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B978-3-437-43690-1.10003-8

10.1016/B978-3-437-43690-1.10003-8

978-3-437-43690-1

Extreme Bandbreite biologischer Aktivitäten von Proteinkatalysatoren. Enzyme können Reaktionen beschleunigen, in denen Reaktanten aus (a) Makromolekülen oder (b) niedermolekularen Verbindungen bestehen.

NAD(P)-bindende Rossmann-Faltungsdomäne als Funktionsmodul der Dehydrogenasen, hier am Beispiel der Alkohol-Dehydrogenase. Die Proteindomäne ist aus dem zentralen -Faltblatt (türkis) aufgebaut, das von mehreren -Helices (rot) umrahmt ist. Sie bildet die Bindungsstelle für das Coenzym NAD+.

Energiediagramm der chemischen Reaktion A + B AB. Bildung eines Komplexes aus den beiden Reaktanden A und B. Es sind lediglich die Energieniveaus der Edukte A und B (Anfangszustand) und des Produkts AB (Endzustand) der Reaktion gezeigt.

Der molekulare Ablauf der Reaktion A + B AB. Er wird als Funktion der freien Enthalpie G durch die sog. Reaktionskoordinate dargestellt (Energieprofil). Es muss eine Aktivierungsschwelle überschritten werden, damit die Reaktion ablaufen kann (G). Das Diagramm gilt gleichermaßen für die Hin- und die Rückreaktion.

Temperaturabhängigkeit der Energieverteilung von Molekülen im Gaszustand. Die Verteilung der Moleküle entsprechend ihrer kinetischen Energie ist nach Ergebnissen der statistischen Thermodynamik (Boltzmann-Statistik) dargestellt. Bei höherer Temperatur wächst die Energie der Moleküle. Die Anzahl der Moleküle mit Energiebeträgen oberhalb einer Aktivierungsschwelle , vergleichbar mit der Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion, nimmt entsprechend zu (grüne Fläche unterhalb der blauen, bzw. roten Kurve). Das Phänomen lässt sich auf den Zustand in Flüssigkeiten gelöster Stoffe verallgemeinern und erklärt die generelle Zunahme chemischer Reaktionsgeschwindigkeiten mit anwachsender Temperatur.

Molekularer Ablauf einer Reaktionsfolge.

a) Energieprofil der Bildung des Komplexes AB aus den zwei Komponenten A und B durch zwei aufeinanderfolgende Reaktionen mit den Übergangszuständen (AB1, AB2) und der Entstehung eines Zwischenprodukts. Inmitten der Aktivierungsberge des Energiediagramms liegt ein Energieminimum, ein metastabiler Zwischenzustand. Dieser hat nur eine gewisse Lebensdauer und wird auch als Reaktionsintermediat I bezeichnet.

b) Energieprofile von Reaktionsfolgen, deren geschwindigkeitsbestimmender Teilschritt am Anfang (links) oder Ende (rechts) der Sequenz liegt.

Energiediagramm der chemischen Reaktion A + B AB in Gegenwart und Abwesenheit eines Katalysators. Der Energiegehalt des Übergangszustands AB wird durch den Katalysator erniedrigt, AB wird also chemisch stabilisiert. Die Aktivierungsenthalpie (G) ist im Vergleich zur unkatalysierten Reaktion erheblich niedriger, wodurch der relative Anteil reaktiver Moleküle stark ansteigt. Hierdurch wird die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht.

Diffusionslimitation biochemischer Reaktionen. Die farbigen Kugeln repräsentieren Reaktanden (große blaue Kugeln: Enzyme, kleine rote Kugeln: Substrate), die zum Eintritt einer Reaktion aufeinandertreffen müssen. Die maximal mögliche Reaktionsgeschwindigkeit ist durch die Diffusionsgeschwindigkeit der Reaktanden im Lösungsmittel Wasser (graue Kugeln) limitiert.

Schlüssel-Schloss-Prinzip der Bindung von Enzym und Substrat.

a) Beide Komponenten werden als starre Gebilde angenommen. Die Struktur des Proteins im Bereich der Substratbindungsstelle ist sterisch komplementär zum Substrat.

b) Induced fit-Prinzip, bei dem sich die Proteinoberfläche der Bindestelle um das Substrat schmiegt.

Induced fit bei der Substratbindung der Hexokinase. Das freie Enzym (a) hat im Bereich der Substratbindungsstelle eine andere Konformation als (b) das substratbindende Enzym. Genau genommen ist in (b) ein Substratanalogon (blau) gebunden, das dem Substrat zwar strukturähnlich ist, jedoch nicht katalytisch umgesetzt wird. Dieser experimentelle Kunstgriff ist erforderlich, wenn man die Struktur von stabilen Enzym-Substrat-Komplexen erforschen will, weil der originale Enzym-Substrat-Komplex ja naturgemäß zeitlich instabil ist.

Energieprofil einer enzymkatalysierten Reaktion. Die Minima im Kurvenverlauf (rote Kurve) geben die relative Absenkung des Energieniveaus im Vergleich zur unkatalysierten Reaktion (blaue Kurve) aufgrund der Bildung des Enzym-Substrat- (ES) und Enzym-Produkt-Komplexes (EP) an. ES und EP sind Intermediate der Enzymreaktion.

Räumliche Organisation der Reaktanden durch Immobilisierung auf dem Enyzm. Bindung der beiden Nucleotidreaktanden an der Adenylat-Kinase. Nach Einfang und korrekter Positionierung der immobilisierten Substrate wird die Phosphatgruppe von ATP (links) auf AMP (rechts) übertragen. Danach verlassen die Produkte der Reaktion (2 ADP-Moleküle) das Enzym. Im Modell ist das dem ATP strukturanaloge Molekül AMPPNP im Komplex mit Mg (grüne Kugel) abgebildet.

Wasserausschluss vom aktiven Zentrum bei Dehydrogenasen. Am Modell der Lactat-Dehydrogenase wird deutlich, dass durch das Zusammenfalten von Polypeptidschleifen Wasser aus dem aktiven Zentrum gepresst wird und so Substrat und Coenzym vom Solvens abgeschieden werden. Damit ist ein stabiler Übertritt des Hydridions vom NADH auf Pyruvat möglich. NADH: blaues Rechteck, NAD+: grünes Rechteck, Pyruvat: blauer Kreis, Lactat: grüner Kreis

Metallkomplexbildung am Beispiel der Carboanhydrase.

a) Modell der Carboanhydrase und der Zinkbindungsstelle im aktiven Zentrum. Zn2+ (graue Kugel) ist von drei Histidinresten koordiniert, die vierte Koordinationsstelle ist von Wasser besetzt (rote Kugel: Sauerstoff).

b) Aktivierung des Wassers in der Carboanhydrase, im proteingebundenen Zustand hat das Wasser einen pK-Wert kleiner als 7 und deprotoniert.

c) Die Reaktion der Carboanhydrase als Beispiel für einen simplen katalytischen Mechanismus: Im aktiven Zentrum des Enzyms ist die Hydroxylgruppe in Richtung des polarisierten Substrats orientiert. Durch den schnellen und ungehinderten Angriff des Nucleophils auf das partiell positiv geladene Kohlenstoffatom von CO2 erklärt sich die hohe Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion (Abb. 3.15).

Reaktionsmechanismus von Chymotrypsin. a) Proteolytische Spaltungsreaktion eines Substratpeptids, z.B. durch das Enzym Chymotrypsin (eine Serinprotease) b) Modell des Reaktionsmechanismus von Chymotrypsin. Die funktionelle Gruppe des katalytisch aktiven Serins ist gelb hinterlegt.

Substratspezifität der Serinproteasen. Schematisches Modell der S1-Substratbindungstaschen (Spezifitätstasche, rot) der Proteasen Elastase, Trypsin und Chymotrypsin und der proteasespezifischen Aufnahme von Substratpeptiden.

Struktur der katalytischen Triade, dem aus den drei Aminosäureresten Aspartat-Histidin-Serin bestehenden funktionellen Zentrum von Serinproteasen, Lipasen und Esterasen.

pH-Aktivitätsbereich verschiedener Proteine.

Temperaturoptimum von Proteinen.

Schema einer Enzym-Substrat-Reaktion nach dem Modell von Michaelis und Menten.

Konzentrationsverhältnisse der Reaktionspartner bei einer Modell-Enzymreaktion nach dem Modell von Michaelis und Menten. Wenn Enzym (E) und Substrat (S) zum Enzym-Substrat-Komplex (ES) reagieren, bildet sich ein quasistationärer Zustand (Fließgleichgewicht) aus, bei dem die Konzentration von ES über gewisse Zeit konstant ist. In diesem Zustand sind Substratverbrauch (blaue Kurve) und Produktbildung (grüne Kurve) linear.

Substratabhängigkeit einer Modell-Enzymreaktion (Michaelis-Menten-Kinetik). Die Abhängigkeit der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0 von der Substratkonzentration wird (a) in der hyperbolischen Darstellung oder (b) im doppelt reziproken, sog. Lineweaver-Burk-Diagramm deutlich.

Spektralphotometrie. a) Aufbau eines Spektralphotometers zur Bestimmung von Enzymaktivitäten. b) Reaktion der alkalischen Phosphatase mit dem Pseudosubstrat p-Nitrophenylphosphat. c) Absorptionsspektren von 50 M p-Nitrophenylphosphat (rot) und p-Nitrophenolat (blau; phosphorylierte und dephosphorylierte Form) bei pH 8,7.

Workflow für die nichtkontinuierliche Messung von Enzymaktivitäten. Das Reaktionsgemisch von Enzym und Substrat wird nach definierten Zeitintervallen t z.B. durch Denaturieren des Enzyms abgestoppt, und die Mengen an gebildetem Produkt oder des verbliebenen Substrats werden quantitativ bestimmt.

Kompetitive Hemmung von Enzymreaktionen. Graphisches Modell (a) und Reaktionsgleichungen (b) der Interaktion von Enzym mit Inhibitor und Substrat. Hyperbolisches (c) und Lineweaver-Burk-Diagramm (d) der Abhängigkeit der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors.

Indinavir.

a) Struktur von Indinavir, einem am aktiven Zentrum der HIV-Protease bindenden Inhibitor

b) Struktur des Komplexes von HIV-Protease und Indinavir.

Nichtkompetitive Hemmung von Enzymreaktionen. Graphisches Modell (a) und Reaktionsgleichungen (b) der Interaktion von Enzym mit Inhibitor und Substrat. Hyperbolisches (c) und Lineweaver-Burk-Diagramm (d) der Abhängigkeit der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration in Gegenwart eines nichtkompetitiven Inhibitors.

Strukturformeln von (a) Uracil und (b) Fluorouracil.

Strukturformeln von irreversiblen Hemmstoffen.

a) Acetylsalicylsäure (Aspirin)

b) der Suizidinhibitor Penicillin.

R ein variabler Substituent. Farblich hervorgehoben ist der dem bakteriellen Zellhüllenbestandteil D-Alanyl-D-Alanin strukturanaloge Teil, der im Ringsystem verborgen liegt.

Wirkungsmodi von allosterischen Effektoren, die durch Bindung die Aktivität von Enzymen modulieren, rot: Enzymkonformation 1 (mit niedrigerer bzw. höherer Aktivität oder Affinität), grün: Enzymkonformation 2 (mit höherer bzw. niedrigerer Aktivität oder Affinität.

Der Effektor kann am Enzym entweder (a) heterotrop an einem von der Substrattasche verschiedenen Ort binden (gelb) oder (b) als Substrat homotrop an die Substrattasche binden (blau). (c) Allosterische Feedback-Hemmung, demonstriert am Modell eines Stoffwechselwegs mit Zwischenprodukten (B, C, D), deren Umwandlung durch verschiedene Enzyme E1-E4 katalysiert wird (a). Durch Bindung des Produkts P an das Enzym E1 kommt die Sequenz zum Erliegen.

Bindungskurve von Sauerstoff an Myoglobin (blau) und Hämoglobin (rot). Der Bindungsgrad (%) ist in Abhängigkeit vom Sauerstoffdruck aufgetragen, dieser ist proportional zur Sauerstoffkonzentration. Bei Myoglobin entspricht 100% Bindung 1 mol O2/mol Mb, bei Hämoglobin entspricht 100% Bindung 4 mol O2/mol Hb. Für Hämoglobin ist Sauerstoff ein homotrop wirkender Effektor. Die rot gestrichelte Kurve stellt die Sauerstoffbindung von Hämoglobin in Gegenwart des heterotrop wirkenden Effektors BPG (2,3-Bisphosphoglycerat) dar.

3-D-Strukturen des tetrameren Hämoglobin (22) in der Oberflächendarstellung.

a) Desoxyhämoglobin

b) Oxyhämoglobin

c) BPG-gebundenes Desoxyhämoglobin.

-Untereinheiten rot, -Untereinheiten blau, Hämgruppen grün-rot, BPG grau-rot.

Allosterie von Hämoglobin. Das Tetramer existiert in zwei unterschiedlichen Konformationen. Die T-Form besteht nur aus den quadratisch symbolisierten Untereinheiten mit niedriger Affinität zu O2, während sich die R-Form nur aus den kreisförmig symbolisierten Untereinheiten mit hoher Affinität zu O2 zusammensetzt.

a) Symmetriemodell: Weil nur zwei Proteinzustände angenommen werden (hoch- oder niedrigaffine Form), in denen alle Untereinheiten immer die gleiche Konformation haben, bezeichnet man das Modell als symmetrisch.

b) Sequenzmodell: Durch Bindung eines O2-Moleküls erhöht sich die Affinität der jeweils benachbarten Untereinheit, die Konformationsumwandlung erfolgt sequenziell.

Pyridinnucleotidbiosynthese.

a) Feedback-Regulation des Reaktionswegs. ATC Aspartat-N-Carbamoylase

b) Struktur der ATC im niedrigaffinen T-Zustand, Ansicht von oben

c) Seitenansicht von ATC. Dunkelrot: Sechs katalytische Untereinheiten bilden zwei Trimere, die in zwei Ebenen angeordnet sind; hellrot: sechs regulatorische Untereinheiten, die außen an die katalytischen Untereinheiten binden; rot, mit Pfeilen markiert: der an die regulatorischen Untereinheiten gebundene heterotrope Effektor CTP.

Allosterische Regulation am Beispiel des Enzyms Aspartat-Transcarbamoylase (ATC).

a) Sigmoide Kurve der Gesamtaktivität und ihre hyperbolischen Aktivitätskurven der reinen T- und R-Komponenten: T-Form (rot, hohe Km, niedrige Affinität) und R-Form (grün, niedrige Km, hohe Affinität). Die beiden Formen der ATC haben verschiedene Konformationen mit unterschiedlicher Aspartataffinität. Ihre Substratabhängigkeiten können durch die theoretischen hyperbolischen Kurven dargestellt werden (rot [T], grün [R]). Die Konformationen von T und R entstehen durch Teilrotation und Auseinanderbewegung der katalytischen Untereinheiten (dunkelrot/dunkelgrün) sowie das Nachfolgen der regulatorischen Untereinheiten (hellrot/hellgrün). Die relativen Anteile von T- und R-Form sind von der Konzentration des positiv kooperativen Substrats Aspartat abhängig. Entsprechend ihrem Komponentenverhältnis verändern sich auch deren Kurvenbeiträge zum tatsächlichen sigmoiden Gesamtkurvenverlauf (blaue Kurve).

b) Wirkung heterotroper Modulatoren: Rechtsverschiebung der Substrataktivierungskurve durch Bindung des heterotropen Inhibitors CTP und die Linksverschiebung durch den heterotropen Aktivator ATP.

Schematische Darstellung der intrasterischen Kontrolle von Kinasen durch Autoinhibition. a) Freisetzung des aktiven Zentrums durch Phosphorylierung (CDK2). b) Die Assoziation katalytischer und regulatorischer Untereinheiten der PKA wird durch Bindung von cAMP aufgehoben und die katalytische Untereinheit freigesetzt. Es ist nur je eine katalytische und regulatorische Untereinheit gezeigt. Rotes Symbol: Substrat der Proteinlinase. c) Die katalytische Untereinheit phosphoryliert PDE, die hydrolytisch die Konzentration von cAMP absenkt, wodurch sich das inaktive Tetramer reformiert.

Aktivierung einer Protease aus einer inaktiven Vorstufe am Beispiel des Chymotrypsins. Das im Dünndarm extrazellulär benötigte Chymotrypsin wird in Pankreaszellen als inaktives Chymotrypsinogen gebildet, in Vesikel verpackt und durch Exozytose in das Pankreassekret abgegeben. Aktiviert wird es erst durch das Zusammentreffen mit Trypsin. Trypsin wird durch die Endopeptidase Enkropeptidase aus seiner Vorstufe Trypsinogen gebildet. Durch proteolytische Spaltung hinter Arginin 15 entsteht das bereits aktive -Chymotrypsin. Dies wird durch autokatalytisches Herausspalten von zwei Dipeptiden in das aktive Produkt -Chymotrypsin umgewandelt. Die Bruchstücke A–B und B–C bleiben aufgrund von Disulfidbrücken verbunden (gelb).

Interkonversion der Glykogen-Phosphorylase.

Bindung von Imatinib (Glivec) an das Protoonkoprotein Tyrosin-Protein-Kinase Abl. Das hochspezifisch wirksame Krebsmedikament Glivec (grün) bindet als kompetitiver Hemmstoff an die kanonische ATP-Bindestelle der Protein-Kinase-Domäne (orange). Dadurch inhibiert es den Phosphotransfer auf Tyrosingruppen von Akzeptorproteinen (nicht gezeigt).

Strukturen von lumineszierenden Biomolekülen.

a) Luciferin des Glühwürmchens, das Substrat der Luciferase

b) Struktur von Coelenteracin, dem Cofaktor des Aequorins.

Chromophor (blau, im Inneren) und 3-D-Struktur des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP).

