (L T 22; L > L0). Würde man die Moleküle nicht auf der Unterlage festhalten, dann würden die Winkel zwischen benachbarten Basenpaaren wieder den normalen Wert von 34,29 anstreben, um die Torsionsspannung abzubauen. Dies kann aber nur dadurch erfolgen, dass das Molekül aus der planaren Lage ausbricht und eine andere Art von Helix bildet (Abb. 11.9c, e). Diese Helices, die zum Ausgleich von Torsionsspannungen entstehen, werden Superhelices genannt; ihre Zahl wird durch die Writhing number W (superhelikale Windungszahl) beschrieben. Zwischen diesen drei topologischen Eigenschaften der DNA besteht folgende Beziehung:
L T + W
Alle Moleküle in Abb. 11.9 haben dieselbe Länge und Nucleotidsequenz, sie unterscheiden sich lediglich durch ihre topologischen Eigenschaften.
Änderung der Topologie der DNA
Die Topologie der DNA ändert sich bei vielen zellulären Prozessen: der Replikation, der Rekombination, der Transkription, wahrscheinlich auch bei der DNA-Reparatur – also praktisch bei jedem zellulären Vorgang, an dem DNA beteiligt ist. Wenn beispielsweise Helicasen während der Transkription die DNA lokal entwinden, verringert sich an diesem Ort die Twist number T. Im Gegenzug erhöht sie sich im benachbarten Abschnitt der DNA (Abb. 11.8). Da bei diesem Prozess keine Phosphodiesterbindungen geöffnet und wieder geschlossen werden, bleibt L gleich. Mit jeder Änderung von T muss sich W ändern, also die Superhelizität der DNA.
Je weiter die Helicase die DNA aufwindet, umso größer wird – vor der Helicase – die superhelikale Dichte der DNA. Wären in der Zelle keine Topoisomerasen vorhanden, die solche überdrehte DNA entspannen, würden Replikation, Transkription etc. zum Stillstand kommen. Dies lässt sich tatsächlich beobachten, wenn Topoisomerasen durch spezifische Inhibitoren gehemmt werden.
Funktion der Topoisomerasen
Enzymatische Eigenschaften
Topoisomerasen katalysieren die Umwandlung topologisch unterschiedlicher Formen der DNA ineinander, indem sie die Linking number L der DNA verändern. Dazu müssen Phosphodiesterbindungen in der DNA gespalten und wieder zusammengefügt werden. Im Prinzip könnte dies mithilfe zweier
Enzyme, nämlich einer DNase und der Ligase, geschehen, doch es wurde beobachtet, dass der Prozess mithilfe spezieller Enzyme erfolgt. Diese wurden Topoisomerasen genannt und wirken in der lebenden Zelle in einem dreistufigen Prozess: Sie spalten einen (Topoisomerase I) oder beide Stränge (Topoisomerase II) der DNA. Damit ermöglichen sie eine Rotation um 360 an einem Ende der Bruchstelle (Veränderung der Linking number). Danach wird die Bruchstelle wieder geschlossen.
Topoisomerasen der Klasse I
Diese führen vorübergehend einen Einzelstrangbruch in die DNA ein; der zweite Strang wird nicht gespalten. Besonders gut erforscht ist die Topoisomerase I des Bakteriums E. coli. Sie entfernt negative Superhelices aus der DNA. Die entsprechenden menschlichen Topoisomerasen der Klasse I können sowohl negative als auch positive Superhelices entfernen. Bei der Topoisomerase I von E. coli wird dabei das 5'-Ende des gespaltenen Strangs – bei der menschlichen Topoisomerase I das 3'-Ende – kovalent über die OH-Gruppe eines Tyrosinrests an das Enzym gebunden (Abb. 11.10b). Diese Umesterung benötigt keine Energiezufuhr, läuft also ohne ATP-Hydrolyse ab. Durch Einführung des Einzelstrangbruchs kann nun eine Rotation um die Achse des unversehrten Strangs erfolgen (Abb. 11.10a), wonach der andere Strang wieder geschlossen wird. Die beiden DNA-Stränge kreuzen sich jetzt einmal weniger als zuvor: Die Linking number L wurde um 1 verändert.
Topoisomerasen der Klasse II
Diese bei Bakterien auch Gyrasen genannten Enzyme verändern die Topologie der DNA durch Spaltung und Wiederverknüpfung beider Stränge. Die Reaktion verläuft unter ATP-Hydrolyse. Der Doppelstrang wird durch die vorübergehend entstandene Lücke durchgezogen (Abb. 11.11a); die DNA-Enden werden wieder miteinander verknüpft. Im Endeffekt bedeutet dies die Umwandlung einer positiven Superhelix in eine negative oder, anders ausgedrückt, die Einführung zweier negativer Superhelices in die DNA. Während sich die Linking number L bei der Topoisomerase I um 1 änderte, wird sie durch die Topoisomerase II um 2 verändert. Um die Linking number noch stärker zu verändern, muss der Vorgang entsprechend oft wiederholt werden. Im Gegensatz zur bakteriellen Gyrase vermag die menschliche Topoisomerase II keine positiven Superhelices in die DNA einzuführen; sie kann die DNA nur relaxieren. Warum dabei die Hydrolyse von ATP nötig ist, ist nicht bekannt.
Bakterielle und eukaryontische Topoisomerase II kann ineinander verwobene DNA (Catenate) trennen (Abb. 11.11b). Solche ineinander verwobenen Strukturen können auch in der menschlichen DNA während der Replikation entstehen. Sie können selbstverständlich nur getrennt werden, wenn beide Stränge der Doppelhelix gespalten werden. Topoisomerase I, die nur einen Einzelstrangbruch in die DNA einführt, kann folglich Catenate nicht entwirren.

MERKE

Topoisomerasen lösen superhelikale Windungen der DNA in der Zelle auf. Die Enzyme der Klasse I öffnen vorübergehend einen Strang, die der Klasse II beide Stränge. In beiden Fällen wird die Linking number L verändert.

Klinik

Topoisomerase-Inhibitoren in der antibakteriellen Therapie und in der Chemotherapie von Tumoren

Infektionsbekämpfung

Die DNA-Gyrase (bakterielle Topoisomerase II) ist Angriffspunkt diverser Antibiotika, die das prokaryontische Enzym wesentlich stärker hemmen als die eukaryontische Topoisomerase II. Novobiocin blockiert die Bindung von ATP an die Gyrase. Nalidixinsäure und Ciprofloxacin, die häufig zur Behandlung von Harnwegsinfekten und anderen Infektionen mit gramnegativen Bakterien eingesetzt werden, hemmen die Wiederverknüpfung der DNA-Kette. Bei Hemmung der Topoisomerase werden Superhelices nicht entfernt, die DNA bleibt überspiralig. Überspiralisierte DNA beeinträchtigt die Transkription und Replikation. Ohne Replikation können sich die Bakterien nicht vermehren.

Chemotherapie

Vor über 30 Jahren wurden Camptothecine als Tumorwachstum hemmende Alkaloide entdeckt. Sie werden aus dem chinesischen Baum Camptotheca acuminata gewonnen. Erst sehr viel später wurde erkannt, dass die Wirkung dieser Alkaloide auf einer Hemmung der Topoisomerase I eukaryontischer Zellen beruht. Die Entwicklung gut wasserlöslicher Derivate machte diese Wirkstoffe zu wertvollen Chemotherapeutika bei der Bekämpfung diverser Tumoren, beispielsweise des Dickdarmkarzinoms.
Etoposid ist ein Abkömmling von Podophyllotoxin mit antimitotischen und antineoplastischen Eigenschaften. Es wirkt über die eukaryontische Topoisomerase II. Etoposid findet Anwendung bei der Therapie von Bronchialkarzinomen, Lymphogranulomatose, Non-Hodgkin-Lymphomen und anderen Tumoren. Weitere Hemmstoffe der Topoisomerasen I und II sind in der klinischen Erprobung. Letztlich wirken diese Agenzien durch Hemmung der Zellteilung, denn für die Replikation werden die Topoisomerasen benötigt.

MERKE

Hemmstoffe bakterieller Topoisomerasen dienen der Infektionsbekämpfung, Hemmstoffe menschlicher Topoisomerasen sind wertvolle Medikamente bei der Tumortherapie.

Wechselwirkungen der DNA-Doppelhelix mit Proteinen und Nucleinsäuren

Die DNA ist im Zellkern mit basischen Proteinen, den Histonen, dicht bepackt. Die Wechselwirkungen zwischen Histonen und DNA sind nicht sequenzspezifisch. Zahlreiche Transkriptionsfaktoren und andere Proteine hingegen binden an die DNA in sequenzspezifischer Weise. Für das Zustandekommen sequenzspezifischer Wechselwirkungen zwischen DNA und Protein eignen sich besonders Wasserstoffbrücken zwischen Donor- und Akzeptorgruppen von Aminosäuren und den entsprechenden Donor- und Akzeptorgruppen der Basenpaare in der DNA-Doppelhelix.
Wechselwirkungen der DNA mit Proteinen
Die Basen der DNA-Doppelhelix sind von außen über beide Furchen für Proteine zugänglich. In der kleinen Furche ist beispielsweise das N3 von Guanin zugänglich. Dieses Atom kann daher als Wasserstoffakzeptor dienen und mit der Amidgruppe eines Asparaginrests eines Proteins Wasserstoffbrücken ausbilden (Abb. 11.12a). Gleichzeitig kann die CO-Gruppe von Asparagin als Wasserstoffakzeptor dienen und mit der NH2-Gruppe von Guanin in Wechselwirkung treten.
Auch in der großen Furche können verschiedene N- und O-Atome an Protein-DNA-Bindungen beteiligt werden, etwa das N7 von Guanin und Adenin, die Sauerstoffatome der CO-Gruppe von Guanin und Thymin. Abb. 11.12b zeigt, wie ein Glutaminrest eines Proteins über die große Furche mit einem T/A-Paar spezifisch in Kontakt tritt. Die Aminogruppe am C6 von Adenin kann als Wasserstoffdonor dienen und mit Wasserstoffakzeptoren von Proteinen in Kontakt treten. Das N7 des Adeninrings kann als Wasserstoffakzeptor fungieren und mit der Amidogruppe von Glutamin in Wechselwirkung treten.
Sequenzspezifität
Die oben beschriebenen Wechselwirkungen können zwischen mehreren Aminosäuren eines Proteins und Basenpaaren in der DNA entstehen und bilden die Grundlage der Sequenzspezifität der Bindung zwischen DNA und Protein. Es ist offensichtlich, dass eine bestimmte Basenpaarabfolge nur von ganz bestimmten Aminosäureanordnungen in der Bindetasche eines entsprechenden Proteins gebunden werden kann.
Jedes Basenpaar in der großen Furche besitzt ein spezifisches Muster an Wasserstoffbrückendonoren und -akzeptoren. In der kleinen Furche dagegen zeigen die Paarungen A∙T und T∙A sowie G∙C bzw. C∙G ein sehr ähnliches Muster.
Die kleine und die große Furche werden von verschiedenen Klassen von DNA-bindenden Proteinen zum Kontakt mit der DNA benutzt. Der Transkriptionsfaktor TFIID (auch TATA-bindendes Protein genannt) bindet über die kleine Furche spezifisch an die TATA-Box. Die meisten der heute bekannten DNA-bindenden Proteine treten jedoch über die große Furche mit der DNA in Kontakt.

MERKE

Sequenzspezifische Bindungen zwischen DNA und Protein werden über Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet. Sie entstehen zwischen Wasserstoffbrückendonoren bestimmter Aminosäuren und Wasserstoffbrückenakzeptoren der Basenpaare vom Watson-Crick-Typ. In gleicher Weise können sich Wasserstoffbrücken zwischen Donoren der Basenpaare und Akzeptoren der Aminosäuren ausbilden.

Schon gewusst

Bindung von Einzelstrang-DNA an einen Doppelstrang

Nicht nur Proteine, sondern auch diverse andere natürliche und synthetische Agenzien, u.a. einzelsträngige DNA, sind potenzielle Bindungspartner der DNA über eine der Furchen. Die Bindung einzelsträngiger DNA an die Doppelhelix führt beispielsweise zur Ausbildung von Tripelstrang-DNA. Experimente im Reagenzglas zeigten, dass sich ein Oligonucleotid aus sich wiederholenden Pyrimidinen an doppelsträngige DNA anlagern kann, wenn einer der Stränge nur Purine und der entsprechende Gegenstrang nur Pyrimidine enthält. Das Produkt ist intermolekulare tripelsträngige DNA (Abb. 11.13a). Die Grundlage für die Entstehung von Tripelstrang-DNA sind sog. Hoogsteen-Basenpaare, die K. Hoogsteen 1963 als Erster beschrieb. Wasserstoffdonoren und -akzeptoren, die noch nicht durch die Watson-Crick-Basenpaarung abgesättigt sind, können mit einzelsträngiger DNA in Kontakt treten und Tripelstränge ausbilden. Beispielsweise ist ein Cytidin (in der protonierten Form) in der Lage, mit dem Guanosin eines G ∙ C-Paars zusätzliche Wechselwirkungen einzugehen (Abb. 11.13b). Solche Wechselwirkungen können sich auch zwischen einem normalen A ∙ T-Paar und einem weiteren T ausbilden (Abb. 11.13c). Eine Besonderheit der tripelsträngigen DNA ist, dass sich der dritte Strang sowohl parallel als auch antiparallel (über Anti-Hoogsteen-Basenpaare) an den purinreichen Strang der Doppelhelix anlagern kann. In jedem Fall ist aber die Bindung sequenzspezifisch. Es wird geprüft, ob die Bildung von Tripelstrang-DNA in der Zelle zur Hemmung der Transkription nutzbar ist.

Replikation

Semikonservative Replikation

Bei der Replikation werden aus dem ursprünglichen DNA-Molekül zwei neue DNA-Doppelhelices gebildet, wobei einer der Einzelstränge vom elterlichen Molekül stammt, der andere neu synthetisiert wird. Als Ergebnis entstehen zwei Doppelhelices, deren Basenfolge mit der der elterlichen DNA identisch ist (Abb. 11.14). Da jeder DNA-Strang eine Nucleotidsequenz enthält, die zur Sequenz des Partnerstrangs genau komplementär ist, kann jeder Strang als Matrize (Vorlage) für die Synthese des neuen, komplementären Strangs dienen. Anders ausgedrückt: Wenn wir die beiden Stränge Watson und Crick (nach den Entdeckern der DNA-Doppelhelix) benennen, benutzt die DNA-Polymerase Watson als Matrize für die Synthese eines neuen Crick-Strangs, während Crick als Matrize für einen neuen Watson-Strang dient. Diese Art der DNA-Synthese, bei der die neue DNA jeweils aus einem elterlichen und einem neu synthetisierten Tochterstrang besteht, wird semikonservative Replikation genannt.
Die DNA-Polymerasen katalysieren die schrittweise Addition von Desoxyribonucleotideinheiten an das 3'-Ende der wachsenden DNA-Kette nach der Gleichung:
(DNA)n Reste + dNTP (DNA)n+1 Reste + PPi
Wie wir später sehen werden, besitzen sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zellen mehrere DNA-Polymerasen, die sich in einigen speziellen Eigenschaften unterscheiden. Alle DNA-Polymerasen arbeiten jedoch nach gemeinsamen Grundprinzipien. Sie verwenden eine Matrize, die die Sequenz der neu synthetisierten DNA festlegt. Diese Matrize kann DNA sein (DNA-abhängige DNA-Polymerasen), aber auch RNA (RNA-abhängige DNA-Polymerasen, auch reverse Transkriptasen genannt).
Alle DNA-Polymerasen katalysieren das Wachstum der DNA-Kette in derselben Richtung, nämlich von 5' nach 3', und benötigen für die Biosynthese aktivierte Bausteine, die Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP). Die DNA-Polymerasen selbst können die Neusynthese der DNA nicht initiieren. Dazu muss, wie in Abb. 11.15 dargestellt, die 3'-OH-Gruppe des zu verlängernden DNA-Strangs vorliegen. Mit anderen Worten, sie können nur einen bereits begonnenen Strang verlängern, nicht jedoch die Synthese eines neuen Strangs beginnen. Bei der von den DNA-Polymerasen katalysierten Reaktion greift das 3'-OH des zu verlängernden Strangs am -Phosphat des eintretenden neuen Nucleotids an, wobei eine neue Bindung geknüpft und gleichzeitig Pyrophosphat freigesetzt wird (Abb. 11.15).
Pyrophosphat wird von Pyrophosphatasen in zwei Phosphate gespalten und damit dem Gleichgewicht der Reaktion entzogen. Die DNA-Synthese wird also von der Energie angetrieben, die bei der Hydrolyse der Säureanhydridbindungen der Desoxyribonucleosidtriphosphate freigesetzt wird.

MERKE

Bei der Replikation der DNA entstehen zwei identische DNA-Helices. Beide Tochterstränge bestehen jeweils aus einem elterlichen und einem neu synthetisierten DNA-Strang. Diese Art der Replikation wird als semikonservative Replikation bezeichnet. Die Neusynthese von DNA wird von DNA-Polymerasen katalysiert und benötigt Desoxyribonucleosidtriphosphate als Bausteine.

