© 2019 by Elsevier GmbH

Bitte nutzen Sie das untenstehende Formular um uns Kritik, Fragen oder Anregungen zukommen zu lassen.

Willkommen

Mehr Informationen

B978-3-437-43690-1.10015-4

10.1016/B978-3-437-43690-1.10015-4

978-3-437-43690-1

Restriktionskarte und Restriktionsverdau.

a) Restriktionsenzymschnittstellen der Enzyme EcoRI und HindIII in der DNA des Bakteriophagen . Die Abstände zwischen den Schnittstellen sind in Basenpaaren angegeben.

b) Auftrennung der DNA-Fragmente nach vollständigem Restriktionsverdau in einer Gelelektrophorese. Durch Vergleich mit einem Größenstandard (M) wird die Länge der Restriktionsfragmente bestimmt. Die DNA-Fragmente werden im UV-Licht sichtbar, da sie einen Farbstoff zwischen den Basenpaaren der Doppelhelix einlagern (Interkalationsfarbstoff Ethidiumbromid).

Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls durch Restriktionsverdau zweier verschiedener DNA-Moleküle und Ligation der kompatiblen Restriktionsenden.

Isolierung von Bakterienkolonien, die ein rekombinantes Plasmid mit einer Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin (AmpR) enthalten.

Klonierung einer mRNA-Sequenz durch Herstellung einer komplementären DNA (cDNA).

Isolierung eines Gens aus einer Genbank durch Koloniehybridisierung.

Reaktionsschritte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

a) Die drei Teilschritte eines PCR-Zyklus,

b) drei aufeinanderfolgende PCR-Zyklen.

Struktur eines normalen Nucleotids und des 2',3'-Didesoxyderivats.

Sequenzierung eines DNA-Strangs nach dem Kettenabbruchverfahren.

a) Reaktionsprodukte der Sequenzierungsreaktion mit dem Abbruchnucleotid für die Base A.

b) Die Reaktionsprodukte für alle vier Basen in einem Sequenzierungsgel. Aus der Abfolge der Länge der Produkte in allen vier Gelspuren lässt sich direkt die Sequenz des neu synthetisierten Gegenstrangs ablesen.

c) DNA-Sequenz, die mit einem Sequenzierungsautomaten erstellt wurde. Jeder der vier Reaktionsansätze ist mit einer anderen Fluoreszenzfarbe markiert: blau für C, rot für T, grün für A und gelb für G. Entsprechend der Länge der Reaktionsprodukte wandern diese zu unterschiedlichen Zeiten am Detektor vorbei: kurze Produkte früher als lange. Die Aufeinanderfolge der Absorptionsmaxima aller vier Farben ergibt die DNA-Sequenz.

Southern-Blot-Analyse. Die im Gel aufgetretenen Fragmente werden mit dem Pufferfluss, der durch das saugfähige Filterpapier entsteht, auf die Nucleinsäuren bindende Membran übertragen, sodass auf der Membran ein exaktes Abbild des Gels entsteht. Die Sonde bindet auf der Membran spezifisch an die gesuchte DNA-Sequenz. Durch Vergleich des Autoradiogramms mit dem Gel lässt sich die Größe des Fragments genau bestimmen.

Chip-Technologie. Aus den beiden Geweben, deren Genexpressionsprofil verglichen werden soll, wird die gesamte mRNA gewonnen und zunächst in einzelsträngige cDNA umgeschrieben. Dabei wird sie gleichzeitig mit einem Fluoreszenzfarbstoff je nach Herkunft rot oder grün markiert. Die cDNA-Moleküle werden gemischt und in einer Reaktion mit den DNA-Spots auf dem Chip hybridisiert. Je nach Menge der ursprünglich vorhandenen mRNA eines bestimmten Gens in den beiden Geweben wird entweder mehr rote oder grüne cDNA an die entsprechende Sequenz auf dem Chip binden, und der DNA-Punkt wird rot bzw. grün aufleuchten. War das Gen in beiden Geweben gleich aktiv, ergibt sich eine Mischfarbe. Wird das Gen nicht exprimiert, bleibt der DNA-Punkt ohne Fluoreszenz.

Mikrosatellitenanalyse. PCR-Primer binden an die singulären Sequenzen, die die Mikrosatellitenabschnitte flankieren. Die flankierenden Sequenzen sind bei verschiedenen Personen gleich, sodass die PCR-Primer universell verwendbar sind. Wegen der individuenspezifischen Anzahl der Sequenzwiederholungen im Mikrosatellitenlocus sind die Längen der PCR-Produkte jedoch unterschiedlich. Die Auftrennung der PCR-Produkte im Gel ergibt für jede Person ein diagnostisches Muster.

Herstellung von transgenen Mäusen. Das zusätzliche, fremde Gen (Transgen) wird durch Mikroinjektion in den väterlichen Vorkern (Pronucleus) noch vor der Verschmelzung mit dem Oozytenkern eingebracht. Der Embryo wird in vitro bis zu einem Mehrzellstadium kultiviert und dann in eine Ammenmaus implantiert. Die Nachkommen, die das Transgen stabil in ihr Genom integriert haben, werden mittels PCR und Southern-Blot-Analyse identifiziert.

Homologe Rekombination. Die klonierte DNA-Sequenz, in die eine inaktivierende Mutation eingeführt wurde, wird durch Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes in hoher Kopienzahl in die embryonale Stammzellen eingebracht (Elektroporation). Gelangt eines der Moleküle in die Nähe der entsprechenden genomischen Sequenz, so kommt es zur Paarung und zum Austausch homologer Sequenzbereiche.

Herstellung einer Knock-out-Maus. Die genetisch manipulierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) werden in eine Empfängerblastozyste transplantiert. Der chimärische Embryo wird in eine Ammenmaus eingepflanzt. Bei den Nachkommen kann leicht an der Fellfarbe erkannt werden, ob sie tatsächlich Zellen enthalten, die von der ES-Zell-Linie abstammen, da die ES-Zellen von einem Mäusestamm gewonnen wurden, der eine andere Fellfarbe als der Empfängerstamm hat. Die durch Verpaarung der Chimären erhaltenen Nachkommen, die homozygot für die in der ES-Zelle gesetzte genetische Veränderung sein sollten, werden mittels PCR und Southern-Blot-Analyse überprüft.

Gentechnische Herstellung von humanem Wachstumshormon in Bakterien. Durch die Fusion der menschlichen Wachstumshormonsequenz (hGH) mit einer bakteriellen Signalsequenz wird gewährleistet, dass das rekombinante Protein in den periplasmatischen Raum der Bakterienzelle transportiert wird. Hier wird das Signalpeptid mit dem bakteriellen, N-terminalen Formylmethionin enzymatisch abgespalten. Durch hypotonen Schock wird das fertige hGH-Protein in das Kulturmedium abgegeben und kann daraus leicht isoliert werden. Es ist in jeder Hinsicht mit dem natürlichen hGH identisch.

RNA-Interferenz. Mechanismus der siRNA Wirkung (links): Doppelsträngige siRNA Moleküle werden in die Zelle eingebracht. Nach Entwindung wird ein Einzelstrang von RISC gebunden. Nach Hybridisierung an eine Ziel-RNA wird diese von einer mit RISC assoziierten Nucleaseaktivität im Bereich des Doppelstrangs gespalten. Danach wird das Spaltprodukt weiter degradiert.

Entstehung und Wirkung von miRNA (rechts): Aus dem Primärtranskript wird zunächst eine kurze doppelsträngige Prä-miRNA durch das Enzym Drosha generiert. Diese wird dann von der Nuclease Dicer weiter prozessiert. Nach Entwindung bindet ein Einzelstrang an RISC und der RISC/RNA-Komplex dann an die komplementäre Sequenz einer mRNA. Die Ziel-RNA bleibt mit der miRNA an RISC gebunden und kann nicht translatiert werden.

Therapeutisches Klonen als Strategie zum autologen Gewebe- und Organersatz.