Freie Standardenthalpien G0' und Gleichgewichtskonstanten K für einige wichtige biochemische Reaktionen (die Konstanten gelten für pH 7)

Tab. 3.1
Reaktion K G0ʹ (kJ mol–1)
ATP + H2O ADP + Pi + H+ 3,5 105 –32
Glucose-6-phosphat + H2O Glucose + Pi 2,6 102 –14
Glucose 2 Ethanol + 2 CO2 5 1045 –260
Glucose + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O 10506 –2.880

Thermodynamik der TIM-Reaktion

Tab. 3.2
Produkt und Edukt der Triosephosphat-Isomerase-Reaktion G +7,50 kJ mol–1 (Standardbedingungen) G 0 kJ mol–1 (chemisches Gleichgewicht) G –2,19 kJ mol–1 (spontaner Verlauf)
Glycerinaldehyd-3-phosphat ( G3P) 1 mM 0,048 mM 0,020 mM
Dihydroxyacetonphosphat ( DAP) 1 mM 1 mM 1 mM
[G3P] : [DAP] 1 : 1 1 : 20,6 1 : 50

Enzymkatalyse – Geschwindigkeiten von unkatalysierten und katalysierten Reaktionen

Tab. 3.3
Enzym Reaktion nichtenzymatische Reaktionsgeschwindigkeit k [s–1] enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit kkat [s–1] katalytischer Beschleunigungsfaktor kkat/k
Carboanhydrase H2O + CO2 H+ + HCO3 1,3 ∙ 10–1 106 7,7 ∙ 106
Chymotrypsin Substratpeptid Produktpeptide 4 ∙ 10–9 4 ∙ 10–2 107
Trioseisomerase Dihydroxyacetonphosphat Glycerinaldehyd-3-phosphat 6 ∙ 10–7 2 ∙ 103 3 ∙ 109
Fumarase Fumarat + H2O L-Malat 2 ∙ 10–6 2 ∙ 103 1011
Urease H2N-CO-NH2 CO2 + 2 NH3 3 ∙ 10–10 3 ∙ 104 1014
alkalische Phosphatase R-phosphat + H2O R-OH + Pi 10–15 102 1017

Substratspezifität der Alkohol-Dehydrogenase (Klasse I) aus der Leber

Tab. 3.4
Substrat Aktivität (%)
Ethanol 100
Methanol 10
Ethylenglykol 46
Benzylalkohol 48
Octanol 58
16-Hydroxyhexadecansäure 52
Cyclohexanol 52

pH-Optima ausgewählter Enzyme

Tab. 3.5
Enzym pH-Optimum
Pepsin 1,5
Katalase 7,6
Trypsin 7,7
Fumarase 7,8
Ribonuclease 7,8
Arginase 9,7

Katalytische Konstanten einiger Enzyme

Tab. 3.6
Enzym Substrat Km (mol L–1) kkat (s–1) kkat/Km (mol–1 L s–1)
Acetylcholinesterase Acetylcholin Essigsäure + Cholin 9 10–5 1,4 104 1,6 108
Carboanhydrase H2O + CO2 H+ + HCO3 1,2 10–2 1 106 8,3 107
Katalase 2 H2O2 2 H2O + O2 1,1 4 107 4 107
Cyclophilin (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase) cis trans-Prolyl-Peptidbindung 8,7 10–4 1,3 104 1,5 107

Substratwirkungsbereich glykolytischer Enzyme

Tab. 3.7
Enzym Km (mmol L–1) [S]/Km
Glucokinase 15 0,25–1,7
Hexokinase 0,1 40
6-Phosphoglucose-Isomerase 0,21 1
Phosphofructokinase 0,27 0,2
Aldolase 0,01 1–3
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 0,04 0,08
3-Phosphoglycerat-Kinase 0,01 < 0,1
2,3-Phosphoglycerat-Mutase 0,24 1
Enolase 0,03 1
Pyruvat-Kinase 0,06 1
Lactat-Dehydrogenase 0,14 0,7

[S] entspricht der intrazellulären Substratkonzentration

Halbwertszeit von Enzymen in der Rattenleber

Tab. 3.8
Enzym biologische Halbwertszeit t1/2
Ornithin-Decarboxylase 11 min
Tyrosinaminotransferase 2 h
Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase 3h
Serin-Dehydratase 4 h
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 5 h
Glucokinase 12 h
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 15 h
Acetyl-CoA-Carboxylase 2d
Arginase 5 d
Lactat-Dehydrogenase 16 d

Enzymregulation durch Interkonversion

Tab. 3.9
Stoffwechselweg Enzym E aktiver Zustand
Glykogenolyse Glykogen-Phosphorylase E ~ P
Phosphorylase-Kinase E ~ P
Glykogensynthese Glykogen-Synthase E
Kohlenhydratabbau Pyruvat-Dehydrogenase E
Fettabbau Triacylglycerin-Lipase E ~ P
Cholesterin-Esterase E ~ P

Enzyme

M. Lübben

  • 3.1

    Struktur und Aufgaben von Enzymen 82

  • 3.1.1

    Spezialisierte Proteindomänen82

  • 3.1.2

    Reaktionsbeschleunigung innerhalb von Stoffwechselwegen83

  • 3.2

    Thermodynamische und kinetische Grundlagen 83

  • 3.2.1

    Thermodynamische Voraussetzungen83

  • 3.2.2

    Reaktionsgeschwindigkeit85

  • 3.2.3

    Aktivierung chemischer Reaktionen86

  • 3.3

    Enzyme als Biokatalysatoren 88

  • 3.3.1

    Diffusionslimitation88

  • 3.3.2

    Aktives Zentrum und Substratbindung88

  • 3.3.3

    Substratimmobilisierung91

  • 3.3.4

    Kompartimentierung durch Wasserausschluss91

  • 3.3.5

    Katalytische Strategien92

  • 3.3.6

    Eigenschaften von Enzymen94

  • 3.4

    Enzymkinetik 96

  • 3.4.1

    Das Michaelis-Menten-Modell96

  • 3.4.2

    Enzymaktivitätsbestimmung99

  • 3.4.3

    Enzyminhibition100

  • 3.5

    Regulation der Enzymaktivität 104

  • 3.5.1

    Nichtkovalente Enzymregulation104

  • 3.5.2

    Kovalente Enzymregulation110

  • 3.6

    Isoenzyme 112

  • 3.6.1

    Definition112

  • 3.6.2

    Oligomere Isoenzyme112

  • 3.6.3

    Organspezifität113

  • 3.7

    Systematische Klassifikation von Enzymen 113

  • 3.7.1

    Enzymklassen113

Praxisfall

Der 59-jährige Maurer Herr Z. klagt am Vormittag über plötzlich auftretende, als einschnürend empfundene Schmerzen im Brustbereich, die bis in den linken Oberarm ausstrahlen. Der rasch herbeigerufene Notarzt weist Herrn Z. ins Krankenhaus ein. Die Beschwerden weisen auf eine ischämische Schädigung des Herzmuskels hin. Das Elektrokardiogramm bestätigt die Verdachtsdiagnose eines Myokardinfarkts. Der Umfang der Gewebeschädigung wird durch Labortests deutlich: Die Aktivitäten der in das Blutplasma freigesetzten Enzyme Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) liegen weit über dem Normwert. Stark erhöht ist auch die Creatinkinase (CK), die besonders charakteristisch für Muskelschädigungen ist. Die immunologische Laboruntersuchung zeigt eine stark erhöhte Serumkonzentration des herzmuskelspezifischen Isoenzyms CK-MB sowie des Herzgewebemarkers kardiales Troponin T (cTNT). Am Patienten wird sofort eine thrombolytische Behandlung der Myokardischämie eingeleitet.

Zur Orientierung

Ein wesentliches Merkmal der belebten Materie besteht in der Fähigkeit, anorganische und organische Stoffe umzusetzen. Diese Reaktionen können in zahlreichen Varianten auftreten, und sie werden durch spezifische zelluläre Katalysatoren beschleunigt, die sich u.a. auf Geschwindigkeit und Energieaufwand einer Reaktion auswirken. Hinsichtlich ihrer biochemischen Natur können die Katalysatoren beispielsweise aus Ribonucleinsäure bestehen. Solche sog. Ribozyme sind an elementaren Prozessen wie der mRNA-Prozessierung oder der Proteinbiosynthese beteiligt und stellen nach gegenwärtigen Hypothesen den molekularen Nachhall einer früheren Evolutionsstufe dar, der sog. RNA-Welt. Als wahres Erfolgsmodell der molekularen Entwicklungsgeschichte haben sich Proteinkatalysatoren erwiesen; sie sind gemeinhin als Enzyme bekannt. Sie stellen die anpassungsfähigsten und vielseitigsten Biomoleküle dar, die wir kennen. Die Regulation der Enzymaktivitäten ist ein kompliziertes System, wobei sich Enzyme u.a. selbst oder gegenseitig durch unterschiedliche Mechanismen aktivieren oder hemmen. Dies passiert auf unterschiedlichsten Ebenen, z.B. bei der Synthese von Enzymen, durch Hemmung von Rezeptoren oder durch direkte Aktivierung bzw. Inaktivierung eines Enzyms.

Struktur und Aufgaben von Enzymen

Die Bandbreite enzymkatalysierter stofflicher Umwandlungen ist unglaublich vielfältig. Man denke z.B. an informationstragende Makromoleküle, wie die Erbträgersubstanz DNA, die enzymatisch mit hoher Präzision vervielfältigt (DNA-Polymerase), abgelesen (RNA-Polymerase) oder verknüpft (DNA-Ligase) werden kann. Aber auch stoffliche Änderungen, in denen niedermolekulare Substanzen durch spezifische Reaktionen gezielt verändert werden, sind ohne Enzyme undenkbar. Dazu gehören z.B. verschiedene Umsetzungen des Nahrungsstoffs Glucose (Abb. 3.1). Enzyme sind an fast allen biochemischen Reaktionen beteiligt und zeichnen sich daher durch enorme Vielseitigkeit und besondere Spezifität aus. Die hochgradige funktionelle Spezialisierung der Enzyme wird durch ihre besondere molekulare Architektur ermöglicht, die zwar abhängig von der biologischen Spezies und der betrachteten chemischen Reaktion ist, aber erstaunlich oft gemeinsame Bauprinzipien aufweist.

Spezialisierte Proteindomänen

Wie alle anderen Proteine können Enzyme gemäß ihrer auf Strukturähnlichkeit basierenden Verwandtschaftsbeziehungen in Klassen eingeteilt werden. Enzymsuperfamilien fassen strukturverwandte Proteine zusammen, die zwar unterschiedliche Substrate umsetzen, aber dabei oft gleiche katalytische Strategien nutzen. Diese Enzyme weisen v.a. in den funktionell bedeutenden Regionen gemeinsame Designprinzipien auf, die phylogenetisch auf ein gemeinsames Vorläuferprotein schließen lassen. Die katalytische Wirkung eines Enzyms kann z.B. auf der Aktivität einer oder mehrerer Domänen beruhen, die bereits als Funktionsmodule der Proteine vorgestellt worden sind (Kap. 2).
Exemplarisch gesehen, stellen die NAD(P)+-bindenden Rossmann-Faltungsdomänen (Abb. 3.2) eine wichtige Kategorie dar. Sie gehören zu den sog. - und - oder /-Proteinen, die aus drei übereinander liegenden Schichten () bestehen und ein zentral gelegenes, aus sechs parallelen -Strängen bestehendes Faltblatt besitzen. Dieses Faltungsmuster findet sich bei den auf unterschiedliche Substrate spezialisierten Alkohol-, Glycerinaldehyd-3-phosphat-, Lactat- und 6-Phosphogluconat-Dehydrogenasen, um nur einige Mitglieder dieser großen Familie zu nennen. Wie der Name sagt, schließt das gemeinsame Bauprinzip dieser Enzymkategorie die Bindung eines Cofaktors NAD+ oder NADP+ ein, der für die Funktion und den Reaktionsmechanismus dieser Katalysatoren unerlässlich ist. Reversibel gebundene Cofaktoren werden auch als Coenzyme bezeichnet, die zusammen mit den Proteinanteilen (Apoenzyme) die funktionstüchtigen Holoenzyme liefern. Auf die Struktur und Funktion von NAD+, NADP+ und anderen Coenzymen wird detailliert in Kap. 4 eingegangen. Andere für die Enzymaktivität unverzichtbare Cofaktoren sind irreversibel an das Protein gebunden, hierzu zählen Metalle, die spezielle Funktionen im Reaktionsmechanismus erfüllen.

Reaktionsbeschleunigung innerhalb von Stoffwechselwegen

Proteinkatalysatoren sind für den Ablauf praktisch aller Stoffwechselwege von erheblicher Bedeutung. Der Aufbaustoffwechsel (Anabolismus) stellt biologisch wertvolle Verbindungen biosynthetisch aus Grundstoffen her. Allerdings kostet das Energie. Für die Energiebereitstellung sorgt der Abbaustoffwechsel (Katabolismus): Bei der Degradation von Nahrungsstoffen wird Energie freigesetzt, die biologisch verfügbar gemacht oder in Energieäquivalenten zwischengespeichert wird.
Stoffwechselvorgänge sind im Prinzip nichts anderes als eine Abfolge chemischer Reaktionen. Eine grundlegende Voraussetzung der Enzymwirkung besteht darin, dass die katalysierte Reaktion energetisch erlaubt sein muss, also theoretisch freiwillig abläuft. Dies sagt noch nichts über den tatsächlichen Verlauf aus. Unter bestimmten Umständen findet spontan überhaupt kein messbarer Stoffumsatz statt. Dann sind Enzyme als Reaktionsbeschleuniger vonnöten.
Biologische Systeme sind entscheidend auf die uneingeschränkte Funktion ihrer Katalysatoren angewiesen. Bei vielen Stoffwechselwegen führt der Ausfall nur eines einzelnen Enzyms zu fatalen Krankheitsbildern, wie z.B. ein Defekt der Phenylalanin-Hydroxylase beim Abbau der Aminosäure Phenylalanin. Dieses und andere Beispiele werden in den entsprechenden Stoffwechselkapiteln besprochen.

MERKE

Enzyme haben hochdifferenzierte Strukturen, die auf die Erfüllung ihre besonderen biochemischen Funktionen als Reaktionsbeschleuniger abgestimmt sind. Der Einsatzbereich der Enzyme ist sehr vielseitig. Bis auf wenige Ausnahmen sind an nahezu allen biochemischen Reaktionen Enzymkatalysatoren beteiligt.

Thermodynamische und kinetische Grundlagen

Alle biochemischen Reaktionen lassen sich mit den Methoden der physikalischen Chemie beschreiben. Die Thermodynamik erlaubt Aussagen darüber, ob eine Reaktion energetisch erlaubt ist. Ist das der Fall, kann man den Ablauf der Reaktionen mittels der Kinetik analysieren.

Thermodynamische Voraussetzungen

Freie Enthalpie
Für das grundsätzliche Verständnis von chemischen Reaktionen ist es wichtig, die Prinzipien der chemischen Energetik zu verstehen (Kap. 1.3). Die betreffende Stoffumwandlung muss zunächst einmal energetisch erlaubt sein. Eine chemische Reaktion nach dem Schema
A + B C + D
kann nämlich nur dann spontan ablaufen, wenn die Reaktionspartner (oder Edukte) A und B zusammengenommen einen höheren Wert der freien Enthalpie G besitzen als die Endprodukte C und D.
Enthalpie stellt ein Maß für die in den Stoffen enthaltene Energie dar. Sie ist zusammengesetzt aus verschiedenen Formen der Wärmeenergie sowie dem Anteil an allen anderen Energiearten, die man für Arbeitsleistungen verwenden kann. Letztere Teilgröße bezeichnet man als freie Enthalpie, denn sie beinhaltet die maximal mögliche nutzbare Arbeit, die ein System bei geeigneter Reaktionsführung zu leisten imstande ist.
Die Änderung der freien Enthalpie (G) bei der Umwandlung der Stoffe A und B in C und D entspricht demnach der geleisteten Arbeit einer chemischen Reaktion. Sie wird durch die sog. Gibbs-Helmholtz-Gleichung beschrieben: G HT S.
Die freie Enthalpie G und ihre Änderung G werden in der physikalischen Einheit J (für Joule oder cal für Kalorie) pro umgesetzte Stoffmenge angegeben (J/mol oder cal/mol). Die entstehenden Energiemengen sind also real messbar.
Bei Redoxreaktionen (Kap. 4.2 und 6.3Kap. 4.2Kap. 6.3) finden Elektronenübertragungen statt. Daher kann man die bei solchen Reaktionen erforderliche oder geleistete Arbeit G auch als elektrische Energie angeben, also als Produkt von Ladung und Spannung.
Die Komponenten, die G bestimmen, sind die Enthalpieänderung H, die man auch als Reaktionswärme bezeichnet, sowie die Entropieänderung S, wobei die Entropie S ein thermodynamisches Maß für die Ordnung eines Systems ist. T steht für die absolute Temperatur (in Kelvin). Wenn man die maximal in Arbeit umzuwandelnde Energie im System nicht in Form von physikalischer Arbeit nutzt, wird der entsprechende Energiebetrag von G in Form von Wärme freigesetzt. Dazu addiert sich der Entropieterm T S, der für die Energiemenge steht, die bei der chemischen Reaktion in jedem Fall als Wärmeenergie gebunden bleibt unabhängig davon, ob G als Arbeitsleistung oder als Wärme frei wird.
Der Betrag und das Vorzeichen von G geben an, ob eine (bio-)chemische Reaktion energetisch möglich ist. Wenn das Vorzeichen von G negativ ist (G < 0), kann die Reaktion spontan ablaufen. Sie ist umso stärker begünstigt, je negativer der Wert von G ist. Man bezeichnet diese Reaktionen auch als exergon. Nicht spontan verlaufende Reaktionen (G > 0) kann man nur herbeiführen, indem man Energie in das System hineinsteckt. Diese heißen endergone Reaktionen.

MERKE

Die freie Enthalpie G einer spontan verlaufenden Reaktion ist immer negativ (G < 0).

Massenwirkungsgesetz
Eine spontane chemische Reaktion kann nur so lange ablaufen, bis sich das chemische Gleichgewicht einstellt. Dies wird rechnerisch im Massenwirkungsgesetz dargestellt, das die Konzentrationsverhältnisse der Reaktionspartner und -produkte angibt. Für unsere o.g. Beispielreaktion lautet es
K [C][D]/[A][B]
Im Gleichgewicht sind die Konzentrationen konstant, was durch die thermodynamische Gleichgewichtskonstante K beschrieben wird, die das Verhältnis der Konzentrationen aller beteiligten Moleküle im Gleichgewicht angibt. Wenn man an einem im Gleichgewicht befindlichen Reaktionsgemisch Veränderungen vornimmt, also z.B. die Konzentrationen von A, B, C oder D durch Entzug oder Zugabe ändert, so entsteht ein Ungleichgewichtszustand. Dieser strebt nach dem Massenwirkungsgesetz aber immer wieder nach der Einstellung einer erneuten Gleichgewichtssituation. Bis zum Erreichen dieser Gleichgewichtslage muss die chemische Reaktion ablaufen.

MERKE

Das Massenwirkungsgesetz besagt, dass im chemischen Gleichgewicht das Konzentrationsverhältnis der Produkte zu den Edukten konstant ist, ausgedrückt durch die thermodynamische Gleichgewichtskonstante K.