Teilprozesse der Replikation

Am besten untersucht ist die Replikation in Prokaryonten (E. coli); daher wird der Ablauf der Replikation am Beispiel dieses Modellorganismus besprochen. Proteine, die bei der eukaryontischen Replikation gleiche oder ähnliche Reaktionen fördern, sind in Tab. 11.2 aufgeführt. Bei deutlich divergierenden Mechanismen zwischen Pro- und Eukaryonten werden diese im Text erklärt.
Beginn der Replikation
Die Replikation beginnt an einem durch die DNA-Sequenz definierten Replikationsursprung (Ori). Dieser ist mit ORC-Proteinen (von origin recognition complex) besetzt und dient als Plattform für Initiationsproteine und für die Anheftung des Polymerase-Holoenzyms. Vom Ori aus schreitet die Replikation in beide Richtungen voran, also bidirektional.
Bevor mit der eigentlichen Synthese der DNA begonnen werden kann, müssen die elterlichen DNA-Stränge aufgetrennt, also entwunden werden. Dazu werden Proteine mit Helicaseaktivität rekrutiert. In E. coli kennt man mehr als ein Dutzend Helicasen: Bei der Replikation spielt die DnaB-Helicase eine wichtige Rolle, die unter ATP-Hydrolyse die A- und T-reiche DNA des Ori lokal aufwindet, indem sie die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen aufbricht. An die partiell einzelsträngigen Bereiche binden einzelstrangbindende Proteine SSB (von single strand binding), die verhindern, dass sich die beiden Stränge gleich wieder vereinigen. Danach bindet eine Gruppe von Proteinen, Pol-III-Holoenzym genannt, die als komplexe Replikationsmaschinen (Abb. 11.18) die Replikation durchführen. Diese Maschinen enthalten neben der DNA-Polymerase eine größere Zahl anderer Proteine (sog. akzessorische Proteine) mit sehr unterschiedlichen Funktionen (Tab. 11.2).
Wir werden zunächst die einzelnen Vorgänge bei der Replikation Schritt für Schritt besprechen (als ob sie von voneinander unabhängigen Enzymen katalysiert würden), um am Ende dieses Abschnitts ein Gesamtbild der koordinierten Replikation beider DNA-Stränge vorzustellen.
Anzahl der Replikationsursprünge
Ein Bakterium wie E. coli besitzt ein ringförmiges Genom von 4 106 Basenpaaren mit einem einzigen, heute gut charakterisierten Replikationsursprung (OriC). Bei der menschlichen DNA hingegen, die mit einem Genom von 3 109 Basenpaaren tausendfach komplexer ist als das bakterielle Genom, muss die Replikation an vielen Replikationsstartstellen gleichzeitig beginnen, um die Zellteilung in wenigen Stunden bewerkstelligen zu können. Die Zahl der Oris im menschlichen Genom schätzt man auf über 10.000. Die Isolierung eines menschlichen Ori ist erst kürzlich gelungen; ein Ori neben dem humanen INK4b-Gen (INK für Inhibitor of CDK) wurde im Jahr 2006 charakterisiert und stellt ein kompliziertes Element dar, da es gleichzeitig ein Transkriptionsregulator ist (Abb. 11.30). Die Funktionsweise menschlicher Oris ist noch weitgehend unerforscht. Somit stammen alle heute gültigen Erkenntnisse über Replikationsursprünge aus Studien mit Bakterien, Hefe, Froscheiern oder Viren. Die Grundprinzipien gelten aber auch für den Menschen.
Bidirektionale Wanderung der Replikationsgabeln
Vom Replikationsursprung setzt sich die DNA-Synthese in beiden Richtungen fort: Die DNA-Synthese erfolgt also bidirektional. Der stets fortschreitende Punkt an beiden Enden der Replikationsblase, an dem die DNA entwunden und gleichzeitig synthetisiert wird, bezeichnet man als Replikationsgabel. DNA, die gerade repliziert wird, lässt sich durch Elektronenmikroskopie und Autoradiographie sichtbar machen (Abb. 11.16a, b). Betrachtet man die Wanderung der Replikationsgabel bei schwacher Auflösung, entsteht der Eindruck, als würde das Wachstum der DNA-Stränge gleichsinnig mit der Fortbewegung der Replikationsgabel erfolgen. Der in Abb. 11.16c oben liegende neu synthetisierte DNA-Strang würde, da die elterlichen DNA-Stränge antiparallel angeordnet sind, in 3'5'-Richtung wachsen, während der untere Strang in 5'3'-Richtung wächst. Dem steht die Erfahrung mit allen bislang isolierten und gereinigten DNA-Polymerasen entgegen: Nucleinsäurestränge werden von den Polymerasen nur in einer Richtung, nämlich von 5' nach 3' (5'3'), synthetisiert.

MERKE

Die Replikation beginnt an einem Startpunkt (Ori) und schreitet bidirektional, d.h. in beiden Richtungen, fort. Eukaryonten-DNA enthält Tausende von Oris. Neben der DNA-Polymerase ist an der Replikation eine große Zahl an anderen Proteinen beteiligt. Die Nucleinsäurestränge werden dabei immer in 5'3'-Richtung synthetisiert.

Diskontinuierliche DNA-Synthese und Okazaki-Fragmente
Die Bildung der Tochterstränge durch die DNA-Polymerase erfolgt immer von 5' nach 3'. In der Natur wurden keine DNA-Polymerasen gefunden, die Nucleotide in umgekehrter Richtung, nämlich von 3' nach 5', polymerisieren können. Folglich wird nur der als Leitstrang (engl. leading strand) bezeichnete Tochterstrang (Abb. 11.16d unten) gleichsinnig mit der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel gebildet. Am anderen elterlichen Strang (Abb. 11.16d oben) werden zunächst in 5'3'-Richtung einzelne kurze DNA-Abschnitte jeweils von der Replikationsgabel weg synthetisiert, die nach ihrem Entdecker Okazaki-Fragmente genannt werden. Sie werden später zu einem kontinuierlichen Strang verschweißt. Die Bildung der Okazaki-Fragmente erfolgt also entgegengesetzt zur Wanderungsrichtung der Replikationsgabel. Die DNA-Polymerase muss dabei immer wieder Sprünge machen. Nach einer Synthesephase von der Replikationsgabel weg erfolgt ein Sprung zurück zur Replikationsgabel. Der diskontinuierlich synthetisierte Tochterstrang wird als Folgestrang (engl. lagging strand) bezeichnet. Die Verknüpfung der unterbrochenen DNA-Fragmente des Folgestrangs zu einer kontinuierlichen Sequenz erfolgt mithilfe der DNA-Ligase.
Die 3'5'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase
Die Replikation der DNA ist so genau, dass bei Einbau von 1 Mrd. oder mehr Basenpaaren statistisch nur ein Irrtum auftritt (Fehlerhäufigkeit < 1 : 109). Die Zahl der gemachten Fehler ist somit wesentlich geringer, als aus theoretischen Überlegungen zu erwarten. Fehler würden entstehen, wenn ein eintretendes Nucleotid mit der Matrize ein nicht korrektes Basenpaar ausbildet, etwa ein G ∙ T oder ein A ∙ C, und die Polymerase dieses falsch gepaarte Nucleotid mit der wachsenden Kette verbindet. Solche inkorrekten Basenpaarungen entstehen wegen ihrer geringen Stabilität zwar viel seltener als die korrekten, aber oft genug, um eine Zelle durch Anhäufung von Fehlern so weit zu schädigen, dass sie abstirbt oder zur Krebszelle entartet, wenn diese nicht korrigiert würden.
Die Anhäufung von Fehlern wird dadurch vermieden, dass die DNA-Polymerase ihre Fehler selbst erkennt und korrigiert. Sie hat neben der Polymeraseaktivität auch eine korrekturlesende Aktivität. Wird ein falsches Nucleotid eingebaut, führt das zu einer Delle im Zucker-Phosphat-Rückgrat, weil die Basenparung nicht perfekt ist. Diese Abweichung von der korrekten Raumstruktur wird von der Polymerase erkannt. Die 3'5'-Exonuclease-Aktivität der Polymerase wird aktiviert, die dann vom 3'-Ende her mehrere Nucleotide aus dem wachsenden Strang entfernt, einschließlich des falsch eingebauten. Damit ist die Polymerase gleichzeitig eine 3'5'-Exonuclease (Exo: spaltet vom Ende her). Die DNA-Polymerase prüft mit dieser Aktivität das Ergebnis jedes von ihr katalysierten Polymerisationsschritts, bevor sie mit dem nächsten fortfährt.

MERKE

An den Replikationsgabeln wird einer der Tochterstränge (Leitstrang) kontinuierlich gebildet, der andere (Folgestrang) wird diskontinuierlich in Form von sog. Okazaki-Fragmenten synthetisiert. Mittels der 3'5'-Exonuclease-Aktivität der beteiligten Polymerasen werden noch während der DNA-Synthese evtl. entstandene Fehler korrigiert. Somit ist die Replikation ein sehr genauer Vorgang.

Primer und Primase
Eine gereinigte DNA-Polymerase benötigt für ihre Funktion, neben der Matrize und den aktivierten Nucleotiden, ein kurzes einzelsträngiges DNA-Molekül, das sich korrekt an die Matrize anlagert. Vom 3'-Ende dieses kurzen, als Primer bezeichneten
Starterstrangs setzt die DNA-Polymerase die Synthese fort. Wie aber beginnt die DNA-Synthese in der Zelle? Auch in der Zelle braucht die DNA-Polymerase einen Primer. Dieser ist jedoch ein kurzes Stück RNA.
Die DNA-Synthese beginnt also mit der Bildung eines RNA-Primers durch eine spezielle RNA-Polymerase, die Primase. Die Primase, die mit der Replikationsmaschine verbunden ist, synthetisiert ein kurzes RNA-Stück, das komplementär zur Matrize ist und später von einer 5'3'-Exonuclease (bei Prokaryonten) wieder herausgespalten wird. Dieses kurze RNA-Stück stellt der DNA-Polymerase das benötigte basengepaarte 3'-OH als Startpunkt zur Verfügung.
Für den Leitstrang wird ein RNA-Primer nur einmal am Replikationsursprung benötigt. Wenn sich die Replikationsgabel gebildet hat, steht der DNA-Polymerase die 3'-OH-Gruppe eines gepaarten Nucleotids kontinuierlich zur Verfügung. Anders am Folgestrang, wo die Synthese diskontinuierlich erfolgt. Hier werden in Abständen von der Größe eines Okazaki-Fragments ständig neue Primer benötigt (Abb. 11.17). Wenn mit dem Fortschreiten der Replikationsgabel, begleitet von der Replikation des Leitstrangs, längere einzelsträngige Strecken an der Folgestrangmatrize entstehen, wird in regelmäßigen Intervallen entlang dem Folgestrang ein neuer RNA-Primer hergestellt. Die DNA-Polymerase addiert ein Desoxyribonucleotid an das freie 3'-Ende und verlängert die DNA anschließend.

MERKE

Da DNA-Polymerasen die Strangsynthese nicht selbst initiieren können, benötigen sie sog. Primer. Diese werden von einer speziellen RNA-Polymerase, der Primase, gebildet.

Die 5'3'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase I
Der RNA-Primer wird durch die 5' 3'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase I entfernt. Die DNA-Polymerase I, die in der Bakterienzelle als Reparaturenzym fungiert, füllt gleichzeitig die entstandene Lücke mit Desoxyribonucleotiden auf. Schließlich verschweißt die DNA-Ligase zwei Okazaki-Fragmente miteinander, sodass letztlich auch der Folgestrang zu einer kontinuierlichen DNA-Doppelhelix wird.
Bei Eukaryonten verläuft die Entfernung der Primer etwas anders: Wenn die DNA-Polymerase an das vorher synthetisierte Okazaki-Fragment anstößt, bricht sie die Wasserstoffbrücken zwischen Matrize und dem Primer auf, wonach eine Endonuclease mit dem Namen FEN-1 das abstehende Oligonucleotid abschneidet. Die DNA-Ligase verschweißt die beiden Okazaki-Fragmente miteinander, wodurch auch der Folgestrang zu einem kontinuierlichen Strang wird.

MERKE

Primer werden im Verlauf der Replikation von der 5'3'-Exonuclease-Aktivität der Polymerase I (bei Prokaryonten) entfernt, bei Eukaryonten durch eine Endonuclease.

Funktion der DNA-Polymerasen

Bakterielle wie menschliche Zellen besitzen unterschiedliche DNA-Polymerasen: Die einen sind für die Replikation des Genoms, die anderen für die Reparatur von DNA-Schäden zuständig. Die erste DNA-Polymerase wurde 1955 von dem amerikanischen Biochemiker Arthur Kornberg entdeckt und aus dem Darmbakterium E. coli isoliert. Dieses Enzym trägt heute den Namen DNA-Polymerase I. Fast zwei Jahrzehnte später wurden zwei weitere DNA-Polymerasen gefunden: DNA-Polymerase II und III. Heute ist klar, dass die DNA-Polymerase III für die Replikation des E.-coli-Genoms verantwortlich ist, die DNA-Polymerase I für die Reparatur von DNA-Schäden, die durch Umwelteinflüsse, insbesondere durch die Einwirkung von UV-Licht, entstehen können (Kap. 14.2.4). Mithilfe ihrer 5'3'-Exonuclease-Aktivität ist sie auch für die Entfernung der RNA-Primer, die bei der Replikation durch diskontinuierliche Synthese vorübergehend gebildet werden, zuständig. Die Polymerase II ist an der DNA-Reparatur beteiligt.
Menschliche Zellen enthalten eine größere Zahl verschiedener DNA-Polymerasen, die mit griechischen Buchstaben bezeichnet werden. An der Replikation der Zellkern-DNA ist die DNA-Polymerase (und ) und an der Replikation der mitochondrialen DNA die DNA-Polymerase beteiligt. Die DNA-Polymerase ist an der Initiation der Replikation, Verlängerung der RNA-Primer um wenige (ca. 20) Desoxyribonucleotide und an der Reparatur beteiligt. Die DNA-Polymerase ist ein Reparaturenzym. Eine Übersicht über diese Enzyme bietet Tab. 11.3. Darüber hinaus gibt es noch eine Reihe weiterer Polymerasen mit spezialisierten Aufgaben im Rahmen der DNA-Reparatur (Kap. 14.3.5).

Die DNA-Replikationsmaschine

Bisher wurden die verschiedenen enzymatischen Schritte, die bei der DNA-Replikation ablaufen, einzeln erörtert, als würden sie tatsächlich durch voneinander unabhängige Enzymen katalysiert. In Wirklichkeit erfolgt die Replikation in einem Multienzymkomplex, in dem alle Teilschritte, von der Bildung und Entfernung der RNA-Primer bis hin zur Leitstrang- und Folgestrangsynthese, miteinander koordiniert sind.
Die bakterielle Replikationsmaschine, die auch DNA-Polymerase-III-Holoenzym genannt wird, ist ein dimerer Komplex aus mehr als zehn verschiedenen Untereinheiten. Ein Teilkomplex baut sich auf dem Leitstrang, ein anderer auf dem Folgestrang auf (Abb. 11.18). Beide Teilkomplexe sind durch eine bestimmte ( Tau) Untereinheit eng miteinander zu einem Gesamtkomplex verbunden. Beide Hälften enthalten die DNA-Polymerase III wie auch die meisten anderen Untereinheiten, und es wird vermutet, dass die eine Hälfte den Leitstrang, die andere den Folgestrang synthetisiert. Folglich ist der Gesamtkomplex ein asymmetrisches Dimer, denn die Folgestrangsynthese enthält Teilreaktionen, die bei der Leitstrangsynthese nicht benötigt werden; entsprechend enthält ein Teilkomplex Untereinheiten, die im anderen nicht vorkommen. Die Helicase, die sozusagen am Bug des Holoenzyms die beiden Stränge der DNA entwindet, wird im Gesamtkomplex nur einmal benötigt. Auch die Primase ist nur einmal vertreten; im Replikationsursprung wird sie zwar zur Initiation beider DNA-Stränge benötigt, später aber nur noch am Folgestrang.
Abb. 11.18 stellt ein schematisches Modell der koordinierten Synthese des Leit- und Folgestrangs am gleichen Ort und zur gleichen Zeit dar, wobei die Synthese des Leitstrangs gleichsinnig mit der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel, die des Folgestrangs entgegengesetzt zu ihr erfolgt. Die Synthese des Folgestrangs, der in diesem Modell eine Schleife bildet, kann so lange fortgesetzt werden, bis die DNA-Polymerase an das bereits vorher synthetisierte Okazaki-Fragment stößt. Dann wird die Synthese unterbrochen, und die DNA-Polymerase, die den Folgestrang synthetisiert, dissoziiert von der DNA ab. Sie kann sich anschließend wieder an die DNA anlagern und beim nächsten Primer (Primer 3) mit der Synthese fortfahren. Bei diesen Sprüngen übernimmt die -Untereinheit des Holoenzyms, die auch als Gleitring oder -Klammer bezeichnet wird, eine wichtige Funktion.
Funktion der -Untereinheit (Gleitring) der DNA-Polymerase III
Der bakterielle Gleitring besteht aus zwei, der Gleitring des Menschen (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) aus drei identischen Untereinheiten, die sich wie ein Ring um die DNA legen und gleichzeitig mit der DNA-Polymerase eine feste Bindung eingehen. Durch diese Bindung wird die DNA-Polymerase eng mit der Matrize verbunden; sie wird zu einem prozessiven Enzym. Eine hohe Prozessivität weist eine Polymerase auf, wenn sie sehr viele katalytische Schritte hintereinander durchführt, bevor sie sich von der Matrize löst. Die isolierte DNA-Polymerase III (beim Menschen die DNA-Polymerase /) arbeitet dagegen distributiv, d.h., sie fällt nach weniger als 20 katalytischen Schritten von der Matrize ab und muss sich neu binden, bevor sie weitere Nucleotide an den wachsenden Strang anknüpfen kann. Die hohe Prozessivität wird also vom Gleitring vermittelt.
Der Gleitring wird vom Klammerlader (-Komplex bei E. coli; RFC [von replication factor C] bei Eukaryonten) an der Stelle auf die DNA aufgesetzt, wo bereits der Primer sitzt. Beim Binden der Polymerase an den Primer rastet die -Klammer mit der Replikationsmaschine ein. Dadurch wird die Polymerase zu einem prozessiven Enzym und fällt nicht von der DNA-Matrize ab, bevor das Enzym an den nächsten Primer angestoßen ist. Dieser Vorgang wiederholt sich am Folgestrang nach Fertigstellung eines jeden Okazaki-Fragments.
Die DNA-Polymerase III im Holoenzym hat eine hohe katalytische Kapazität (Vmax): Sie ist in der Lage, die Kette um 1000 Nucleotide in der Sekunde zu verlängern. Die isolierte DNA-Polymerase III, ohne Beteiligung der anderen Proteinuntereinheiten, ist zwar ebenfalls aktiv, schafft aber nur ca. 20–40 Nucleotide in derselben Zeit. Zur hohen Geschwindigkeit der DNA-Polymerase trägt die Prozessivität entscheidend bei. Der Gleitring ist also auch für die hohe Synthesegeschwindigkeit im Holoenzym mit verantwortlich.

Klinik

Proliferatinfg nuclear cell antigen (PCNA)

PCNA ist ein Protein, das als Antigen im Kern sich vermehrender Zellen nachgewiesen werden kann. Entdeckt wurde das Protein, weil es als Antigen mit Autoantikörpern im Serum von Patienten mit Lupus erythematodes reagierte. Bei dieser Erkrankung entwickeln betroffene Patienten Autoantikörper gegen Komponenten der im Zellkern befindlichen Ribonucleoproteinpartikel (snRNP), die sich dann in Gefäßen und Geweben, besonders in der Niere, ablagern und zu Entzündungen führen. Letztlich führt dies zur Sklerosierung und zum Funktionsverlust des Organs. Dabei werden insbesondere sich teilende und transkriptionsaktive Zellen betroffen. Eine kausale Therapie gibt es nicht; Todesursache ist häufig Nierenversagen. Viele Lupuspatienten haben auch Antikörper gegen andere nucleäre Antigene der Chromosomen wie PCNA. Man fand heraus, dass PCNA besonders in proliferierenden Zellen vorkommt. Dass es bei der Replikation mitwirkt, wurde erst später klar.

MERKE

Die Replikationsmaschine bei Prokaryonten ist ein Komplex aus der DNA-Polymerase III und mindestens neun weiteren Untereinheiten (Polymerase-III-Holoenzym). Eine besondere Untereinheit ist die -Klammer (bei Prokaryonten), die auch Gleitring genannt wird. Sie trägt zur hohen Prozessivität und Synthesegeschwindigkeit der Polymerasen bei. Der Gleitring bei Eukaryonten wird PCNA genannt.