Restriktionsenzyme

Tab. 15.1
Enzym Mikroorganismus Spaltsequenz Bemerkungen
HaeIII Haemophilus aegypticus erzeugt glatte Enden
TaqI Thermus aquaticus 5'-Ende hängt über
PstI Providencia stuarti 3'-Ende hängt über
DdeI Desulfovibrio desulfuricans N/N kann jedes beliebige Basenpaar sein
5'-Ende hängt über
NotI Nocardia otitidiscaviarum schneidet sehr selten
5'-Ende hängt über
CG-Basenfolge bei Vertebraten unterrepräsentiert und meist methyliert, damit nicht schneidbar

Beispiele gentechnischer Arzneimittel

Tab. 15.2
Produktbezeichnung Wirkstoff Anwendung
Humulin Insulin Diabetes mellitus
Protropin, Humatrope Wachstumshormon hypophysärer Kleinwuchs
Roferon-A Interferon -2a Haarzellenleukämie, Kaposi-Sarkom, Nierenzellkarzinom, Melanom
Intron-A Interferon -2b Haarzellenleukämie, Kaposi-Sarkom, Genitalwarzen
Interferon 2c Interferon -2c Herpes-simplex-Virus-Keratitis
Actilyse Gewebe-Plasminogen-aktivator (tPA) Herzinfarkt, arterielle Thrombose
EPREX, Recormon Erythropoetin Anämie, Blutdoping
Polyferon Interferon- rheumatoide Arthritis
Rekombivax HB Hepatitis-B-Vakzine Hepatitis-B-Prophylaxe
Havrix Hepatitis-A-Vakzine Hepatitis-A-Prophylaxe
Pulmozyme DNase cystische Fibrose (Mukoviszidose)
Recombinate, KOGENATE Blutgerinnungsfaktor VIII Hämophilie A
Betaferon Interferon -1b multiple Sklerose
Prokine Granulozyten-Makrophagen-Wachstumsfaktor autologe Knochenmarktransplantation
REGRANEX Thrombozyten-wachstumsfaktor PDGF-BB Wundheilung
Orochol Vibrio cholerae Cholera-Lebendimpfstoff

Beispiele für Krankheiten, die durch Gendefekte verursacht werden

Tab. 15.3
Erkrankung Symptom defektes Gen Häufigkeit des Defekts in Risikogruppen
-Thalassämie abnorme Erythrozyten, defektes Hämoglobin -Globin 1 : 400
Sichelzellanämie abnorme Erythrozyten, defektes Hämoglobin -Globin 1 : 625
familiäre Hypercholesterinämie erhöhter Cholesterinspiegel im Blut -LDL-Rezeptor 1 : 1000
cystische Fibrose (Mukoviszidose) erhöhte Viskosität der Sekrete, Fibrose von Pankreas und Lunge CFTR-Chloridkanal 1 : 2000
Gaucher-Krankheit Lipidablagerungen, Hepatosplenomegalie Glucocerebrosidase 1 : 2500
1-Antitrypsin-Mangel Lungenemphysem 1-Antitrypsin-Inhibitor 1 : 3500
Duchenne-Muskeldystrophie Muskelschwäche Dystrophin 1 : 10.000
Bluterkrankheit, klassische Hämophilie Blutgerinnungsstörung Gerinnungsfaktor VIII 1 : 10.000

Gentechnik, Gendiagnostik, Gentherapie

M. Schartl

  • 15.1

    Grundlagen der Gentechnik 438

  • 15.1.1

    DNA-Rekombination438

  • 15.1.2

    DNA-Klonierung440

  • 15.1.3

    Die Polymerase-Kettenreaktion445

  • 15.1.4

    DNA-Sequenzierung447

  • 15.2

    Gendiagnostik 448

  • 15.2.1

    Molekulare Hybridisierung448

  • 15.2.2

    DNA-Chips451

  • 15.2.3

    Genetischer Fingerabdruck452

  • 15.3

    Genetisch veränderte Organismen 453

  • 15.3.1

    Gentechnisch modifizierte Organismen (GMOs)453

  • 15.3.2

    Einfacher Gentransfer454

  • 15.3.3

    Knock-out-Mäuse456

  • 15.4

    Gentechnische Medikamente 458

  • 15.4.1

    Bedeutung rekombinanter Proteine458

  • 15.4.2

    Produktion rekombinanter Proteine459

  • 15.5

    Gentherapie 461

  • 15.5.1

    Gentherapeutische Verfahren461

  • 15.5.2

    Anwendungen der Gentherapie464

  • 15.5.3

    Xenotransplantation und therapeutisches Klonen465

Praxisfall

In einer englischen Grafschaft wurde in den 80er Jahren des 20. Jahrhunderts ein junges Mädchen vergewaltigt und ermordet. Der Täter konnte überführt werden. Jahre vorher kamen in derselben Gegend zwei weitere Mädchen unter ähnlichen Umständen ums Leben. Unter dem Druck der polizeilichen Verhöre gestand der Verdächtigte auch diese Morde. Doch während der Gerichtsverhandlung leugnete er plötzlich, einen der drei Morde begangen zu haben, während er in den beiden anderen Fällen geständig blieb. Bis zu seiner Verurteilung und auch noch in der Haft beharrte er hartnäckig darauf, nur zwei der Morde begangen zu haben. Zu dieser Zeit wurden von dem englischen Molekularbiologen Jeffreys und Mitarbeitern die von ihnen so genannten Minisatelliten entdeckt und deren Bedeutung in der Gerichtsmedizin für die Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks erkannt. Man ließ die Spermaspuren untersuchen, die der Täter hinterlassen hatte. Die Analyse ergab eindeutig, dass zwei der Proben vom Verurteilten stammten, die dritte jedoch von einer anderen Person. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde eine Rasterfahndung nach dem zweiten Täter eingeleitet, und Tausende Männer in der in Frage kommenden Gegend und Altersklasse wurden aufgerufen, Blutproben abzugeben. Der DNA-Fingerabdruck eines der Probanden erwies sich als identisch mit dem Abdruck aus den Spermaspuren vom Tatort. Der Verdächtige brach unter der Last des Beweises zusammen und legte ein Geständnis ab. Dies war der erste Fall in der Kriminalgeschichte, bei dem DNA-Methoden zur Identifizierung eines Mörders führten. Innerhalb weniger Jahre etablierte sich die Methode des genetischen Fingerabdrucks, die auf der hohen individuellen Längenvariabilität von Minisatelliten im Genom beruht, als zuverlässiger und sehr empfindlicher Nachweis in der Gerichtsmedizin und bei Vaterschaftsprozessen.

Zur Orientierung

Die rasanten Fortschritte in der Biochemie der Nucleinsäuren, der Zellbiologie und Mikrobiologie haben es ermöglicht, gezielt DNA-Moleküle in vitro neu zu kombinieren und zu vermehren. Dies hat die Möglichkeit eröffnet, bislang nicht in gewünschter Menge und Reinheit zur Verfügung stehende Proteine für die medizinische Anwendung effizient zu produzieren. Das Methodenrepertoire der Gentechnik bietet des Weiteren die Möglichkeit, Krankheiten, die auf Mutationen der Gensequenz oder Veränderungen im Expressionsmuster beruhen, zu diagnostizieren. Molekulare Verfahren der Gendiagnostik und gentechnisch hergestellte Medikamente gehören heute schon zum klinischen Alltag. Schließlich bietet die Gentechnologie die Möglichkeit, therapeutisch beim Patienten in den Krankheitsprozess einzugreifen. Die Gentherapie ist heute zwar noch eine experimentelle Therapie, es wird jedoch große Hoffnung auf ihre Anwendung in der Zukunft gesetzt.

Grundlagen der Gentechnik

Die Grundlage gentechnischer Verfahren ist die Möglichkeit, DNA-Moleküle in definierte Fragmente zu spalten und wieder zu einem neuen Molekül zusammenzusetzen. Dieser Prozess wird als DNA-Rekombination bezeichnet, das Fachgebiet entsprechend als rekombinante DNA-Technologie und deren Produkte als rekombinante Proteine, z.B. rekombinantes Insulin für das gentechnisch hergestellte Hormon zur Behandlung des Diabetes mellitus.
DNA-Rekombination ist ein natürlicher Prozess, der z.B. beim Crossing-over in der Meiose oder bei der DNA-Reparatur stattfindet. In der Gentechnik führt man jedoch die Neukombination gezielt in vitro (im Reagenzglas) durch. Dabei kann man auch beliebig DNA verschiedener Organismen oder synthetisch hergestellte Nucleinsäuren verknüpfen.

DNA-Rekombination

Restriktionsenzyme
Definition
Restriktionsenzyme sind Endonucleasen, korrekt als Restriktionsendonucleasen bezeichnet, die spezifische Basensequenzen in einer DNA-Doppelhelix erkennen und diese dort schneiden.