Die freie Enthalpie G einer biochemischen Reaktion ist mit der Gleichgewichtskonstante des Massenwirkungsgesetzes nach folgender Gleichung verknüpft:
G0' –RT ln K
R stellt die allgemeine Gaskonstante (R 8,315 J K–1 mol–1) dar. Der zusätzliche Index (0) soll anzeigen, dass es sich hier um G-Werte handelt, die für biochemische Standardbedingungen im Gleichgewicht gelten, also bei einer absoluten Temperatur von T 25 C und bezogen auf Stoffkonzentrationen von je 1 mol L–1 der beteiligten Reaktionspartner. Wenn Protonen an der Reaktion beteiligt sind, ist es sinnvoller, die Standardbedingungen zu modifizieren und anstelle der Protonenkonzentration von 1 mol L–1 mit [H+] 10–7 mol L–1 (entspricht einem pH-Wert von 7) zu rechnen. Sonst entspräche die Protonenkonzentration einem pH-Wert von 0. Diese Festlegung wird durch den Apostrophen () angezeigt. Das so modifizierte G nennt man auch freie Standardenthalpie G0'. Man kann also direkt aus der Gleichgewichtskonstante die freie Enthalpie berechnen und umgekehrt. Je stärker das Gleichgewicht aufseiten der Produkte liegt (K ist dann sehr groß), umso negativer ist die freie Standardenthalpie. Dieser Zusammenhang der freien Standardenthalpien und Gleichgewichtskonstanten ist beispielhaft für einige biochemische Reaktionen in Tab. 3.1 gezeigt.
In lebenden Zellen laufen biochemische Reaktionen nicht unter Standardbedingungen ab: Die beteiligten Reaktanden befinden sich nicht im thermodynamischen Gleichgewicht. Die im biologischen System real vorliegenden Konzentrationen prägen die vorherrschenden energetischen Verhältnisse. Allgemein kann man aus der Formel
ΔG=ΔG0+RTIn([Produkte]/[Edukte])
die Konzentrationsabhängigkeit der freien Enthalpie berechnen. In der Formel geben die [Produkte] und [Edukte] nicht die Gleichgewichts-, sondern die tatsächlich vorliegenden Konzentrationen an. Die Beziehung ist für das Verständnis zahlreicher Stoffwechselprozesse nützlich. Exemplarisch kann man sie an einer Teilreaktion der Glykolyse darlegen (Kap. 5.2.2). In der Aldolasereaktion werden aus Fructose-2,6-bisphosphat die beiden Metaboliten Dihydroxyacetonphosphat (DAP) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) im stöchiometrischen Verhältnis 1 : 1 produziert. Weil aber nur G3P verstoffwechselt wird, muss es in der Trioseisomerase-(TIM-)Reaktion
DihydroxyacetonphosphatTIMGlycerinaldehyd-3-Phosphat
ständig aus DAP nachgebildet werden, wobei gilt (G0ʹ +7,5 kJ mol–1 und K 0,048). Unter Standardbedingungen ist die Reaktion endergon, und im thermodynamischen Gleichgewicht läge das Edukt in etwa 20fachem Konzentrationsüberschuss gegenüber dem Produkt vor (Tab. 3.2). Weil G3P für die Nachfolgereaktion der Glykolyse gebraucht wird, würde der Stoffwechselprozess unter diesen Verhältnissen lahmgelegt werden. Die Rechnung zeigt, dass die freie Enthalpie bei 50fachem G3P-Unterschuss
G +7,5 kJ mol–1 + 0,008315 298 kJ K–1 mol–1 ln(0,02 mM/1 mM) –2,19 kJ mol–1
beträgt, die Reaktion also freiwillig abläuft. Die G3P-Konzentration muss also weit unterhalb der thermodynamischen Gleichgewichtskonzentration eingestellt werden, damit die Reaktion spontan abläuft. Im Glucosestoffwechsel der Zelle wird die G3P-Konzentration durch dessen effektive Weiterverarbeitung so weit herunterreguliert, dass der Stoffwechselprozess nicht ins Stocken gerät. Man bezeichnet einen solchen Zustand als Fließgleichgewicht.

MERKE

Die freie Standardenthalpie und die thermodynamische Gleichgewichtskonstante einer chemischen Reaktion sind direkt korreliert: G0 –RT ln K.

Reaktionsgeschwindigkeit

Geschwindigkeitsgesetz und Geschwindigkeitskonstante
Die Thermodynamik definiert ganz allgemein, ob eine chemische oder biochemische Reaktion überhaupt ablaufen kann, sie macht aber keine Aussagen über den Reaktionsweg und schon gar nicht über die Geschwindigkeit ihres Ablaufs. Dafür ist die Reaktionskinetik zuständig, sie beschreibt den zeitlichen Verlauf von Reaktionen. Aus der quantitativen Darstellung der Reaktion kann man Rückschlüsse auf den Reaktionsmechanismus ziehen. Die Kinetik strebt an, Reaktionsgeschwindigkeiten durch Formulierung eines Geschwindigkeitsgesetzes adäquat zu beschreiben. Man kann die Geschwindigkeit v einer chemischen Reaktion aus der Konzentrationsänderung eines Reaktanden über die Zeit bestimmen. Für unsere Modellreaktion
A + B C + D
können wir schreiben, dass die Reaktionsgeschwindigkeit v gleich der differenziellen Konzentrationsänderung d[C] des entstehenden Reaktionsprodukts C im (unendlich kleinen) Zeitintervall dt ist. Anders ausgedrückt:
d[C]/dt v
Da sich die Konzentrationen der anderen Reaktionspartner entsprechend ändern, denn es entsteht genauso schnell das Produkt D, und die Edukte A und B werden ebenso schnell verbraucht, gilt:
v d[C]/dt d[D]/dt -d[A]/dt –d[B]/dt
wobei negative und positive Vorzeichen auf dem Verbrauch der Edukte und dem Entstehen der Produkte beruhen. Die Reaktionsgeschwindigkeiten chemischer Reaktionen sind proportional zu den Konzentrationen der reagierenden Stoffe A und B (Proportionalitätsfaktor k1), sodass sich für die Hinreaktion die Geschwindigkeit vhin ergibt:
vhin –d[A]/dt k+1 [A][B]
Ganz analog kann man die Reaktionsgeschwindigkeit für die Rückreaktion formulieren:
vrück +d[A]/dt k–1 [C][D]

MERKE

Die Reaktionsgeschwindigkeit einer chemischen Reaktion gibt die zeitliche Änderung der Konzentration von den Reaktionspartnern wieder.

Chemisches Gleichgewicht als dynamischer Zustand
Wie schon erwähnt, läuft die chemische Reaktion nur so lange ab, bis das chemische Gleichgewicht erreicht ist. Die Frage ist nur, wann dies der Fall ist. Mit unserer kinetischen Beschreibung der Reaktion können wir das leicht angeben, denn im chemischen Gleichgewicht laufen Hin- und Rückreaktion gleich schnell ab, also vhin vrück. Dabei verschwindet netto nichts, und nichts Neues wird gebildet. Für die Reaktanden bilden sich letztlich stationäre Konzentrationen aus, deren Größen von dem Verhältnis von Bildungsrate und Zerfallsrate der Komponenten bestimmt sind, also in den Geschwindigkeitskonstanten k1 und k–1 stecken.
Aus dem Gleichsetzen der Ausdrücke für vhin und vrück folgt:
vhin vrück k+1[A][B] k–1[C][D].
Durch Umformen erhalten wir daraus die Formel
k+1/k–1 [C][D]/[A][B] K
die gleich dem Ausdruck für das Massenwirkungsgesetz ist. Im chemischen Gleichgewicht finden zwar Hin- und Rückreaktion mit den gleichen Geschwindigkeiten vhin und vrück statt, davon merkt man aber nach außen nichts, weil im Gleichgewicht die Konzentrationen aller Reaktionspartner konstant bleiben. Mit anderen Worten, aus dem Massenwirkungsgesetz wird auch die Dynamik der chemischen Gleichgewichtssituation deutlich, denn das Verhältnis der beiden Geschwindigkeitskonstanten k+1 und k–1 für die Hin- und Rückreaktionen ist konstant und daher identisch mit der thermodynamischen Gleichgewichtskonstante K.

Aktivierung chemischer Reaktionen

Aktivierungsenergie
Ein Blick auf Tab. 3.1 zeigt, dass die Reaktion Glucose + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O energetisch stark begünstigt ist und eigentlich spontan ablaufen muss. Dies passiert aber nicht, denn dieser hohe negative freie Enthalpiewert bedeutet praktisch, dass Zucker an der Luft spontan verbrennen würde. Unter normalen Bedingungen ist der Prozess nämlich glücklicherweise extrem erschwert, weil für die Oxidation von Glucose eine erhebliche Energiebarriere überwunden werden muss. Daher ist der Zucker unter Normalbedingungen stabil. Um die Glucose für den Stoffwechsel reaktionsbereit zu machen, muss sie zuerst aktiviert werden, indem man sog. Aktivierungsenergie bzw. Aktivierungsenthalpie hineinsteckt. Nur aktivierte Glucose kann unter Freisetzen von G0 –2880 kJ mol–1 über eine Vielzahl von Einzelschritten zu den Produkten Kohlendioxid und Wasser reagieren (Tab. 3.1). Für den Stoffwechsel ist von Bedeutung, dass Katalysatoren die Energiebarrieren vermindern können, die (bio)chemische Reaktionen erschweren, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit um ein Vielfaches beschleunigt wird. Diese Zusammenhänge sollen an einer einfachen chemischen Modellreaktion
A + B AB
betrachtet werden, in der zwei Reaktanden A und B miteinander unter Bildung des Komplexes AB reagieren. In Abb. 3.3 sind der energetische Anfangs- und Endzustand der Reaktionspartner dargestellt. Die Edukte haben eine höhere freie Enthalpie als das Produkt. Beim Ablauf der Reaktion (Pfeil) wird also freie Enthalpie freigesetzt. Bildlich gesprochen kann der Vorgang energetisch nur bergab, nicht jedoch bergauf laufen.
Man kann sich nun den molekularen Ablauf der chemischen Reaktion in unendlich viele kleine Schritte aufgeteilt vorstellen. Trägt man die freie Enthalpie G des Systems zu jedem Teilschritt in einem Diagramm auf (Abb. 3.4), so erhält man das Energieprofil der Reaktion. Es reflektiert den Verlauf der freien Enthalpie beim Fortgang der Reaktion. Für unsere Betrachtungen sind allerdings nicht die Absolutwerte von G wichtig, sondern vielmehr die Änderungen relativ zum Anfangszustand. Die thermodynamischen Verhältnisse sind durch die freie Enthalpiedifferenz G0' gegeben, d.h., die Differenz der Produkte minus der Edukte lässt sich direkt aus dem Anfangs- und Endniveau in Abb. 3.3 und Abb. 3.4 ablesen.

MERKE

Nicht alle chemischen Reaktionen laufen unter normalen Umgebungsbedingungen spontan ab, obwohl sie energetisch erlaubt sind.

Übergangszustand und Aktivierungsenthalpie
Soll nun eine Reaktion zwischen A und B eintreten, ändert sich das simple thermodynamische Bild. Aus Abb. 3.4 wird ersichtlich, dass vor dem Eintritt der Reaktion die Reaktionspartner erst aktiviert werden müssen, damit sie die Energiebarriere überschreiten können.
Für eine erfolgreiche Reaktion müssen die Moleküle einen Mindestabstand haben, d.h., sie müssen gezwungen werden, sich einander anzunähern. Es braucht also zuerst zugeführte Energie, um die Abstoßungskräfte bei Annäherung der Elektronenhüllen zu überwinden, bis das Energiemaximum erreicht ist (Abb. 3.4). Dieses Stadium bezeichnet man als Übergangszustand AB, in dem sich der Molekülkomplex für kurze Zeit befindet. Hier entscheidet sich, ob eine Reaktion zum energetisch begünstigten Produktkomplex AB oder eine Dissoziation in die ebenfalls energetisch niedrigen Ausgangsstoffe A und B erfolgt. Damit die Reaktion ablaufen kann, müssen die Komponenten also die Energiebarriere (Aktivierungsenthalpie) G+1 überwinden. Das Sternsymbol () bedeutet übereinkunftsgemäß, dass es sich um aktivierte Zustände handelt. Die gleiche Überlegung gilt natürlich auch für die Rückreaktion, also die Moleküldissoziation. Hier ist die Aktivierungsenthalpie G–1 zu überwinden, um zu den voneinander getrennten Komponenten zu gelangen (Abb. 3.4).
Die Geschwindigkeitskonstanten k1 und k–1 stehen in einem direkten Zusammenhang mit der freien Aktivierungsenthalpie G für die Hin- und Rückreaktion. Die Gleichungen hierzu lauten:
k1=kgT/h×eΔGRTh1=kgT/h×eΔG-1RT
Dabei sind h das Planck-Wirkungsquantum und kB die Boltzmann-Konstante. Je kleiner die Aktivierungsenthalpie G, umso größer ist die Geschwindigkeitskonstante k und damit die erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit, egal in welche Richtung. Außerdem verdeutlicht diese Formel auch die Temperaturabhängigkeit von chemischen Reaktionen. Bei höheren Temperaturen nimmt die Energie der Reaktionspartner zu, ganz analog zum Verhalten von Gasmolekülen, die in der Wärme mit höherer Geschwindigkeit fliegen, also mit höherer Energie (Abb. 3.5). Je höher die Temperatur ist, umso größer ist die Anzahl der Moleküle, deren Energie größer als eine kritische Energieschwelle ist (vgl. die roten [ Energie < ] und die grünen [ Energie > ] Flächen unter den Kurven in Abb. 3.5). Wenn die Moleküle höhere Energien besitzen, können sie statistisch häufiger die Aktivierungsbarriere überschreiten. Je höher also die Temperatur ist, umso schneller laufen chemische Reaktionen ab.

MERKE

Damit eine Reaktion ablaufen kann, müssen die beteiligten Moleküle eine Energiebarriere überwinden, die durch die Aktivierungsenthalpie beschrieben wird. Die Geschwindigkeit der Reaktion wird größer, wenn die Aktivierungsbarriere niedriger ist. Die Anzahl der reaktionsbereiten Moleküle kann durch Temperaturerhöhung vergrößert werden.

Reaktionsfolgen Der oben dargestellte physikalische Zusammenhang von Aktivierungsschwellen und damit korrelierten Geschwindigkeitskonstanten ist besonders wichtig bei aufeinanderfolgenden Reaktionen (Abb. 3.6a). Das gilt z.B. für metabolische Prozesse, bei denen ein Substrat A in mehreren Teilschritten sukzessive abgebaut oder aus einer Vorstufe in verschiedenen Teilreaktionen ein Endprodukt AB hergestellt wird. Eine Serie von hintereinandergeschalteten Reaktionen bezeichnet man auch kurz als Reaktionsfolge. Die auftretenden Zwischenprodukte nennt man auch Intermediate I; sie sind durch relative Minima im Energieprofil (Abb. 3.6a) gekennzeichnet.
Der geschwindigkeitsbestimmende Teilschritt einer Reaktionsfolge ist immer derjenige mit der höchsten freien Aktivierungsenthalpie G. Dies ist also der langsamste Teilreaktionsschritt mit der kleinsten Geschwindigkeitskonstante. Es ist hierbei völlig unerheblich, ob dieser Schritt am Beginn oder Ende einer Reaktionssequenz liegt (Abb. 3.6b).

MERKE

Hohe Aktivierungsenergien sind gleichbedeutend mit niedrigen Geschwindigkeitskonstanten. Bei Reaktionsfolgen ist der langsamste Teilschritt bestimmend für die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion. Zwischen Teilstufen einer Reaktionsfolge bilden sich ein oder mehrere Reaktionsintermediate aus.

Wirkung von Katalysatoren
Katalysatoren sind Stoffe, welche die Reaktionsgeschwindigkeit von chemischen Reaktionen erhöhen, selbst aber unverändert aus der Reaktion hervorgehen. Eine wesentliche Eigenschaft von Katalysatoren ist, dass sie nur die Reaktionsgeschwindigkeit (Kinetik!), aber nicht die Gleichgewichtslage (Thermodynamik!) beeinflussen. Sie erhöhen also nur die Geschwindigkeitskonstanten, und zwar sowohl die der Hin- als auch die der Rückreaktion.
Im Energieprofil (Abb. 3.7) sieht das Ganze folgendermaßen aus: In Gegenwart eines Katalysators werden die Aktivierungsbarrieren der Reaktion G1 sowie G–1 im Vergleich zur unkatalysierten Reaktion abgesenkt. Bei gegebener Temperatur können also mehr Moleküle pro Zeiteinheit das Energieniveau des Übergangszustands erreichen und reagieren (Abb. 3.5), was bedeutet, dass die chemische Reaktion im Vergleich zum unkatalysierten Zustand beschleunigt wird.

MERKE

Katalysatoren beschleunigen chemische Reaktionen (sowohl Hin- als auch Rückreaktionen), sie können aber niemals die chemische Gleichgewichtslage verändern.

Enzyme als Biokatalysatoren

Biologisch-chemische Reaktionen werden von Enzymen katalysiert. Ihre grundsätzliche Funktion besteht darin, die Aktivierungsenthalpie herabzusetzen, um von Natur aus langsame biochemische Reaktionen um ein Vielfaches zu beschleunigen. Tab. 3.3 gibt eine Übersicht über den Geschwindigkeitsbereich verschiedener Reaktionen im freien und katalysierten Zustand und die enorme Spanne der erzielten Beschleunigungsfaktoren. Hierzu wirken die Biokatalysatoren mit sehr unterschiedlichen, hocheffizienten Strategien. Bei manchen Enzymen (z.B. alkalische Phosphatase) ergeben sich Beschleunigungswerte von bis zu 1017 (Tab. 3.3). Enzyme funktionieren also wie mikroskopisch kleine Apparate oder Nanomaschinen, die auf Hochtouren laufen.

MERKE

Enzyme setzen die Aktivierungsbarriere (Aktivierungsenthalpie) G einer Reaktion herab und beschleunigen biochemische Reaktionen um ein Vielfaches. Sie agieren als Biokatalysatoren.

Diffusionslimitation

Enzyme erreichen extrem hohe Beschleunigungsfaktoren für Reaktionsgeschwindigkeiten. Allerdings gibt es hierfür eine physikalisch bedingte Obergrenze. Voraussetzung für den Eintritt einer chemischen Reaktion ist, dass die beteiligten Moleküle aufeinandertreffen, egal ob in Gegenwart oder Abwesenheit eines Katalysators. Reaktanden chemischer und biochemischer Reaktionen diffundieren im Lösungsmittel frei umher. Selbst wenn jeder Molekülzusammenstoß zur Reaktion führt (die Aktivierungsenthalpie ist dann gleich null!), ist die Reaktionsgeschwindigkeit von der Diffusionsgeschwindigkeit der Reaktanden begrenzt, die von der thermischen Beweglichkeit der Moleküle innerhalb des Solvens, z.B. Wasser, herrührt (Abb. 3.8). Man spricht dann auch von einer diffusionslimitierten bzw. -kontrollierten Reaktion. Proteine bewegen sich aufgrund ihrer Größe viel langsamer als niedermolekulare Substrate. Mit anderen Worten bedeutet das, die Diffusionsrate des Proteins beschränkt theoretisch die maximal mögliche Geschwindigkeit. In der Praxis wird der theoretische Wert bei den meisten Enzymreaktionen weit unterschritten. Der langsamste geschwindigkeitsbestimmende Schritt tritt dann erst nach dem Zusammenprall der Reaktanden ein.

Schon gewusst

Die oberste Grenze möglicher biomolekularer Reaktionsgeschwindigkeiten wurde bei Proteolysereaktionen beobachtet, die mit Geschwindigkeitskonstanten von k 1011 M–1 s–1 ablaufen. Demgegenüber erlaubt die relativ niedrige Diffusionsrate der makromolekularen Enzyme nur maximale Höchstgeschwindigkeiten von 3 108 M–1 s–1. Die in Wirklichkeit häufig noch viel niedrigeren Raten sind nach Bildung des reaktiven Komplexes durch anderweitige Faktoren im folgenden Reaktionsablauf begrenzt.