Regulation der Replikation

Für das Überleben von Zellen höherer Eukaryonten ist es von größter Bedeutung, dass die Replikation der DNA nur in der S-Phase (Synthesephase) des Zellzyklus stattfindet und jeder Abschnitt des Genoms exakt einmal pro Zyklus repliziert wird. Es muss also einen Mechanismus geben, der verhindert, dass die Replikation an einer bereits verdoppelten Stelle ein zweites Mal beginnt. Unser Wissen über die Mechanismen der Regulation der Replikation ist relativ dürftig und stammt überwiegend aus Experimenten mit Tierviren (z.B. SV-40-Virus) und Hefe, doch gibt es gute Hinweise darauf, dass die grundlegenden Mechanismen auch für menschliche Zellen Gültigkeit besitzen.
Ein Ori, an dem die Replikation in Gang kommen soll, muss zuvor mehrere Zustände durchlaufen. Einige Schritte, die sich nach heutiger Kenntnis an einem Replikationsursprung in einer Hefezelle abspielen, zeigt Abb. 11.19. Am Ende eines jeden Zellzyklus werden an den Replikationsursprüngen Proteine gebunden, welche die DNA-Sequenz der Ori spezifisch erkennen; es bildet sich ein Komplex aus, der ORC (origin recognition complex) genannt wird. Dieser wird auch als molekulare Landeplattform bezeichnet, denn er bindet die Proteine, die später für die Initiation der Replikation gebraucht werden. Erinnern wir uns daran, dass die Anwesenheit eines ähnlichen Komplexes auf der DNA von E. coli den bakteriellen Ori im Elektronenmikroskop überhaupt erst sichtbar gemacht hat (Abb. 11.16a).
Wenn die Teilung der eukaryontischen Zelle eingeleitet wird, wird dieser Komplex durch zusätzliche Proteine erweitert (u.a. Mcm2 – Mcm7; Cdc6), die den Ori für die Replikation vorbereiten: Mcm-Proteine sind Helicasen und trennen den DNA-Doppelstrang auf. Diesen Komplex nennt man Präreplikationskomplex, der neben der Helicaseaktivität auch die Funktion einer Andockstelle für weitere Proteine besitzt. Diese Fähigkeit wird durch Cdc6 dem Komplex vermittelt. Kurz vor Eintritt der Zelle in die DNA-Synthese-Phase (S-Phase) rekrutiert der Komplex weitere Proteine, u.a. eine cyclinabhängige Protein-Kinase (Cdk; in Hefe Cdc7 genannt), die nach einem Signal den Präreplikationskomplex durch Phosphorylierung von Proteinen aktiviert. Nachdem darauf die Replikation begonnen hat, wandern die Proteine des Präinitiationskomplexes (Mcm2 – Mcm7; Cdc6 etc.) mit der Gabel, bis zwei Replikationsgabeln aneinanderstoßen und damit die DNA-Synthese beendet wird. Danach werden die Proteine des Präreplikationskomplexes abgelöst.
Die erwähnte Protein-Kinase Cdc7 bleibt bis zur Mitosephase aktiv und hat eine zweite Funktion: Sie unterdrückt während der gesamten S-Phase die Ausbildung eines neuen Präreplikationskomplexes. Damit ist ausgeschlossen, dass während desselben Zyklus eine zweite Initiation stattfinden kann. Ein neuer Präreplikationskomplex wird erst wieder aufgebaut, wenn die Zelle erneut in den Teilungszyklus eintritt.

MERKE

Für das Überleben der Zelle ist es von größter Bedeutung, dass die Replikation auf die S-Phase des Zellzyklus beschränkt und jeder Abschnitt des Genoms nur einmal pro Zyklus repliziert wird.

Das Telomerproblem

Telomere sind Endabschnitte der linearen eukaryontischen Chromosomen. Die Replikation der Telomere führt zu einem Dilemma: Am 5'-Ende des Folgestrangs entsteht ein ungepaartes Stück DNA, wenn der RNA-Primer entfernt wird (Abb. 11.20). Diese Lücke kann nicht, wie im Inneren der Chromosomen, von der DNA-Polymerase I aufgefüllt werden, da das freie 3'-OH Ende fehlt. Bei der nächsten Replikationsrunde wird der eine Tochterstrang um diese fehlenden Nucleotide kürzer, denn die Matrize ist um die Länge des Primers verkürzt worden. Diese Situation wiederholt sich bei jeder Replikationsrunde, sodass mit jeder Zellteilung an den Chromosomenenden DNA verloren geht.
Der Verlust längerer Abschnitte der DNA an den Chromosomenenden kann zur Instabilität führen und apoptotische Prozesse (den programmierten Zelltod) auslösen. Das Telomerproblem wird als ein wichtiger Grund angesehen, warum Zellen nicht unbegrenzt teilungsfähig sind. Telomerverkürzungen charakterisieren somit eine wichtige Komponente des Alterungsprozesses von Zellen und Individuen.
Die Telomerase
Keimbahnzellen dürfen in ihrem DNA-Bestand nicht gefährdet werden. In diesen Zellen wird der Verlust terminaler DNA-Sequenzen verhindert. Der Prozess beruht auf der Tatsache, dass sich an beiden Enden aller Chromosomen eine spezialisierte DNA-Sequenz befindet, die aus häufigen Wiederholungen des Hexanucleotids GGGTTA mit einer Gesamtlänge von meist mehreren 1000 Nucleotiden besteht. Diese Struktur wird als Telomerrepeat bezeichnet. Dieses besondere Sequenzmotiv ermöglicht die Verlängerung der Chromosomenenden, die von einer besonderen reversen Transkriptase, der Telomerase, bewerkstelligt wird. Enzyme, die eine RNA-Matrize benutzen, um DNA zu synthetisieren, werden reverse Transkriptasen genannt.
Die Telomerase ist insofern eine besondere reverse Transkriptase, weil sie ihre eigene Matrize mit sich bringt. Die Telomerase enthält eine RNA, welche die Sequenz 3'-AUCCCAAU-5' enthält (Abb. 11.20). Diese Sequenz ist komplementär zum parentalen Strang des Telomers (GGGTTA). Mit dem ersten AU bindet die Telomerase an das letzte TA am 3'-Ende des elterlichen DNA-Strangs und verlängert die DNA mithilfe der mitgebrachten Matrize um die Sequenz 5'-GGGTTA-3'. Danach rutscht die Telomerase wieder an das Ende der DNA und wiederholt diesen Vorgang. Bei jedem Schritt wird das Chromosomenende um sechs Nucleotide verlängert. Nach mehreren Wiederholungen ist ein langer einzelsträngiger Überhang vorhanden.
Wie danach der Gegenstrang synthetisiert wird, ist nicht bekannt. Eine mögliche Vorstellung ist, dass mit der Verlängerung des Leitstrangs genug Platz für die Primaseaktivität der DNA-Polymerase geschaffen wurde, um einen Primer und nachfolgend DNA zu synthetisieren. Damit wäre das Chromosomenende wieder vervollständigt.

Klinik

Telomeraseaktivität in Tumorzellen

Außer in Keimbahnzellen, wo im Gegensatz zu Somazellen eine Verkürzung der Chromosomenenden nicht toleriert wird, konnten hohe Aktivitäten an Telomerase v.a. in transformierten Zellen (Tumorzellen) gemessen werden. Diese Beobachtung lässt den – allerdings nicht unumstrittenen – Schluss zu, dass transformierte Zellen deshalb unbegrenzt teilungsfähig sind, weil sie den Verlust terminaler DNA-Sequenzen in ihren Chromosomen durch Anwesenheit der Telomerase kompensieren können. Somit böte die Telomerase einen Ansatzpunkt für die Therapie maligne entarteter Zellen.

MERKE

Bei der Replikation der Endabschnitte linearer Chromosomen (Telomere) entsteht ein Problem: Mit jeder Zellteilung werden Chromosomen in Körperzellen (Somazellen) kürzer. Diese Verkürzung limitiert die Teilungsfähigkeit von Somazellen und damit vermutlich die Lebensdauer von Organismen. In Keimbahnzellen und vielen Tumorzellen werden die Chromosomenenden jedoch von einem Enzym, der Telomerase, wieder vervollständigt. Die Telomerase ist eine reverse Transkriptase, die keine Matrize braucht, weil sie ihre Matrize (eine RNA) selbst mitbringt.

Verpackung der DNA

Chromatin und Histone

Chromatin
Die DNA eukaryontischer Zellen liegt nicht nackt vor. Sie ist mit diversen Proteinen, hauptsächlich mit den basischen Histonen, assoziiert. Der Komplex aus DNA und Protein wird wegen seiner spezifischen Färbbarkeit Chromatin genannt.
Chromatin liegt in verschiedenen Organisationsformen vor: In Zellkernen, die sich in der Interphase befinden, erscheint es als eine lichtmikroskopisch unsichtbare amorphe Masse. Kurz vor Eintritt der Zelle in die Mitose beginnt sich das Chromatin zu lichtmikroskopisch erkennbaren, kompakten Faserstrukturen zu organisieren. In der Metaphase werden in menschlichen Zellen 46 Chromosomen als klar abgrenzbare Einheiten der Organisationsform der DNA sichtbar. Es ist anzunehmen, dass es die enorme Länge der DNA erfordert, dass das menschliche Genom in mehrere Chromosomen unterteilt ist und nicht, wie bei Bakterien, ein zusammenhängendes Molekül bildet. Die Gesamtlänge der DNA aller 46 Chromosomen beträgt insgesamt ca. 2 m.
Wie lassen sich so lange Fäden in den Zellkern packen, eine Kugel von nur 10 m Durchmesser? Die Verpackung muss einerseits sehr dicht sein, andererseits muss sie einen hohen Grad an Ordnung aufweisen. Es ist wesentlich, dass spezifische Abschnitte der DNA für die Transkriptions- und Replikationsmaschinerie stets zugänglich gemacht werden können. Es dürfte plausibel erscheinen, dass ein planloses Hineinstopfen der DNA in den Zellkern keine geeignete Organisationsform darstellt, genauso wenig wie für eine kilometerlange Schnur, die nicht ordentlich aufgespult, sondern in einen Karton gestopft wurde.
Das maximal kondensierte Chromosom 1 des Menschen hat eine Länge von etwa 10 m. Um die ca. 9 cm lange DNA auf 10 m zu komprimieren, muss sie etwa um den Faktor 10.000 verdichtet werden. Einfache Faltung oder ein Aufspulen wie bei einer Schnur lässt die stark negativ geladene DNA wegen der elektrostatischen Abstoßung der Phosphatgruppen nicht zu. An der Verpackung von DNA zu Chromatin sind daher basische Proteine beteiligt, die Histone, die die negativen Ladungen der DNA teilweise neutralisieren.
Histone
Die hauptsächliche Proteinkomponente des Chromatins bilden die basischen Histone. Histone findet man in allen Eukaryonten. Man unterscheidet zwischen den Kernhistonen H2A, H2B, H3 und H4 mit Molekülmassen zwischen 11 und 16 kDa und dem Linker-Histon H1 mit einer Molekülmasse von 21 kDa. Die Kernhistone falten sich so, dass sie eine zentrale globuläre Domäne mit einem C-terminalen und einem positiv geladenen N-terminalen Arm bilden (Abb. 11.21). Die positive Ladung der Arme beruht auf der Anwesenheit mehrerer Arginin- (im Einbuchstabencode: R) und Lysinreste (K).

Schon gewusst

Histone gehören zu den am besten konservierten Proteinen. Zwischen den Aminosäuresequenzen des Histons H4 aus Rind und Erbse, die beide 102 Aminosäuren lang sind, bestehen nur zwei unwesentliche Unterschiede. Die Aminosäuresequenz von H4 hat sich demnach seit mehr als 1 Mrd. Jahren, seit der Divergenz von Pflanzen und Tieren, fast nicht verändert. Offensichtlich lastet ein starker Selektionsdruck auf diesen Proteinen, weil vermutlich auch kleinere Änderungen dazu führen, dass fundamentale Funktionen der Histone bei der Organisation der DNA zu den verschiedenen Formen von Chromatin und Chromosomen beeinträchtigt wären.

MERKE

Das eukaryontische Genom liegt im Zellkern als Chromatin verpackt vor. An der Verpackung sind v.a. kleine basische Proteine, die Histone, beteiligt. Histone neutralisieren die negativen Ladungen der DNA. Neben einer globulären Domäne besitzen die Histone H2A, H2B, H3 und H4 einen frei beweglichen N-terminalen Arm, der vielfachen enzymatischen Modifikationen, wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, ADP-Ribosylierung und Ubiquitinierung, unterliegt.

Aufbau des Chromatins

Nucleosomen als Grundbausteine der Chromatinstruktur
Je zwei Moleküle der vier Kernhistone lagern sich zu einem Komplex zusammen, dem sog. Histon-Oktamer, um das sich 146 Basenpaare der DNA-Kette unter Bildung eines Nucleosomenkerns (engl. nucleosome core particle) wickeln (Abb. 11.22). Zwei Nucleosomenkerne sind durch eine Verbindungs-DNA (Linker-DNA) miteinander verbunden. Im Gegensatz zu den konstant 146 Basenpaaren im Kern ist die Länge der DNA im Verbindungsstück (Linker) ziemlich variabel; sie schwankt zwischen 20 und 100 Basenpaaren.
Das eigentliche Nucleosom besteht aus dem Nucleosomenkern und einem Teil der Linker-DNA. Höhere Eukaryonten besitzen ein weiteres Histon, das Histon H1. Dieses ist sowohl mit der Linker-DNA (deswegen auch Linker-Histon genannt) als auch mit dem Nucleosomenkern assoziiert. Es ist an der Stelle lokalisiert, an der die DNA in den Nucleosomenkern eintritt und ihn nach zwei Windungen wieder verlässt. Hier klammert H1 die DNA an den Nucleosomenkern und trägt zu einer weiteren Stabilisierung des Nucleosoms bei. H1 ist besonders für die Ausbildung der nächsthöheren Verpackungsstruktur, der 30-nm-Faser, wichtig; einfache Eukaryonten, wie die Hefe, haben kein H1 und bilden auch keine 30-nm-Faser aus.

Schon gewusst

Protamine

Nicht die gesamte menschliche DNA ist in Nucleosomen verpackt. Eine Ausnahme bildet das kleine ringförmige Genom der Mitochondrien. Aber auch bei der Verpackung der DNA in Spermien werden keine Nucleosomen gebildet. Die besonders kompakte Struktur wird in Spermien durch andere basische Proteine, nämlich durch Protamine, bewerkstelligt. Einzelheiten der Struktur sind nicht bekannt.
Chromatinfilamente und eine dichter gepackte Faserstruktur
Isoliertes Chromatin aus einer Zelle in der Interphase ist im Lichtmikroskop unsichtbar. Im stärker auflösenden Elektronenmikroskop zeigt sie eine an Perlenketten erinnernde, aus Nucleosomenkernen und Verbindungs-DNA bestehende Filamentstruktur mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 11 nm (Abb. 11.23). Diese Filamentstruktur bildet sich unter unphysiologischen Bedingungen, nämlich bei sehr niedriger Ionenstärke, aus. Unter physiologischen Bedingungen geht die Filamentstruktur spontan in eine kompaktere Faser mit einem Durchmesser von 30 nm (Abb. 11.23) über. Wie diese zustande kommt, ist nicht klar. Nach einer von zwei gängigen Vorstellungen sind die Nucleosomen selbst um eine Achse gewunden und bilden eine Spirale, der man den Namen Solenoid (engl. solenoid Spule, Magnetspule) verlieh. Eine Windung des Solenoids besteht im Durchschnitt aus sechs Nucleosomen. Sie hat einen Durchmesser von 30 nm. Die Ausbildung dieser kompakteren Chromatinstruktur erfordert die Anwesenheit des Histons H1. Eine neuere Vorstellung ist, dass Nucleosomen zickzackartig gefaltet werden und dadurch die 30-nm-Faserstruktur ausbilden. Auch für dieses Modell ist die Anwesenheit von H1 nötig.
Der überwiegende Teil des Chromatins liegt in Form der kompakteren 30-nm-Faser-Struktur vor, die in Zellkernen in der Interphase, besonders aber in Metaphasechromosomen, weiter zu Strukturen höherer Ordnung gefaltet ist. Wenige Prozent des Chromatins jedoch scheinen in locker verpackter Form als 11-nm-Filament vorzuliegen. Man vermutet, dass Chromatin während der Transkription diese Form annimmt. Unter physiologischen Bedingungen könnte diese locker verpackte Form durch Modifizierung der Histone entstehen.

MERKE

Die Struktur aus DNA und Histonen sowie anderen Proteinen wird Chromatin genannt. Der Grundbaustein des Chromatins ist das Nucleosom, bestehend aus dem Nucleosomenkern und Verbindungs-DNA (Linker-DNA). Der Nucleosomenkern (core particle) setzt sich aus einem Histon-Oktamer (H2A, H2B, H3, H4)2 zusammen, um das 146 Basenpaare der DNA gewickelt sind. Histon H1 bindet an die Linker-DNA. Das Aufwickeln der DNA um Histon-Oktamere unter Bildung von Nucleosomen stellt die unterste Stufe der Verpackung von DNA zu Chromatin dar. In der zweiten Stufe organisieren sich die Nucleosomen zu einer 30 nm dicken Faser. In beiden Stufen wurde die DNA jeweils um den Faktor 7, also insgesamt ca. 50fach, verkürzt.

Faltung der 30-nm-Faser zu Schleifen
Wie die 30-nm-Faser zu Strukturen höherer Ordnung gefaltet wird, ist im Detail noch offen. Es gibt Hinweise dafür, dass die 30-nm-Faser in Schleifen organisiert ist, die von einer zentralen Achse ausgehen (Abb. 11.24d). In der Interphase könnte dies bereits die höchste Stufe der Verpackung der DNA sein. Lichtmikroskopisch sind diese Strukturen noch nicht sichtbar, denn die Schleifen bestehen aus einem nur 30 nm dicken Faden in einer lockeren Formation. Erst eine dichtere Packung der Schleifen selbst würde zu mikroskopisch sichtbaren Strukturen führen.
Anordnung der Schleifen in Chromosomen
Ein Modell für die nächsthöhere Ebene der Organisation, die mit dem Eintritt in die Mitose erfolgt, schlägt vor, dass dieStämme der Schleifen spiralenförmig aufgewickelt werden. Dadurch entsteht eine zentrale Achse, von der die Schleifen radial nach außen ragen – etwa wie die Schaufeln einer Turbine. Dieses Modell wird deshalb als Radial-loop-Modell bezeichnet (Abb. 11.24e). Das Radial-loop-Modell ist aber nur eines von mehreren möglichen Modellen. Eine dichte Anordnung der Schleifen würde im Lichtmikroskop als ein langer Faden mit unregelmäßiger Oberfläche erscheinen (sog. Lampenbürstenchromosomen, Abb. 11.25). Diese hätte eine geschätzte Dicke von 700 nm und wäre damit bereits lichtmikroskopisch erkennbar. Der postulierte Faden könnte sich durch weitere Faltung oder Spiralisierung zu Metaphasechromosomen formieren (Abb. 11.24f).