Schon gewusst

Restriktionsenzyme kommen bei vielen Bakterien vor. Sie haben dort die Aufgabe, fremde DNA (z.B. von einem eingedrungenen Bakteriophagen) zu spalten und so unschädlich zu machen. Die zelleigene DNA wird nicht gespalten, da sie durch Methylierung einzelner Basen in der Erkennungssequenz des entsprechenden Restriktionsenzyms vor dem Verdau geschützt ist. Die Methylierung der Erkennungssequenz übernehmen bakterielle Methylasen, die die gleiche Sequenz wie die Restriktionsendonuclease erkennen. Die Phagen besitzen diese Methylasen nicht.

Erkennungssequenzen
Restriktionsenzyme (Tab. 15.1) erkennen meist 4–8 Basenpaare lange Sequenzen, die eine bestimmte Symmetrieachse besitzen.
Solche Sequenzabschnitte bezeichnet man als Palindrome (Kasten). Wenn die Spaltung der Phosphodiesterbindungen in den beiden Strängen der Doppelhelix an gegenüberliegenden Stellen erfolgt, entstehen Produkte mit glatten Enden (blunt ends). Werden die Stränge um mehrere Nucleotide versetzt gespalten, haben die entstehenden DNA-Fragmente einzelsträngig überhängende 3'- bzw. 5'-Enden. Da diese Überhänge wegen der zueinanderpassenden Basen über die Ausbildung von Wasserstoffbrücken wieder miteinander verkleben können, werden solche Enden auch als Sticky ends bezeichnet.

Schon gewusst

Der Begriff Palindrom bezeichnet ursprünglich eine Buchstabenfolge, die von links nach rechts gelesen gleich lautet wie von rechts nach links (gr. palindromos zurücklaufend). Sprachpalindrome: Anna, Otto, Madam. Ein Neger mit Gazelle zagt im Regen nie.

DNA-Sequenz-Palindrom:

5-GAATTC-33-CTTAAG-5

Das Rückwärtslesen erfolgt auf dem Gegenstrang.

Nomenklatur
Die Namen der Restriktionsenzyme (z.B. EcoRI) bestehen aus einer dreibuchstabigen Abkürzung des Organismus, aus dem das Enzym isoliert wurde (Eco steht für Escherichia coli); falls notwendig, folgen eine Stammkennzeichnung (R steht für Stamm RY 13) und eine römische Zahl, wenn mehrere Enzyme mit unterschiedlicher Sequenzspezifität aus dem gleichen Stamm isoliert wurden.
Restriktionsfragmente
Längere DNA-Moleküle werden durch ein Restriktionsenzym in mehrere Stücke gespalten, die als Restriktionsfragmente bezeichnet werden. Die Länge und Anzahl der Restriktionsfragmente eines DNA-Moleküls werden von der Lage der Erkennungssequenzen bestimmt; 4-Basenpaar-Erkennungssequenzen sind häufiger als 6-Basenpaar-Sequenzen und ergeben im Durchschnitt mehr und kleinere Restriktionsfragmente. Theoretisch tritt eine Sequenz von vier Basen alle 256 (44) Basen, ein 6-Basen-Sequenzmotiv alle 4096 (46) Basen auf. In Wirklichkeit sind die Erkennungssequenzen eines Restriktionsenzyms jedoch ungleichmäßig verteilt und führen deshalb zu unterschiedlich großen Restriktionsfragmenten. Die Restriktionsfragmente können gelelektrophoretisch aufgetrennt und nach Anfärben mit DNA-spezifischen Farbstoffen sichtbar gemacht werden (Abb. 15.1). Von DNA-Molekülen bis zu einer gewissen Größe entstehen so bestimmte Muster, die z.B. für das Genom einiger Viren stammspezifisch sind.
Neukombination von Restriktionsfragmenten
Restriktionsfragmente können nach der Auftrennung in der Elektrophorese aus dem Gel ausgeschnitten und von den Bestandteilen des Gels getrennt werden. Wenn man Fragmente von DNA-Molekülen, die mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten wurden, zusammengibt, können die überhängenden Enden der beiden Fragmente wegen der Basenkomplementarität eine lockere Bindung über Wasserstoffbrücken eingehen (Abb. 15.2). Diese können dauerhaft miteinander verknüpft werden, wenn man das Enzym DNA-Ligase zufügt, das die Ausbildung neuer Phosphodiesterbrücken katalysiert. Dabei spielt es keine Rolle, ob die beiden zu verknüpfenden Restriktionsfragmente vom gleichen DNA-Molekül stammen oder unterschiedlicher Herkunft sind. Auch glatte (Blunt) Restriktionsfragmentenden können durch Ligase kovalent verbunden werden.

MERKE

Restriktionsenzyme erkennen in der Regel Palindrome und zerlegen einen DNA-Strang in definierte Stücke, die gezielt neu miteinander verknüpft werden können.

DNA-Klonierung

Gezielte DNA-Vermehrung
Um ein bestimmtes Stück DNA analysieren zu können, z.B. zur Entschlüsselung der Basensequenz, oder um es gezielt zu verändern oder aber um es in eine andere Zelle oder einen Organismus einschleusen zu können, benötigt man eine große Menge dieses Moleküls. Die Herstellung vieler identischer Kopien eines DNA-Moleküls kann man erreichen, indem man es in eine leicht anzüchtbare Zelle (z.B. ein Bakterium) einbringt. Bei der exponentiellen Vermehrung der Bakterien wird das fremde DNA-Molekül mit vermehrt und kann am Ende der Kulturphase wieder leicht in reiner Form isoliert werden. Da alle Bakterien einer solchen Kultur durch Teilung aus einer gemeinsamen Vorfahrenzelle hervorgegangen und daher genetisch identisch sind (einschließlich der Fremd-DNA), sind sie definitionsgemäß ein Klon. Dieses Verfahren zur DNA-Vermehrung wird deshalb als Klonierung bezeichnet.
Oft wird der Begriff Klonierung auch für die Isolierung eines bestimmten DNA-Abschnitts (meist ein Gen) vom Rest der zellulären DNA verwendet, weil dabei die Herstellung vieler identischer Kopien, wie oben beschrieben, ein entscheidender Teil des Prozesses ist. Der Begriff Klonierung darf jedoch nicht mit dem Begriff Klonen verwechselt werden; Letzterer bezeichnet lediglich die gezielte Herstellung genetisch identischer Zellen oder Individuen, ohne dass dabei die Vermehrung eines DNA-Moleküls im Mittelpunkt des Interesses steht. Auf das Klonen zur medizinischen Anwendung wird gesondert eingegangen (Kap. 15.5.3).

MERKE

Die DNA-Klonierung ist die Vermehrung eines fremden DNA-Moleküls in einem Wirtsorganismus.