Aktives Zentrum und Substratbindung

Die bisherigen Überlegungen zur Energetik und Kinetik gelten für chemische und biochemische Reaktionen, also auch für die Enzyme. Generell bestehen Katalysatoren aus speziellen Oberflächen, mit denen Wirkstoffe in Kontakt treten. In den Enzymen werden diese Kontaktflächen durch Proteinstrukturelemente bestimmt, die nach Bedarf auch mit chemischen Cofaktoren kombiniert werden. Das sog. aktive Zentrum ist ein wesentliches Merkmal der katalytischen Proteine. Es bildet den genauen molekularen Ort der Katalyse, der oberflächlich oder auch spaltenförmig im Inneren der Proteine liegen kann und hauptsächlich die Substratbindungsstelle enthält. Die aktiven Zentren binden Substrate (die Edukte) nach Art des Schlüssel-Schloss-Prinzips (Abb. 3.9a). Grundsätzlich kann man sagen, dass makromolekulare Enzyme eine gewisse Passform für die beteiligten Substrate besitzen.
Enzyme sind jedoch keineswegs starre Gebilde. Es kommt oft erst zu einer richtigen Bindung des spezifischen Substrats, nachdem das reaktive Molekül angedockt hat. Dann wird durch z.B. lokale konformative Änderungen des Proteinrückgrats oder von Aminosäureseitenketten eine optimal passende Substratbindungstasche ausgebildet (induced fit; Abb. 3.9b). Die allerbeste Passform (gleichbedeutend mit der höchsten Affinität) des Enzyms zum Substrat ist wieder durch den Übergangszustand gegeben, in dem das häufig niedermolekulare Substrat an das makromolekulare Enzym gebunden ist. In dieser Orientierung kann das Substrat durchaus verzerrt oder gespannt vorliegen. Das Substrat ist also im Hinblick auf zu spaltende oder neu zu bildende Bindungen deformiert. Das Ausmaß der konformativen Anpassung durch Induced fit wird in Abb. 3.10 am Beispiel der Hexokinase demonstriert, welche die Reaktion Glucose + ATP Glucose-6-phosphat + ADP katalysiert.
Die Substratbindungstasche von Enzymen wird durch bestimmte Aminosäureseitengruppen gebildet, die durch nichtkovalente Wechselwirkungen das Substratmolekül binden. Hier sind u.a. elektrostatische Anziehungskräfte wirksam. So können z.B. negativ geladene Aminosäuren die positiv geladenen Bereiche eines Substratmoleküls festhalten. Nach erfolgter Reaktion überwiegen abstoßende Kräfte, weil das gebildete Produkt nur abdissoziieren kann, wenn es nicht stark gebunden ist. Der Katalysatoreffekt der Enzyme liegt darin, die freie Enthalpie des Übergangszustands zu minimieren, indem sie den Reaktanden das Erreichen dieses Zustands erleichtern. Der molekulare Ablauf einer enzymkatalysierten Reaktion wird im Energiediagramm (Abb. 3.11) deutlich. Die freien Aktivierungsenthalpien G1 und G–1 sind vermindert (G1, kat G–1, kat), jedoch hat die Aktivierungskurve im Unterschied zum allgemeinen Fall chemischer Katalysatoren (Abb. 3.7) eine Feinstruktur. Die Minima der Kurve rühren von den relativen Stabilisierungen der beiden Reaktionsintermediate, Enzym-Substrat-(ES-) und Enzym-Produkt-(EP-)Komplex. Diese sind notwendig, um die für die katalytische Reaktionserleichterung erforderlichen strukturellen Deformationen und elektronischen Umorientierungen des Substratmoleküls energetisch zu kompensieren. Jedoch dürfen die relativen Energieabsenkungen nicht allzu stark sein, weil sonst vom Energieminimum ausgehend die Aktivierungsschwellen zu hoch würden und der Reaktionskatalyse entgegenwirkten. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass die Bindungsaffinitäten zu Substrat bzw. Produkt nicht zu stark sein dürfen (hohe Affinität bedeutet starke Energieabsenkung!). Andererseits muss offensichtlich eine wesentlich höhere Affinität des Enzyms zum Übergangszustand (symbolisiert in Abb. 3.11 mit ) existieren, um die Aktivierungsenthalpie effektiv abzusenken und so die Katalyse zu ermöglichen.

Schon gewusst

Die chemischen Analoga von niedermolekularen Übergangskomplexen kann man auch künstlich herstellen. Sie ahmen die Sterik des Komplexes nach, werden aber aufgrund ihrer Modifikation nicht katalytisch umgesetzt und sind daher stabil. Aus ihrer Struktur lassen sich oft Rückschlüsse auf den Reaktionsmechanismus ziehen. Da Enzyme das Substrat im Übergangszustand der Reaktion optimal stabilisieren, verhindern einmal gebundene Analoga den Zutritt zur Substratbindestelle und hemmen die Enzymreaktion. Man kann synthetisierte Übergangszustandsanaloga auch zur Herstellung völlig neuartiger Katalysatoren nutzen. Biochemisch handelt es sich hierbei um Abzyme, ein aus Antibody und enzyme gebildetes Kurzwort. Diese katalytisch aktiven Antikörper werden gebildet, wenn man Versuchstiere mit dem synthetischen Übergangskomplexanalogon immunisiert. Durch Abzyme mit Ferrochelataseaktivität (Einbau von Metallen in Protoporphyrin) konnte man beispielsweise die Geschwindigkeit der nichtkatalysierten Reaktion 2500fach beschleunigen. Mit diesem Wert ist das Abzym immerhin nur um den Faktor 10 langsamer als das natürliche Enzym.

Substratimmobilisierung

Die diffusionsbedingte Langsamkeit im Vergleich zur maximal möglichen Reaktionsgeschwindigkeit von Enzymen ist unvermeidlich und nur scheinbar nachteilig. Der eigentliche Gewinn besteht darin, dass ein Enzym die Reaktanden aus der Lösung einfängt und durch Bindung immobilisiert. Dabei bildet das Enzym einen äußeren Rahmen, in dem die reagierenden Substrate in optimal reaktionsfähiger Ausrichtung zueinander festgehalten werden. Durch diesen auf die Substrate ausgeübten Zwang kann die Reaktion mit viel höherer Geschwindigkeit ablaufen als ohne den Katalysator. Beispielhaft wird die geometrische Ordnung von Substraten an der Adenylat-Kinase deutlich, die den Phosphattransfer von ATP auf AMP katalysiert:
ATP + AMP 2 ADP
Das Enzym bindet die beiden Substrate ATP als Mg-Komplex und AMP und richtet sie in einer reaktionsfähigen Anordnung aus (Abb. 3.12). Nach Bindung der beiden Substrate tritt ein Induced-fit-Effekt ein: Eine Schleife oberhalb der Substratbindungstasche faltet sich um und bildet einen Verschluss. Die relativen Bewegungen der Substrate werden hierdurch drastisch reduziert, man spricht auch von Entropieverminderung. Die so eingefangenen Substrate können viel besser reagieren als in freier Lösung, sodass die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten produktiver Kollisionen der Substratmoleküle beträchtlich erhöht ist.

Kompartimentierung durch Wasserausschluss

Die Bindung von Substrat am aktiven Zentrum des Enzyms wird durch schwache Wechselwirkungen stabilisiert, dabei wird die Wasserhülle des Substrats abgestreift, es wird desolvatisiert. Dieses Prinzip kommt auch häufig beim Stofftransport zum Tragen, sofern er durch Membranproteine katalysiert wird.
Empfindliche und hochreaktive Reaktionspartner müssen u.U. völlig vom Lösungsmittel abgeschirmt werden. Manche Enzyme bilden hierzu im aktiven Zentrum einen abgeschlossenen Raum; der Reaktionsort wird kompartimentiert. So funktionieren z.B. Dehydrogenasen durch den Transfer von Hydrid-(H-)Ionen des Coenzyms NADH auf einen Akzeptor, wie am Beispiel der Lactat-Dehydrogenase-Reaktion deutlich wird:
NADH + H+ + Pyruvat Lactat + NAD+
Das extrem instabile H-Ion wird vom Lösungsmittel Wasser ferngehalten, indem das Enzym nach Bindung der beiden Reaktionspartner NADH und Pyruvat (Akzeptor) mittels einer lokal beschränkten Umfaltung eine Klappe fallen lässt, die das Wasser aus der Kavität herausdrückt und vor einem erneuten Zutritt sperrt (Abb. 3.13). In dem so geschaffenen wasserfreien Kompartiment kann nun das H-Ion problemlos auf das Akzeptormolekül übertragen werden. Verschluss und Öffnung der Klappe erfolgen durch thermische Bewegung, sodass die Produkte der Reaktion, NAD+ und Lactat, freigesetzt werden können.

MERKE

Grundlegende katalytische Prinzipien bestehen in der Immobilisierung und der optimalen geometrischen Orientierung von Substraten. Nach dem Andocken binden Enzyme ihre Substrate durch Induced fit. Durch die hohe Bindungsaffinität zum Übergangszustand senken Enzyme die Aktivierungsenthalpien biochemischer Reaktionen deutlich ab. Lösungsmittelempfindliche Substrate werden stabilisiert, indem durch eine lokale Konformationsänderung Wasser aus dem aktiven Zentrum entfernt wird.

Katalytische Strategien

Die katalytische Funktion von Enzymen beruht nicht allein auf ihrer räumlichen Organisation von Substraten, sondern auch auf der Präsenz von Aminosäureseitenketten mit ihren funktionellen Gruppen, die direkt an der katalytischen Funktion beteiligt sind. Vor allem sind hier die polaren Seitenketten von Arginin, Lysin, Histidin, Serin, Cystein, Glutamat, Aspartat und Tyrosin zu nennen. Mit ihren funktionellen Gruppen können Aminosäuren direkt in das Reaktionsgeschehen eingreifen, etwa durch Polarisierung von Bindungen, was die Substrate reaktionsbereiter macht und so z.B. nucleophile Angriffe ermöglicht. Enzyme haben unterschiedliche katalytische Strategien entwickelt. Hierzu zählen:
  • 1.

    die Katalyse durch räumliche Annäherung, bei der Abstand und Orientierung der Reaktanden optimiert werden. Ein Beispiel dieses Typs ist die bereits oben vorgestellte Adenylat-Kinase (Abb. 3.12).

  • 2.

    die metallionenvermittelte Katalyse. Metallionen können

    • als Elektrophile fungieren und so negative Ladungen im Enzym-Substrat-Komplex kompensieren. Beispiel ist das Mg2+ im Verbund mit Nucleotiden und DNA beim Reaktionsmechanismus der DNA-Polymerase.

    • als Brücke zwischen Enzym und Substrat dienen, wie Mg2+ im Fall der bereits erwähnten Adenylat-Kinase

    • die Bildung von Nucleophilen unterstützen, die Substrate angreifen. Das Protein richtet die Metallionen durch hochspezifische Bindung an bestimmte Aminosäureseitenketten räumlich in einer katalytisch wirksamen Orientierung aus (Metallkomplexbildung). Dies wird beispielsweise an der Carboanhydrase veranschaulicht, in der drei Histidingruppen den Metallcofaktor Zn2+ binden (Abb. 3.14a, b). Außerdem bindet das Zinkion ein Wassermolekül, das in diesem Komplex einen pKa-Wert von deutlich kleiner als 7 hat und partiell deprotoniert (Abb. 3.14b). Die gebundene Hydroxylgruppe greift das partiell positiv geladene Kohlenstoffatom des gebundenen Substrats CO2 nucleophil an, wobei sich unmittelbar das Hydrogencarbonation, HCO3, bildet (Abb. 3.14c).

  • 3.

    die generelle Säure-Base-Katalyse, in der die Funktion des Protonendonors oder -akzeptors von einem anderen Molekül als Wasser übernommen wird. Als spezifische Säure-Base-Katalyse bezeichnet man im Gegensatz hierzu Reaktionen, die direkt durch die Gegenwart von H3O+ bzw. OH beschleunigt werden.

  • 4.

    die kovalente Katalyse, bei der ein proteingeneriertes Nucleophil eine, wenn auch kurzlebige, kovalente Bindung mit dem Substrat eingeht. Die beiden letztgenannten katalytischen Prinzipien kommen beim Reaktionsmechanismus der Protease Chymotrypsin zum Einsatz (unten).

MERKE

Es gibt vier wichtige Prinzipien, auf denen Enzymkatalyse basiert: Katalyse durch Annäherung, Metallionenaktivierung, Säure-Base-Aktivierung und Bildung kovalenter Intermediate.

Reaktionsmechanismus der Serinprotease
Exemplarisch lassen sich Architektur des aktiven Zentrums und molekularer Reaktionsmechanismus an der Verdauungsprotease Chymotrypsin aus der Gruppe der Serinproteasen verdeutlichen. Hier sind die beiden Prinzipien der kovalenten und der allgemeinen Säure-Base-Katalyse wirksam. Das Enzym spaltet Substratproteine bevorzugt an Peptidbindungen (Abb. 3.15a), in denen C-terminal die aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan vorkommen. Der Begriff Serinprotease stammt von dem katalytisch wichtigen Serinrest an der Substratbindungsstelle, der das Substratpeptid kovalent binden kann (Abb. 3.15b).
Aus den biochemischen Daten kann man den mechanistischen Ablauf der Reaktion rekonstruieren: Das Substratpeptid nähert sich der reaktiven Hydroxylgruppe des Serinrests (Abb. 3.15b). Es bildet sich ein tetraedrischer Übergangskomplex, was durch die Protonenübergabe an die benachbarte Histidinbase begünstigt wird (generelle Basenkatalyse). Das Proton wird dann von Histidin auf das Abgangspeptid RB übertragen und es entsteht das Enzym-Acyl-Intermediat, bei dem das Restpeptid RA kovalent an den Serinrest gebunden ist (kovalente Katalyse). Das Abgangspeptid verlässt das aktive Zentrum. An die nunmehr freie Stelle kann ein Wassermolekül binden.
Durch den nucleophilen Angriff der OH-Gruppe, die bei der Dissoziation des gebundenen Wassermoleküls entsteht, bildet sich erneut ein tetraedrischer Übergangskomplex. Durch Abspaltung des RA-Peptids wird der Anfangszustand des Enzyms wiederhergestellt. Die Reaktionsfolge wird durch die optimale Orientierung des Peptids in der Substratbindungstasche begünstigt (Abb. 3.16, rot gefärbter Bereich), in der bestimmte Proteingruppen die Substratspezifität der Protease durch besondere Wechselwirkungen festlegen. Je nach Auskleidung und Passform der Serinproteasebindungstasche (auch S1-Tasche oder Spezifitätstasche genannt) ragt gerade eine der Spezifität entsprechende Aminosäureseitenkette des Substratpeptids hinein und wird so orientiert, dass die benachbarte Peptidbindung gespalten werden kann.
Typisch für diese Proteasen ist die Orientierung der katalytischen Elemente. Die katalytische Triade (Abb. 3.17) aus den Gruppen Asp-His-Ser ist kennzeichnend für diese Proteasesuperfamilie. Das im Modell des Reaktionsmechanismus besprochene enge Zusammenspiel von Histidin und Serin wird an den Einzelschritten deutlich. Die Rolle von Aspartat in der katalytischen Triade liegt in der Bildung einer Wasserstoffbrücke zu einem der Histidinstickstoffatome, wodurch die Protonenaffinität für das Proton der Serin-OH-Gruppe erhöht wird (Abb. 3.17, blau gestrichelter Streifen). Die Komponenten des Trios Asp-His-Ser können in der Primärstruktur von Proteinen weit voneinander entfernt liegen, wichtig ist aber ihre von der Tertiärstruktur bestimmte räumliche Orientierung im aktiven Zentrum. Man findet diese auch bei den ebenfalls zur Serinproteasefamilie gehörenden Enzymen wie Trypsin, Elastase, Thrombin und sogar bei der evolutionär nicht verwandten bakteriellen Protease Subtilisin. Die Natur hat also offenbar das Wirkprinzip der katalytischen Triade mehrfach unabhängig erfunden. Mit diesem Funktionsmodul können die Prinzipien der kovalenten und der Säure-Base-Katalyse realisiert werden. Die katalytische Triade ist daher auch das bestimmende Element in anderen Hydrolasen (z.B. Lipasen, Esterasen).

MERKE

Die katalytische Triade Asp-His-Ser stellt ein bei vielen Hydrolasen genutztes Funktionsmodul dar, in dem die OH-Gruppe der Serinseitenkette nucleophil aktiviert wird und daraufhin CO-Bindungen in Ester- oder Amidbindungen angreift.

Eigenschaften von Enzymen

Spezifität
Enzyme zeichnen sich durch ihre hohe Substratspezifität hinsichtlich des katalytisch umgesetzten Stoffes aus. Absolute Monospezifität, beschränkt auf eine singuläre chemische Molekülstruktur, ist dabei eher eine Ausnahme. Oft wird eine Gruppe von chemisch verwandten Verbindungen umgesetzt (Chemoselektivität). Typisch dafür ist das Wirkungsspektrum der Alkohol-Dehydrogenase (ADH; Tab. 3.4), welche die Reaktion
R-OH + NAD+ RHO + NADH + H+
katalysiert. Entscheidend für die Aktivität der ADH ist die Position der Hydroxylgruppe im Substrat. Die angegriffene Gruppe des Substrats ist variabel, da sowohl kurz- und langkettige Aliphate als auch zyklische Moleküle reagieren können (Tab. 3.4). Besitzt ein Substrat generell mehrere Angriffsstellen, mit denen ein Enzym unterschiedlich reagiert, spricht man auch von Regioselektivität.
Enzyme können sogar chirale Moleküle voneinander unterscheiden (Stereospezifität): Beispielsweise kann Hexokinase nur D-Glucose, aber nicht L-Glucose erkennen. Außerdem haben Enzyme eine Reaktionsspezifität, sie sind also auf die Katalyse ganz bestimmter Reaktionen spezialisiert. So wird z.B. D-Glucose enzymatisch in verschiedene Produkte umgesetzt (Abb. 3.1). Das Substrat Glucose-6-phosphat wird von der Glucose-6-phosphat-Isomerase in Fructose-6-phosphat umgewandelt, dagegen wird es von der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu 6-Phosphogluconat oxidiert.
pH-Optimum
Die katalytische Aktivität von Enzymen ist meist auf einen bestimmten pH-Bereich beschränkt, weil der Ionisationsgrad von protonierbaren Aminosäureseitenketten im aktiven Zentrum von der H+-Konzentration im Medium abhängig ist. Je nach Struktur des aktiven Zentrums und dem Mechanismus des Enzyms können sowohl saure als auch basische Gruppen beteiligt sein, die nur entweder in protonierter oder in deprotonierter Form katalytisch aktiv sind. Wenn mehrere protonierbare Proteingruppen gleichzeitig beteiligt sind, z.B. mindestens eine Säure- und eine Basegruppe, ergibt sich eine charakteristische Aktivitätskurve mit ansteigender und abfallender Flanke und einem pH-Optimum (Abb. 3.18, Tab. 3.5).
Die meisten Enzyme haben ihr pH-Optimum in dem Bereich, in dem sie auch physiologischerweise ihre Funktion erfüllen, also ungefähr bei neutralen pH-Werten. Doch die Spanne von biokompatiblen Protonenkonzentrationen im Körper reicht über mehr als sechs Größenordnungen. So hat die Verdauungsprotease Pepsin der sauren Umgebung im Magen entsprechend ein pH-Optimum von 1,5, wogegen das Verdauungsenzym Trypsin im Dünndarm bei etwa pH 8 aktiv ist. Die alkalische Phosphatase aus Knochengewebe entfaltet ihre maximale Aktivität sogar erst bei pH 8,5.
Temperaturoptimum
Gemäß ihrer biologischen Natur sind Enzyme nur in einem definierten Temperaturbereich katalytisch aktiv, in dem die Stabilität aller dreidimensionalen Strukturelemente gewährleistet ist. Die temperaturbedingte Geschwindigkeitszunahme enzymkatalysierter Reaktionen ist im Stabilitätsbereich der Proteine vergleichbar mit der bei unkatalysierten Reaktionen beobachteten Steigerung. Die absteigende Flanke im Aktivitätsdiagramm (Abb. 3.19) bei höheren Temperaturen ist durch die Denaturierung der Enzyme bedingt. Bei Temperaturen über 37 C beginnen viele Enzyme zu denaturieren. Zellbiologisch ist dieser Bereich besonders kritisch. Doch der zunehmenden Gefahr durch Inaktivierung der Biokatalysatoren wirkt das Heat shock-Programm entgegen: Durch Synthese von Chaperonen werden die Enzyme stabilisiert bzw. die Rückfaltung denaturierter Enzyme unterstützt.