Schon gewusst

Lampenbürstenchromosomen

Für das Radial-loop-Modell spricht u.a. die Existenz der sog. Lampenbürstenchromosomen (Abb. 11.25). Diese stellen eine spezielle Chromosomenform dar, die sich in der meiotischen Prophase von Oozyten einer Reihe von Wirbeltieren und Wirbellosen ausbildet. Sie ist besonders bei Amphibien und Fliegen gut darstellbar. Diese Form der Chromosomen ist durch einen langen Faden mit unregelmäßiger Oberfläche charakterisiert. Aus diesem Faden treten lange Schleifen heraus. Die Deutung der Struktur der Schleifen von Lampenbürstenchromosomen erscheint zunächst widersprüchlich. Man nimmt an, dass einige wenige Chromatinschleifen in einer aufgelockerten Form als 11-nm-Filament vorliegen und sich daher weit aus dem zentralen Faden ausstülpen. Diese sollten allerdings lichtmikroskopisch unsichtbar sein. Dass diese Schleifen trotzdem sichtbar werden, verdanken sie einem besonderen Umstand. In den Schleifen findet eine intensive Transkription statt mit vielen gleichzeitig arbeitenden RNA-Polymerasen, die immer länger werdende, dicht mit Protein verpackte RNA-Moleküle synthetisieren. Es sind wohl die dicht beieinanderliegenden Ribonucleoproteinkomplexe, die den Schleifen eine im Lichtmikroskop erkennbare Kontur verleihen.

MERKE

Die Kette aus Nucleosomen kann diverse Strukturen steigender Packungsdichte annehmen: das 11-nm-Filament, die 30-nm-Faserstruktur und höhere Organisationsformen. Letztere sind in ihren Einzelheiten noch nicht aufgeklärt; ein anschauliches Modell postuliert die Faltung der 30-nm-Faser zu Schleifen. In der Mitose werden die Schleifen über weitere Stufen der Kompaktion zu den lichtmikroskopisch sichtbaren Chromosomen verdichtet.

Chromatin-Remodelling

Bisher haben wir diskutiert, wie die enorme Menge an DNA so gefaltet werden kann, dass sie innerhalb der Begrenzungen eines Zellkerns Platz findet. Jetzt müssen wir uns mit der Frage beschäftigen, wie spezifische Stellen des verpackten Genoms, wie etwa Promotoren inaktiver Gene, Replikationsursprünge, schadhafte Stellen in der DNA etc. den relevanten Proteinen zugänglich gemacht werden können. Dafür gibt es verschiedene Enzyme, die offensichtlich in der Lage sind, unter physiologischen Bedingungen bestimmte Abschnitte des Chromatins reversibel zugänglich zu machen. In den letzten Jahren des 20. Jahrhunderts wurden die Histon-Acetyltransferasen, Histon-Deacetylasen und Chromatin-Remodellierungskomplexe entdeckt, die offensichtlich diese Funktionen erfüllen.
Modifikation der Histone
Der N-terminale Arm der Histone unterliegt diversen Modifizierungen. So werden spezifische Lysinreste acetyliert, andere methyliert. Serin und Threonin in bestimmten Positionen einzelner Histone werden phosphoryliert. Eine andere Modifizierung von Histonen ist die ADP-Ribosylierung. Dabei wird aus NAD+ Nicotinamid abgespalten, und der ADP-Ribosylrest wird auf das Protein übertragen.
Eine Modifikation von H2A und H2B kann auch durch Ubiquitin erfolgen. Ubiquitin, ein aus 79 Aminosäuren bestehendes Peptid, kann über seine C-terminale Carboxylgruppe mit einem spezifischen Lysinrest im jeweiligen Histon verknüpft werden. Die Verknüpfung von Proteinen mit Ubiquitin führt normalerweise zum Abbau des Proteins über das Proteasom (Kap. 17.5). Dies ist jedoch bei den beiden genannten Histonen nicht der Fall. Die Modifizierung hat offenbar andere Funktionen.
Die Acetylierung der vier Kernhistone erfolgt in allen untersuchten Pflanzen und Tieren. Der hauptsächliche Angriffspunkt für die Histon-Acetylierung sind die Lysinreste in den stark basischen N-terminalen Armen der Kernhistone (Abb. 11.21). Jede Acetylgruppe vermindert die positive Ladung der Histonarme um eine Einheit (unten). Die genaue Funktion der verschiedenen Histonmodifizierungen ist noch nicht geklärt. Man weiß jedoch, dass modifizierte Histone von Proteinen erkannt werden. Proteine, die an modifizierte Histone spezifisch binden, dürften mannigfaltige Funktionen bei der Replikation, Transkription, Rekombination oder Reparatur ausüben.
Histon-Acetylierung und -Deacetylierung
Histon-Acetyltransferasen
Aus Säugerzellen wurden mehrere Histon-Acetyltransferasen (HAT) isoliert, die Acetylgruppen von Coenzym A (CoA) auf Lysinreste von Histonen übertragen. Diese Acetylasen können Histone, die in Nucleosomen eingebaut sind, an spezifischen Positionen im basischen N-terminalen Arm acetylieren.
Welche Folgen hat diese Modifizierung der Histone? Jede Acetylierung eines Lysinrests trägt zur Neutralisierung einer positiven Ladung des Histons bei. Dadurch können elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der negativ geladenen DNA und dem positiv geladenen Histon aufgehoben und damit die Bindung geschwächt werden. Möglich ist aber auch eine Lockerung von Wechselwirkungen zwischen Histonen untereinander oder zwischen dem modifizierten Histon und anderen Proteinen im Chromatin.
Die Lockerung starker Wechselwirkungen zwischen DNA, Histonen und anderen Proteinen führt zu einer weniger kompakten Chromatinstruktur und einer besseren Zugänglichkeit von Komponenten der Transkriptionsmaschinerie an Promotoren bzw. Enhancern. Mit diesem einfachen Modell im Einklang steht, dass Nucleosomen in transkriptionell aktiven Chromatinbereichen häufig hyperacetyliert sind.
Histon-Deacetylasen
Histon-Deacetylasen (HDAC) sind Enzyme, die Acetylgruppen von Histonen hydrolytisch abspalten. Damit können Acetylierungen rückgängig gemacht werden. Dies hat zur Folge, dass die betroffenen Histone eine positive Ladung mehr besitzen und dadurch eine stärkere Bindung zu DNA, anderen Histonen oder Proteinen eingehen. Insgesamt werden durch Deacetylierung die Chromatinstruktur verdichtet, die Zugänglichkeit für regulatorische Proteine erschwert und Gene reprimiert.
Der Histoncode
Es wurde beobachtet, dass acetylierte Histone, meist im Kontext mit anderen spezifischen Modifizierungen (Methylierung, Phosphorylierung, Polyadenylierung oder Ubiquitinierung), von diversen Proteinen spezifisch erkannt und mit hoher Affinität gebunden werden. Modifizierte Histonarme werden also zu Andockstellen für Proteine. Ähnlich wie die Phosphorylierung von Tyrosinresten des Insulinrezeptors zu einer Andockstelle für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) wird (Kap. 22.4.3), kann eine Acetylierung spezifischer Lysinreste in Histonarmen ebenfalls zu einer Andockstelle für wichtige Proteine werden. Dies bedeutet, dass die Modifizierung der beweglichen Histonarme, analog zur Phosphorylierung von Tyrosinresten in Rezeptorproteinen, Teil eines Signaltransduktionswegs ist.
Solch ein Signalweg könnte wie folgt aussehen: Ein internes oder von außen auf die Zelle wirkendes Signal führt zu der Aktivierung einer spezifischen Histon-Acetyltransferase. Diese modifiziert spezifisch Lysinreste in Histonen. Das spezifische Modifizierungsmuster stellt ein verschlüsseltes Signal dar, das von spezifischen Proteinen entschlüsselt werden kann. Nach Bindung von Proteinen, die das Modifizierungsmuster erkennen, können weitere Proteine aktiviert oder inaktiviert werden.Letztlich führt die Histonmodifikation zur Aktivierung oder Inaktivierung von Genen, zur Reparatur geschädigter DNA und vielem mehr.
Es konnte gezeigt werden, dass Acetylierung des Histons H3 am Lysinrest in Position 14 durch eine spezifische Histon-Acetyltransferase mit der Transkription einiger Gene korreliert. Acetylierung von Histon H4 in Positionen 5 und 11 korreliert mit der Bildung neuer Nucleosomen während der Replikation. Andere Histonmodifizierungen, wie Phosphorylierung von H1 und H3 an bestimmten Serinresten, korrelieren mit der Kondensation von Chromatin während der Mitose. Diese Beobachtungen zeigen, dass Histonmodifizierungen nicht pauschal durch Auflockerung oder Kondensation der Chromatinstruktur wirken, sondern über die Bindung spezifischer Proteine mit besonderen Funktionen.
Rekrutierung von Histon-Acetyltransferasen und -Deacetylasen
Eine interessante Beobachtung ist, dass sowohl Histon-Deacetylasen als auch Histon-Acetyltransferasen häufig von Cofaktoren der Transkription rekrutiert werden. Histon-Acetyltransferasen binden an sog. Coaktivatoren (Coaktivatoren der Transkription; Kap. 12.7), sie können sogar integraler Bestandteil dieser Faktoren sein und führen letztlich zur Aktivierung der Genexpression. Histon-Deacetylasen hingegen sind häufig mit sog. Corepressoren der Transkription verbunden und tragen zur Repression von Genen bei.

Klinik

Defekte von Histon-Acetyltransferasen können Krebs verursachen

Histon-Acetyltransferasen spielen auch eine Rolle bei der Kontrolle des Zellzyklus. Von medizinischer Relevanz ist der Befund, dass gewisse Mutationen in einer der Histon-Acetyltransferasen mit der Bezeichnung p300 zu kolorektalen und anderen gastrointestinalen Karzinomen führen.
Chromatin-Remodellierungskomplexe
Chromatin-Remodellierungskomplexe (ChRC) sind aus mehreren Enzymen und anderen Proteinen zusammengesetzte molekulare Maschinen, die – ähnlich wie Histon-Acetyltransferasen und -Deacetylasen – die Zugänglichkeit von regulatorischen Proteinen an die dicht verpackte DNA erleichtern oder gar erst ermöglichen. Nach ihrer Entdeckung Anfang der 90er Jahre des 20. Jahrhunderts sind Dutzende dieser Maschinen aus etlichen Organismen isoliert und charakterisiert worden. Sie werden überall dort gebraucht, wo Chromatin als Substrat dient: bei der Genregulation, der Replikation, Reparatur, Rekombination und Translokation der DNA.
Die Remodellierungskomplexe enthalten alle eine ATPase als Untereinheit, die offenbar die Energie der ATP-Hydrolyse ausnutzt, um lokal die Struktur des Chromatins zu verändern. Die ATPase-Untereinheit scheint daher als der Motor des Komplexes zu fungieren. Andere Untereinheiten haben andere Funktionen, wie etwa die Erkennung von Andockstellen und vieles mehr.
Rekrutierung und Funktion
Über viele Jahre dachte man, dass Chromatin-Remodellierungskomplexe an Chromatin in einer nicht zielgerichteten Weise binden und anschließend entlang dem Filament wandern, wie dies auch DNA-Reparaturkomplexe tun. In einem solchen Modell würde eine aufgelockerte Chromatinstruktur nur vorübergehend existieren, es sei denn, diese würde von Proteinen, wie z.B. den Reparaturkomplexen, Rekombinations- und Replikationskomplexen oder Transkriptionsfaktoren, stabilisiert. Heute weiß man, dass sie mithilfe ihrer vielen Proteinuntereinheiten an zahlreiche DNA-bindende Proteine, Transkriptionscofaktoren, methylierte DNA, acetylierte Histonarme oder Actinfilamente des Zellkerngerüsts im Chromatin binden (Abb. 11.26).
Die Wirkung der Chromatin-Remodellierungskomplexe im Einzelnen ist vielschichtig (Abb. 11.27). Es konnte nachgewiesen werden, dass sie an Nucleosomen binden und unter ATP-Hydrolyse die Bindung zwischen DNA und dem Histon-Oktamer vorübergehend lockern. Was anschließend passiert, hängt von den spezifischen Eigenschaften des Remodellierungskomplexes ab: Es kann zu einer Verschiebung der DNA entlang dem Histon-Oktamer kommen (Abb. 11.27, Schritt 3a). Im gelockerten Zustand kann eines der Histone gegen eine seltene Histonvariante ausgetauscht werden mit Konsequenzen für die Faltung des Chromatins und Zugänglichkeit der DNA-Sequenz (Schritt 3b). Nachgewiesen ist auch eine komplette Übertragung eines Histon-Oktamers auf eine andere Stelle in der DNA (Schritt 3c), wodurch ein kurzer Abschnitt der DNA frei von Histonen bleibt. In all diesen Fällen ändert sich die Zugänglichkeit der DNA für Proteine.

Schon gewusst

Defekte in Chromatin-Remodellierungskomplexen führen zu Erkrankungen

Mutationen in Genen für Chromatin-Remodellierungskomplexe können zu schweren klinischen Symptomen führen. Das sog. BRG1-Protein ist die ATPase-Untereinheit mehrerer Chromatin-Remodellierungskomplexe, die für die Expression von nahezu 100 Genen eine bedeutende Rolle spielt. BRG1 bindet an Proteine wie p53 (Tumorsuppressor), Cyclin E (Zellzyklusregulator) und BRCA1 (ein Protein, dessen Mutationen bei Frauen zu Brust- und Gebärmutterkrebs führen). Erbliche Mutationen im Gen für BRG1 führen zu verschiedenen Tumoren, bei Kleinkindern etwa zu Tumoren des Gehirns und der Niere.

MERKE

Das als Chromatin dicht gepackte eukaryontische Genom muss überall zugänglich sein, um einzelne Gene nach Bedarf zu exprimieren, die DNA zu replizieren, schadhafte DNA zu reparieren etc. Histon-Acetyltransferasen und -Deacetylasen können die N-terminalen Arme der Kernhistone reversibel acetylieren. Histon-Acetylierung im Kontext mit anderen Modifikationen (Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, ADP-Ribosylierung etc.) führt zur Schaffung von Erkennungsstellen für Proteine (Histoncode), die an die modifizierten Stellen binden und durch Veränderung der Chromatinstruktur die o.g. Funktionen einleiten oder fördern. Chromatin-Remodellierungskomplexe verändern ebenfalls, häufig in Zusammenwirkung mit Histon-Acetyltransferasen und -Deacetylasen, die Chromatinstruktur und damit die Zugänglichkeit.

Organisation von Genen und Genomen

Aufbau von Genen

Ein Gen ist ein Abschnitt auf der DNA, der für ein bestimmtes Protein oder eine biologisch aktive RNA kodiert. Zu einem Gen gehört aber auch jener Abschnitt auf der DNA, an den die RNA-Polymerase bindet und an der die Initiation der Transkription reguliert wird. Solche Abschnitte werden Promotoren genannt. Einfache prokaryontische Gene bestehen also aus dem kodierenden Abschnitt und einem Promotor unmittelbar davor. Die Gene von Eukaryonten werden jedoch wesentlich komplizierter reguliert als die der Prokaryonten, u.a. von DNA-Elementen, die weit entfernt von den kodierenden Abschnitten eines Gens liegen können. Daher ist ein eukaryontisches Gen in seinem Aufbau komplexer als ein prokaryontisches.
Komplexität eukaryontischer Gene
Zwar werden auch eukaryontische Gene durch Promotoren reguliert, doch wird hier die Aktivität des Promotors selbst von weiteren Elementen beeinflusst, die, je nachdem, ob sie die Promotoraktivität verstärken oder abschwächen, als Enhancer bzw. Silencer bezeichnet werden. Wie oben schon erwähnt, können Enhancer und Silencer weit weg von den kodierenden Abschnitten der Gene liegen. In einigen Fällen fand man solche Stellen 1000 Basenpaare stromauf- (entgegen der Transkriptionsrichtung) oder stromabwärts von der kodierenden Region, häufig auch in Introns (unten). Daher ist der gesamte DNA-Abschnitt, der somit zum eigentlichen Genbereich gehört, bei eukaryontischen Genen Tausende von Nucleotiden länger als bei Prokaryonten.
Zur Komplexität der molekularen Definition eines Gens kommen noch andere Besonderheiten hinzu. Bei menschlichen Genen kann derselbe DNA-Abschnitt mehr als ein Protein verschlüsseln. Die Mechanismen sind mannigfaltig. Wenn Gene von mehreren Promotoren aus transkribiert werden, können sie unterschiedliche N-Termini besitzen. Die Benutzung unterschiedlicher Polyadenylierungssignale kann zu unterschiedlichen 3'-Termini, folglich beim Protein zu unterschiedlichen C-Termini, führen. Der häufigste Fall ist jedoch, dass von einem Gen zunächst eine einzige mRNA-Vorstufe gebildet, diese aber anschließend unterschiedlich prozessiert wird. Dadurch können aus einer Vorstufe unterschiedliche funktionelle mRNA-Moleküle und folglich unterschiedliche Proteine entstehen. Derselbe Abschnitt einer Nucleinsäure kann auch in verschiedenen Leserastern gelesen werden und somit zur Bildung von zwei oder drei unterschiedlichen Proteinen führen. Dies kommt zwar beim Menschen sehr selten vor (Abb. 11.30), ist jedoch bei Viren des Öfteren der Fall.

MERKE

Gene bilden die kleinsten funktionellen Einheiten im Genom eines Organismus. Sie enthalten in verschlüsselter Form die Information, die zur gewebs- und entwicklungsspezifischen Bildung eines Proteins oder einer biologisch aktiven RNA notwendig ist, also neben den kodierenden Abschnitten auch alle weiteren Elemente, die die Gene regulieren.

Exons und Introns
Die meisten Proteine in Bakterien werden von einem durchgehenden Stück DNA kodiert. Im Gegensatz dazu ist in den meisten eukaryontischen Genen die kodierende Sequenz von nichtkodierenden Abschnitten, den sog. Introns, unterbrochen (Abb. 11.28). Kodierende Sequenzen, die sog. Exons, bilden bei Eukaryonten, von wenigen Ausnahmen abgesehen, keinen zusammenhängenden Abschnitt auf der DNA. Der kodierende Bereich, also die Summe der Exons, macht meist sogar nur einen Bruchteil der gesamten Länge eines Gens aus, denn Introns sind im Allgemeinen deutlich länger als die Exons. Die Länge der Introns schwankt erheblich: Sie können ca. 80 Nucleotide kurz sein, sie können aber auch die beträchtliche Länge von 10.000 oder mehr Nucleotiden erreichen. In seltenen Fällen wurden Introns von 50.000, ja sogar von 80.000 Nucleotiden gefunden. Das längste bekannte menschliche Gen, das DMD-Gen (Duchenne-Muskeldystrophie), ist durch die vielen langen Introns insgesamt 2 Mio. Basenpaare lang und damit etwa viermal länger als das gesamte Genom des Bakteriums Haemophilus influenzae, das gut 3000 Gene besitzt.
Die zuerst gebildete RNA, das Primärtranskript hnRNA, enthält zunächst noch Intron- und Exonsequenzen in der Anordnung der DNA und ist damit erheblich länger als die fertig prozessierte mRNA, die in das Zytosol entlassen wird. Introns werden im Verlauf der Prozessierung aus der RNA ausgeschnitten und die Exons aneinandergefügt. Diesen Vorgang nennt man Spleißen (Kap. 12.9.3). Fehlerhaftes Spleißen führt in der Regel zu einem veränderten Protein.
Es gibt einige wenige menschliche Gene, die nur aus einem einzigen Exon bestehen und deren mRNA deshalb nicht gespleißt werden muss. Dazu gehören z.B. die Histon-Gene und einige Gene, die für Wachstumsfaktoren oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren kodieren.