Vektoren
Um beim Klonierungsprozess die DNA in die Wirtszelle einzuschleusen und dort zu vermehren, benötigt man einen Vektor als Trägermolekül, in das die zu vermehrende DNA eingebaut wird. Der Einbau erfolgt durch Restriktionsverdau und Ligation. Die fremde DNA bezeichnet man als Insert. Vektoren besitzen Eigenschaften, die es erlauben, sie (mitsamt Insert) leicht in die Wirtszelle einzuschleusen. Fremd-DNA, die ohne Vektor in eine Zelle gelangt, wird sehr schnell abgebaut. Außerdem müssen Vektoren die Signale für eine autonome Replikation enthalten. Meist tragen sie noch Marker- oder Selektionsgene, die es erlauben, den Prozess der DNA-Klonierung zu verfolgen und zu steuern. Alle heute in der Gentechnologie verwendeten Vektoren leiten sich von Molekülen ab, die dem natürlicherweise vorkommenden Gentransfer zwischen Zellen und Organismen dienen.
Plasmide
Dies sind relativ kleine ringförmige doppelsträngige DNA-Moleküle von mehreren tausend Basenpaaren, die v.a. in Bakterien vorkommen. Sie besitzen einen Replikationsursprung, der die Replikation unabhängig vom Bakterienchromosom erlaubt. Bestimmte Plasmide (sog. High-copy-number-Plasmide) können in bis zu 100 Kopien pro Bakterienzelle vorliegen. In der Regel sind Plasmide für die Bakterien entbehrlich, allerdings können plasmidkodierte Gene, z.B. für eine Antibiotikaresistenz, dem Träger einen Selektionsvorteil verschaffen. Natürlich vorkommende Plasmide können von einer Zelle auf eine andere übertragen werden. Dieser horizontale Gentransfer ermöglicht eine schnelle Ausbreitung plasmidkodierter Gene in einer Bakterienpopulation. Diese kann so z.B. wesentlich effektiver gegen ein Antibiotikum resistent werden, als wenn das Plasmid nur durch Zellteilung weitergegeben würde. Plasmide sind damit prädestiniert, DNA von außen in eine Bakterienzelle einzubringen.
Die Gentechnik nutzt Plasmide als sehr effektive Vektoren für kurze DNA-Fragmente (wenige Basenpaare bis ca. 10 Kilobasenpaare). Das Einbringen eines Plasmids in eine Bakterienzelle wird als Transformation bezeichnet. Aufgrund ihrer kleinen und kompakten ringförmigen Struktur unterscheiden sich Plasmide in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften von der hochmolekularen, ausgestreckten genomischen DNA des Bakterienchromosoms. So zeigen sie z.B. ein unterschiedliches Sedimentationsverhalten bei der Dichtegradientenzentrifugation oder eine erhöhte Resistenz gegen Denaturierung durch Alkali. Dies ermöglicht die Isolierung und Aufreinigung der Plasmide am Ende des Vermehrungsprozesses.
Zur Vermehrung von Plasmiden wird meist das Darmbakterium Escherichia coli (E. coli) verwendet, das zum Arbeitspferd der Gentechnologie wurde. Alle Laborstämme tragen bestimmte Defektmutationen, die verhindern, dass sie sich außerhalb des Labors vermehren können.
Plasmide gibt es auch für DNA-Klonierungen mit Hefe als Wirtszelle. Diese sind durch einen hefespezifischen Replikationsursprung und hefespezifische Selektionssysteme gekennzeichnet.
Phagen
Der Bakteriophage (lambda) ist ein Virus, das Bakterien befällt. Er setzt sich an der Zelloberfläche fest und injiziert seine DNA. Diese baut sich in das Bakterienchromosom ein und wird bei jeder Zellteilung mit vermehrt. In diesem lysogenen Zustand ist der Phage unschädlich. Durch bestimmte Umweltbedingungen kann das Phagengenom jedoch aktiviert werden. Dieser lytische Zustand ist durch die Produktion von Phagen-DNA und -Proteinen gekennzeichnet; es werden bis zu 100 neue Phagenpartikel in der Bakterienzelle gebildet. Diese platzt, und die freigesetzten Phagen können neue Zellen befallen.
Für die Gentechnologie sind Phagen deshalb interessant, weil große Segmente der DNA für eine erfolgreiche Infektion nicht essenziell sind und durch fremde DNA (bis zu 25 kb) ersetzt werden können. Außerdem können sie Bakterien sehr effizient infizieren. Fast jeder Phage kann seine DNA in eine Wirtszelle einschleusen. Damit sind Phagen Plasmiden weit überlegen, die insbesondere ab einer gewissen Größe Bakterien nur noch sehr ineffektiv transformieren. Da die Phagen nach der Lyse der Bakterienzelle in das Medium entlassen werden, lassen sie sich leichter aufreinigen. Mit ihnen wird die vermehrte Insert-DNA gewonnen.
Cosmide
Dabei handelt es sich um chimärische Vektoren aus Plasmid und Phagensequenzen, die die Vorteile beider Systeme kombinieren. Ihre Kapazität für Fremd-DNA liegt bei 30–48 kb.
YACs, PACs, BACs
YACs (yeast artificial chromosomes) sind Vektoren, die für die Klonierung extrem langer DNA-Stücke (bis 1000 kb) in der Hefe entwickelt wurden. Es sind kleine Minichromosomen, die neben der Fremd-DNA einen hefespezifischen Replikationsursprung, Telomere und Zentromere enthalten. Wegen verschiedener Probleme, z.B. ihrer Instabilität, werden sie heute kaum noch benutzt.
PACs (P1 phage artificial chromosomes) und BACs (bacterial artificial chromosomes) werden wiederum in E. coli vermehrt. Bis zu 100 kb nehmen die PACs und bis zu 300 kb die BACs auf. Wegen ihrer einfachen Handhabung und guten Ausbeute bei der Vermehrung werden sie insbesondere bei Genomprojekten und der Manipulation größerer Genomregionen verwendet.
Cosmide und Artificial chromosomes sind v.a. für das Anlegen von Genbanken (unten) wichtig.
Viren
Um Fremd-DNA in eukaryontische Zellen einzubringen, die in Kultur gezüchtet und vermehrt werden können, bedient man sich spezieller, für die Zwecke der Gentechnologie gezielt veränderter Viren, die diese Zellen besonders gut infizieren können. Auch hier kann man, wie bei den Bakteriophagen, nichtessenzielle Bestandteile des Genoms durch Fremd-DNA ersetzen.

MERKE

Vektoren werden für das Einschleusen, die Vermehrung und die Rückgewinnung der Fremd-DNA benötigt. Je nach Vektortyp können zwischen einige hundert Basenpaare und mehrere hundert Kilobasen lange Fremd-DNA-Stücke eingebaut werden.

Selektion
Die technische Schwierigkeit der DNA-Klonierung liegt darin, dass das gewünschte rekombinante Molekül oder die damit transformierte Bakterienzelle oft nur in geringer Zahl erhalten wird und aus der Vielzahl nichtrekombinanter Moleküle oder nichttransformierter Zellen isoliert werden muss. Zur Lösung des Problems bedient man sich vielfach sog. Selektionssysteme, die sich auf mikrobiologische Verfahren gründen.
Dies soll am Beispiel einer Plasmidklonierung erläutert werden (Abb. 15.3): Bei der Ligationsreaktion entstehen neben dem gewünschten rekombinanten Plasmid (Vektor + Insert) natürlich auch zirkularisierte Insert-DNA-Moleküle und rezirkularisierte Vektormoleküle, da auch deren Enden wegen des vorhergegangenen Restriktionsverdaus komplementär zueinander sind. Genau wie zwischen den Endsequenzen von Vektor und Insert bilden sich Wasserstoffbrücken. Die Ligase schließt durch kovalente Bindung solche intramolekularen Kontaktstellen.
Bei einem häufig verwendeten Verfahren benutzt man Plasmide, die einerseits ein Gen für eine Antibiotikaresistenz tragen und andererseits für ein Enzym kodieren, das ein (künstliches) Substratmolekül spaltet, sodass ein farbiges Produkt entsteht. Die Restriktionsschnittstelle befindet sich im Gen für das Enzym. Produkte der Ligationsreaktion werden in Bakterienzellen transformiert und diese auf einen Nährboden verteilt, der das Antibiotikum und das Enzymsubstrat enthält.
Alle Bakterienzellen, die keine DNA aufgenommen haben oder mit der zirkularisierten Insert-DNA transformiert werden, sterben ab, da sie sensitiv für das Antibiotikum bleiben. Nur die Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, sind resistent gegen das Antibiotikum und wachsen zu sichtbaren Kolonien (Klonen) heran. Kolonien von Bakterien mit dem rezirkularisierten Plasmid sind jedoch an ihrer Färbung zu erkennen, da sie das Enzym produzieren, das das farbige Produkt bildet. In den Bakterien mit dem rekombinanten Plasmid ist der Leserahmen für das Enzym-Gen durch die Insert-DNA unterbrochen. Diese Kolonien sind farblos und können nun leicht isoliert werden.

MERKE

Durch Antibiotikaselektion wird der DNA-Klonierungsprozess kontrolliert.

Genbanken
Genomische Banken
Wie kann man nun ein einzelnes Gen aus der Vielzahl der Sequenzen des gesamten Genoms isolieren? Als Ausgangsmaterial dafür dient zunächst eine Genbibliothek oder Genbank, die sämtliche Gene in klonierter Form enthält. Diese Sammlung von DNA-Fragmenten erhält man, indem man die gesamte DNA, die z.B. aus menschlichen Zellen isoliert wurde, mit einem Restriktionsenzym schneidet und mit einem passenden Vektor ligiert. Das Reaktionsgemisch, das sämtliche Restriktionsfragmente des menschlichen Genoms enthält, wird nun in eine Bakterienpopulation eingeschleust. Die Bakterien werden vereinzelt und so auf einen Nährboden verteilt, dass jede der heranwachsenden Kolonien ein bestimmtes DNA-Fragment repräsentiert und die Gesamtheit aller Kolonien alle menschlichen genomischen Sequenzen mindestens einmal enthält.