Schon gewusst

Die Thermostabilität von Proteinen kann über einen weiten Temperaturbereich moduliert werden. Es gibt Proteine von thermophilen Mikroorganismen, die nahe dem Siedepunkt von Wasser aktiv sind. Der Rekordhalter ist gegenwärtig das Archaebakterium Pyrolobus fumarii, das in hydrothermalen Quellen bei Temperaturen um 113 C lebt, wobei die hohe Temperatur des flüssigen Wassers durch den erhöhten Umgebungsdruck bedingt ist. Die molekularen Gründe, warum Proteine noch bei so hohen Temperaturen stabil sind und katalytische Aktivität haben, sind momentan noch nicht geklärt. Es gibt natürlich auch eine Untergrenze für die Aktivität der Enzyme, die durch die Verfügbarkeit flüssigen Wassers bedingt ist: Ozeanische kryophile bzw. psychrophile Organismen fühlen sich bei Wassertemperaturen um und sogar unter 4 C wohl.

MERKE

Enzyme sind durch Substratspezifität, Chemo- und Regioselektivität sowie durch Stereospezifität charakterisiert. Sie weisen Reaktionsspezifität aus. Maximale Umsatzraten werden beim pH- und Temperaturoptimum erreicht.

Enzymkinetik

Das Michaelis-Menten-Modell

Wie bereits angesprochen, sind Enzyme Biokatalysatoren, die biochemische Reaktionen beschleunigen. Für das Verständnis des Mechanismus ist es unerlässlich, die Enzymreaktion auch quantitativ darzustellen. Wir wollen nun, analog zu den bisher besprochenen Prinzipien, die Kinetik von Enzymen betrachten. Die zugrunde liegende Theorie wurde von Leonor Michaelis und Maud Menten entwickelt und basiert auf zwei Grundannahmen, die in Abb. 3.20 schematisch illustriert werden.
  • Es wird postuliert, dass freies Enzym (E) und Substrat (S) in einer schnell erfolgenden Anlagerungsreaktion zunächst einen Enzym-Substrat-Komplex ES bilden (Abb. 3.20):

    E+SK1K1ES

  • Die Zerfallsrate k2 des Enzym-Substrat-Komplexes zur Bildung von Produkt und freiem Enzym stellt den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion dar:

    ESK2E+P

    Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0 des Enzyms ist also, ähnlich dem Zerfall des Übergangszustands,

    V0 k2 [ES].

Dies gilt natürlich nicht im strengen Sinne, da sich der Enzym-Substrat-Komplex nicht im absoluten Energiemaximum des Übergangszustands befindet, sondern in einem lokalen Minimum innerhalb des Aktivierungsbergs liegt. Trotzdem nimmt er ein energetisch hohes Niveau ein (Abb. 3.11).
Die Reaktionsgeschwindigkeit ist also proportional zur Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes. Man betrachtet mit V0 die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, gemessen zum Zeitpunkt t 0, bei dem die Rückreaktion
E+PK2ES
vernachlässigbar gering ist, weil praktisch kein freies Enzym und v.a. noch kein Produkt vorliegen. Diese einfache Einschränkung ist wichtig, weil die mathematische Behandlung der Enzymkinetik sonst unnötig kompliziert würde. Das wichtigste Element in dieser Betrachtung ist der intermediär auftretende Enzym-Substrat-Komplex, dessen Konzentration [ES] bei der Reaktion einen konstanten Wert annimmt (Abb. 3.21). Es kommt nämlich zur Ausbildung eines Fließgleichgewichts (Steady state), bei dem Entstehung und Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes mit gleicher Geschwindigkeit ablaufen. Es wird also genauso viel Substrat verbraucht, wie Produkt gebildet wird (Abb. 3.21). Man kann sich die Ausbildung eines Fließgleichgewichts des Intermediats ES plastisch vorstellen wie ein Wasserbecken mit je einem Zu- und einem Abfluss. Ein konstanter Flüssigkeitspegel stellt sich ein, sobald der zufließende und der abfließende Strom gleich sind. Auf unsere Reaktion übertragen heißt das: Solange genügend Substrat S vorhanden ist und nachfließt, bleibt das Fließgleichgewicht erhalten (Abb. 3.21).
Substrataffinität – Michaelis-Menten-Konstante Km
Nach dem Modell von Michaelis und Menten sind die Bildung und der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes ES durch die kinetischen Grundgleichungen
d[ES]/dt k1[E][S] (Bildung von ES)
und
–d[ES]/dt k2[ES] + k–1[ES] (Zerfall von ES) gegeben.
Im Steady state bleibt also [ES] unverändert. Rechnerisch sagt man dazu auch d[ES]/dt 0 (Abb. 3.20). Man darf die beiden Ausdrücke für Bildung und Zerfall gleichsetzen:
k1[E][S] k2[ES] + k–1[ES]
Durch Umformen der Ausdrücke für die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes erhält man im Fließgleichgewicht
[E][S]/[ES] (k–1 + k2)/k1 Km.
Die Michaelis-Menten-Konstante Km beschreibt die Dissoziation des Enzym-Substrat-Komplexes. Sie ist ein wichtiges Maß der Affinität des Enzyms für das Substrat: Je niedriger der Wert für Km ist, umso höher ist die Neigung des Enzyms, das betreffende Substrat katalytisch umzusetzen (Tab. 3.6). Der Wert von Km entspricht allerdings der thermodynamischen Gleichgewichtskonstante (Dissoziationskonstante des Enzym-Substrat-Komplexes) nur dann, wenn der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (k2) vernachlässigbar langsam gegen k–1 ist.

MERKE

Im Fließgleichgewicht ist die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes ES konstant. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms ist proportional zur ES-Konzentration. Die Substrataffinität von Enzymen wird durch die Konstante Km (Michaelis-Menten-Konstante) gekennzeichnet. Je niedriger der Wert für Km, desto größer ist die Affinität und umgekehrt.

Die Michaelis-Menten-Gleichung
Durch weiteres rechnerisches Umformen erhält man die außerordentlich wichtige Michaelis-Menten-Gleichung als Ausdruck für die quantitative Berechnung der Anfangsgeschwindigkeit:
V0 Vmax [S]/(Km + [S])
Die graphische Auftragung der Michaelis-Menten-Gleichung ist in Abb. 3.22a gezeigt und gibt den Zusammenhang von Enzymaktivität (Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0) und Substratkonzentration [S] für eine bestimmte Enzymmenge wieder.
Die Größe Vmax entspricht der maximalen Anfangsreaktionsgeschwindigkeit, der man sich nur bei sehr hohem Substratüberschuss (Substratsättigung) nähert, wenn es praktisch kein freies Enzym [E] mehr gibt, sondern alle Enzymmoleküle im Zustand [ES] vorliegen. Die Gleichung stellt mathematisch eine Hyperbel dar (Abb. 3.22a), bei der zwei Grenzfälle bemerkenswert sind:
  • 1.

    Bei niedrigen Substratkonzentrationen ist [S] vernachlässigbar klein gegen Km, und die Reaktionsgeschwindigkeit V0 ist proportional zu [S]. Die Kurve in Abb. 3.22a steigt linear an.

  • 2.

    Bei hohen Substratkonzentrationen ist Km klein gegen [S] und damit vernachlässigbar. Dann ist V0 Vmax, und zwar unabhängig von der Substratkonzentration, wie man in Abb. 3.22a sehen kann.

Die maximal erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit Vmax hängt von der Enzymmenge bzw. der Enzymkonzentration [Et] ab. Man bezieht daher die maximale Reaktionsgeschwindigkeit auch auf die Zahl der vorhandenen Enzymmoleküle: Vmax/[Et] kkat
kkat bezeichnet man auch als molekulare Wechselzahl des Enzyms (engl.: turnover number), die angibt, wie viele Substratmoleküle ein Enzymmolekül pro Sekunde umsetzt. Die Einheit von kkat ist demnach s–1. Es handelt sich hierbei um ein Maß für die maximale Leistungsfähigkeit des Katalysators. Km und Vmax (bzw. kkat) von verschiedenen Enzymen können höchst unterschiedliche Werte annehmen (Tab. 3.6 und Tab. 3.7).
Die Bestimmung der Konstanten erfolgt allerdings unter Idealbedingungen (z.B. Substratsättigung), die im biochemischen System praktisch kaum vorkommen. In vivo wird nur ein Bruchteil der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit Vmax erzielt, weil Enzyme unter den zellulär vorhandenen Substratkonzentration im Bereich von 1/100 Km bis 1 Km ihre Umsatzraten erreichen müssen. Für sich genommen, sagen diese Konstanten daher nur wenig aus. Beispielhaft sind in Tab. 3.7 die intrazellulären Substratoperationsbereiche von Enzymen des glykolytischen Stoffwechselwegs (Kap. 5) in Relation zu den Km-Werten dargestellt.
Ein auf die biochemischen Umgebungsbedingungen ([S] << Km) abgestimmtes Maß für die Leistungsfähigkeit von Enzymen ist die Spezifitätskonstante, die man aus dem Verhältnis von kkat und Km erhält:
Spezifitätskonstante kkat/Km
Die Spezifitätskonstante gibt also die katalytische Effizienz eines Enzyms an. Sie ist immer dann besonders günstig, wenn das Enzym bei hochgradiger Substrataffinität einen hohen Umsatz erzielt.
Wie man aus Tab. 3.6 ersieht, ergeben sich bei völlig unterschiedlichen Km- und kkat-Werten Spezifitätskonstanten in der Größenordnung von 107–108 M–1 s–1. Diese Enzyme kommen dem theoretisch erreichbaren Maximum von 3 108 M–1 s–1 schon recht nah, das durch die makromolekulare Diffusionsgeschwindigkeit beschränkt ist. Sie erreichen das Attribut der kinetischen Perfektion, denn praktisch jede Begegnung von Enzym- und Substratmolekül ist produktiv. Aber es gibt am anderen Ende der Geschwindigkeitsskala auch Enzyme, die extrem langsam operieren: Lysozym ist so ein Gegenbeispiel, das je nach Herkunft glykosidische Bindungen von Zuckerketten bakterieller Peptidoglykane mit einer kkat von 0,5–1 s–1 hydrolysiert.

MERKE

Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit eines Enzyms ist Vmax, gemessen in mol min–1. Die molekulare Wechselzahl kkat gibt an, wie viel mol Substrat pro mol Enzym in der Sekunde umgesetzt werden, und wird in der Einheit s–1 angegeben. Die Spezifitätskonstante gibt das Verhältnis von Wechselzahl zu Affinitätskonstante an (kkat/Km), ihre Einheit ist M–1 s–1, sie ist ein Maß für die katalytische Effizienz des Enzyms.

Bestimmung der katalytischen Konstanten
Um die Konstanten Vmax und Km zu ermitteln, bestimmt man die Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten V0 eines Enzyms bei Vorgabe verschiedener Substratkonzentrationen und trägt die Messdaten entsprechend der Michaelis-Menten-Gleichung auf (Abb. 3.22a). Die maximale Geschwindigkeit Vmax liest man aus dem asymptotisch angenäherten Grenzwert für V0 ab. Die Michaelis-Menten-Konstante Km entspricht der Substratkonzentration [S], bei der die halbmaximale Geschwindigkeit erreicht ist, also V0 Vmax. Man kann das leicht mathematisch ableiten, indem man in die Michaelis-Menten-Gleichung V0 Vmax einsetzt.
Daraus ergibt sich Vmax/2 Vmax [S]/(Km + [S]).
Umgeformt heißt das
[S]/(Km + [S])
Km + [S] 2 [S]
Km [S]
Eine alternative Bestimmungsmethode besteht darin, die Konstanten Vmax und Km aus der durch Umformung linearisierten Michaelis-Menten-Gleichung zu entnehmen. Die Messdaten werden hierfür nach der Formel 1/V0 (Km/Vmax) (1/[S]) + 1/Vmax doppelt reziprok im sog. Lineweaver-Burk-Diagramm aufgetragen (Abb. 3.22b). Hierbei liest man die Konstanten aus den Achsenabschnitten der Geraden ab. Diese Form der Auswertung sei aber nur aus historischen Gründen erwähnt, weil hierin mit erheblichen Messfehlern behaftete Daten stark übertrieben gewichtet werden und daher zu ungenauen Ergebnissen führen. Heutzutage wertet man bevorzugt die experimentell gewonnen Messdaten mithilfe der direkten Michaelis-Menten-Darstellung durch nichtlineare Anpassung mit Computerunterstützung aus.

MERKE

Die Enzymkonstanten Km und Vmax kann man aus der direkten hyperbolischen Auftragung oder der reziproken linearen Lineweaver-Burk-Auftragung graphisch bestimmen.

Enzymaktivitätsbestimmung

Maßeinheiten
Enzymaktivitäten sind Reaktionsgeschwindigkeiten (V0). Diese werden zweckmäßigerweise in umgesetzter Substratstoffmenge pro Zeit angegeben. Die zurzeit immer noch gebräuchliche Einheit der Enzymaktivität ist Unit (1 Unit 1 U 1 mol min–1), die nach dem International System of Units (SI) abgeleitete Einheit katal (gemessen in mol s–1) hat sich noch nicht richtig durchgesetzt.
Normalerweise wird die Aktivität bezogen auf ein bestimmtes Probevolumen (mL) oder eine Proteinmenge (mg) angegeben. Die berechneten Größen bezeichnet man dann als Volumenaktivität (U mL–1) und spezifische Aktivität (U mg–1). In der klinischen Chemie bezieht man die Aktivitäten von Enzymen als diagnostische Größe z.B. auf bestimmte Volumina von Körperflüssigkeiten. Je höher die Volumenaktivität eines kritischen Enzyms ist, umso deutlicher der klinische Befund. Der Biochemiker misst die Reinheitsstufe und damit den Anreicherungsgrad von isolierten Enzymen anhand der spezifischen Aktivität, die umso höher ist, je größer der spezifische Gehalt des fraglichen Enzyms in der Gesamtproteinmenge einer Probe ist.
Messung der Enzymaktivität
Enzymaktivitätsbestimmungen sind Messungen von Reaktionsgeschwindigkeiten. Man kann die Geschwindigkeiten mit verschiedenen Methoden verfolgen. Besonders verbreitet sind hierbei spektroskopische Verfahren, weil viele umgesetzte Substrate oder gebildete Produkte optische Eigenschaften haben, also im ultravioletten oder sichtbaren Spektralbereich absorbieren oder fluoreszieren. Absorptionsänderungen einer in Flüssigkeit gelösten Substanz kann man mit einem Spektralphotometer quantitativ bestimmen (Abb. 3.23a).
Optischer Test
Ein häufig in der Biochemie und klinischen Chemie genutztes Chromophor ist NADH (Kap. 4), das als Coenzym (Cofaktor) bei verschiedenen Dehydrogenasen vorkommt. Allgemein katalysieren Dehydrogenasen die Reaktion
oxidiertes Substrat + NADH + H+ reduziertes Substrat + NAD+
Nur das NADH als reduzierte Form, nicht aber NAD+ in seiner oxidierten Form zeigt eine Absorption bei 340 nm. Man kann also aus dem zeitlichen Verlauf der Absorptionsänderung den Übergang beider Formen messen und damit den Umsatz von Substraten bestimmen, der an den Umsatz von NADH/NAD+ gekoppelt ist. Diese Bestimmung erfolgt in der (sorgfältig temperierten) Küvette eines Spektralphotometers (Abb. 3.23a), das den Absorptionsverlauf über die Zeit registriert. Die Absorptionsänderungen über die Zeit sind gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz (Kap. 2.1.2) proportional zur Reaktionsgeschwindigkeit. Mit dem molaren Extinktionskoeffizienten kann man aus den gemessenen Werten den Stoffumsatz berechnen.
Nach dem spektroskopischen Messprinzip lassen sich viele weitere biochemisch relevante Chromophore zur Aktivitätsbestimmung nutzen, z.B. gefärbte Coenzyme oder Cofaktoren (Kap. 4), chromogene Substrate oder Substratanaloga. Die Enzymaktivität der klinisch wichtigen alkalischen Phosphatase kann beispielsweise mit p-Nitrophenylphosphat bestimmt werden, einem künstlichen Pseudosubstrat, das vom Enzym genauso umgesetzt wird wie das natürliche Substrat (Abb. 3.23b). Das Enzym hydrolysiert die C–P-Bindung unter Bildung des Produkts Nitrophenol, das im alkalischen Milieu im sichtbaren Bereich absorbiert: Durch Messung der Extinktion bei 405 nm kann man die Bildung von Nitrophenolat verfolgen (Abb. 3.23c).
Nichtkontinuierliche Messtechniken
Falls keine optischen Eigenschaften für die kontinuierliche zeitliche Beobachtung nutzbar sind, kann man Stoffumsätze auch mit anderen Methoden bestimmen, z.B. durch Abstoppen einer Reaktion nach einer bestimmten Inkubationszeit und nachfolgende chemische Analyse der noch vorhandenen Substrate oder gebildeten Produkte (Abb. 3.24). Neben chromatographischen Verfahren kommen auch radiochemische Techniken zum Einsatz, denn die Enzyme reagieren chemisch gleichwertig mit natürlichen oder den entsprechend isotopenmarkierten Substraten.
So werden z.B. radioaktiv markierte Substratmoleküle (vorzugsweise unter Einsatz der Isotope 3H, 14C, 32P, 35S) umgesetzt und die Reaktionspartner und -produkte voneinander getrennt. Durch Flüssig-Szintillationszählung kann man die mit dem Stoffumsatz korrelierende Radioaktivitätsverteilung quantitativ erfassen und daraus die Enzymaktivitäten berechnen.

MERKE

Die Enzymaktivität gibt die Reaktionsgeschwindigkeit als Stoffumsatz pro Zeit an. Die meistverwendete Einheit (Unit) der Enzymaktivität ist 1 U 1 mol min–1.