Schon gewusst

Unterbrochene Gene beschleunigen die Evolution

Komplexe Proteine des Menschen sind aus einzelnen Domänen aufgebaut. Eine Domäne ist ein Abschnitt eines Proteins mit einer bestimmten Funktion. Ein Enzym beispielsweise, das mehrere Metaboliten bindet wie ATP, NADH, eine bestimmte Aminosäure etc., könnte in der Entwicklungsgeschichte durch Zusammenfügen einer ATP-, einer NADH- und einer Aminosäurebindungsdomäne entstanden sein. Diese Hypothese ist wahrscheinlicher als die Alternative, dass die Natur bei jedem Protein, das ATP bindet, eigens eine ATP-Bindungsdomäne erfunden hat. Die Tatsache, dass Proteindomänen mit der gleichen Funktion verwandte Aminosäuresequenzen besitzen, spricht dafür, dass sie, nachdem sie einmal entstanden waren, von mehreren Enzymen genutzt wurden. Häufig, wenn auch nicht immer wird eine Proteindomäne von einem einzigen Exon kodiert. Eine plausible Hypothese besagt, dass in zunehmend komplexeren Organismen die wachsende Zahl an spezifischen Proteinen durch Neuordnung von Exons (exon shuffling) entstanden ist. Dazu müssen Exonsequenzen dupliziert und in einem zweiten Schritt durch DNA-Rekombination im Genom an andere Loci gebracht werden. Die Mischung von Exons ist ein schneller und effizienter Weg, um neuartige Gene zu erzeugen, denn hierbei werden funktionelle Bausteine zusammengefügt.
Introns hingegen sind ausgedehnte Regionen, in denen die DNA verändert, gespalten und rekombiniert werden kann, ohne dass in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle Schaden für die kodierten Proteine entsteht. Die Anwesenheit von Introns ist also eine Voraussetzung dafür, dass eine Neuordnung von Exons stattfinden kann. Es herrscht Konsens darüber, dass die Evolution, gerade wegen der unterbrochenen Gene, sehr viel schneller vorangeschritten ist, als es der Fall gewesen wäre, wenn eukaryontische Gene zusammenhängend wären wie bei Bakterien.

MERKE

Bei Prokaryonten bestehen Gene aus einer zusammenhängenden Sequenz. Eukaryontische Gene hingegen sind gestückelt: Kodierende Sequenzen (Exons) sind durch nichtkodierende Abschnitte (Introns) unterbrochen. Transkribiert werden sowohl Introns als auch Exons. Durch RNA-Spleißen werden die Introns entfernt und die Exons dabei zu einer funktionellen mRNA miteinander verknüpft. Die Organisation eukaryontischer Gene in Exons und Introns beschleunigt die Weiterentwicklung von Organismen, denn die Rekombination von Exons führt zu funktionell neuen Genen. Manche Gene kodieren nicht für Proteine, sondern für funktionelle RNA-Moleküle, wie tRNA oder rRNA.

Organisation von Genen und nichtkodierender DNA im menschlichen Genom
Bei Prokaryonten und einfachen Eukaryonten, wie Hefe, sind die Gene in dichter Folge in den Chromosomen aufgereiht, wobei nur wenige Basenpaare an nichtkodierender DNA zwischen ihnen liegen (Abb. 11.29). In höheren Eukaryonten hingegen, wie beim Menschen, ist der Anteil an kodierender DNA am Gesamtgenom wesentlich geringer. Das Genom des Menschen, mit einer Größe von ca. 3 109 Basenpaaren, reicht theoretisch aus, um 1 Mio. Proteine mit einer durchschnittlichen Länge von 500 Aminosäuren zu verschlüsseln. In Wirklichkeit liegt die Zahl der Gene im menschlichen Genom deutlich niedriger, nach neuerlichen Schätzungen bei maximal 25.000. Daraus ergibt sich, dass mehr als 97% der Nucleotide im menschlichen Genom nicht für Proteine kodieren. Es handelt sich um DNA zwischen Genen oder um Introns. Ein typischer ca. 80 kb (kb Kilobasenpaare) langer Abschnitt aus dem Hefechromosom 3 mit insgesamt 48 Genen ist kompakt organisiert (Abb. 11.29). Im HNF-1-Locus des Menschen dagegen entfallen auf etwa 2000 Basenpaare an kodierender DNA mehr als 100.000 Basenpaare an nichtkodierender DNA. Einige wenige DNA-Abschnitte des Menschen sind etwas dichter mit Genen bestückt: In einem 80 kb langen Abschnitt des menschlichen Chromosoms 11, im -Globin-Locus, befinden sich immerhin fünf aktive Gene und zwei nichtfunktionelle Gene, sog. Pseudogene.

Schon gewusst

Selektionsdruck führt zu hoher Gendichte bei Mikroorganismen

Der bemerkenswerte Unterschied in der Gendichte bei Mikroorganismen und multizellulären Organismen erklärt sich wahrscheinlich aus dem unterschiedlichen Selektionsdruck, dem diese Organismen im Verlauf der Evolution ausgesetzt waren. Mikroorganismen konkurrieren um eingeschränkte Mengen an Nährstoffen in ihrer unmittelbaren Umgebung, und wirtschaftlicher Stoffwechsel kann ein ausschlaggebender Faktor für ihr Überleben sein. Da die Synthese nichtkodierender – daher nichtfunktioneller – DNA zeitraubend und aufwändig ist, bestand offensichtlich ein Selektionsdruck, nichtfunktionelle DNA zu eliminieren. Nicht so bei Säugern und anderen höheren Eukaryonten. Ihr Überleben hängt in erster Linie von ihrem Verhalten ab. Die Energie, die in die DNA-Synthese investiert wird, ist gering im Vergleich zu der Energie, die bewusste Wahrnehmung, andere Tätigkeiten des Nervensystems, Bewegung und Muskelarbeit erfordern. Somit bestand nur ein geringer Selektionsdruck, nichtkodierende DNA zu eliminieren.

MERKE

Eukaryontische Gene sind von Tausenden Nucleotiden an nichtkodierender DNA umgeben.

Genduplikation und Pseudogene
Die überwiegende Zahl der Gene eines höheren Eukaryonten kommt im haploiden Genom nur einmal vor. In seltenen Fällen passiert es dennoch, dass ein Gen dupliziert wird. Genduplikationen sind zufällige, in evolutionären Zeiträumen gemessen zwar häufig, bei einzelnen Individuen dagegen extrem selten vorkommende Ereignisse.
Genduplikationen bilden die Grundlage für die Entstehung neuer Gene und ganzer Genfamilien; sie sind damit für die Evolution von Organismen von Nutzen. Eine Genduplikation ist jedoch nicht von vornherein ein unbedenkliches Ereignis. Die Expression eukaryontischer Gene wird streng reguliert, was dazu führt, dass die Menge an Genprodukten exakt dem Bedürfnis der Zelle in jeder Stoffwechsellage angepasst ist. Eine plötzliche Duplikation kann für den Organismus auch fatale Auswirkungen haben: Die doppelte Menge, beispielsweise eines Proteins, das die Zellteilung fördert, würde mit großer Wahrscheinlichkeit zu Krebs führen und damit zum vorzeitigen Untergang des Organismus.
Andererseits kann die zweite Genkopie zunächst ohne Effekt für den Organismus sein und somit überflüssig werden. Es besteht somit eine gewisse evolutionäre Tendenz, eine der duplizierten Genkopien zu inaktivieren. Dies kann beispielsweise durch eine inaktivierende Mutation des Promotors oder der Enhancer erfolgen oder durch eine die Funktion des Proteins zerstörende Mutation im Gen selbst. Der Mensch besitzt beispielsweise zwei Kopien des 21-Hydroxylase-Gens (Klinik), wobei jedoch nur eine der beiden Genkopien aktiv ist. Die zweite Kopie besitzt keinen funktionellen Promotor und ist daher inaktiv. Man spricht hier von einem Pseudogen.

Klinik

Duplikation fördert die Mutation des 21-Hydroxylase-Gens beim Menschen

Das 21-Hydroxylase-Gen kodiert für ein Protein, das in der Biosynthese von Cortisol und Aldosteron eine wichtige Rolle spielt. Mutationen in diesem Gen sind sehr häufig. Aus einer Studie von 1985 in München geht hervor, dass etwa 2% der Bevölkerung Münchens Träger des mutierten Allels sind. Der Ausfall des Gens führt zum Krankheitsbild des adrenogenitalen Syndroms, das durch die Mangelproduktion an Cortisol und Aldosteron geprägt ist. Das 21-Hydroxylase-Gen kommt in zwei unmittelbar nebeneinanderliegenden Kopien im Genom vor. Nur eine der beiden Genkopien wird exprimiert. Das zweite Gen hat keinen funktionierenden Promotor und ist deshalb ein Pseudogen. Da auf dem Pseudogen kein Selektionsdruck lastet, haben sich in dieser Kopie Mutationen angesammelt. Beide Gene sind trotz der Ansammlung von Mutationen im Pseudogen zu über 90% in ihrer DNA-Sequenz identisch.
Obwohl die duplizierte Kopie des 21-Hydroxylase-Gens nicht aktiv ist, kann sie trotzdem manchen Menschen zum Verhängnis werden. Die hochgradige Ähnlichkeit beider DNA-Sequenzen fördert die illegitime (ungleiche) Rekombination (Kap. 14.4) zwischen Gen und Pseudogen, was häufig dazu führt, dass aus dem inaktiven Pseudogen mutierte Abschnitte in die exprimierte Kopie gelangen. Ein solches Ereignis kann zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Aktivität der 21-Hydroxylase und zum adrenogenitalen Syndrom führen.
Genduplikation und Entstehung neuer Gene
Wie oben erwähnt wurde, bilden Genduplikationen die Grundlage für die Entstehung neuer nützlicher Gene. Ein kleines, nur 15 kDa langes, die Ausbildung von Tumoren unterdrückendes Protein namens p15INK4 (ein Tumorsuppressor) ist bereits im Genom von Fischen vorhanden, unmittelbar neben dem Gen für die Methylthioadenosin-Phosphorylase (MTAP) gelegen. Untersucht man den entsprechenden Genlocus beim Menschen (Abb. 11.30), dann findet man neben dem MTAP-Gen zwei eng verwandte Tumorsuppressorgene. Die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen legt nahe, dass das zweite Gen (p16INK4a) durch eine Duplikation des ersten entstanden ist. Analysiert man den entsprechenden Genlocus beim Huhn, so stellt man fest, dass die Genduplikation bereits nach der Abspaltung der Vögel von den Fischen stattgefunden hat. Bei Hühnern ist jedoch das duplizierte Gen zu einem Pseudogen degeneriert, während bei der Entwicklung zum Menschen ein funktionelles Gen für einen neuen Tumorsuppressor generiert wurde.
Exon sharing
Die Schöpfung neuer Gene kann ungewöhnliche Wege gehen. Nach der Duplikation des p15INK4 Gens (Abb. 11.30) wurde zwischen die beiden Gene ein weiteres Exon (E1) inseriert. Beim Huhn wird dieses Exon exprimiert und kodiert für ein 7 kDa kurzes Peptid mit Tumorsuppressorfunktion. Beim Menschen ist das entsprechende Protein deutlich länger, denn es wird von zwei Exons kodiert. Das zweite Exon ist Exon 2 des p16INK4a-Gens. Exon 2 wird offensichtlich von zwei Proteinen genutzt, von p16INK4a und von ARF (alternative reading frame), allerdings in verschiedenen Leserastern. Die gemeinsame Nutzung desselben Exons in verschiedenen Leserastern (exon sharing) kommt bei Viren relativ oft, beim Menschen dagegen selten vor.
Genfamilien
Genduplikationen können im Verlauf der Evolution mehrfach auftreten, was dann zur Ausbildung ganzer Genfamilien führt. Das menschliche Genom enthält viele Familien funktionell verwandter Gene. Die - und -Globine, verschiedene Formen von Kollagen (einer Komponente des Stützgewebes), von Actin (einem Zytoskelettprotein) oder der G-Proteine (die bei der Signaltransduktion hormoneller Regelkreise eine bedeutende Rolle spielen) sind alle durch Genduplikation und nachfolgende Divergenz entstanden. Auch Isoenzyme des Stoffwechsels sind durch Genduplikationen entstanden.
Entstehung intrazellulärer Hormonrezeptoren
Eine aus medizinischer Sicht bedeutsame Genfamilie ist die der intrazellulären Hormonrezeptoren. Sie haben alle einen ähnlichen Aufbau:
  • Am N-Terminus besitzen sie eine Aktivierungsdomäne variabler Länge, mit der sie direkt oder indirekt die RNA-Polymerase stimulieren.

  • Etwa in der Mitte des Proteins befindet sich eine DNA- Bindungsdomäne, mit der das Protein an regulatorische Sequenzen von Genen andockt.

  • Im C-terminalen Bereich befindet sich die Ligandenbindungsdomäne.

Diese Rezeptoren binden unterschiedliche Liganden, meist lipophile Hormone, darunter Steroidhormone, Triiodthyronin (T3), 1,25-Dihydroxycholecalciferol (Vitamin-D3-Hormon), Retinsäure oder Eicosanoide. Bei einigen Mitgliedern der Genfamilie, wie dem COUP-Transkriptionsfaktor (chicken ovalbumin upstream promoter binding protein) oder HNF-4 (hepatocyte nuclear factor), wurde bislang der zugehörige Ligand noch nicht entdeckt. Möglicherweise sind diese Faktoren sogar von Liganden unabhängig, weshalb man sie auch als Orphan-Rezeptoren (engl. orphan Waise, verwaist) bezeichnet.
Die Genfamilie der intrazellulären Hormonrezeptoren entwickelte sich infolge wiederholter Duplikationen mit nachfolgender Divergenz. Zu der Zeit, als sich wirbellose Tiere und Wirbeltiere in der Evolution noch nicht getrennt hatten, besaß vermutlich einer der Vorfahren der Wirbellosen eine einzige Genkopie, aus der sich allmählich die heutige Familie entwickelte (Abb. 11.31).
Eine Genduplikation ist ein seltenes, zufälliges Ereignis. Man nimmt an, dass es das Ergebnis einer illegitimen Rekombination (Kap. 14.4) zwischen homologen Chromosomen ist, die zum Einbau einer zusätzlichen Kopie in eines der Chromosomen führt. Ist ein Gen einmal dupliziert, können durch wiederholte Rekombinationen weitere Kopien erzeugt oder auch wieder aus dem Chromosom entfernt werden.

MERKE

Eukaryontische Gene kommen im haploiden Genom einmal vor. Genduplikation ist im Leben eines Individuums ein extrem seltenes Ereignis, in evolutionären Zeiträumen dagegen relativ häufig. Sie ist die Basis zur Bildung von Isoenzymen und Genfamilien und damit wichtig für die Evolution neuer Funktionen.

Tandemartig wiederholte Gene
Von einigen Genen sind 100 Kopien vorhanden, die meist für Komponenten des Proteinsyntheseapparats kodieren. So hat der Mensch etwa 150–200 Genkopien der ribosomalen RNA (rRNA). Die Zahl der Genkopien für individuelle Transfer-RNA-Moleküle liegt zwischen 10 und 100. Histon-Gene kommen ebenfalls in ca. 25 Kopien im menschlichen Genom vor. Diese Gene unterscheiden sich grundlegend von den zuvor besprochenen Genfamilien, denn bei den rRNA-, tRNA- oder Histon-Genen handelt es sich um identische oder nahezu identische Kopien desselben Gens.
rRNA-Gene
Warum benötigen Zellen so viele Kopien einiger ausgewählter Gene? In der frühen Teilungsphase haben einige embryonale Zellen des Menschen eine Verdopplungszeit von etwa 24 h. Jede Zelle benötigt 5–10 Mio. Ribosomen. Aber können durch die Transkription einer einzigen rRNA-Genkopie 5–10 Mio. ribosomale RNA-Moleküle in 24 h produziert werden? Plausible Berechnungen unter einfachen Annahmen verneinen diese Möglichkeit. Die Geschwindigkeit, mit der die RNA-Polymerase Nucleotide verbindet, ist durch die katalytische Kapazität (Vmax) des Enzyms auf ca. 50 Nucleotide pro Sekunde limitiert. Hinzu kommt, dass Gene von Wirbeltieren häufig lange Introns oder wie die rRNA-Gene lange transkribierte Spacer enthalten sowie ausgedehnte 3'- und 5'-Regionen, die zunächst mit transkribiert, später bei der Reifung der rRNA aber wieder entfernt werden. Bei einer In-vivo-Reaktionsgeschwindigkeit der RNA-Polymerase I von ca. 50 Nucleotiden pro Sekunde dauert die Transkription des insgesamt 14.000 bp langen transkribierten Abschnitts eines menschlichen rRNA-Gens nahezu 5 min. Daraus ergibt sich eine Produktion von 300 rRNA-Molekülen pro Tag und Polymerase. An der Transkription eines rRNA-Gens arbeiten allerdings ca. 250 RNA-Polymerase-I-Moleküle gleichzeitig, was die Tagesproduktion um das 250fache auf 75.000 rRNA-Moleküle pro transkribiertes Gen erhöht. Für die Bereitstellung von 5–10 Mio. rRNA-Molekülen bedarf es jedoch, nach dieser groben Abschätzung, mindestens 50 bis 100 aktiver rRNA-Gene.
tRNA- und Histon-Gene
Für die Produktion der benötigten Mengen an tRNA reichen offenbar weniger Gene aus, da tRNA-Gene keine langen transkribierten Spacer oder Introns enthalten und deshalb schneller hergestellt werden können als rRNA.
Extrem große Mengen an Histonmolekülen werden bei der Teilung der Zelle benötigt. Da auch Histon-Gene nicht von langen Introns unterbrochen sind und die RNA-Polymerase II in wenigen Sekunden eine Histon-mRNA transkribieren kann, reichen bereits ca. 20 Gene aus, um den Bedarf zu decken.
Segmentierte Gene
Einer der bemerkenswerten Aspekte des Immunsystems ist, dass B- bzw. T-Zellen weitaus mehr spezifische Immunglobuline und T-Zell-Rezeptoren produzieren können, als Gene dafür im Genom vorhanden sind. Wie kommt diese enorme Diversität von Antigenen zustande, wenn nur wenige Gene für deren Produktion zur Verfügung stehen? Die molekularen Mechanismen zur Erzeugung dieser hohen Diversität sind heute aufgeklärt und verstanden (Kap. 26.4). Die Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor-Gene liegen in der Keimbahn als unfertige Gensegmente vor und werden in heranreifenden B- bzw. T-Zellen durch DNA-Umlagerung zu fertigen Genen zusammengesetzt. Die Kombination von Segmenten zu fertigen Genen ist kein gerichteter, sondern ein vom Zufall bestimmter Prozess. In jeder einzelnen Zelle wird also ein besonderes Gen erzeugt, das für ein Antikörpermolekül mit einer ganz bestimmten Spezifität kodiert. Es entsteht eine riesige Population von B-Zell- und T-Zell-Vorläufern unterschiedlicher Antikörper- bzw. T-Zell-Spezifität. Bei Infektion wird aus dieser Population die richtige Zelle ausgesucht (klonale Selektion), zur reifen Zelle differenziert und vervielfältigt. Die Möglichkeiten der Kombination von Gensegmenten zu einem vollständigen Gen sind so groß, dass wenige hundert Segmente für die variablen Regionen und noch weniger der anderen Segmente ausreichen, um Millionen Antikörpergene bzw. T-Zell-Rezeptor-Gene zu bilden.