MERKE

Genomische Genbanken sind komplette Sammlungen von DNA-Fragmenten, die das gesamte genetische Material eines Organismus in klonierter Form enthalten.

cDNA-Banken
Ist man an den Bereichen eines Gens interessiert, die seine Expression bei normalen physiologischen Prozessen oder bei einer Erkrankung regulieren, oder an Gensequenzen, die nicht in der mRNA enthalten sind, kann man diese Informationen nur anhand klonierter Gene aus der chromosomalen DNA gewinnen. Oft ist jedoch nur die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, von Interesse. In solchen Fällen greift man auf Genbanken zurück, die sämtliche mRNA-Sequenzen in klonierter Form enthalten. Im Folgenden werden die einzelnen Schritte der Herstellung einer cDNA-Bank beschrieben.
  • Isolierung der mRNA: Man macht sich die Tatsache zunutze, dass fast alle mRNA-Moleküle an ihrem 3'-Ende einen Poly(A)-Schwanz tragen. Zunächst wird die mRNA, die nur 1–2% der gesamten zellulären RNA ausmacht, von der rRNA und tRNA (der ribosomalen und der Transfer-RNA) abgetrennt. Dazu wird die gesamte zelluläre RNA über eine Säule gegeben, die eine Matrix enthält, an der sich einzelsträngige Oligonucleotide befinden, die nur aus Desoxythymidin (dT) bestehen. Die Poly(A)-Schwänze der mRNA-Moleküle werden an die Oligo(dT)-Sequenzen gebunden, während alle nichtpolyadenylierten Moleküle die Säule passieren. Danach können die mRNA-Moleküle mit einem geeigneten Puffer wieder vom Säulenmaterial abgelöst werden.

  • Umschreibung in cDNA: Für den zweiten Schritt der cDNA-Klonierung (Abb. 15.4) spielt der Poly(A)-Schwanz wieder eine wichtige Rolle. Man mischt kurze, synthetisch hergestellte Oligonucleotide von ca. 20 Desoxythymidinbausteinen mit der mRNA. Nach Basenpaarung mit dem Poly(A)-Ende dienen die Oligo(dT)-Sequenzen als Primer für das Enzym reverse Transkriptase. Dieses Enzym kann RNA als Matrize für die Synthese eines DNA-Strangs verwenden. Die DNA-Kopie der mRNA wird als cDNA (von complementary DNA) bezeichnet. Das Produkt der Reverse-Transkriptase-Reaktion ist ein doppelsträngiges DNA-RNA-Hybrid. Durch Zugabe der spezifischen RNase H, die solche Hybridmoleküle erkennt und für den Abbau des RNA-Anteils sorgt, und einer konventionellen DNA-Polymerase, die die einzelsträngige cDNA zum Doppelstrang ergänzt, erhält man eine exakte DNA-Kopie des mRNA-Moleküls.

  • Herstellung der cDNA-Bank: Um das Einbringen dieser Kopien in einen Vektor zu erleichtern, werden an beide Enden noch kurze synthetische DNA-Sequenzen ligiert, die eine geeignete Restriktionsschnittstelle enthalten. Eine Expressionsbank besteht – je nach Zelltyp – aus mehreren Millionen einzelner Klone, von denen jeder ein mRNA-Molekül repräsentiert. Wegen der unterschiedlichen Expressionsstärke der Gene gibt es von hoch exprimierten Genen (z.B. -Actin) viele mRNA-Moleküle und somit entsprechend viele Klone mit der -Actin-Sequenz, während andere, schwach exprimierte Gene nur durch ein bis zwei Klone repräsentiert sind.

MERKE

mRNA-Moleküle werden nach Umschreiben in eine cDNA kloniert.

Isolierung von klonierten Genen
Gensonden
Für das Auffinden der Bakterienkolonie aus der gesamten genomischen Bibliothek oder der cDNA-Bank, die das gesuchte Gen in klonierter Form enthält, benötigt man eine molekulare Sonde (engl. Probe), die – z.B. aufgrund einer radioaktiven Markierung – die Identifizierung der gesuchten Sequenz ermöglicht.
Geeignete Sonden erhält man beispielsweise, wenn das von dem zu klonierenden Gen kodierte Protein zumindest teilweise bekannt ist. Aus der Proteinsequenz (oft genügen weniger als 15 Aminosäuren) wird die kodierende DNA-Sequenz abgeleitet. Mittels eines automatisierten chemischen Verfahrens lassen sich Oligonucleotide jeder beliebigen vorgegebenen Sequenz synthetisieren. Wegen der Degeneration des genetischen Codes sind für die meisten Aminosäuresequenzen jedoch mehrere Nucleotidsequenzen möglich. Deshalb stellt man sich ein Gemisch aus all diesen Möglichkeiten (von denen jedoch nur eine die tatsächliche Gensequenz sein wird) her und versieht die synthetischen Oligonucleotide mit einer radioaktiven Markierung.
Eine andere Möglichkeit für molekulare Sonden eröffnet sich, wenn das gesuchte Gen zu einer Genfamilie gehört, von der bereits ein anderes Mitglied (paraloges Gen) kloniert wurde, oder wenn von einem Tiermodell, z.B. der Maus, das entsprechende verwandte (orthologe) Gen bekannt ist. Die Ähnlichkeit der DNA-Sequenzen orthologer bzw. paraloger Gene reicht meist zur Identifizierung aus.
DNA-Hybridisierung
Grundlage der Genidentifizierung ist die DNA-Hybridisierung. In einem Gemisch einzelsträngiger DNA-Moleküle bildet eine molekulare Sonde bei Temperaturen etwas unterhalb des Schmelzpunkts des DNA-Doppelstrangs nur mit dem DNA-Molekül einen Doppelstrang, zu dem es über alle (oder fast alle) Nucleotide komplementär ist.
Beim Absuchen einer Gen- oder Expressionsbank (Abb. 15.5) wird zunächst von der Anordnung sämtlicher Bakterienkolonien ein Replikat erstellt, und zwar durch Auflegen eines saugfähigen Filters auf die Petrischale. Beim Abziehen des Filters bleiben von jeder Kolonie einige Bakterienzellen an dem Filter haften. Die Zellen auf dem Filter werden lysiert und die DNA einschließlich des Inserts durch Behandlung mit Alkali in Einzelstränge zerlegt. Wenn dieser Filter, an dem die bakterielle DNA festhaftet, mit der radioaktiven Sonde inkubiert wird, so bindet diese nur dort, wo sich eine Kolonie befand, deren DNA ähnliche Sequenzen wie die Sonde enthält. Damit ist auch auf der ursprünglichen Petrischale die lebende Bakterienkolonie mit der gesuchten Sequenz identifiziert.

MERKE

Die DNA-Klonierung ist ein Verfahren zur Herstellung vieler identischer Kopien einer Sequenz. Ein DNA-Molekül wird dazu mit Restriktionsenzymen geschnitten und mit einem Vektor ligiert. Nach Vermehrung in einem Wirtsorganismus werden die klonierten Sequenzen isoliert. Die Klonierung von mRNA-Molekülen erfolgt nach Umschreiben in eine cDNA. Die Identifizierung der gesuchten DNA-Sequenzen wird durch molekulare Hybridisierung mit einer sequenzidentischen oder sequenzähnlichen Sonde erreicht.