Enzyminhibition

In der Medizin spielen Hemmstoffe von Enzymen eine große Rolle als pharmakologisch wirksame Substanzen. Daher ist es sinnvoll, die kinetischen Effekte dieser Verbindungen im Hinblick auf Medikamentenentwicklung und -anwendung zu testen. Nach ihrem Wirkungsmechanismus werden diese verschiedenen Inhibitionstypen zugeordnet.
Reversible Hemmung
Bei der reversiblen Hemmung liegt eine dynamische Wechselwirkung zwischen Enzym und Hemmstoff vor, die zur Ausbildung eines Inhibitor-Enzym-Komplexes führt. Man unterscheidet hierbei vier Formen, die als kompetitive, nichtkompetitive, unkompetitive und allosterische Hemmtypen eingeteilt werden.
Kompetitive Hemmung
Kompetitive Hemmstoffe (I) sind den Substraten strukturell sehr ähnlich, werden aber nicht vom Enzym umgesetzt. Sie binden nichtkovalent an die Substratbindungsstellen (Abb. 3.25a) unter Bildung von Enzym-Inhibitor-Komplexen (EI) anstelle von Enzym-Substrat-Komplexen (ES). Der Inhibitor konkurriert also mit dem Substrat um den Bindeplatz im aktiven Zentrum. Den Zutritt eines kompetitiven Hemmers zum Bindungsplatz im aktiven Zentrum kann man nur durch hohe Substratkonzentrationen unterbinden. Man erreicht also die maximale Enzymaktivität Vmax erst bei höheren Substratkonzentrationen. Die sich – abhängig von der Inhibitorkonzentration – ergebende Michaelis-Konstante K'm des Enzyms, auch als apparente Km bezeichnet, ist gegenüber Km erhöht (Abb. 3.25b):
Km Km (1 + [I]/Ki)
Die Inhibitorkonstante Ki gilt als Maß für die Bindungsstärke eines Inhibitors und entspricht der thermodynamischen Gleichgewichtsbindungskonstanten:
Ki [E] [I]/[EI]
Beispiele für kompetitive Hemmstoffe sind Substratanaloga, deren chemische Struktur eng mit der des Substrats verwandt ist, die aber vom Enzym nicht katalytisch umgesetzt werden können. So oxidiert Succinat-Dehydrogenase Bernsteinsäure (HOOC–CH2–CH2–COOH) zu Fumarsäure (HOOC–CH2CH2–COOH), das Enzym wird aber kompetitiv von der chemisch verwandten Malonsäure (HOOC–CH2–COOH) gehemmt. Der Inhibitor ist im Vergleich zum Substrat nur um eine Methylengruppe verkürzt und wird chemisch nicht umgesetzt, weil sich darin keine CC-Doppelbindung ausbilden kann.
Um die Inhibitorkonstante Ki zu bestimmen, misst man die apparente Km aus der direkten oder der Lineweaver-Burk-Darstellung (Abb. 3.25c, d) bei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen und trägt Km gegen [I] auf. Nach der obigen Formel lässt sich 1/Ki aus der Steigung der Geradengleichung ablesen.

Klinik

Bei Methanolvergiftungen wird durch die Alkohol-Dehydrogenase (ADH) der Leber der toxische Metabolit Formaldehyd produziert, der u.a. zu Erblindung führen kann. Die Reaktion lautet:

CH3OH+NAD+ADHCHO+NADH+H+

Therapeutisch sinnvoll ist hier die parenterale Gabe von Ethanol, da eine konstant niedrige Konzentration dieses Stoffs aufgrund der Substratspezifität das Methanol von der Bindungsstelle auf der ADH verdrängt, wodurch die folgende Reaktion dominiert:

CH3CH2OH+NAD+ADHCH3CHO+NADH+H+

Dies senkt die Formaldehydsyntheserate drastisch, gleichzeitig wird das restliche Methanol renal eliminiert.

Schon gewusst

Proteasen können durch Peptidanaloga kompetitiv gehemmt werden. Das gilt auch für die HIV-Protease, die für die Abspaltung funktioneller Polypeptide aus dem viralen Polyprotein und damit entscheidend für die Reifung und Vermehrung des HI-Virus verantwortlich ist. Die HIV-Protease ist daher ein Zielobjekt der Pharmakotherapie. Man hat spezifisch wirkende Inhibitoren synthetisiert und deren molekularen Wirkort strukturell verifiziert. Entfernt peptidanaloge Wirkstoffe können den Substratbindungsplatz der HIV-Protease besetzen (Abb. 3.26a, b). Indinavir ist eines der Medikamente, das in der sog. HAART-(hochaktive antiretrovirale Therapie)-Kombinationstherapie gegen HIV-Infektionen eingesetzt wird.

Nichtkompetitive Hemmung
Ein reversibler nichtkompetitiver Hemmstoff (I) bindet an einer von der Substratbindungsstelle verschiedenen Position auf dem Enzym (Abb. 3.27a, b), wodurch der Substratzutritt zum aktiven Zentrum erhalten bleibt, die katalytische Rate dennoch vermindert wird. Da in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration nur ein bestimmter Anteil der Enzymmoleküle blockiert ist, verringert sich die Reaktionsgeschwindigkeit Vmax (ohne Inhibitor) zu Vmax (mit Inhibitor). Weil die Affinität des Enzyms zum Substrat unbeeinträchtigt ist, bleibt der ursprüngliche Wert für Km erhalten (Abb. 3.27c, d). Für Vmax gilt die Beziehung: Vmax Vmax/(1 + ([I]/Ki). In eine Geradengleichung umgeformt, sieht das folgendermaßen aus:
1/Vmax (1 + ([I]/Ki)/Vmax bzw. 1/Vmax 1/Vmax + ([I]/Ki Vmax)
Nach Bestimmung der Vmax bei gegebener Inhibitorkonzentration können aus der Auftragung von 1/Vmax gegen die [I] aus dem Ordinatenabschnitt 1/Vmax und aus der Geradensteigung 1/(Ki Vmax) abgelesen werden.
Schwermetalle wie z.B. Quecksilber, die mit katalytisch wichtigen Thiolgruppen außerhalb der eigentlichen Substratbindungsstelle des Enzyms reagieren, gelten als nichtkompetitive Hemmstoffe. Die Hemmung kommt in dem Fall zustande, weil diese Gruppen durch die chemische Modifikation inaktiviert werden und damit die Maximalgeschwindigkeit vermindert wird. Dabei hat das Substrat aber weiterhin ungehinderten Zugang zu seiner Bindungsstelle. Die Affinität des Quecksilbers zu den Thiolgruppen ist sehr hoch, und man kann die Bindung auch als kovalent ansehen, dann wäre die Hemmung als irreversibel einzustufen. Das Beispiel zeigt, wie schwierig es ist, eine eindeutige Systematik für diese pharmakologisch bedeutsamen Enzymeigenschaften zu finden.

Klinik

Chronische Bleivergiftungen gehen mit den Symptomen einer hypochromen Anämie einher. Dabei kommt es u.a. zu charakteristischen Änderungen des Blutbilds wie Erhöhung der Retikulozytenzahl, basophiler Tüpfelung der Erythrozyten und außerdem zur Akkumulation von Zwischenprodukten der Biosynthese des Blutfarbstoffs Häm im Urin. Ursache hierfür ist die Reaktion der schwermetallischen Bleiionen mit Sulfhydrylgruppen mancher Enzyme der Häm-Biosynthese, was insbesondere zur nichtkompetitiven Hemmung der Ferrochelatase führt. Das therapeutische Ziel muss hier in der Entfernung des toxischen Metalls liegen: Durch Infusion von Komplexbildnern wie BAL (British Anti-Lewisite Dimercaptopropanol), Penicillamin (Dimethylcystein) oder Chelatoren wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden nichttoxische Komplexe gebildet, die nierengängig sind und schnell die Serumkonzentration von Bleiionen herabsetzen.

Unkompetitive Hemmung
Im Fall der unkompetitiven Hemmung, die auch als gemischte Hemmung bezeichnet wird, bindet der Inhibitor nur an den Enzym-Substrat-Komplex, es bildet sich also nach der Beziehung E + S + I ESI ein inaktiver ternärer Komplex ESI aus. Der Hemmeffekt nimmt mit zunehmender Konzentration von Substrat und Hemmstoff zu, weil beide Faktoren die Konzentration der inhibierten Spezies ESI erhöhen. Bei diesem Hemmtyp können Km und Vmax vermindert werden. L-Tryptophan tritt beispielsweise als ein unkompetitiver Inhibitor der intestinalen alkalischen Phosphatase auf.
Allosterische Hemmung
Bei sog. allosterischen Enzymen wird die Aktivität durch Bindung eines Moleküls an nichtkatalytische Bindungsstellen außerhalb des aktiven Zentrums herabgesetzt. Allosterische Hemmstoffe unterscheiden sich von nichtkompetitiven Inhibitoren, weil sie nur eine von zwei oder mehr möglichen Proteinkonformationen stabilisieren und in den meisten Fällen die Enzymaktivitäten partiell blockieren. Die Hemmung allosterischer Enzyme wird nicht durch das Michaelis-Menten-Modell erfasst. Man spricht hier eher von einer Modulation der Enzymaktivität. Dieses Phänomen wird später unter dem Begriff Allosterie besprochen (Kap. 3.5.1).
Irreversible Hemmung
Ein irreversibler Inhibitor bindet sehr fest (kovalent) an das Enzym, sodass die Bindung praktisch nicht mehr dissoziiert, man spricht auch von Enzymgiften. Dabei kann die Bindung am aktiven Zentrum erfolgen und den Zugang für das Substrat versperren. Findet die Bindung außerhalb des aktiven Zentrums statt, so verändert sich die Struktur des Proteins derart, dass die katalytischen Funktionen beeinträchtigt werden. Als Beispiel kann man das Nervengas Diisopropylfluorophosphat (DIFP) anführen, das kovalent an einen Serinrest im aktiven Zentrum des Enzyms Acetylcholinesterase bindet und so die Weiterleitung von Nervenimpulsen beeinträchtigt.

Klinik

Aspirin (Acetylsalicylsäure, Abb. 3.28a) ist ein seit vielen Jahren populäres Medikament zur Behandlung von Entzündungs- und Schmerzsymptomen, dessen hauptsächliche pharmakologische Wirkung in der Hemmung der Synthese von Prostaglandinen besteht, einer wichtigen Gruppe biologischer Mediatoren. Der irreversible molekulare Hemmeffekt wird durch kovalente Reaktion des Wirkstoffs (Acetylierung) mit den Enzymen Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2 (COX-1 und COX-2) ausgelöst. Es gibt mittlerweile auch zahlreiche moderne NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drugs), z.B. Ibuprofen. Diese wirken jedoch als reversible Inhibitoren mittels Kompetition mit dem physiologischen Substrat am aktiven Zentrum der COX.

Suizidinhibitoren
Suizidinhibitoren (engl. suicide inhibitors) stellen eine heterogene und interessante Klasse von Hemmstoffen dar. Sie lassen sich nach den bisherigen Schemata nicht klassifizieren, weil sie nach Aktivierung zwar substratanalog sind, jedoch kovalent mit dem Zielenzym reagieren. Ihnen gemeinsam ist die Applikationsform als eine zunächst harmlose Vorstufe, die im Stoffwechsel scharf gemacht wird und als hochreaktive Spezies kovalent mit molekularen Targets interagiert. Durch ihren eigenen Reaktionsmechanismus blockieren sich die betroffenen Enzyme also selbst. Der besondere Vorteil dieser Verbindungen bzw. Pharmaka ist die hohe Spezifität. Suizidinhibitoren sind für die Medikamentenentwicklung sehr wichtig, weil bei geschickter Auswahl und chemischer Modifikation des Substrats mögliche Nebenwirkungen minimiert werden können.
Das gegen grampositive Bakterien wirksame Antibiotikum Penicillin sowie seine Derivate sind solche Suizidinhibitoren (Abb. 3.28b). Die strukturelle Ähnlichkeit zu D-Alanyl-D-Alanin, einem Bauelement der Peptidoglykanzellhülle, wird von einem bakteriellen Zellwandsyntheseenzym (einer Transpeptidase) als Substrat erkannt und kovalent an einen Serinrest im aktiven Zentrum gekoppelt. Der Ausfall des blockierten Enzyms sorgt für den antibiotischen Effekt, weil sich die Bakterien bei defekter Zellwandsynthese nicht mehr vermehren können.

Klinik

Das Ksrebstherapeutikum Fluorouracil ist strukturanalog zum Nucleotidvorläufer Uracil (Abb. 3.29). In vivo wird die Substanz in Fluoro-dUMP gewandelt, das anstelle des natürlichen Substrats dUMP ein stabiles Addukt mit dem Coenzym N5,N10-Methylen-Tetrahydrofolat bildet. Dieses wird über eine Schwefelbrücke kovalent an das Enzym Thymidylat-Synthase gekoppelt, wodurch das Enzym irreversibel geblockt ist. Die Folge: Besonders teilungsaktive Zellen, die einen hohen Nucleotidbedarf haben, werden inhibiert und sterben ab.

MERKE

Enzyme können durch kovalente Bindung oder andere intermolekulare Wechselwirkungen mit Hemmstoffen assoziieren. Nichtkovalent bindende Stoffe werden nach ihrem Mechanismus in kompetitive und nichtkompetitive Hemmstoffe eingeteilt. Suizidinhibitoren binden spezifisch an die Substratbindungsstelle und können das Zielenzym durch eine chemische Reaktion blocken. Spezifisch wirkende Enzymhemmstoffe kommen auch als Pharmaka zum Einsatz.

Regulation der Enzymaktivität

Um ihre vielfältigen Aufgaben zu erfüllen, müssen Enzymaktivitäten je nach Stoffwechsellage bzw. zellulären Erfordernissen reguliert werden können. Auf unterster Ebene werden die Aktivitäten durch Biosynthese und Biodegradation, d.h. durch Transkription, Translation und proteolytischen Abbau der Enzymproteine, die kontrollierte Proteolyse, gesteuert. Einen Eindruck von der durchschnittlichen Lebensdauer ausgewählter Enzyme in Rattenleber vermitteln die Daten in Tab. 3.8. Durch regulatorische Beeinflussung der biologischen Halbwertszeit können Enzymaktivitäten über die verfügbare Enzymmenge effektiv der Stoffwechselsituation angepasst werden.
Darüber hinaus gibt es eine Reihe von subtileren Mechanismen der Regulation. Bei komplexen Stoffwechselreaktionswegen, die aus mehreren zusammengesetzten Schritten bestehen, reicht es aus, einen dieser Teilschritte regulativ zu beeinflussen. Ganz allgemein bestehen Regulationseffekte darin, dass Enzymaktivitäten durch Auslösung bestimmter chemischer Signale moduliert werden. Man kann grundsätzlich die Steuerung der Enzymaktivität durch kovalente und nichtkovalente Wechselwirkungen unterscheiden.