MERKE

Gene für die ribosomale RNA (rRNA) liegen, einschließlich einiger Pseudogene, in ca. 200 Kopien an einem Genort vor. Diese Zahl an Genkopien ist nötig, um bei der Zellteilung rRNA für die benötigte Zahl an Ribosomen bereitzustellen. Um das Chromatin nach der Verdopplung des Genoms korrekt in Nucleosomen verpacken zu können, sind ebenfalls mehrere Kopien, insgesamt ca. 20, an Histon-Genen nötig. Um die enorme Diversität an Antikörpern und T-Zell-Rezeptoren zu kodieren, werden in heranreifenden B- und T-Zell-Vorläufern ca. 1 Mio. verschiedene Antikörper- bzw. T-Zell-Rezeptor-Gene aus wenigen Gensegmenten kombinatorisch zusammengefügt.

Nichtkodierende DNA

Einmal vorkommende nichtkodierende DNA
Wie wir im vorigen Kapitel gesehen haben, liegen die Gene höherer Eukaryonten nicht dicht nebeneinander, sondern wie einzelne Inseln im Meer weit verstreut, umgeben von Tausenden Basenpaaren an nichtkodierender DNA. Die Nucleotidsequenz dieser nichtkodierenden DNA kommt im Genom meist nur einmal vor, man nennt sie deshalb auch unique DNA (engl. unique einmalig). Auch die Introns bestehen meist aus unique DNA. In diese DNA-Abschnitte haben sich jedoch im Laufe der Evolution viele Kopien einiger weniger DNA-Elemente eingenistet. Man spricht hier, im Gegensatz zu unique, von repetitiver DNA.
Repetitive nichtkodierende DNA
Neben duplizierten oder mehrfach wiederholten Genen (z.B. rRNA-Gene) enthält das menschliche Genom eine große Menge an DNA, die in Tausenden Kopien oder noch häufiger vorkommt, ohne dass sie – nach heutigem Wissensstand – eine Funktion hätte. Sie wird in der Regel nicht transkribiert und enthält demnach keine verschlüsselte Information für RNA-Moleküle oder Proteine. Aufgrund der Anordnung ihrer Sequenzelemente teilt man sie in zwei Klassen ein: Sie sind entweder wie Glieder einer Kette nebeneinander aufgereiht (Satelliten, Mini- und Mikrosatelliten) oder in bis zu 1.000.000 Kopien, mehr oder weniger nach dem Zufallsprinzip, im gesamten Genom verstreut.
Mini- und Mikrosatelliten
Satelliten, Minisatelliten und Mikrosatelliten werden in der angelsächsischen Literatur auch als Simple sequence DNA bezeichnet, denn ihre Elemente, die sich stets wiederholen, können sehr einfach sein. Der hier als Beispiel gewählte Minisatellit (Abb. 11.32) hat eine sich wiederholende Einheit (tandem repeat unit) von 63 Basenpaaren, die sich aber offensichtlich aus der – simplen – Tetranucleotidsequenz GGAT durch Punktmutationen und einer Basendeletion entwickelt hat.
Die Unterscheidung zwischen Mini- und Mikrosatelliten ist willkürlich. Ist die sich wiederholende Einheit nur zwei bis zehn Nucleotide lang (etwa GGAT), bezeichnet man sie als Mikrosatelliten. Von einem Minisatelliten spricht man in der Regel, wenn die Länge der sich wiederholenden Einheit größer als zehn ist (z.B. 63 in unserem Beispiel, auch wenn sie ursprünglich aus einer nur vier Nucleotide langen Einheit entstanden ist). Auch die Zahl der Wiederholungen der repetitiven Einheit spielt eine Rolle, ob man die DNA als Mikro- oder Minisatellit bezeichnet; hier gibt es keine strengen Regeln. Wenn sich aus der ursprünglichen kurzen Einheit (z.B. GGAT) durch evolutionäre Veränderungen bereits eine längere repetitive Einheit aus 63 Basenpaaren ausgebildet hat, bezeichnet man dies in der Regel als Minisatelliten. Solche Einheiten können sich durch illegitime Rekombination (unequal crossover) ständig weiter verändern und zur Bildung der echten Satelliten führen.
Mikrosatelliten erlangten einen besonderen Stellenwert in der Gerichtsmedizin, denn sie bilden die Grundlage für den sog. genetischen Fingerabdruck. Mikrosatelliten kommen in Introns oder in Bereichen zwischen benachbarten Genen vor. Die Anzahl ihrer Wiederholungen variiert von zwei bis zu mehreren hundert Kopien. Mikrosatelliten mit derselben DNA-Sequenz kommen in mehreren chromosomalen Orten vor und zeigen individuelle Längenvariation. Diese Längenvariation kann zur persönlichen Identifizierung (genetischer Fingerabdruck; Kap. 15.2.3) herangezogen werden.
Satelliten
Die wiederholten Einheiten der echten Satelliten sind in der Regel, wenn auch nicht immer, deutlich länger (50–1000 bp) als die der Minisatelliten und 10.000fach wiederholt. Damit bilden sie Blöcke von DNA mit einer Gesamtlänge von 1–2 Mio. Basenpaaren, also von der Größe eines bakteriellen Genoms. Die Bezeichnung Satellit stammt aus den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts, als es gelungen war, die erste Satelliten-DNA aufgrund des etwas höheren AT-Gehalts durch Dichtegradientenzentrifugation von der Masse des restlichen Genoms abzutrennen. In Cäsiumchloridgradienten löste sich eine kleine Nebenbande (Satellit) von der Hauptbande ab.
Satelliten-DNA ist häufig im Zentromer der Chromosomen, seltener in der Nähe von Chromosomenenden lokalisiert. Im Vergleich dazu sind Mikro- und Minisatelliten im gesamten Genom verstreut. Einer der am besten charakterisierten Satelliten ist die menschliche -Satelliten-DNA mit einer sich wiederholenden Einheit von 171 Basenpaaren. Im Zentromer von Autosomen kommt sie in Blöcken von 1–2 Mio. Basenpaaren vor, was einer 6000- bis 12.000fachen Wiederholung der 171 Basenpaare langen Einheit entspricht. Nur im Y-Chromosom ist die Zahl der Wiederholungen eine Größenordnung niedriger: Dort ist der Block nur 200.000 Basenpaare lang.

MERKE

Mehr als 50% des menschlichen Genoms besteht aus nichtkodierender repetitiver DNA. Satelliten und Minisatelliten sind aus einfachen, sich wiederholenden Einheiten aufgebaut und bilden Blöcke von um die 100 (Mikrosatelliten), um die 1000 (Minisatelliten) bis zu mehreren Millionen Nucleotiden (Satelliten). Erstere zeigen eine große individuelle Längenvariation und werden in der Gerichtsmedizin zur personellen Identifizierung (genetischer Fingerabdruck) herangezogen. Satelliten sind vorwiegend in den Zentromeren menschlicher Chromosomen lokalisiert.

Transposons

Neben den repetitiven Satelliten, die in den Chromosomen in Blöcken vorkommen, enthält das menschliche Genom hochrepetitive DNA, die vereinzelt und nach dem Zufallsprinzip im gesamten Genom verstreut vorkommt. Solche Elemente, die auch als Transposons bezeichnet werden, kommen wahrscheinlich in allen Eukaryonten vor und sind bewegliche Elemente des Genoms. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass sie ihren angestammten Ort im Chromosom verlassen können und sich an anderer Stelle wieder in das Genom integrieren. Daher liegen sie überall verstreut im menschlichen Genom.
Einige dieser Elemente, die sog. DNA-Transposons, springen als DNA-Moleküle, wobei sie das Enzym für ihre Integration an einem anderen Ort selbst kodieren (Abb. 11.33). Dieses Enzym trägt den Namen Integrase. Die meisten der mobilen Elemente des Menschen bewegen sich jedoch nicht selbst, sondern verschicken RNA-Transkripte, die mithilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) in DNA-Kopien umgeschrieben werden und sich anschließend an einer neuen Stelle in das Genom einnisten. Diese Elemente, die RNA als Intermediate verwenden, nennt man retrotransposable Elemente. Im Gegensatz zu den DNA-Transposons führt dieser Vorgang zur Vermehrung der Elemente im Genom. Sie werden in zwei Klassen eingeteilt: solche, die an ihren beiden Enden eine lange wiederholte Sequenz (LTR long terminal repeat) tragen, und solche, denen diese Sequenzen fehlen. Zu den LTR-tragenden Elementen zählen neben den Retrotransposons, die außerhalb des Zellkerns nicht existieren können, auch die Retroviren, die die Zelle verlassen und dann andere Zellen und Individuen infizieren können. Die häufigsten LTR-freien Elemente, die sog. Retroposons, sind im menschlichen Genom die LINEs (long interspersed elements) und die SINEs (short interspersed elements), die zusammen ca. 35% des Genoms ausmachen.
LINEs
LINEs gehören zur Familie der autonom replizierenden Retroposons und sind in Eukaryonten weit verbreitet. Das menschliche Genom enthält grob eine Mio. Kopien dieser DNA, die etwa 6500 Basenpaare lang ist. LINEs enden häufig mit einer adeninreichen Sequenz. Dies deutet darauf hin, dass diese Elemente bei ihrer Integration in das Genom RNA als Intermediate verwendet haben, und zwar RNA, die wie normale Gene von der RNA-Polymerase II transkribiert und anschließend am 3'-Ende polyadenyliert wurden. Bei der reversen Transkription wurden die Adenosine von der reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben und somit in das Genom aufgenommen.
Ein LINE enthält zwei offene Leseraster. Das erste kodiert beim Menschen für ein Protein ohne bekannte Funktion. Das zweite kodiert für ein Protein mit zwei stark konservierten Domänen: Die eine Domäne hat Ähnlichkeit mit Endonucleasen (sie spielt vermutlich bei der Integration des Elements in das Genom eine Rolle), die andere kodiert für eine reverse Transkriptase, die die prozessierte mRNA in DNA umschreibt. Diese Befunde deuten an, dass sich LINEs von mobilen Elementen ableiten, die für ihre eigene reverse Transkriptase und Integrase kodieren. Die meisten Kopien dieser Elemente im menschlichen Genom haben Mutationen angesammelt oder sind verkürzt. Damit haben sie ihre Fähigkeit zur Transposition verloren.
Eine relativ kleine Zahl an LINEs im menschlichen Genom, man schätzt 50–100, besitzt noch die volle Länge und ist zur Retrotransposition befähigt. Solche Transpositionsereignisse finden z.B. in undifferenzierten Zellen, in Keimzellen und undifferenzierten Tumorzellen statt. Transpositionen von LINE-DNA, die in jüngster Zeit stattgefunden haben, wurden als Ursache für Erkrankungen erkannt. Integration in das Gen für den Blutgerinnungsfaktor VIII verursacht Hämophilie; Transposition in das DMD-Gen führt zu Duchenne-Muskeldystrophie. LINE-Insertion in das APC-Tumorsuppressorgen (APC-Mutationen fördern adenomatöse Polyposis coli) wurden in Dickdarmkarzinomzellen, nicht jedoch in den umgebenden gesunden Dickdarmzellen gefunden – ein Hinweis darauf, dass LINE-Transpositionen auch krebsfördernd sein können.
SINEs
SINEs sind kürzere Elemente mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 300 Basenpaaren. Im menschlichen Genom kommen sie in ca. 1 Mio. Kopien vor. Viele von ihnen sind in zahlreichen Genen, meist in Introns, oder in unmittelbarer Nähe von Genen lokalisiert. Dies deckt sich gut mit der Beobachtung, dass bei der Färbung mit dem Farbstoff Giemsa die hellen, genreichen Banden mehr SINEs enthalten als etwa die genarmen, dunklen Banden.
SINEs werden auch als Alu-Elemente bezeichnet, denn sie enthalten etwa in der Mitte eine, gelegentlich auch zwei Erkennungsstellen für die Restriktionsnuclease Alu. Die Sequenz der SINEs ist entfernt verwandt mit der 7SL-RNA, der RNA-Komponente des Signalerkennungspartikels (SRP), das eine vitale Rolle bei der Zielsteuerung sekretorischer Proteine spielt (Kap. 17.5.1). Man vermutet, dass SINEs sich von dieser RNA ableiten.
Ähnlich wie bei den LINEs finden auch heute noch Transpositionsereignisse von SINEs im menschlichen Genom statt. Insertionen in die Faktor-IX-, NF1-, APC- und BRCA2-Gene führen zu Hämophilie, Neurofibromatose, Dickdarm- bzw. Brustkrebs. Ist das XSCID-Gen betroffen, führt die Transposition zu X-chromosomal vererbter Immunschwäche (SCID, severe combined immunodeficiency).

MERKE

Ungefähr 35% des menschlichen Genoms gehören zu den mobilen Elementen, die ihre angestammte Position im Genom verlassen können, um sich an anderer Stelle neu anzusiedeln. Am besten untersucht sind die LINEs und SINEs. Sie stammen wahrscheinlich von prozessierten Transkripten der Polymerase II ab. Transposition in Gene führt zur Mutation und kann Ursache für Krankheiten sein. Ein offensichtlicher Nutzen solcher Elemente konnte noch nicht nachgewiesen werden. Man kann aber auch nicht ausschließen, dass sie zur Evolution des menschlichen Genoms beigetragen haben.

Schon gewusst

Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms

Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms wurde von einem internationalen Konsortium von Wissenschaftlern (Human Genome Project) durchgeführt. Die Arbeiten begannen im Oktober 1990 und dauerten knapp 15 Jahre. Einzelnen Gruppen von Forschern wurden bestimmte Aufgaben zugeteilt, etwa welchen Teil von welchem Chromosom sie zu sequenzieren hatten. Andere Gruppen erhielten die Aufgabe, diese Teile passgenau zu einem Ganzen zusammenzusetzen.
Im Jahr 2004 wurde ein vorläufiges Endergebnis publiziert. Das aus 280 sequenzierten Teilen zusammengesetzte Gesamtgenom ergab eine Länge von 2.858.160.000 Nucleotiden, in hervorragender Übereinstimmung mit früheren Schätzungen von ca. 3 109 Nucleotiden pro haploides Genom. Das Ergebnis ist jedoch immer noch vorläufig, denn während der Arbeiten stieß man auf unerwartete Schwierigkeiten, die bislang noch nicht vollständig überwunden werden konnten. Repetitive Abschnitte des Genoms stellten sich als besonders problematisch für die Sequenzanalyse heraus, sodass noch etliche Lücken bestehen, besonders im Bereich der Zentromere der Chromosomen mit ihren -Satelliten und im Bereich der Chromosomenenden (Telomere). Man schätzt jedoch, dass diese Lücken nicht mehr als insgesamt 1% des Genoms ausmachen. Der technische Fortschritt der letzten Jahre ermöglichte eine große Genauigkeit der Analyse: Die Quote liegt bei weniger als einem Fehler pro 100.000 Nucleotide.
Die Entschlüsselung des Genoms brachte interessante Erkenntnisse zum Aufbau des Genoms. So weiß man heute, wie Gene, intergenische Regionen und die verschiedenen Klassen von repetitiver DNA im Genom verteilt sind. Die Analyse ergab, dass ca. 40% des Genoms von Genen abgedeckt werden. Dabei nehmen die Exons nur 65 Megabasen (6,5 107 Basenpaare) ein; alle Introns sind zusammen 1,1 Gigabasenpaare (1,1 109 Basenpaare) lang. Die durchschnittliche Länge eines Exons errechnet sich zu 293 Basenpaaren, die der Introns zu 5675 Basenpaaren. Im Durchschnitt gibt es sieben Introns pro Gen, wobei etwa 4000 Gene keine Introns besitzen.
Da Gene charakteristische Elemente enthalten (Promotoren, andere regulatorische Elemente, bestimmte funktionelle Domänen etc.), konnte mithilfe intelligenter Algorithmen nach bislang unentdeckten Genen gesucht werden. Aufgrund dieser Analysen schätzt man die Zahl der Gene im menschlichen Genom auf ca. 30.000, im Gegensatz zu früheren Schätzungen, die bei ca. 100.000 lagen. Durch die Entdeckung zahlreicher neuer Gene ist ein Überblick über die Zuordnung dieser zu bestimmten biologischen Prozessen möglich geworden. So sind z.B. 14% aller Gene am Metabolismus beteiligt, aber nur 1% für die Zellteilung und die Kontrolle des Zellzyklus zuständig. Knapp 6% der Gene haben eine Funktion in der Kommunikation der Zellen untereinander, während für die gesamte Entwicklung des Organismus nur etwas mehr als 2% identifiziert wurden. Die restlichen Gene kodieren für Proteine, die die Struktur der Zelle bestimmen und extrazelluläre Bestandteile des menschlichen Körpers aufbauen. Bei vielen durch Computersuche entdeckten Genen ist die Funktion noch gänzlich unklar.
Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms hat schließlich zahlreiche medizinische Implikationen. So ist durch den Vergleich der DNA-Sequenzen aus der Genbank mit entsprechenden Abschnitten einzelner Individuen (sowohl gesunder als auch von Erkrankungen betroffener) bekannt geworden, dass sich zwei nicht verwandte Personen durchschnittlich in ca. 3 Mio. Basenpaaren unterscheiden. Die Mehrzahl dieser Unterschiede betrifft einzelne Nucleotide und wird als SNPs (single nucleotide polymorphisms) bezeichnet. Es sind jedoch auch Fälle bekannt geworden, bei denen einzelne Gene, ja sogar lange Loci, wie der V-Locus der leichten Immunglobulinkette, dupliziert vorlagen. Besonders der Analyse der SNPs wird eine große medizinische Bedeutung zugemessen, weil viele dieser kleinen Unterschiede die Regulation von Genen oder die Funktion von RNA-Molekülen und Proteinen in subtiler Weise modulieren können. Im Rahmen einer multifaktoriellen Vererbung können solche SNPs für individuelle Unterschiede in der Anfälligkeit (Suszeptibilität) für bestimmte Erkrankungen (z.B. Altersdiabetes, Bluthochdruck etc.), für unterschiedliche Krankheitsverläufe bei gleicher Ursache oder unterschiedliches Ansprechen auf Therapien und Medikamente verantwortlich sein.