Die Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist die enzymatische Vervielfältigung (Amplifikation) eines DNA-Abschnitts in vitro. Sie wurde Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts von Kary Mullis entwickelt und hat, wie die Entdeckung der Restriktionsenzyme und der DNA-Sequenzierung, die Molekularbiologie revolutioniert. Mit der PCR lässt sich eine enorme Anzahl von Kopien einer spezifischen DNA-Sequenz herstellen, ohne auf die Klonierung mittels gentechnisch veränderter Organismen oder Zellen zurückgreifen zu müssen.
Grundlagen
Prinzip
Die PCR leitet sich von der DNA-Replikation ab und benutzt dazu das Enzym DNA-Polymerase. Das Problem der diskontinuierlichen Synthese bei der Replikation der DNA-Doppelhelix im Zellkern kann in vitro umgangen werden, indem der Doppelstrang durch Erhitzen in die beiden Einzelstränge zerlegt wird. Diese werden dann jeder für sich von einem Molekül DNA-Polymerase wieder zum Doppelstrang ergänzt.
Reaktionsmechanismus
Entsprechend ihren biochemischen Eigenschaften benötigt die DNA-Polymerase neben der Matrize ein freies 3'-OH für den Beginn der Synthese. Dies wird bei der PCR von einem synthetischen Oligodesoxynucleotid, dem sog. Primer, geliefert, der mindestens 20–30 Nucleotide lang sein muss. Er ist komplementär zu einer kurzen Sequenz, die 5' des zu amplifizierenden Bereichs des DNA-Einzelstrangs liegt. Solche Primer werden für beide Stränge benötigt. Sie flankieren somit die zu amplifizierende DNA-Sequenz und sind Bestandteile des Produkts der PCR. Um ein Stück DNA mittels PCR zu vermehren, muss zumindest so viel Sequenzinformation vorliegen, um die beiden Primer herstellen zu können. Werden dem Reaktionsgemisch noch alle vier Desoxyribonucleosidtriphosphate zugefügt, kann die DNA-Polymerase nun die komplementären Stränge synthetisieren. Die beiden so entstandenen Doppelstränge können nun erneut durch Erhitzen in Einzelstränge zerlegt werden, die in einem zweiten Reaktionszyklus zu vier doppelsträngigen DNA-Molekülen ergänzt werden. Durch die Aneinanderreihung vieler solcher Reaktionszyklen kann aus einem einzigen Ausgangsmolekül eine große Anzahl identischer Kopien hergestellt werden. Da die neu synthetisierten DNA-Stränge selbst wieder als Matrize fungieren, kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der DNA. Nach 21 Zyklen sind es bereits mehr als eine Million, nach 31 Zyklen mehr als eine Milliarde.
Hitzestabile Polymerase
Da die DNA-Polymerase der meisten Organismen ein hitzelabiles Protein ist, benutzt man ein Enzym aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, das bei der Denaturierungstemperatur der DNA nicht beeinträchtigt wird. Diese Polymerase wird auch als Taq-Polymerase bezeichnet.

MERKE

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine Abfolge von DNA-Replikationszyklen in vitro.

Der PCR-Zyklus
Ein PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten (Abb. 15.6)
  • Strangtrennung (Denaturierung): Durch Erhitzen des Reaktionsgemischs auf 95 C werden die DNA-Doppelstränge in Einzelstränge aufgeschmolzen. Dieser Schritt führt zur Denaturierung der DNA.

  • Anlagern der beiden Primer (Annealing): Im zweiten Schritt wird die Lösung sehr schnell auf die Temperatur abgekühlt, bei der sich der Primer entsprechend der Anzahl der möglichen Wasserstoffbrücken, die er aufgrund seiner Basenzusammensetzung auszubilden vermag, optimal an die Zielsequenz des DNA-Einzelstrangs anlagern kann (Annealing). Diese optimale Temperatur ist also abhängig von der Nucleotidsequenz und muss für beide Primer aufeinander abgestimmt werden. Die Annealing-Temperatur wird so gewählt, dass sie zwischen 50 und 72 C liegt.

  • DNA-Synthese (Elongation): Anschließend wird die Lösung auf 72 C erhitzt, die optimale Temperatur für die Taq-DNA-Polymerase. Die Synthese erfolgt so lange, bis das Ende der Matrize erreicht wird oder – z.B. im Fall der ursprünglich eingesetzten zellulären DNA-Moleküle – bis die Temperatur in anschließenden Zyklen wieder auf die Denaturierungstemperatur angehoben wird. Da in diesem Schritt die Primersequenz verlängert wird, bezeichnet man diesen Teil des Zyklus auch als Elongation.

MERKE

Ein PCR-Zyklus umfasst Denaturierung, Annealing und Elongation.

Anwendungen der PCR-Technologie
Einige Besonderheiten und Abwandlungen der PCR-Technik seien herausgestellt:
  • Die PCR-Methode benötigt keine hochgereinigte DNA. Die DNA für eine PCR besteht häufig aus der gesamten genomischen DNA, die man aus Zellen extrahiert. DNA, die durch Kochen aus Zellen freigesetzt wurde, kann bereits ohne weitere Abtrennung von den Zellbestandteilen als Matrize verwendet werden.

  • Die PCR ist eine sehr leistungsfähige Methode. Durch den Einsatz spezieller PCR-Maschinen, die die Temperaturzyklen in vielen Reaktionsgefäßen gleichzeitig steuern, ist sie sehr einfach, kostengünstig und schnell. Eine konventionelle PCR von 30–35 Zyklen dauert eine bis wenige Stunden. Die Länge der zu amplifizierenden DNA kann von wenigen Basen bis ca. 20 kb reichen.

  • Die Annealing-Temperatur für eine PCR kann so gewählt werden, dass die Primer nur binden, wenn sie in ihrer gesamten Sequenz mit der Sequenz der Matrize übereinstimmen. Damit lassen sich z.B. Mutationen nachweisen oder auffinden. Diese Technik findet eine breite Anwendung in der Gendiagnostik.

  • Die PCR ist eine sehr empfindliche Methode. Im Prinzip reicht ein einziges DNA-Molekül als Matrize für den ersten Zyklus aus. Diagnostische Verfahren lassen sich so mit wenigen Zellen (z.B. Zellen, die an der Basis eines ausgerissenen Haares haften bleiben, oder Mundschleimhautzellen eines Abstrichs) durchführen. Mit spezifischen Primern lassen sich Bakterien und Viren leicht nachweisen.

    Klinik

    Die Diagnose des die Tuberkulose verursachenden Bakteriums Mycobacterium tuberculosis ist schwierig, weil in pathologischen Proben häufig zu wenig Erreger vorhanden sind. Die stattdessen durchgeführte Züchtung und mikrobiologische Charakterisierung dauert Wochen und ist nicht immer erfolgreich. Mit der PCR lassen sich zehn Tuberkulosebakterien unter einer Million menschlicher Zellen nachweisen. Der PCR-Test ist also wesentlich schneller, zuverlässiger und empfindlicher.

  • Auch die in der mRNA enthaltene Sequenzinformation kann durch PCR amplifiziert werden. Dabei wird zunächst die mRNA mittels reverser Transkriptase in eine cDNA umgeschrieben. Diese wird dann als Matrize für eine folgende PCR eingesetzt. Diese Abwandlung der Methode wird als RT-PCR bezeichnet.

  • Die PCR ist über viele Zyklen hinweg eine konstant exponentielle Vermehrung der Matrize. Somit liefert sie auch quantitative Aussagen. Je nach Anzahl der Matrizenmoleküle in der Ausgangslösung entstehen nach einer bestimmten Anzahl von Reaktionszyklen mehr oder weniger Produkte. So kann durch RT-PCR die Menge einer bestimmten mRNA in einem erkrankten Gewebe oder Organ, der Anteil der Zellen in einem Tumor mit einer typischen genetischen Veränderung oder die Anzahl von Viren im Blut (z.B. Viruslast bei HIV-Infektion oder Hepatitis B) bestimmt werden.

Eine Variante ist die Real-time-PCR, bei der die Zunahme der PCR-Produkte durch Fluoreszenzmarkierung mit einem empfindlichen Detektor kontinuierlich verfolgt und genau quantifiziert werden kann.

Blick ins Labor

DNA ist ein sehr stabiles Molekül. Man hat sogar DNA aus ägyptischen Mumien, die mehrere tausend Jahre alt sind, aus Knochenresten des Neandertalers (ca. 35.000 Jahre alt) und aus in Bernstein eingeschlossenen Insekten amplifizieren können. In der forensischen Medizin findet die PCR breite Anwendung, da aus Blutflecken, Spermaproben und Haaren oft eindeutige Hinweise auf Tathergang, Täter und Opfer gewonnen werden können. Auch aus fixiertem Gewebe (z.B. aus Paraffinblöcken in der Pathologie) lässt sich noch DNA für PCR-Analysen gewinnen. Wird die PCR-Reaktion nach Überschichten eines histologischen Schnitts mit dem Reaktionsgemisch so durchgeführt, dass die Reaktionsprodukte am Ort ihrer Entstehung verbleiben, so lässt sich in situ der Nachweis einer bestimmten mRNA, eines zellulären Gens bzw. dessen Veränderung oder die Infektion durch einen Erreger erbringen.

Klinik

In der pränatalen Diagnostik ist die genetische Analyse einer kleinen Anzahl von Zellen von großer Bedeutung. Mittels Amniozentese wird eine geringe Menge Fruchtwasser entnommen, die genügend Zellen des Embryos enthält, um eine PCR z.B. im Hinblick auf die Vererbung bestimmter Risikofaktoren durchzuführen.