Nichtkovalente Enzymregulation

Isosterische Autoregulation und Produkthemmung
Die einfachsten Enzymregulationsphänome lassen sich durch Wechselwirkung der Enzyme mit niedermolekularen Stoffen erklären, bei denen die Konformation des Enzyms unverändert bleibt; es sind die isosterischen Effekte. Viele Enzyme regeln dabei ihre Aktivität gewissermaßen selbst, da die Umsatzraten in einem weiten Substratkonzentrationsbereich (etwa in der Größenordnung 0 < [S] < 5 Km) von dem Ausmaß der Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes abhängen (Autoregulation). Die Substratkinetik dieser Enzyme, die auch als hyperbolisch bezeichnet werden, wird durch das bereits beschriebene Modell von Michaelis und Menten erklärt. Auf höheres Substratangebot reagiert das Enzym mit höherer Umsatzgeschwindigkeit bzw. umgekehrt. Dies gilt natürlich nur bis zum Erreichen der Substratsättigung. Viele Enzyme haben einen Substratwirkungsbereich (ausgedrückt als Maß der Km-Werte) in der Größenordnung der intrazellulären Konzentrationen, wie Tab. 3.7 am Beispiel von glykolytischen Enzymen zeigt. Die meisten dort gelisteten Enzyme operieren bei Substratkonzentrationen [S] Km, nur die Hexokinase arbeitet praktisch unter Sättigungsbedingungen. Im Gegensatz hierzu ist die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase in vivo noch weit von der Maximalgeschwindigkeit entfernt.
Eine weitere Form der nichtkovalenten Regulation, die auf der Affinität der Substratbindungsstelle beruht, ist die Produktinhibition. Wenn sich das Produkt während einer enzymatischen Reaktion anhäuft, kann es aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit dem Substrat um den Bindeplatz am aktiven Zentrum konkurrieren, es handelt sich somit um eine kompetitive Hemmung durch das Reaktionsprodukt. Bei der Reaktion der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
Glucose-6-phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+
konkurriert das zunehmende Coenzymprodukt NADPH mit dem Cosubstrat NADP+ um die Enzymbindungsstelle, was zwangsläufig die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms reduziert.
Allosterische Regulation
Im Gegensatz zur isosterischen Regulation wird die Aktivität des Enzyms bei der allosterischen Regulation durch eine Veränderung der Konformation beeinflusst, wobei eine der möglichen Konformationen durch Bindung eines allosterischen Effektors stabilisiert wird (Abb. 3.30).
Feedback-Wirkung
Aktivierung oder Hemmung kann auch eintreten, wenn nicht das Produkt einer einzelnen Reaktion, sondern das Zwischen- oder Endprodukt einer Reaktionskette auf das Enzym einwirkt. Diese Stoffe sind dann mit dem Substrat nicht strukturverwandt. In Abb. 3.30c ist das Modell eines Stoffwechselwegs dargestellt, bei dem aus dem Anfangsstoff A in mehreren enzymatisch katalysierten Teilschritten das Produkt P erzeugt wird. Derartige Reaktionssequenzen sind häufig bei Aminosäure- und Nucleotidbiosynthesewegen anzutreffen. Die Bildung des Endprodukts ist in diesen Fällen gehemmt, weil das Produkt selbst als negativer Effektor auf das erste Enzym (E1) der Sequenz einwirkt, also eine Feedback-Hemmung auslöst. Bei Anhäufung des Produkts kommt daher dessen weitere Synthese zum Erliegen, bei Verminderung der Produktkonzentration wird die Reaktionsfolge wieder angekurbelt. Der Effektorwirkstoff beeinflusst das Geschehen dabei, indem er sich an einer anderen Position als der Substratbindungsstelle anheftet (Abb. 3.30a). So wird oftmals eine Proteinkonformation stabilisiert, in der das modulierte Enzym verminderte Aktivität aufweist (negatives Feedback). Andererseits gibt es aber auch Effektoren, die aktivierend wirken, indem sie eine andere Enzymkonformation stabilisieren (positives Feedback).
Allosterie
Als Allosterie bezeichnet man das Vorkommen von Proteinen in verschiedenen, durch Bindung niedermolekularer Wirkstoffe stabilisierten Konformationen, die sich in ihren Aktivitätszuständen unterscheiden (Abb. 3.30 a, b). Den Übergang zwischen den Formen modulieren Effektoren, die an unterschiedlichen Stellen binden. Sie können je nach Typ hemmenden oder aktivierenden Einfluss haben.
Von heterotrop erwirkten Konformationsänderungen spricht man, wenn die Effektorsubstanz und das Substratmolekül unterschiedliche Stoffe sind (Abb. 3.30a). Bei homotrop ausgelösten Konformationsänderungen (Abb. 3. 30b) sind Substrat und allosterischer Effektor identisch. Diese Konstellation ist in der Natur häufig anzutreffen. Enzyme, die nach einem homotropen Wirkungsmodus arbeiten, haben meist zwei oder mehr identische Untereinheiten, die sich durch intermolekulare Wechselwirkungen gegenseitig beeinflussen. Man nennt dies auch molekulare Kooperativität. Manche regulatorische Enzyme werden sowohl hetero- als auch homotrop moduliert. Aufgrund ihrer Komplexität weisen homotrope Enzyme keine hyperbolischen Substratgeschwindigkeitsdiagramme auf (V0 gegen [S]) wie in Abb. 3.22, sondern zeigen häufig einen sog. sigmoiden Kurvenverlauf, der durch kooperative Wechselwirkungen zwischen den beteiligten Untereinheiten zustande kommt, wie im nächsten Abschnitt erklärt wird.
Kooperativität von Proteinen
Das Phänomen Proteinkooperativität soll am Beispiel des Hämoglobins erklärt werden. Bindung und Transport des Liganden Sauerstoff sind die herausragenden Merkmale des tetrameren Hämoglobins, das beim Erwachsenen überwiegend in der aus zwei - und zwei -Untereinheiten bestehenden HbA-Form vorkommt. Auch wenn das Protein keinerlei enzymatische Aktivität hat, wurde es als Enzym honoris causa bezeichnet, weil man an diesem Modell das allosterische Regulationsprinzip gut verstehen kann. Die besonderen Eigenschaften von Hämoglobin werden deutlich, wenn man es mit seinem nur als Monomer vorkommenden Verwandten, dem Myoglobin, vergleicht. Der Bindungsgrad von Sauerstoff an Myoglobin ist in Abb. 3.31, als Funktion des Sauerstoffdrucks dargestellt.
Der hyperbolische Verlauf der Bindungskurve zeigt das typische Sättigungsverhalten des Proteins. 100% Sättigung entspricht einem gebundenen Molekül O2 pro Molekül Myoglobin (Oxymyoglobin). Das tetramere Hämoglobin (Desoxyhämoglobin) hat vier Bindestellen für Sauerstoff, seine Bindungskurve (Abb. 3.31) hat eine S-artige, sigmoide Form. Der Sättigungsbindungsgrad entspricht vier gebundenen Molekülen O2 pro Molekül Hämoglobin (Oxyhämoglobin). Aus dem sigmoiden Kurvenverlauf kann man ablesen, dass ein Hämoglobinmolekül bei niedriger O2-Konzentration geringe O2-Affinität hat (flacher Kurvenabschnitt) und bei mittlerer und hoher Konzentration eine höhere O2-Affinität aufweist (steiler Kurvenabschnitt und Sättigungsbereich). Das Ansprechen des Hämoglobinmoleküls auf den Sauerstoffliganden (homotrope Wirkung) erklärt man durch beladungsabhängige kooperative Wechselwirkungen der Untereinheiten, weil die Ligandenbindungsstellen auf den verschiedenen Untereinheiten zusammenarbeiten. Bindet Sauerstoff an eine Untereinheit, so verstärkt sich die Affinität für weitere Sauerstoffmoleküle an den restlichen Untereinheiten. Das Ausmaß der Kooperativität wird durch den sog. Hill-Koeffizienten angegeben, der im Idealfall mit der Anzahl der kooperierenden Ligandenbindungsstellen übereinstimmt und bei Hämoglobin den realen Wert von 3 annimmt (theoretisch: 4). Kooperative Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten erklärt man durch einen Allosterieeffekt, wobei man annimmt, dass die freie und die ligandengebundene Konformation von Hb verschieden sind. Da Sauerstoff ein aktivierender Ligand ist, dessen Bindung die Affinität für weitere Moleküle erhöht, spricht man hier von positiver Kooperativität der Bindestellen. Aus der 3-D-Strukturanalyse weiß man, dass ligandenfreies Desoxyhämoglobin und sauerstoffgebundenes Oxyhämoglobin tatsächlich in verschiedenen Konformationen existieren (Abb. 3.32).
Zur Erklärung der Sauerstoffbindung nimmt man das Symmetriemodell an, auch Modell des konzertierten Übergangs oder auch Alles-oder-nichts-Modell genannt. Es besagt, dass Hämoglobin nur in zwei Konformationen existiert (Abb. 3.33a), der O2-niederaffinen T- und der O2-hochaffinen R-Form. Die Bezeichnungen T steht für tense (engl. gespannt) und bezeichnet eine Struktur wie Desoxyhämoglobin. R kommt von relaxed (engl. entspannt) und steht für eine Struktur wie Oxyhämoglobin, ohne gebundenen Sauerstoff. Die T- und R-Formen stehen miteinander im Gleichgewicht, ohne Ligand liegt das Protein überwiegend in der niederaffinen T-Form vor:
T R
Das Symmetriemodell besagt, dass Sauerstoff mit hoher Affinität an die in der R-Form befindlichen Moleküle bindet und diese stabilisiert:
Damit wird das Gleichgewicht von T R nach rechts verschoben, und insgesamt gehen bei zunehmender Ligandenbindung immer mehr Moleküle von der T-Form in die R-Form über:
Obwohl das Symmetriemodell die Bindungseigenschaften grundsätzlich gut beschreibt, ist alternativ das Sequenzmodell (konsekutives Modell) entwickelt worden (Abb. 3.33b), bei dem die Umwandlung von T nach R pro Untereinheit in Einzelschritten erfolgt. Auch mit diesem Modell lässt sich unter Berücksichtigung der postulierten Zwischenzustände die O2-Bindungskurve angemessen erklären.
Neben den vom eigentlichen Liganden Sauerstoff ausgehenden homotropen Wirkungen am Hämoglobin können andere Substanzen heterotrope allosterische Effekte auslösen: 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) ist ein solcher im Zytoplasma der Erythrozyten vorkommender Ligand, der im Zentrum des Hämoglobintetramers bevorzugt an den Desoxyzustand bindet (Abb. 3.32c), diesen stabilisiert und so die Sauerstoffaffinität vermindert. Hierdurch wird die Bindungskurve nach rechts verschoben (Abb. 3.31). Die Destabilisierung der Sauerstoffbindung durch BPG ist ein Beispiel für negative Allosterie. Mithilfe des Symmetriemodells lässt sich das folgendermaßen darstellen:
In Gegenwart des Modulators BPG wird das T R-Gleichgewicht nach links verschoben, was die Konzentration der R-Form vermindert und dadurch die Sauerstoffdissoziation fördert. Die BPG-Bindung erleichtert also die Desoxygenierung bzw. vermindert die O2-Affinität an Desoxyhämoglobin und erklärt damit den verschobenen Kurvenverlauf in Abb. 3.31.

MERKE

Die sigmoide Sauerstoffbindungskurve des tetrameren Hämoglobins ist auf kooperative Effekte der Untereinheiten hinsichtlich der Ligandenbindung zurückzuführen (homotroper allosterischer Effekt). Nach Bindung eines Sauerstoffmoleküls ist die Bindung weiterer Sauerstoffmoleküle erleichtert. Die Sauerstoffbindung wird durch das Symmetrie- oder das Sequenzmodell erklärt. Für das Symmetriemodell muss man annehmen, dass die Untereinheiten in einer für Sauerstoff entweder niedrig- (T-) oder hochaffinen (R-)Konformation vorliegen. 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) ist ein heterotrop wirkender Modulator, der bevorzugt an die Desoxyhämoglobin-Form (T) bindet und hierdurch die Sauerstoffbindungsaffinität mindert.

Allosterische Enzyme
Bei den meisten allosterischen Enzymen herrschen positiv kooperative (aktivierende) Effekte durch Substratmoleküle vor, welche die sigmoide Konzentrationsabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit erklären. Als kinetischer Parameter wird mit Vmax die Maximalgeschwindigkeit angegeben, die Enzyme bei Substratsättigung erreichen. Weil sie der hyperbolischen Michaelis-Menten-Gesetzmäßigkeit (Abb. 3.22) nicht folgen, ist eine entsprechende Konstante Km nicht definiert. Als charakteristisches Maß für die Substrataffinität gibt man stattdessen die Substratkonzentration K an, bei der die Enzyme mit halbmaximaler Geschwindigkeit arbeiten. Heterotrop wirkende Modulatoren können vom V- oder vom K-Typ sein, je nachdem, ob sie die Vmax oder die K eines allosterischen Enzyms beeinflussen. Der überwiegend auftretende Wirkmodus ist vom K-Typ und führt zu Erniedrigungen (Aktivierung) oder zu Erhöhungen (Desaktivierung) der K bzw. praktisch gesehen zu Links- oder Rechtsverschiebungen der sigmoiden Kurve (Abb. 3.35).

Schon gewusst

Allosterische Regulation der Aspartat-Transcarbamoylase. Die Biosynthese von Pyridinnucleotiden unterliegt der Feedback-Hemmung durch das Produkt CTP (Abb. 3.34a). Der erste Schritt des Weges wird durch die Aspartat-N-Carbamoylase (ATC) katalysiert: Aspartat + Carbamoylphosphat N-Carbamoylaspartat + Pi

Das Enzym besteht aus sechs katalytischen und sechs regulatorischen Untereinheiten (Abb. 3.34b, c) und verhält sich

  • homotrop in Bezug auf das positiv kooperative Substrat Aspartat (Bindungsort: katalytische Untereinheiten)

  • heterotrop in Bezug auf den negativen Modulator CTP (Bindungsort: regulatorische Untereinheiten), das Endprodukt des Stoffwechselwegs, und auf den positiven Modulator ATP.

Nach dem bereits für Hämoglobin diskutierten Symmetriemodell stehen die beiden Konformationen T und R im Gleichgewicht und werden durch das Substrat Aspartat stabilisiert:

Durch Annahme unterschiedlicher Enzymaktivitätszustände von T- und R-Form mit jeweils hyperbolischer Substratabhängigkeit (Abb. 3.35a, rote und grüne Kurve) erklärt sich die tatsächlich gemessene sigmoide Kurve (Abb. 3.35a, blaue Kurve) als Folge der Mischung aus den T- und R-Komponenten, wobei das T/R-Verhältnis abhängig von der Konzentration des positiven Substrateffektors Aspartat ist. Die 3-D-Struktur der hochaffinen R-Konformation stellt sich, ausgehend vom T-Zustand, durch eine Teilrotation und Auseinanderbewegung der katalytischen Trimerebenen ein (Abb. 3.35a).

Durch Bindung des heterotropen Inhibitors CTP an die regulatorischen Bindungsstellen verschiebt sich die sigmoide Kurve nach rechts (Abb. 3.35b), und es wird die Bildung der T-Form der ATC favorisiert; die Substrataffinität wird vermindert, K wird also größer. Eine gegenläufige Wirkung stellt sich mit dem positiven Effektor ATP ein, der die R-Form begünstigt. Es resultiert eine Linksverschiebung der Kurve, d.h., die Substrataffinität steigt (K wird kleiner):

In Gegenwart jedes der beiden heterotropen Effektoren bleibt die Maximalgeschwindigkeit bei hoher Substratkonzentration gleich. Weil sich aber K für Aspartat ändert, handelt es sich bei der ATC um eine Regulation vom K-Typ. Im Bereich der höchsten Steilheit der sigmoiden Kurve ist die Regelung der Enzymaktivität besonders empfindlich (helle Zone in Abb. 3.35b), d.h., hier spricht die ATC auf relativ geringe Änderungen der Effektorkonzentrationen mit hohen Aktivitätsänderungen an.

Klinik

Die -Zellen des endokrinen Pankreas sind ein wichtiges Mess- und Regelelement für den Blutglucosespiegel. Sie enthalten die zytoplasmatische Glucokinase als Schaltstelle, die – anders als die hochaffine, praktisch immer substratgesättigte Hexokinase – dynamisch im physiologischen Glucosekonzentrationsbereich operiert, also vor dem Essen bei Konzentrationen von 4–7 mM, nach einer Mahlzeit bei weniger als 10 mM. Glucokinase ist ein allosterisches, homotrop moduliertes Enzym, das bei einer Glucosekonzentration von Km 5,5 mM eine halbma- ximale Geschwindigkeit hat und kooperative Glucosebindungsstellen mit einem Hill-Koeffizienten von 3 aufweist.

Bei hoher Glucosekonzentration wird im Stoffwechsel viel ATP produziert. Dessen Bindung an Kaliumkanäle löst durch nachgeschaltete zellelektrophysiologische Prozesse die Sekretion von gespeichertem Insulin aus, das die zelluläre Aufnahme von Glucose aus dem Serum fördert. Niedrige Glucosekonzentrationen stoppen die Sekretion. In etwa 1,5–2,5% der Diabetesfälle ist der erhöhte Blutzuckerspiegel auf einen Kontrollverlust der Pankreas--Zell-Glucokinase zurückzuführen: Bei der MODY-2-Erkrankung (maturity-onset diabetes of the young type 2) beruht der Enzymdefekt auf autosomal-dominant vererbten Mutationen, die zu einer Verminderung der Vmax oder Erhöhung der K für Glucose führen.

Intrasterische Kontrolle
Das Phänomen der intrasterischen Kontrolle findet man bei vielen Protein-Kinasen, die wie ein molekularer Schalter zahlreiche zelluläre Aktivitäten regulieren. Ihre Funktion besteht darin, andere Proteine durch Phosphorylierung zu aktivieren oder zu inaktivieren. Das bei diesen Kinasen realisierte Kontrollprinzip der intrasterischen Regulation besteht in einer Autoinhibition, bei der ein Teil des Proteins an das aktive Zentrum bindet und es quasi verschließt. Die autoinhibierende Wirkung kann wie im Fall des Proteins CDK2 nach Phosphorylierung durch eine Konformationsänderung aufgehoben werden, die das aktive Zentrum freisetzt (Abb. 3.36a).
Etwas anders liegt der Fall bei der Protein-Kinase A (PKA), die in tetramerer Form vorliegt. Die katalytischen Zentren (C) werden freigesetzt, indem der gesamte Komplex durch Bindung des Liganden cAMP an die zwei regulatorischen Untereinheiten (R) dissoziiert (Abb. 3.36b). Die aktive PKA wird über einen Rückkopplungsmechanismus wieder ausgeschaltet: Die katalytische Untereinheit der PKA aktiviert durch Phosphorylierung auch eine Phosphodiesterase (PDE), die ihrerseits das gebildete cAMP zu AMP hydrolysiert, sodass sich der inaktive tetramere PKA-Komplex regenerieren kann (Abb. 3.36c).

Kovalente Enzymregulation

Proteolytische Prozessierung
Enzymaktivitäten können durch proteolytische Prozessierung von Proteinen verändert werden (limitierte Proteolyse). Das trifft auf die Zymogene oder Proenzyme zu, die durch Abspaltung eines Proteinanteils aus einer inaktiven Vorstufe in aktive Enzyme umgewandelt werden. Mit diesem Prinzip ist sichergestellt, dass die Proteine unschädlich an ihrem Lagerungsort gespeichert und erst nach Transfer an ihren Wirkort aktiviert werden. Der Sinn dieses Aktivierungsmechanismus wird bei den Verdauungsproteasen deutlich: Pepsinogen wird erst nach Sekretion in das saure Milieu des Magens nach partieller Umfaltung autokatalytisch in die aktive Protease Pepsin überführt. Die pankreatischen Proteasen Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase und Elastase entstehen aus den Vorläuferproteinen Trypsinogen, Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase und Proelastase. In diesem Quartett nimmt Trypsin eine herausgehobene Rolle ein, weil es die proteolytische Aktivierung der jeweils anderen Proteasen kontrolliert. Daneben wird der Selbstverdau des Pankreasgewebes durch die gespeicherten Proteasen noch über eine zusätzliche Sicherheitsmaßnahme unterdrückt, der Bereitstellung des pankreatischen Trypsininhibitors. Trypsinogen selbst wird durch die im Duodenum sezernierte Enteropeptidase (einer Endopeptidase) über Hydrolyse einer Lys-Ile-Peptidbindung in seine aktive Form überführt (Abb. 3.37).
Die Peptidabspaltung aus dem Proenzym führt zu einer Konformationsänderung im Protein, bei der das aktive Zentrum für das Substrat zugänglich wird. Analoge Mechanismen der Proteinaktivierung regeln auch die Reaktionskaskade der Blutgerinnung (Kap. 25.5.2) oder die von Proteasen kontrollierte Auslösung der Apoptose (Kap. 23.3.1) oder auch die Bildung von Insulin aus Proinsulin.

MERKE

Zahlreiche Proenzyme, wie z.B. Vorstufen von Proteasen, werden durch proteolytische Prozessierung in die aktive Form überführt. Im Dünndarm aktiviert Trypsin die anderen Verdauungsproteasen durch limitierte Proteolyse.

Interkonversion von Enzymen
Eine andere Möglichkeit, Enzyme in verschiedene Funktionszustände zu überführen, besteht in der kovalenten Modifikation. Man spricht auch von interkonvertierbaren Enzymen. Ihre Aktivitäten werden durch kovalente Bindung von niedermolekularen Komponenten an funktionelle Gruppen des Proteins kontrolliert. In ATP-abhängigen Reaktionen werden hierbei Phosphatreste auf OH-Gruppen von Proteinen übertragen. Die Regulation durch Interkonversion betrifft bemerkenswerterweise v.a. bestimmte Schlüsselenzyme der Hauptstoffwechselwege (Tab. 3.9). Ein charakteristisches Beispiel für diesen Regulationstyp ist das Enzym Glykogen-Phosphorylase, das die Reaktion
Glykogen + Pi Glucose-1-phosphat + verkürztes Glykogen (Phosphorolyse) katalysiert.
Die Phosphorylierung eines Serinrests der Glykogen-Phosphorylase erfolgt durch eine spezifische Protein-Kinase, der bereits erwähnten PKA (Abb. 3.36b, c). Das Phosphoenzym ist die aktive Form (Abb. 3.38). Eine spezifische Protein-Phosphatase schaltet die Aktivität des Enzyms durch Entfernung des kovalent gebundenen Phosphatrests wieder ab. Interessanterweise kann hier das wenig aktive Dephosphoenzym auch noch über den alternativen Mechanismus einer allosterischen Aktivierung reguliert werden (Abb. 3.38).
Wie bereits in Kap. 2 herausgestellt, führen einfache posttranslationale Reaktionen, insbesondere die Aminosäurephosphorylierung, zu gravierenden Änderungen der physikochemischen Eigenschaften von Enzymen (z.B. Ladungseigenschaften), die sich drastisch auf die Affinität zu Bindungspartnern auswirken. Das Vorkommen der Interkonversion in verschiedenen Stoffwechselwegen (Tab. 3.9) verdeutlicht, dass die einfache auf Phosphorylierung und Dephosphorylierung beruhende Modifikation ein vielseitiges und hocheffizientes Regulationsprinzip darstellt.
Tyrosin-Protein-Kinasen in der Signaltransduktion
Das Prinzip der Proteinaktivierung bzw. -deaktivierung durch Phosphotransfer findet sich auch bei den Protein-Kinasen in Signaltransduktionsketten (Kap. 22). Auf die Zellmembran von außen einwirkende Signale, z.B. Bindung von Wachstumshormonen, wie STH (somatotropes Hormon) an Membranrezeptoren, werden in das Zellinnere geleitet und aktivieren Tyrosin-Protein-Kinase-Domänen. Letztere sind entweder intrinsische, zytosolisch orientierte Domänen des Rezeptors oder als intrazelluläres Protein mit dem Rezeptor assoziiert. Die Protein-Kinase überträgt die Phosphatgruppe aus ATP auf Tyrosinreste von Akzeptorproteinen. Diese wiederum agieren als Weitervermittler der chemischen Botschaft, die sie an Empfängerproteine übertragen. Tyrosin-Kinasen sind an vielen regulatorischen Prozessen beteiligt, u.a. auch an der Kontrolle der Zellteilung.