Viren

Aufbau der Viren
Viren sind kleine parasitäre Partikel ohne eigenen Stoffwechsel, die zur Vermehrung auf eine Wirtszelle angewiesen sind und dazu das Programm der Zelle so abändern, dass ihr Überleben gewährleistet ist. Jedes Virus enthält DNA oder RNA als genetisches Material. Es sind keine Viren bekannt, die beide Arten von Nucleinsäure gleichzeitig besitzen. Außer der Nucleinsäure enthalten Viren eine Hülle aus Protein, die man Kapsid nennt. Diese Proteinhülle besteht im einfachsten Fall aus nur einem Proteintyp, der für jede Virusart charakteristisch ist.
Manche Viren, z.B. HIV-1 (humanes Immundefizienzvirus), besitzen eine zusätzliche Hüllmembran, die einige virusspezifische Proteine enthält. Solche Proteine können an Rezeptoren, die sich an der Oberfläche von Zellen befinden, binden. Im Fall von HIV sind es die Glykoproteine Gp110 und Gp41. Gp110 bindet an CD4, während Gp41 für die Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran sorgt. Die Hüllmembran geht aus der Plasmamembran der Wirtszelle hervor und entsteht, wenn das virale Nucleokapsid die Wirtszelle verlässt. Beim Verlassen bilden Virionen kleine Ausstülpungen in der Membran, die dann weiter abgeschnürt werden (Abb. 11.34). Wenn schließlich das Viruspartikel die Zelle verlässt, ist es vollständig von der Membran umhüllt.
Das Genom einiger Viren ist sehr klein und kodiert im Extremfall für nur drei Proteine, wie bei den meisten tierischen Retroviren. Bei größeren und komplexeren Viren (z.B. Epstein-Barr-Virus) können im Genom mehrere hundert Proteine verschlüsselt sein.
Virusrezeptoren und Wirtsspektrum
Um Zellen infizieren zu können, benötigen Viren einen Rezeptor auf der Oberfläche der Wirtszelle. Es ist nicht anzunehmen, dass Zellen eigens Rezeptoren für potenzielle Wechselwirkungen mit Viren entwickelten. Vielmehr ist wahrscheinlich, dass Viren mit Rezeptoren in Kontakt treten, die für normale Funktionen der Zelle zuständig sind, aber offensichtlich auch eine hohe Affinität zu Virusproteinen aufweisen.
So benutzt beispielsweise das HIV-1 ein Protein (CD4), das bei der zellvermittelten Immunantwort als Corezeptor fungiert und auf der Oberfläche immunkompetenter Zellen zu finden ist. Rhinoviren, Verursacher des gewöhnlichen grippalen Infekts, binden an ICAM-I, ein Zelladhäsionsmolekül auf der Oberfläche respiratorischer Epithelzellen, und werden über diese Bindung in die ZelIe befördert. Adenoviren und das Coxsackievirus binden Integrine, Influenzaviren benutzen zum Andocken Glykoproteine und Glykolipide, die N-Acetylneuraminsäure enthalten, das Herpes-simplex-Virus dagegen Heparinsulfat. Das Vorkommen solcher Rezeptoren bestimmt das Wirtsspektrum der Viren.

MERKE

Viren sind parasitische Lebewesen, die sich nur in Wirtszellen vermehren können. Sie enthalten ein kleines Genom, das DNA oder RNA sein kann. Die Infektion durch ein Virus beginnt mit dem Andocken an einen zellulären Oberflächenrezeptor der Wirtszelle. Die Spezifität dieser Wechselwirkung bestimmt das Wirtsspektrum des Virus.

Lytische und Iysogene Infektion
Viele Viren töten die infizierten Wirtszellen nicht. Die Überlebensstrategie dieser Viren besteht vielmehr darin, ihr Genom in das des Wirts zu integrieren und auf diese Weise an viele Tochterzellen weiterzugeben. Die in das Genom integrierte virale DNA bezeichnet man auch als Provirus. In dieser Form kann das Virus sehr lange unauffällig im Genom verharren. Dieser Verlauf der Infektion ist persistierend; man spricht auch von einer lysogenen Infektion.
DNA-Viren, wie Herpesviren, können sehr lange persistieren, ohne die Nervenzelle, die sie bevorzugt befallen, zu schädigen. Es kann jedoch durch äußere Einflüsse, etwa starke UV-Bestrahlung, zu einer Aktivierung des Provirus und zur Bildung einer großen Zahl von Virionen kommen, die auf verschiedene Weise die Zelle schädigen und zum Zelluntergang führen.
Andere Viren, z.B. Pockenviren, vermehren sich durch Lyse der Zelle. Unmittelbar nach Infektion werden Tausende neuer Virionen hergestellt, die die Zelle schädigen und letztlich zum Bersten bringen (Lyse). Die frei gewordenen Virionen infizieren viele benachbarte Zellen, womit ein lawinenartiger Prozess in Gang gesetzt wird, der den gesamten Organismus stark gefährden kann.

MERKE

Virale Wachstumszyklen können einen lytischen oder einen Iysogenen Verlauf nehmen.

Genome der Viren
Viren enthalten entweder RNA oder DNA als genetisches Material. Die Nucleinsäure kann dabei sowohl einzel- als auch doppelsträngig sein. Die Art der Nucleinsäure – ob sie aus DNA oder RNA besteht, einzel- oder doppelsträngig ist, den Minus- oder Plusstrang in Virionen verpackt – bedingt, welche Strategie das Virus benutzt, um sein Genom zu exprimieren und replizieren (Abb. 11.35). Die virale mRNA wird in diesem System als Plusstrang definiert, der RNA-Gegenstrang, der also nicht unmittelbar translatiert werden kann, als Minusstrang. Entsprechend wird die DNA, die zur mRNA komplementär ist, als
Minusstrang bezeichnet. Die Produktion von mRNA erfordert also, dass eine Minusstrang-RNA oder -DNA abgelesen wird.
DNA-Viren
Viren mit einem doppelsträngigen DNA-Genom
Die doppelsträngige DNA (dsDNA) gelangt in den Zellkern, wo zelluläre Enzyme die DNA transkribieren und die gebildete RNA prozessieren (Abb. 11.35, a). Die mRNA wird im Zytosol der Wirtszelle translatiert. Einige prominente Beispiele dieser Klasse von Viren sind:
  • Adenoviren: Sie verursachen bei vielen Tieren und beim Menschen Infektionen des oberen Respirationstrakts sowie des Gastrointestinaltrakts und dienen bei der Gentherapie als Vektoren zum Einbringen von Genen in Zellen (Kap. 15.5).

  • SV40-Virus (Simian-Virus-40): Dieses Affenvirus wird als Modell für Untersuchungen der DNA-Replikation im Laboratorium häufig verwendet.

  • Herpesviren: Sie verursachen diverse entzündliche Hautexantheme wie Lippenbläschen, Gürtelrose, Windpocken etc.

  • humane Papillomaviren: Sie bilden Warzen oder andere Hautläsionen und verursachen gelegentlich maligne Transformationen im Gebärmutterhals.

  • Poxviridae: Hier erfolgen Replikation und Transkription im Zytosol des Wirts. Die Viren bringen ihre eigenen DNA- und RNA-Polymerasen mit. Typische Vertreter dieser Gruppe sind Variolavirus (Erreger der menschlichen Pocken), Vacciniavirus (Pockenimpfvirus) und Molluscipoxvirus (Erreger des Molluscum contagiosum bzw. der Dellwarze).

Viren mit einem einzelsträngigen DNA-Genom
Sie werden auch Parvoviren genannt (lat. parvus klein). Sie sind einfach gebaut mit einer einzelsträngigen DNA (ssDNA). Einige Parvoviren verpacken Plus- und Minus-DNA, allerdings in verschiedene Virionen; andere verpacken nur den Minusstrang. In beiden Fällen wird jedoch in der Zelle zuerst doppelsträngige DNA gebildet, die dann als Vorlage für die Bildung der mRNA dient (Abb. 11.35, b).
RNA-Viren
Viren mit einem doppelsträngigen RNA-Genom
Sie enthalten doppelsträngige RNA (dsRNA). Der Minusstrang dient als Matrize für die Bildung der mRNA (Abb. 11.35, c). Alle bekannten Viren dieser Klasse haben ein segmentiertes Genom, das aus zehn bis elf RNA-Fragmenten besteht, wobei auf jedem Fragment ein bis zwei Gene liegen.
Die Virionen enthalten einen kompletten Satz an Enzymen, der sie befähigt, nach Infektion im Zytosol der Zelle mRNA zu synthetisieren. Zu dieser Klasse gehören Reoviren, Rotaviren (Erreger akuter Durchfallerkrankungen) und Orbiviren; Letztere verursachen das Colorado-Zeckenfieber und andere durch Zecken übertragbare Erkrankungen.
Viren mit einem einzelsträngigen Plusstrang-RNA-Genom
Sie enthalten einen einzigen Plusstrang, der mit der mRNA identisch ist (Abb. 11.35, d). Da von dieser RNA mithilfe von Zellenzymen unmittelbar Proteine gebildet werden können, ist bereits die nackte RNA infektiös. Während der Replikation wird zunächst ein kompletter Minusstrang gebildet, der dann als Matrize für die Synthese vieler weiterer Kopien von Plusstrang-RNA dient.
Diese Viren lassen sich in zwei Gruppen aufteilen:
  • Bei Ersterer, zu denen das Poliovirus gehört, wird zunächst die gesamte mRNA in eine lange Proteinvorstufe übersetzt, die anschließend in kürzere funktionelle Einheiten zerschnitten wird.

  • Letztere hingegen synthetisieren zunächst vom Minusstrang zwei mRNA-Moleküle: eines mit der vollen Länge der Matrize und ein kürzeres, das komplementär zum letzten Drittel der viralen Minusstrang-RNA ist. Beide RNA-Moleküle werden zunächst in lange Proteinvorstufen übersetzt, die anschließend in funktionelle Einheiten geschnitten werden. In diese Klasse der Viren fallen die Erreger des Gelbfiebers und der viralen Enzephalitis. Früher wurden diese Viren Arboviren genannt (von arthropod-borne), heute nennt man sie Togaviren (lat. toga Mantel), da diese Viren eine Lipidhülle besitzen.

Viren mit einem einzelsträngigen Minusstrang- RNA-Genom
Diese besitzen eine einzige Minusstrang-RNA, die als Matrize zur Bildung von mRNA dient (Abb. 11.35, e). Auch hier lassen sich die Viren in zwei Untergruppen einteilen.
  • Die einen, zu denen die Erreger von Mumps und Masern gehören, transkribieren mithilfe der viralen Polymerase diverse mRNA-Moleküle unterschiedlicher Länge, die jeweils für ein spezifisches Polypeptid kodieren.

  • Die anderen hingegen, zu denen das Influenzavirus gehört, besitzen ein segmentiertes Genom. Jede Minusstrang-RNA dient als Matrize für die Bildung einer spezifischen mRNA, die in der Regel für ein Protein kodiert. Einige der mRNA-Moleküle können jedoch in zwei verschiedenen Leserastern abgelesen werden und damit für zwei Proteine kodieren.

Beiden Klassen ist gemeinsam, dass sie ihre eigene RNA-Polymerase mitbringen, die zur Bildung der mRNA dient. Somit ist hier die nackte virale RNA nicht infektiös.
Viren mit einer einzelsträngigen Minusstrang-RNA wenden eine ungewöhnliche Strategie zur Synthese ihrer eigenen mRNA an. Die Influenza-Polymerase initiiert die Transkription der viralen mRNA mithilfe eines elf 11–15 Nucleotide langen Oligonucleotids, das sie aus einer bestimmten mRNA-Vorstufe des Wirts durch Abschneiden gewinnt. Dieses Oligonucleotid dient bei der viralen mRNA-Synthese als Primer, der sich an den viralen Minusstrang anlagert und dann verlängert wird.
Retroviren
Das Genom dieser Klasse von RNA-Viren besteht aus zwei identischen Kopien von Plusstrang-RNA. Diese Viren sind unter der Bezeichnung Retroviren bekannt, denn ihr Programm steuert die Bildung von DNA mit der viralen RNA als Matrize (Abb. 11.35, f). Retro bezieht sich auf den umgekehrten Fluss der genetischen Information (RNA DNA) im Hinblick auf das zentrale Dogma der Genexpression (Kap. 11.1.1). Die gebildete DNA dient als Vorlage für die Synthese der viralen mRNA.
Prominentes Mitglied dieser Virusfamilie ist das HIV-1. Nach Infektion der Zelle wird zunächst das virale RNA-Genom (Plusstrang) durch die virale reverse Transkriptase in eine Minusstrang-DNA überschrieben (Abb. 11.34 und 11.35, f). Die reverse Transkriptase, die sowohl RNA als auch DNA als Matrize verwenden kann, synthetisiert nachfolgend auch den komplementären Plusstrang der DNA. Die doppelsträngige DNA gelangt in den Zellkern und wird dann an zufällig ausgewählten Stellen in das Genom des infizierten Wirts integriert. Dazu bedarf es eines viruskodierten lntegrase-Enzyms. In diesem Zustand ist das Virus latent.
Retroviren töten ihre Wirtszellen in der Regel nicht ab. So kann die Wirtszelle sich teilen und gibt bei jeder ZellteiIung die Virus-DNA an die Nachkommen weiter. Schließlich wird die provirale DNA durch die Maschinerie der Zelle in RNA (Plusstrang) transkribiert, wonach sie entweder der Synthese viraler Proteine dient oder durch Virusproteine in Virionen verpackt wird. Virionen werden an die Plasmamembran transportiert, wo sie nach Ausknospung eine Membranhülle erhalten und die Zelle verlassen.

Schon gewusst

Tumorviren

Es gibt viele Retroviren, die bei Tieren Tumoren hervorrufen, wie das Rous-Sarkom-Virus (RSV) oder das Vogel-Leukosevirus (ALV, avian leukosis virus). Andere Beispiele aus der Klasse der Säugetiere sind Rinder-Leukämievirus (BLV, bovine leukemia virus), Maus-Mammatumorvirus (MMTV) und Maus-Leukämievirus (MLV). Das Studium dieser Viren brachte große Fortschritte für das Verständnis der Tumorentstehung und bei der Charakterisierung der meisten Onkogene. Das einzige bisher bekannte Retrovirus, das beim Menschen Tumoren hervorruft, ist HTLV, das humane T-Zell-Leukämie-Virus.

Klinik

Antimetaboliten

Zwei Antimetaboliten, Acycloguanosin (Aciclovir) und Azathymidin (AZT), haben sich besonders bei der Behandlung von Herpesviren bzw. bei der HIV-Infektion bewährt.
Aciclovir ist ein Guanosinderivat (Abb. 11.36), dem ein Teil des Pentoserings fehlt (daher Acyclo-). Das Molekül besitzt somit weder eine 2'- noch eine 3'-OH-Gruppe. Um wirksam zu werden, muss Aciclovir nach Aufnahme in die Zelle zum Monophosphat und weiter zum Triphosphat phosphoryliert werden. Das Triphosphat ist Substrat von DNA-Polymerasen. Wird die Verbindung in DNA eingebaut, führt dies zum Kettenabbruch, denn der Verbindung fehlt ja die 3'-OH-Gruppe zur Fortsetzung der Polymerisation. Eine unvollständige virale DNA führt nicht zu infektiösen Viruspartikeln. Den ersten Phosphorylierungsschritt katalysiert in der Zelle die virale Thymidin-Kinase (Kap. 10.3.2). Diese hat eine bedeutend höhere Affinität zu Aciclovir als das zelluläre Enzym. Somit besteht bereits eine deutliche Selektion für die Konzentration des Therapeutikums in Zellen, die vom Virus befallen sind, da die phosphorylierte Form des Therapeutikums in der Zelle verbleibt, während die nichtphosphorylierte Form die Zelle wieder verlassen kann. Auch die virale reverse Transkriptase zeigt eine höhere Affinität als die zellulären DNA-Polymerasen. Diese Eigenschaften bewirken, dass Aciclovir bevorzugt in infizierte Zellen aufgenommen und dort bevorzugt in das virale Genom eingebaut wird.
Bei Azathymidin (Abb. 11.36) ist die 3'-OH-Gruppe durch die Azidogruppe (N3-Gruppe) ersetzt. Einbau in die DNA führt ebenfalls zum Kettenabbruch, denn an der Azidogruppe kann die DNA-Kette auch nicht verlängert werden.
Beide Substanzen hemmen die Vermehrung der betreffenden Viren. Sie können den Verlauf der Erkrankung günstig beeinflussen, führen aber keine Heilung herbei. Im Fall von AZT wird das Fortschreiten der Erkrankung verlangsamt, durch Aciclovir werden die Symptome gelindert.

MERKE

Das Genom eines Virus besteht entweder aus DNA oder aus RNA. Beide können einzel- oder doppelsträngig sein. Viren verursachen zahlreiche, oft lebensbedrohliche Erkrankungen. Retroviren und manche DNA-Viren (Adenovirus, Herpesvirus, menschliche Papillomaviren) können ihre DNA in das Wirtsgenom integrieren.

Mitochondriales Genom

Die DNA menschlicher Mitochondrien ist ein doppelsträngiges, ringförmiges Genom mit nur 16.569 Basenpaaren. Sie ist kompakt organisiert und kodiert für 37 Gene: zwei Gene für rRNA, 22 für tRNA und 13 für Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe und ATP-Synthase. Somit besteht eine zellbiologische Besonderheit der Mitochondrien darin, dass die komplexen Enzyme der oxidativen Phosphorylierung sowohl aus kern- als auch aus mitochondrial kodierten Untereinheiten bestehen.
Durch die mitochondriale DNA werden sieben (der etwa 40) Untereinheiten der NADH-Dehydrogenase, eine Untereinheit der Cytochrom-Reduktase, zwei Untereinheiten der ATP-Synthase und drei Untereinheiten der Cytochrom-Oxidase kodiert. Der überwiegende Anteil mitochondrialer Proteine (Enzyme des Citratzyklus, der Atmungskette, Carrierproteine etc.) sind in Genen des Zellkerns verschlüsselt. Die kernkodierten Proteine entstehen im Zytosol und werden von dort in die Mitochondrien transportiert. Die Transkription, Prozessierung und Translation der mitochondrialen Gene hingegen erfolgen in der mitochondrialen Matrix. Die mitochondrial kodierten Genprodukte werden, zumindest beim Menschen, nicht exportiert, sondern verbleiben alle im Organell.
Die beiden Stränge der mitochondrialen DNA (mtDNA) enthalten unterschiedlich viele Purine und haben deshalb eine unterschiedliche Dichte. So lassen sie sich durch Dichtegradientenzentrifugation in einen schweren (H) und einen leichten (L) Strang auftrennen. Die meisten Gene sind im H-Strang verschlüsselt. Der L-Strang kodiert lediglich für ein Protein und für acht tRNA-Moleküle (Abb. 11.37).