Die Präimplantationsdiagnostik, ein Verfahren, das derzeit zwar nicht in Deutschland, aber in vielen anderen Ländern angewendet wird, nutzt die Regenerationsfähigkeit des frühen menschlichen Embryos. Nach In-vitro-Befruchtung und Kultivierung bis ungefähr zum Achtzellstadium kann dem Embryo mit einem Mikromanipulator eine Zelle entnommen werden, ohne dass es im weiteren Verlauf der Entwicklung zu einer Beeinträchtigung kommt. Aus der DNA der entnommenen Zelle kann z.B. unter Verwendung von Primern, die die spezifische Amplifikation Y-chromosomaler Sequenzabschnitte ermöglichen, festgestellt werden, ob der Embryo männlich oder weiblich ist. Im Fall einer X-gekoppelten Erbkrankheit, die im hemizygoten Zustand zu schwerwiegenden Beeinträchtigungen führt, kann man nun gezielt nur die weiblichen Embryonen in die Mutter verpflanzen. Auch für viele andere Erbkrankheiten können so kranke und gesunde Embryonen sortiert werden. Der mögliche Missbrauch und die ethische Problematik, die diese Technik aufwirft, liegen auf der Hand.

Die Sensitivität und Spezifität der PCR erlauben es, den Verlauf von bestimmten Krebserkrankungen zu verfolgen. Viele Tumoren, insbesondere Leukämien, sind durch bestimmte chromosomale Veränderungen (Translokationen, Deletionen, Punktmutationen) gekennzeichnet. Mittels spezifischer Primer, die für diese Aberrationen in den Tumorzellen spezifisch sind (also ein PCR-Produkt ergeben), lässt sich z.B. ein Rezidiv nach einer Chemotherapie frühzeitig nachweisen.

MERKE

Bei der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) wird die DNA durch Hitzedenaturierung aufgeschmolzen. Oligonucleotide, die den zu amplifizierenden Sequenzabschnitt flankieren, dienen als Primer für die Synthese der komplementären Stränge durch eine hitzestabile DNA-Polymerase. Durch die Aufeinanderfolge vieler PCR-Zyklen wird die DNA exponentiell vermehrt. Die PCR ist eine außerordentlich sensitive Methode zum spezifischen Nachweis von Nucleinsäuresequenzen.

DNA-Sequenzierung

Sequenzierungsreaktion
Die Abfolge der Basen auf einem DNA-Molekül (die sog. Basensequenz) lässt sich nach dem Verfahren von Frederick Sanger entschlüsseln. Die biochemische Grundlage ist die Ergänzung einer einzelsträngigen DNA-Matrize zum Doppelstrang. Das Verfahren leitet sich also von der Replikation ab, und das verwendete Enzym ist wie bei der PCR eine DNA-Polymerase. Als Primer wird ein kurzes Oligodesoxyribonucleotid (ca. 15–20 Basen lang) verwendet, das das freie 3'-OH für den Synthesebeginn liefert. Das Besondere an der DNA-Sequenzierungsreaktion ist, dass neben den vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten noch eine der vier Basen als 2',3'-Didesoxyribonucleosidtriphosphat zugegeben wird. Wird dieses falsche Nucleotid eingebaut, kommt es zum Abbruch der Synthese, da die bis dahin synthetisierte Kette kein freies 3'-OH mehr hat (Abb. 15.7). Die Zugabe von Didesoxy-ATP führt z.B. zu Fragmenten, die alle mit einem A enden. Beim richtigen Mischungsverhältnis mit dem regulären Desoxy-ATP wird zu jeder Position, an der in der Matrize ein T steht, ein Abbruchfragment gebildet (Abb. 15.8a).
Ablesen der DNA-Sequenz
Radioaktive Sequenzreaktion
Vier Reaktionsansätze (einer für jedes Didesoxyribonucleosidtriphosphat) werden elektrophoretisch aufgetrennt. Wurden die Syntheseprodukte oder der Sequenzierungsprimer radioaktiv markiert, lässt sich vom Autoradiogramm der vier Bahnen der Elektrophorese direkt die Basensequenz von unten nach oben ablesen (Abb. 15.8b): Kurze Abbruchfragmente wandern weiter als die nächstlängeren.
Die radioaktive Markierung kann erfolgen, indem der Primer, der den Anfang aller Syntheseprodukte bildet, markiert wird oder indem eines der Desoxyribonucleosidtriphosphate radioaktiv ist.
Fluoreszenzmarkierung
Fluoreszenzmarkierung ist eine sehr effektive Verbesserung, die eine Teilautomatisierung der DNA-Sequenzierung erlaubt. Der Fluoreszenzmarker wird kovalent an den Primer angehängt, und zwar jeweils ein anders gefärbter in den vier Reaktionsansätzen für den Kettenabbruch, oder in jeder der vier Reaktionen wird eines der Abbruchnucleotide mit einer eigenen Fluoreszenzfarbe markiert. Die Reaktionsansätze werden vereinigt und in einem Gel aufgetrennt. Die aufgetrennten DNA-Banden lassen sich an ihrer Fluoreszenzfarbe mittels eines Laserdetektors erkennen, wenn sie das Gel an einer bestimmten Stelle passieren (Abb. 15.8c). Aus der Sequenz der Farben ergibt sich die Basensequenz. DNA-Sequenzierungsautomaten ermöglichen die gleichzeitige Analyse vieler Sequenzierungsreaktionen. Pro Reaktion kann die Abfolge von 500–1000 Basen gelesen werden.

Blick ins Labor

Als biochemisches Verfahren benötigt die DNA-Sequenzierung viele DNA-Stränge der gleichen Sequenz, um die Kettenabbruchfragmente in einer detektierbaren Menge entstehen zu lassen. Die benötigte Ausgangsmenge an Matrizenmolekülen erhält man durch PCR oder durch Klonierung der zu untersuchenden DNA. Bei der Klonierung werden entsprechend der Lesekapazität der Sequenzierungsreaktion Stücke mit einer Länge von ca. 500–1000 Basenpaaren in einem Plasmidvektor kloniert. Durch Denaturierung erhält man die benötigten Einzelstränge. Für die Bestimmung einer unbekannten DNA-Sequenz muss wegen der Verwendung der Primer also zumindest eine kurze flankierende Nucleotidsequenz bekannt sein. Diese kann z.B. die Sequenz des Vektors in der Nähe der Klonierungsstelle sein. Wenn PCR-Produkte sequenziert werden, kann einer der PCR-Primer auch als Sequenzierungsprimer verwendet werden. Das Plasmidverfahren bietet den Vorteil, dass man universelle Primer benutzen kann. Diese sind komplementär zu kurzen Sequenzen, die die Klonierungsstelle im Plasmid flankieren.

Die Sequenzierungsreaktion wird heute meist als asymmetrische PCR durchgeführt. Zu der denaturierten DNA wird nur ein Primer (der Sequenzierprimer) hinzugegeben, sodass in der PCR nur ein Strang vermehrt wird. Für die Synthese dieses Strangs stehen alle vier Didesoxynucleotide und alle vier Desoxynucleotide im gleichen Reaktionsansatz zur Verfügung. Somit entstehen die Abbruchfragmente für alle vier Basen. Aufgrund unterschiedlicher Fluoreszenzfarben für die einzelnen Basen kann das Gemisch nach Auftrennung in einer Gelkapillare mit einem Laserdetektor analysiert werden. Die Abfolge der Fluoreszenzfarben der einzelnen DNA-Stränge gibt direkt die DNA-Sequenz wieder.

MERKE

Die DNA-Sequenzierung erfolgt nach dem Kettenabbruchverfahren mittels modifizierter Nucleotide (2',3'-Didesoxy-NTPs). Die bei radioaktiver Markierung für die vier Basen getrennt angesetzten Reaktionen werden elektrophoretisch aufgetrennt. Aus der Länge der Reaktionsprodukte kann direkt die Sequenz abgelesen werden. Bei Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung wird nur ein Reaktionsansatz benötigt.

Gendiagnostik

Viele Krankheiten des Menschen beruhen auf einer quantitativen oder qualitativen Veränderung in den Proteinen einer Zelle, die durch Mutationen ausgelöst werden. Für eine große Zahl solcher Erkrankungen sind die betroffenen Gene bekannt. Dadurch wird die Diagnose des Gendefekts möglich. Dies kann bereits vor dem Auftreten der ersten Symptome geschehen, z.B. bei Erbkrankheiten in der pränatalen Diagnostik oder bei der Früherkennung von Tumoren. Andererseits dient die Analyse des genauen Gendefekts der Differentialdiagnose, oder sie liefert wichtige Informationen für den Krankheitsverlauf.