Klinik

Bei der chronischen myeloischen Leukämie (CML) liegt eine durch Translokation hervorgerufene Chromosomenaberration vor. Im sog. Philadelphia-Chromosom ist durch Austausch von genetischem Material der Chromosomen 9 und 22 eine Fusion der Gene für die Tyrosin-Protein-Kinase Abl und für das Protein Bcr eingetreten. Das resultierende Fusionsprotein Bcr-Abl ist ein Onkoprotein, unter dessen erhöhter Aktivität die weißen Blutkörperchen unkontrolliert vermehrt werden. Der Inhibitor Imatinib ( Glivec), ein hochwirksames und spezifisches Krebstherapeutikum, bindet an die Abl-Kinase-Domäne (Abb. 3.39) und verhindert kompetitiv den Zutritt des Substrats ATP und damit die Phosphorylierung von Substratproteinen. Damit wird v.a. die exzessive Proliferation myeloischer Zellen unterdrückt, wogegen nicht transformierte Zellen aufgrund zusätzlicher Signalübertragungswege überleben können.

Isoenzyme

Definition

Isoenzyme katalysieren dieselbe biochemische Reaktion, unterscheiden sich aber in ihrer enzymatischen Aktivität und in ihrem Verhalten gegenüber Hemmstoffen, Aktivatoren oder Substratanaloga. Die unterschiedlichen Varietäten beruhen auf Isoformen, die von verschiedenen Genen kodiert werden. Diese sind zwar miteinander verwandt, unterscheiden sich aber im Detail an bestimmten Stellen ihrer Aminosäuresequenz. Sie haben oft organ- bzw. gewebsspezifische Expressionsmuster, um besondere funktionale Erfordernisse lokal zu erfüllen. Isoenzyme unterscheiden sich in der Vmax und Km für verschiedene Substrate und in der Ki für Hemmstoffe.

Oligomere Isoenzyme

Im einfachsten Fall sind Isoenzyme bereits als monomere Proteine aktiv. Oligomere Isoenzyme können sich aus ungleichen Untereinheiten zusammensetzen. Für die Lactat-Dehydrogenase gibt es zwei Polypeptidisoformen, und zwar eine Herz- (H) und Muskel-Form (M), die von unterschiedlichen Genen kodiert werden. Das funktionelle LDH-Enzym besteht aus vier Untereinheiten. Aus den Monomeren kann sich das tetramere Enzym in fünf verschiedenen Isoformen zusammensetzen, die als Isoform LDH-1 (HHHH), LDH-2 (HHHM), LDH-3 (HHMM), LDH-4 (HMMM) und LDH-5 (MMMM) bezeichnet werden (Abb. 2.28). Die Isoformen haben alle unterschiedliche LDH-Aktivität und kommen in unterschiedlichen Konzentrationen in verschiedenen Geweben vor. Die LDH-5 (Muskel-Typ) hat eine hohe Affinität zum Substrat Pyruvat und eine zweifache höhere Vmax als die LDH-1 (Herz-Typ). Die LDH-1 katalysiert wegen ihres niedrigeren Km-Werts ( höhere Affinität zu Lactat als zu Pyruvat) sogar die Rückreaktion (Bildung von Pyruvat aus Lactat), während die LDH-5 die Hinreaktion beschleunigt, also die Bildung von Lactat aus Pyruvat. Die LDH-1 wird sogar durch Pyruvat gehemmt (Produkthemmung). Dies erlaubt dem Herzmuskel, Lactat zur Energiegewinnung zu verwerten (Kap. 5.2).

Organspezifität

Aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften kann man die Existenz bestimmter Isoformen in verschiedenen Organen spezifisch nachweisen. Überwiegend geschieht das durch elektrophoretische Methoden wie native Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung oder durch Ionenaustauschchromatographie. Bei ausreichend hoher Sequenzdiversität der Isoformen kann man auch mit immunologischen Methoden differenzieren. Da Zellschädigungen in betroffenen Organen zur Freisetzung der Zellinhalte in Körperflüssigkeiten führen können, gibt das aufgefundene Isoenzymmuster bereits Hinweise auf das geschädigte Organ. Somit besteht ein medizinisches Interesse an Isoenzymen, weil charakteristische Muster oft organspezifisch sind und Krankheitsbilder anzeigen können.

Klinik

Die Creatinkinase (CK) ist ein medizinisch relevantes Enzym, das die Reaktion Creatin + ATP Creatinphosphat + ADP katalysiert. Sie besteht aus zwei Untereinheiten, die gewebsspezifisch synthetisiert werden, nämlich M (wie Muskel) und B (wie brain Gehirn). Es kommen also drei Isoenzymvarianten des Dimers vor: CK-MM, CK-MB und CK-BB. Läsionen von Muskelgewebe (Skelett- oder Herzmuskel) führen zu erheblichen Erhöhungen der CK-Aktivität im Serum, doch erst die Isoenzymdifferenzierung lässt auf den Muskeltyp schließen. Bei einer Myokardschädigung ist der herzmuskelspezifische CK-MB-Typ erhöht, bei einer Skelettmuskelschädigung der CK-MM-Typ. Die im Gehirn synthetisierte CK-BB hat wegen ihrer geringen Aktivität keine diagnostische Bedeutung. Klassischerweise wird bei klinischem Verdacht auf Herzinfarkt die Aktivität von CK in Abwesenheit ( Ge- samt-CK) und Anwesenheit von aktivitätsneutralisierenden Antikörpern gegen die M-Untereinheit bestimmt. Die Differenz zwischen den beiden Aktivitäten spiegelt die CK-MB-Aktivität wider. Ist sie absolut oder relativ zur Gesamt-CK erhöht, wird ursächlich ein Herzinfarkt angenommen. Eine spezifi- schere Bestimmung des CK-MB-Subtyps ist mithilfe von Sandwich-Immunoassays möglich, welche die Konzentration der CK-MB messen. Es ist wichtig zu wissen, dass heute über diese klassischen Methoden hinaus die immunologische Bestimmung von zwei herzmuskelspezifischen Proteinen des kontraktilen Apparats, dem kardialen Troponin T (cTNT) oder dem kardialen Troponin I (cTNI), zum Goldstandard in der labormedizinischen Herzinfarktdiagnostik geworden ist.

MERKE

Isoenzyme sind strukturell und funktionell verwandt, unterscheiden sich aber in ihren kinetischen Eigenschaften. Sie weisen gewebsspezifische Expressionsmuster auf. Man kann die Verteilung organspezifischer Isoenyzme in Körperflüssigkeiten diagnostisch nutzen.

Systematische Klassifikation von Enzymen

Entsprechend der enormen Vielfalt physiologisch-chemischer Reaktionen gibt es eine Vielzahl von spezifischen biologischen Katalysatoren. Gegenwärtig sind mehr als 2000 verschiedene Enzyme bekannt. Trotz der hochgradigen Individualität der Enzyme gibt es nur wenige verschiedene Grundprinzipien, nach denen sich ähnliche Enzyme in Gruppen zusammenfassen und systematisch katalogisieren lassen.

Enzymklassen

Enzyme werden im wissenschaftlichen Jargon und in der klinischen Alltagssprache mit ihren Trivialnamen bezeichnet. Diese geben oft das Substrat und die Art der katalysierten Reaktion wieder und sind bis auf wenige historisch bedingte Ausnahmen (z.B. Trypsin, Lysozym) durch das Suffix -ase gekennzeichnet. Ein Beispiel ist die Lactat-Dehydrogenase (LDH), die formal ein – in Wirklichkeit coenzymgebundenes – Wasserstoffatom vom Substrat L-Lactat abstrahiert.
Strenger ist die Enzymnomenklatur, wie sie von der Enzymkommission (Enzyme Commission) der IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) in Zusammenarbeit mit der IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) festgelegt wird. Sie bestimmt den exakten Namen für das Enzym und weist ihm nach einem vorgegebenen Zahlencode eine Erkennungsnummer zu. Im Enzymkatalog gibt es die folgenden EC-Hauptkategorien (EC von Enzyme Commission)
  • EC 1 Oxidoreduktasen

  • EC 2 Transferasen

  • EC 3 Hydrolasen

  • EC 4 Lyasen

  • EC 5 Isomerasen

  • EC 6 Ligasen.

In weiteren Unterkategorien werden die Substrate (Donoren, Akzeptoren), übertragene Gruppen und veränderte chemische Bindungen systematisch eingeteilt. Für die Lactat-Dehydrogenase (LDH) ist die systematische Bezeichnung dementsprechend L-Lactat-NAD+-Oxidoreduktase. Die Katalogisierung und Nummerierung der LDH basiert auf folgender Einteilung:
  • 1. Kategorie 1.x.x.x. Oxidoreduktase

  • 2. Kategorie x.1.x.x wirkt auf CH-OH-Gruppen von Donoren

  • 3. Kategorie x.x.1.x mit NAD+ als Cosubstrat (Akzeptor)

  • 4. Kategorie x.x.x.27 Substrat: L-Lactat.

Die LDH hat also die Katalognummer EC 1.1.1.27.
Oxidoreduktasen
Die erste Hauptgruppe im Enzymkatalog bilden die Oxidoreduktasen, bei denen ein Elektronendonor oxidiert und ein Elektronenakzeptor reduziert wird. Es handelt sich hierbei um Dehydrogenasen, Reduktasen oder Oxidasen. Ein Beispiel ist die bereits angesprochene Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27):
Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+.
Transferasen
Transferasen sind Enzyme, die Atome oder Molekülgruppen auf andere Substrate übertragen. Exemplarisch ist hierfür die Aspartat-Transcarbamoylase oder Aspartat-Carbamoyltransferase (EC 2.1.3.2), die eine Übertragung der Carbamoylgruppe aus Carbamoylphosphat auf Aspartat katalysiert:
Aspartat + Carbamoylphosphat N-Carbamoylaspartat + Pi.
Zu den Transferasen zählt man auch die wichtige Gruppe der Polymerasen wie die DNA-abhängige DNA-Polymerase (oder einfach DNA-Polymerase [EC 2.7.7.7]) und die DNA-abhängige RNA-Polymerase (RNA-Polymerase [EC 2.7.7.6]). Auch die Kinasen gehören in diese Kategorie, die Phosphatgruppen auf Aminosäurereste übertragen, wie Phosphorylase-Kinase (EC 2.7.1.38) oder die Tyrosin-Kinasen (EC 2.7.1.112).
Hydrolasen
Diese Klasse beinhaltet Enzyme, die allgemein hydrolytische Spaltungsreaktionen katalysieren. Komplexe Moleküle werden dabei durch Wasser in kleinere Moleküle zerlegt. Dazu gehören die Proteasen (spalten Peptidbindungen), Nucleasen (spalten Nucleotidbindungen in DNA und RNA) sowie Phosphatasen und ATPasen (spalten anorganisches Phosphat aus Adenosintriphosphat). Letztere koppeln die freie Enthalpie der Phosphorsäureanhydridbindung an energieverbrauchende Reaktionen, z.B. an den aktiven Transport von Ionen (Na+-K+-ATPase [EC 3.6.1.37]) oder an Muskelarbeit (Myosin-ATPase [EC 3.6.1.32]):
ATP + H2O ADP + Pi.
Lyasen
Lyasen sind Enzyme, die chemische Bindungen lösen oder bilden können. Hierunter fallen auch die Synthasen wie die Citrat-Synthase (EC 4.1.3.7), die die Stoffwechselreaktion Oxal- acetat + Acetyl-CoA Citrat + Coenzym A katalysiert.
Isomerasen
Diese Enzyme beschleunigen die Neuanordnung von Bindungen innerhalb eines Moleküls. Ein Beispiel ist die Reaktion der Triosephosphat-Isomerase (EC 5.3.1.1):
Dihydroxyacetonphosphat Glycerinaldehyd-3-phosphat.
Ligasen
Ligasen (früher auch als Synthetasen bezeichnet) bilden schließlich eine Gruppe von Katalysatoren, die nur Bindungen zwischen zu verknüpfenden Molekülen bilden. Ein Beispiel ist die Pyruvat-Carboxylase (EC 6.4.1.1):
Pyruvat + CO2 + ATP Oxalacetat + ADP + Pi.
Natürlich zählen hierzu auch Enzyme, die die kovalente Verknüpfung von Makromolekülen unterstützen, z.B. die ATP-abhängige DNA-Ligase (EC 6.5.1.1). Die dafür notwendige Energie stammt aus energiereichen Nucleotiden wie ATP.

Schon gewusst

Nicht alle Enzyme lassen sich in ein Schema pressen. Die Natur hat faszinierende Enzymreaktionen erfunden, mit deren Hilfe Organismen untereinander kommunizieren können. Ein leuchtendes Beispiel hierfür ist die Biolumineszenz, eine Lichtemission auf der Basis biochemischer Reaktionen. Glühwürmchen können ATP an ein sog. Luciferin koppeln (Abb. 3.40a). Das entstehende energiereiche Produkt wird in aufeinanderfolgenden Teilschritten vom Enzym Luciferase umgesetzt, wobei Energie in Form von blauem Licht ausgesendet wird. In der Natur teilt sich das Glühwürmchen so seinen Artgenossen mit, im Labor kann durch diese Reaktion mit höchster quantitativer Empfindlichkeit ATP bestimmt werden. Mithilfe des Ca2+-aktivierten Photoproteins Aequorin senden auch manche Quallen über den Cofaktor Coelenteracin Blaulicht aus (Abb. 3.40b). Dass diese jedoch grün leuchten, liegt am GFP (green fluorescent protein; Abb. 3.41): GFP absorbiert die blauen Biolumineszenzquanten und emittiert seinerseits grünes Fluoreszenzlicht. Warum die Quallen das tun, ist allerdings noch unklar.

Luciferase und GFP sind als Reportermoleküle auch wichtige Werkzeuge im Molekularbiologielabor: Wenn man die hierfür codierenden Gene mit den zu untersuchenden Genen im korrekten Leserahmen fusioniert, kann man das von dem Gen codierte Protein mit hoher Empfindlichkeit sichtbar machen und z.B. mit dem Fluoreszenzmikroskop seine zelluläre Lokalisation untersuchen. GFP hat einen hochinteressanten Fluorophor (Abb. 3.41), der autokatalytisch durch Reaktionen aus den natürlichen Aminosäuren Ser65-Tyr66-Gly67 der Polypeptidkette entsteht, sobald das Protein nach der Biosynthese seine richtige Tertiärstruktur gefaltet ist.

MERKE

Enzyme werden nach ihrer Funktion in sechs Hauptkategorien eingeteilt: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.

Zusammenfassung

Proteine als Katalysatoren

Enzyme sind Biokatalysatoren und können die Geschwindigkeiten biochemischer Reaktionen mehr als milliardenfach erhöhen. Sie sind durch ihre hohe Affinität zum Substrat und die hohe Spezifität der katalysierten Umsetzung charakterisiert. Die Katalysatorwirkung besteht in der Absenkung der Aktivierungsenergie für die betrachtete Reaktion, die durch die Ausbildung des energieärmeren Enzym-Substrat-Komplexes gefördert wird. Die Bindungsstelle des Enzyms stellt sich auf das Substrat ein (induced fit); durch spezifische Wechselwirkungen wird das Substrat in seiner Konformation verzerrt und damit der Eintritt der Reaktion begünstigt. Im aktiven Zentrum befinden sich häufig funktionelle Gruppen, die direkt in den Reaktionsmechanismus eingreifen. Verschiedene katalytische Prinzipien sind realisiert, z. B. in Form von Substratimmobilisierung und -orientierung, Wasserausschluss, kovalenter Katalyse, Säure-Base-Katalyse und metallionenvermittelter Katalyse. Für den grundsätzlichen Mechanismus der Enzyme wird das Modell von Michaelis und Menten herangezogen, dem zufolge sich in einem schnellen Gleichgewicht ein Enzym-Substrat-Komplex bildet und die Geschwindigkeit der Produktbildung proportional zur Komplexkonzentration ist.
Die kinetischen Parameter nach dem Michaelis-Menten-Modell sind die Michaelis-Menten-Konstante Km, die ein Maß für die Affinität der Enzyme darstellt, und Vmax, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit. Die molekulare Wechselzahl Kcat gibt an, wie viele Substratmoleküle ein Enzymmolekül pro Sekunde umsetzen kann. In die Spezifitätskonstante Kcat/Km, die ein Ausdruck der katalytischen Effizienz ist, gehen maximale Wechselzahl und mit der Michaelis-Konstante die Stärke des ES-Komplexes ein.

Inhibition von Enzymen

Enzyme sind potenzielle Zielstrukturen für Pharmaka, die kovalent oder reversibel binden können. Zu den kovalenten Hemmstoffen zählen die hochspezifischen Suizidsubstrate. Reversible Inhibitoren können Enzymaktivitäten durch einen kompetitiven oder nichtkompetitiven Mechanismus blocken. Der Mechanismus durch reversible Inhibitoren gehemmter Enzyme lasst sich kinetisch mit dem Michaelis-Menten-Modell beschreiben.

Regulation der Enzymaktivität

Für die Organisation des Stoffwechsels und zellbiologischer Prozesse ist es unbedingt nötig, Enzym- bzw. Proteinaktivitäten sinnvoll zu regulieren. Dies kann auf der Ebene eines Stoffwechselwegs durch Rückkopplungsmechanismen erfolgen. Auf molekularer Ebene kann Regulation durch kovalente oder nichtkovalente Modifikationen ausgeübt werden. Kooperative Wechselwirkungen bei allosterischen Enzymen können Substrataffinitäten und Reaktionsgeschwindigkeiten verändern. Durch Phosphorylierung können Proteine an Schaltstellen des Intermediärstoffwechsels an- oder abgestellt werden. Andere Proteine werden durch proteolytische Prozessierung aktiviert.
Isoenzyme sind biologische Varianten von Enzymen, die über gewebsspezifische Aktivität und Regulierbarkeit verfügen.

Enzymkatalog

Man kann biologische Katalysatoren nach ihrem Reaktionstyp und gemeinsamen Merkmalen in sechs Hauptgruppen zusammenfassen: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Um die Vielfalt der verschiedenen Enzyme systematisch zu sortieren, gibt es den von der Enzymkommission festgelegten Enzymkatalog, der jedes Enzym durch einen Nummerncode identifiziert.

Fragen

  • 1.

    Worin unterscheiden sich Übergangszustand und Intermediat einer chemischen Reaktion?

  • 2.

    Beschreiben Sie qualitativ den Zusammenhang zwischen Geschwindigkeitskonstante und Aktivierungsenthalpie.

  • 3.

    Mit welchen Tricks können Sie eine (bio)chemische Reaktion beschleunigen?

  • 4.

    Erklären Sie den Unterschied zwischen Schlüssel-Schloss-Hypothese und Induced fit.

  • 5.

    Welche Aminosäurereste von Enzymen sind häufig an katalytischen Reaktionen beteiligt?

  • 6.

    Welche Annahmen liegen dem Michaelis-Menten-Modell zugrunde?

  • 7.

    Entwickeln Sie eine experimentelle Strategie zur Untersuchung des Wirkungsmechanismus eines neuartigen Medikaments, das eine enzymatisch katalysierte Reaktion blockiert.

  • 8.

    Welche Prinzipien sind für die Regulation von Enzymaktivitäten wirksam?

  • 9.

    Worin unterscheiden sich isosterische und allosterische Enzyme?

  • 10.

    Was versteht man unter Feedback-Mechanismen bei Enzymen und bei welchen Reaktionen kann man sie beobachten?

006 IMPP-Fragen

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