MERKE

Mitochondrien besitzen ein kleines Genom, das beim Menschen für 13 Untereinheiten der Enzyme der Atmungskette und ATP-Synthese kodiert. Ferner sind die Gene für die mitochondriale rRNA und tRNA im mitochondrialen Genom verschlüsselt.

Replikation, Regulation und Transkription der mitochondrialen DNA
Replikation
Die mitochondriale DNA-Synthese beginnt am Replikationsursprung für den H-Strang (OH), von dem aus die Replikation unidirektional erfolgt (Abb. 11.37). Erst nachdem der H-Strang komplett fertiggestellt ist, wird, ausgehend vom Replikationsursprung für den L-Strang (OL), die leichte Kette synthetisiert.
Für die Replikation der mitochondrialen DNA ist ein spezielles Enzym, die im Zellkern kodierte DNA-Polymerase (Tab. 11.3, Kap. 11.2.4), nötig. Diese hat keine Primaseaktivität, kann also keinen Primer synthetisieren, sondern benutzt ein RNA-Fragment zur Replikation, das von der RNA-Polymerase bereitgestellt wird.
Mitochondrien besitzen keine Reparatursysteme für die mitochondriale DNA mit der Konsequenz, dass Mutationen nicht repariert werden können. Die Ansammlung von Mutationen hat jedoch zunächst keine schwerwiegenden Folgen, da jede Zelle viele Mitochondrien (103–104) und jedes Mitochondrium mehrere DNA-Kopien (zwei bis zehn) enthält. Folgen der Ansammlung von Mutationen in der Mitochondrien-DNA der somatischen Zellen zeigen sich, wenn überhaupt, bei sonst gesunden Menschen erst im hohen Alter. Die sukzessive Anhäufung somatischer Mutationen gilt allerdings als ein Faktor bei altersbedingten Degenerationserscheinungen oder bei altersbedingter zunehmender Verschlechterung ererbter mitochondrialer Erkrankungen.
Regulation
Die Kontrolle der Replikation ist mit der Transkription gekoppelt. Wie bereits erwähnt, beginnt sie am Replikationsursprung für den schweren Strang (OH). Als Primer dient eine RNA, die vom L-Strang-Promotor aus synthetisiert wurde und im OH endet, sodass die Replikation der mtDNA von der LSP-kontrollierten Transkription abhängt. Die Replikation der mtDNA ist nicht vom Zellzyklus abhängig und wird insgesamt weniger streng kontrolliert als die der Kern-DNA.
Transkription
Die Transkription des schweren Strangs beginnt am H-Strang-Promotor (HSP), wobei ein kurzes und ein langes Transkript im Verhältnis von ca. 10 : 1 gebildet werden. Das kurze Transkript enthält die zwei ribosomalen RNA-Moleküle sowie die tRNAPhe und die tRNAVal. Somit werden von diesen Genen größere Produktmengen gebildet als von den anderen. Das lange Transkript besteht aus einer fast vollständigen Kopie des schweren Strangs. Die Transkription des leichten Strangs geht vom L-Strang-Promotor (LSP) aus.
Die gebildeten RNA-Moleküle werden durch eine spezifische Ribonuclease prozessiert, die das Primärtranskript spaltet und die einzelnen funktionellen RNA-Moleküle entlässt. Die mRNA-Stränge werden mit kurzen Poly(A)-Schwänzen versehen und an den mitochondrialen Ribosomen translatiert.

MERKE

Die Replikation mitochondrialer DNA ist unabhängig vom Zellzyklus. Bei der Transkription mitochondrialer Gene werden zunächst polycistronische RNA-Moleküle (Kap. 12.2.2) gebildet, die anschließend zu funktionellen RNA-Molekülen prozessiert werden.

Vererbung des mitochondrialen Genoms
Maternale Vererbung
Oozyten von Säugetieren enthalten eine hohe Zahl an Mitochondrien, die wahrscheinlich 100.000 weit übersteigt. Im Gegensatz hierzu besitzen Spermien nur 50–75 Mitochondrien. Bei der Befruchtung gelangen selbst diese wenigen Mitochondrien nicht in die Eizelle, da sie abgebaut werden.
Nach erfolgter Befruchtung teilen sich die Zellen schnell, zunächst ohne Vermehrung der Mitochondrien. Daher verdünnt sich mit jeder Zellteilung die Zahl der Organellen, bevor in einem späteren Entwicklungsstadium die Teilung der Mitochondrien einsetzt. Ihre Zahl pro Zelle schwankt von Gewebe zu Gewebe. Rote Blutzellen, die ihren ATP-Bedarf ganz aus der Substratkettenphosphorylierung der Glykolyse decken, besitzen keine Mitochondrien.
Homoplasmie und Heteroplasmie
Wie bereits erwähnt, ist die Wahrscheinlichkeit der Ansammlung von Mutationen in der mitochondrialen DNA höher als in Chromosomen, denn wichtige postreplikative Korrekturmechanismen fehlen im Organell. Man nimmt dennoch an, dass bei der Oozytenreifung eine noch nicht verstandene Qualitätskontrolle existiert, sodass nur in seltenen Fällen mutierte mitochondriale DNA-Ringe weitervererbt werden.
Nicht alle Mutationen sind schädlich, manche tragen lediglich zur beobachteten, relativ hohen Sequenzvariation verschiedener Bevölkerungsgruppen bei. Andere Mutationen können zu lebensbedrohlichen Erkrankungen führen.
In Analogie zu den Mendel-Begriffen Homozygotie und Heterozygotie spricht man bei der mitochondrialen Vererbung von Homoplasmie und Heteroplasmie (zytoplasmatische Rein- bzw. Mischerbigkeit). Als homoplasmisch bezeichnet man eine Zelle, wenn alle ihre Mitochondrien die gleiche DNA-Sequenz haben. Heteroplasmische Zellen enthalten Mitochondrien mit unterschiedlicher DNA, z.B. variierende Anteile an Mitochondrien mit mutierter und nichtmutierter DNA.

MERKE

Die Weitergabe der mitochondrialen Gene erfolgt ausschließlich über die mütterliche Linie.

Mitochondriale Erkrankungen
Bei vererbten mitochondrialen Stoffwechselstörungen sind in erster Linie ZNS, periphere Nerven, Muskeln und Drüsen betroffen. Die unmittelbare Folge einer krankheitsrelevanten mitochondrialen Mutation ist eine eingeschränkte Energieversorgung der Zelle. Einzelne Organe und Gewebe werden durch
Mängel in der zelleigenen Energieproduktion unterschiedlich stark und unterschiedlich früh beeinträchtigt. Nervenzellen verbrauchen einen erheblichen Teil ihres ATP zur Aufrechterhaltung des Membranpotenzials, für elektrische Aktivitäten, wie die Auslösung eines Aktionspotenzials und Weiterleitung elektrischer Impulse. Sie sind als Erste von einer Mangelversorgung betroffen. Muskelzellen benötigen viel Energie für die Kontraktionsarbeit. Hormonproduzierende Drüsen, wie das endokrine Pankreas, stehen an nächster Stelle, gefolgt von Organen wie Leber, Niere etc. Neben der Heteroplasmie ist die unterschiedliche Abhängigkeit der genannten Organe von der Energieversorgung wohl die Ursache dafür, dass mitochondriale Erkrankungen am häufigsten mit neuromuskulären Symptomen einhergehen. Eine Besonderheit ist, dass selten nur ein Organ allein betroffen ist; in der Regel sind es Kombinationen von betroffenen Organen.

MERKE

Mutationen in den Mitochondrien der Eizelle führen zu erblichen mitochondrialen Erkrankungen, die durch neuromuskuläre Symptome geprägt sind.

Zusammenfassung

Unser Leben ist von der Fähigkeit der Zelle abhängig, genetische Information zu speichern, abzurufen, zu übersetzen und schließlich von einer Generation zur nächsten unverändert weiterzuvererben. Alle diese Fähigkeiten sind in der DNA, dem genetischen Material, verschlüsselt. Die genetische Information besteht v.a. aus Bauplänen für Proteine. Proteine werden nach Instruktion der Gene synthetisiert und dienen allen möglichen physiologischen Funktionen: Sie bilden die Bausteine für Zellstrukturen, sie sind die Enzyme, die alle chemischen Reaktionen einer Zelle katalysieren, sie regulieren die Genexpression, ermöglichen Zellbewegungen und die Zellkommunikation.

DNA-Struktur und -Replikation

Die DNA ist eine Doppelhelix. Die antiparallel angeordneten Stränge werden durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten; sie werden in der Zelle durch Helicasen reversibel getrennt. Vor jeder Zellteilung wird die DNA repliziert. Beide Stränge der elterlichen Doppelhelix dienen als Matrize für die Synthese der neuen Doppelhelices und ermöglichen damit die Bildung zweier identischer Kopien der elterlichen DNA in den Tochterzellen. Diese Art nennt man semikonservative Replikation. Gene sind einzelne Abschnitte der DNA. Sie werden in mehrere identische RNA-Kopien transkribiert (umgeschrieben) und dann in Proteine translatiert (übersetzt).
Die Topologie der DNA ändert sich bei vielen zellulären Prozessen: der Replikation, der Rekombination, der Transkription, wahrscheinlich auch bei der DNA-Reparatur, also praktisch bei jedem zellulären Vorgang, an dem DNA beteiligt ist. Topoisomerasen sind Enzyme, die topologisch unterschiedliche Formen der DNA ineinander umwandeln. Topoisomerase-Inhibitoren werden in der antibakteriellen Therapie und in der Chemotherapie von Tumoren verwendet. Die Neusynthese der DNA aus aktivierten Bausteinen, den Desoxyribonucleotid-Triphosphaten, wird von DNA-Polymerasen katalysiert. DNA-Polymerasen habe auch eine Funktion bei der Reparatur geschädigter DNA. Die Replikation beginnt an definierten DNA-Sequenzen, den sog. Replikationsursprüngen (Ori), und verläuft von dort aus bidirektional. Die Bildung der Tochterstränge durch die DNA-Polymerase erfolgt immer von 5' nach 3'. In der Natur wurden keine
DNA-Polymerasen gefunden, die Nucleotide in umgekehrter Richtung, nämlich von 3' nach 5', polymerisieren können. Folglich wird nur der Leitstrang kontinuierlich und gleichsinnig mit der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel gebildet. Am anderen elterlichen Strang (Folgestrang) erfolgt die DNA-Synthese diskontinuierlich als kurze DNA-Abschnitte (Okazaki-Fragmente). Okazaki-Fragmente werden später zu einem kontinuierlichen Strang durch Ligasen verschweißt. Fehler bei der Replikation werden durch eine korrekturlesende Aktivität der DNA-Polymerasen minimiert.
DNA-Polymerasen können die DNA-Synthese nicht initiieren, diese Aufgabe übernimmt eine spezielle RNA-Polymerase, die Primase. Die RNA-Primer werden bei Prokaryonten von der 5'3'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase, bei Eukaryonten von einer Endonuclease entfernt. Für das Überleben der Zelle ist es von größter Bedeutung, dass die Replikation der DNA nur in einer bestimmten Phase des Zellzyklus (S-Phase) stattfindet und dass jeder Abschnitt des Genoms exakt einmal pro Zyklus repliziert wird. Endabschnitte der linearen eukaryontischen Chromosomen (Telomere) werden bei jeder Replikationsrunde verkürzt, ein Prozess, der die Lebensdauer von Körperzellen einschränkt. In Keimbahnzellen werden Telomere durch die Telomerase verlängert, eine reverse Transkriptase, die ihre RNA-Matrize selbst mitbringt.

Chromatin

Die DNA eukaryontischer Zellen ist mit diversen Proteinen, hauptsächlich mit den basischen Histonen, assoziiert. Der Komplex aus DNA und Protein wird Chromatin genannt. Die kleinste Packungseinheit des Chromatins ist das Nucleosom. Je zwei Moleküle der vier Kernhistone (H2A, H2B, H3 und H4) lagern sich zu einem Histon-Oktamer zusammen, um das sich 146 Basenpaare der DNA-Kette wickeln. Zwei Nucleosomenkerne sind durch unterschiedlich lange Verbindungs-DNA miteinander verbunden. Höhere Eukaryonten besitzen ein weiteres Histon, das Histon H1. H1 ist sowohl mit der Linker-DNA als auch mit dem Nucleosomenkern assoziiert. Die Kette aus Nucleosomen kann diverse Strukturen steigender Packungsdichte annehmen: das 11-nm-Filament, die 30-nm-Faser-Struktur und höhere Organisationsformen. Letztere sind in ihren Einzelheiten noch nicht aufgeklärt; ein anschauliches Modell postuliert die Faltung der 30-nm-Faser zu Schleifen. In der Mitose werden die Schleifen über weitere Stufen der Kompaktion zu den lichtmikroskopisch sichtbaren Chromosomen verdichtet.
Das dicht gepackte Chromatin muss überall zugänglich sein, um einzelne Gene nach Bedarf zu exprimieren, die DNA zu replizieren, schadhafte Stellen in der DNA zu reparieren etc. Chromatin-Remodellierungskomplexe sorgen für die Zugänglichkeit. Acetylierung, Methylierung und andere Modifikationen der Histonarme machen Histone zu Andockstellen für Proteine, die die genannten Funktionen einleiten.

Gene und Genome

Gene sind konstante, untereinander frei kombinierbare Einheiten der Vererbung. Sie sind Baupläne für Proteine oder RNA. Ein Gen kann als ein Abschnitt des Genoms definiert werden, der notwendig und hinreichend ist, um die Bildung eines funktionellen Proteins oder einer RNA zu verschlüsseln. Eukaryontische Gene sind nicht zusammenhängend; kodierende Abschnitte (Exons) werden von nichtkodierenden Abschnitten (Introns) unterbrochen. Die Organisation eukaryontischer Gene in Exons und Introns beschleunigt die Evolution von Organismen, denn die Rekombination von Exons führt zu funktionell neuen Genen.
Während bei Prokaryonten und einfachen Eukaryonten die Gene in dichter Folge in den Chromosomen aufgereiht sind, sind eukaryontische Gene von Tausenden Nucleotiden an nichtkodierender DNA umgeben. Das menschliche Genom besteht zu ca. 97% aus nichtkodierender DNA. Die überwiegende Zahl der Gene eines höheren Eukaryonten kommt im haploiden Genom nur einmal vor. rRNA-, tRNA- und Histon-Gene jedoch kommen in höherer Kopienzahl vor. Genduplikationen bilden die Grundlage für die Entstehung neuer Gene und ganzer Genfamilien.
Etwa die Hälfte der nichtkodierenden DNA des menschlichen Genoms ist unique, d.h., ihre Nucleotidsequenz kommt im Genom nur einmal vor. Die andere Hälfte ist dagegen in Tausenden Kopien oder noch häufiger vertreten. Sie sind entweder wie Glieder einer Kette nebeneinander aufgereiht (Satelliten, Mini- und Mikrosatelliten) oder in bis zu 1.000.000 Kopien, mehr oder weniger nach dem Zufallsprinzip, im gesamten Genom verstreut. Letztere sind bewegliche Elemente des Genoms. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass sie ihren angestammten Ort im Chromosom verlassen können und sich an anderer Stelle wieder in das Genom integrieren. Die häufigsten Vertreter dieser Elemente sind die SINEs und LINEs.
Viren sind kleine parasitäre Partikel ohne eigenen Stoffwechsel, die zur Vermehrung auf eine Wirtszelle angewiesen sind und dazu das Programm der Zelle so abändern, dass ihr Überleben gewährleistet ist. Jedes Virus enthält DNA oder RNA als genetisches Material.
Das Genom einiger Viren ist sehr klein und kodiert im Extremfall für nur drei Proteine, wie bei den meisten tierischen Retroviren; bei größeren und komplexeren Viren (z.B. Epstein-Barr-Virus) können im Genom mehrere hundert Proteine verschlüsselt sein. Retroviren und manche DNA-Viren (Adenovirus, Herpesvirus, menschliche Papillomaviren) können ihre DNA in das Wirtsgenom integrieren. Infektion mit Viren führt häufig zu schweren bis schwersten Erkrankungen.
Mitochondrien besitzen ein kleines ringförmiges Genom. Die DNA menschlicher Mitochondrien kodiert für 37 Gene: zwei Gene für rRNA, 22 für tRNA und 13 für Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe und ATP-Synthase. Die Replikation mitochondrialer DNA ist unabhängig vom Zellzyklus: Bei der Transkription mitochondrialer Gene werden zunächst polycistronische RNA-Moleküle gebildet, die anschließend zu funktionellen RNA-Molekülen prozessiert werden. Die Weitergabe der mitochondrialen Gene erfolgt ausschließlich maternal. Mutationen in den Mitochondrien der Eizelle führen zu erblichen mitochondrialen Erkrankungen, die durch neuromuskuläre Symptome geprägt sind.

Fragen

  • 1.

    Gegeben ist ein Abschnitt eines Gens (ATG Startcodon für das kodierte Protein): 5'-CGATGAGATCGAAACCC-3'. Schreiben Sie die Sequenz des Gegenstrangs in 5'3'-Richtung und die Sequenz der kodierten mRNA in 5'3'-Richtung.

  • 2.

    Gezeigt ist ein Abschnitt aus dem Genom eines RNA-Tumorvirus. Schreiben Sie die Sequenz, die durch die reverse Transkriptase synthetisiert wird. 5'-C-C-G-U-A-A-U-3' 5'- - - - - - - -3'

  • 3.

    Welche Rolle spielt die 3' 5'-Exonuclease-Aktivität von DNA-Polymerasen?

  • 4.

    Welche Rolle spielt die Primase bei der Replikation des Leitstrangs und des Folgestrangs?

  • 5.

    Welche gemeinsamen Eigenschaften von Aciclovir und Azathymidin machen diese Substanzen zu geeigneten Medikamenten bei der Therapie von Virusinfektionen? Denken Sie dabei an die Struktur der Substanzen und die Affinitäten dieser Substanzen zu Enzymen.

  • 6.

    Beschreiben Sie zwei Mechanismen, durch die genetische Elemente sich von einer Stelle im Genom zu einer anderen bewegen können.

  • 7.

    Welche sind die wesentlichen Unterschiede zwischen bakteriellen Genomen und denen der höheren Eukaryonten? Denken Sie dabei an die Komplexität der Genome, die Regulation der Gene, kodierende Sequenzen und die Verpackung des genetischen Materials.

  • 8.

    Was bedeutet der Begriff DNA-Denaturierung? In welcher Weise hängt die Denaturierung vom GC-Gehalt der DNA ab?

  • 9.

    Worin unterscheiden sich RNA- und DNA-Polymerasen?

  • 10.

    Welche Enzyme sind unmittelbar an der Replikation menschlicher DNA im Zellkern beteiligt?

015 IMPP-Fragen

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