Molekulare Hybridisierung

Bei diesem Verfahren macht man sich zunutze, dass aufgrund der Basenpaarung zwischen zwei einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen die zu untersuchende Sequenz mit einer bekannten, im Labor zur Verfügung stehenden Vergleichssequenz (Probe) einen stabilen Doppelstrang ausbildet.
Southern-Blot-Analyse
Methode
Um große strukturelle Mutationen (Deletionen, Insertionen und Translokationen) zu erkennen, die ein bestimmtes krankheitsverdächtiges Gen betreffen, benutzt man die DNA/DNA-Hybridisierung (Abb. 15.9). Man schneidet die zu untersuchende genomische DNA mit einem Restriktionsenzym und trennt dann die entstandenen Fragmente mittels Gelelektrophorese der Größe nach auf. Auf das Gel legt man dann eine aus Nitrocellulose oder Nylon bestehende Filtermembran und erzeugt einen Pufferfluss durch das Gel hin zum Filter. Dadurch werden die DNA-Fragmente aus dem Gel auf die Membran übertragen, wo sie an deren Oberfläche binden. Auf dem Filter entsteht so ein exakter Abdruck der größenmäßig aufgetrennten DNA. Durch Behandlung der Filtermembran mit Natronlauge wird die DNA denaturiert und damit einzelsträngig. Nun kann die radioaktiv oder mit einem Farbstoff markierte klonierte Sonde des entsprechenden Gens hybridisiert werden. Die ebenfalls einzelstängige DNA-Sonde bindet nur dort, wo sich das Restriktionsfragment befindet, welches das untersuchte Gen enthält, weil es hier zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen den homologen Basen identischer Sequenzabschnitte kommt. Fehlt z.B. aufgrund einer Deletion ein Sequenzabschnitt in einer Kopie der beiden Allele eines Gens, so tritt neben der Bande, die die erwartete Größe hat, bei dem Patienten eine zweite mit niedrigerer Molekülmasse auf, die dem mutierten Gen entspricht.
Gensonden
Als Sonde können klonierte Stücke der genomischen DNA oder einer cDNA dienen, die mit der Sequenz des zu analysierenden Restriktionsfragments übereinstimmen. Häufig sind die Mutationen jedoch sehr subtil, d.h., es handelt sich um Deletionen oder Insertionen, die nur wenige Basen betreffen, oder um Punktmutationen. Zur Diagnose solcher Defekte müssen die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass die Probe nur dann an die Patienten-DNA bindet, wenn die Sequenzen absolut identisch sind. Dabei kann die Probe entweder zu der nichtmutierten Wildtyp-Normalsequenz oder zu den erwarteten mutierten Sequenzen (bereits bekannte, krankheitsauslösende Allele) homolog sein.
Die hohe Spezifität der Probe wird nur von relativ kurzen DNA-Einzelsträngen, sog. allelspezifischen Oligonucleotiden, unter ganz besonders stringenten Hybridisierungsbedingungen erreicht.
PCR-Diagnostik
Allelspezifische Oligonucleotide eignen sich auch für den Nachweis von Punktmutationen und kleinen Deletionen mittels der PCR-Reaktion. Wird ein PCR-Experiment so konzipiert, dass einer der Primer an der Mutationsstelle liegt (während der andere an einer beliebigen Stelle liegt), wird man mit dem Mutationsoligonucleotid nur ein PCR-Produkt von dem mutierten Allel erhalten. Ein PCR-Produkt mit dem Primer der Wildtypsequenz zeigt das gesunde Allel an.
Die Diagnostik von Mutationen wird heute fast ausschließlich mittels PCR durchgeführt, da diese Methode innerhalb weniger Stunden eindeutige Ergebnisse liefert und wesentlich kostengünstiger ist. Die Southern-Blot-Analyse ist eine wichtige Methode in der biomedizinischen Forschung.

Klinik

Die Sichelzellanämie beruht auf einem Basenaustausch im sechsten Codon des -Globin-Gens. Das Triplett GAG, das für Glutaminsäure kodiert, ist zu GTG mutiert, sodass sich im Protein jetzt an dieser Stelle ein Valinrest befindet. Das veränderte Globin führt zu einer geringeren Löslichkeit des mit Sauerstoff beladenen Hämoglobins. Dadurch kommt es zu der namensgebenden Veränderung der Erythrozytenform. Die Sichelzellen hämolysieren leicht und haben deshalb eine kürzere Lebensdauer. So kommt es zur Anämie. Günstigerweise liegt die Mutation von A zu T in einer Sequenz, die Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym ist. Das Enzym kann das mutierte Gen an dieser Stelle nicht mehr schneiden. In einer Southern-Blot-Diagnose wird also bei einem Patienten mit Sichelzellanämie mit einer -Globin-Gen-Sonde ein größeres Fragment hybridisieren. Aber auch bei einem Überträger, der nur eine Kopie des Sichelzellgens neben der normalen Kopie trägt und der wegen des rezessiven Charakters der Erkrankung keine Symptome hat, ist damit das Sichelzellgen diagnostizierbar. Leider sind Mutationen, die eine Krankheit verursachen und eine Restriktionsschnittstelle ändern, sehr selten.

Die cystische Fibrose (CF, Synonym: Mukoviszidose) entsteht aufgrund von Mutationen im CFTR-Gen (CFTR von cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), das für einen Chloridkanal kodiert. Neben der häufigen Mutation F508 (Deletion der Aminosäure 508, Phenylalanin), die bei ca. 60% der Patienten gefunden wird, gibt es eine Reihe von Mutationen im CFTR-Gen, die ebenfalls zu einer cystischen Fibrose führen. Für eine Frühdiagnostik bei Neugeborenen, bei denen die Krankheit noch nicht ausgebrochen ist, wird neben dem Nachweis des erhöhten Spiegels von immunreaktivem Trypsinogen (als Zeichen einer Pankreasschädigung, die diese Erkrankung begleitet) ein direkter Nachweis der Mutationen in der Patienten-DNA durchgeführt. Dazu wird ein Satz von PCR-Reaktionen mit allelspezifischen Primern durchgeführt, die die häufigsten bekannten Mutationen detektieren (Kap. 17.5.4).

Northern-Blot-Analyse
Mit einem zum Southern-Blot analogen Verfahren kann man die Expression krankheitsverdächtiger Gene untersuchen. Hier wird die Gesamt-RNA oder die mRNA der Größe nach elektrophoretisch aufgetrennt und ebenfalls nach Übertragung auf ein Filterpapier mit einer einzelsträngigen Nucleinsäuresonde hybridisiert. Hierbei entsteht ein DNA-RNA-Hybridmolekül. Im Northern-Blot lässt sich nicht nur eine Größenveränderung der mRNA, sondern auch die Veränderung in der Expressionsstärke (z.B. aufgrund einer Mutation im Promotor des Gens) feststellen.
Ist man nur an der Veränderung der Expressionsstärke interessiert, benutzt man das viel effizientere und sensitivere Verfahren der RT-PCR.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Durch molekulare Hybridsierung mit DNA-Proben, die durch Fluoreszenzfarbstoffe markiert sind, lässt sich die Lokalisation eines Gens auf dem Chromosom finden. Dazu werden Präparationen von Metaphase-Chromosomen erstellt und diese nach Denaturierung mit der einzelsträngigen Probe hybridisiert. Das Fluoreszenzsignal zeigt den Ort des zur Probe homologen Genorts an.
Die FISH-Methode dient zum Nachweis von Translokationen und Deletionen sowie von Aneuploidien in der humangenetischen Diagnostik. Auch in der Tumordiagnostik wird sie zum Nachweis chromosomaler Veränderungen und von Genamplifikationen verwendet.

DNA-Chips

Durch neu entwickelte Werkstoffe und Mikrotechnologien wurde es möglich, auf extrem kleinen Flächen eine große Anzahl verschiedener DNA-Moleküle aufzubringen. Wegen des hohen Gehalts an genetischer Information und der Kleinheit des Informationsträgers bezeichnet man diesen in Analogie zur Mikroelektronik als DNA-Chip. So haben auf einem nur 20 cm2 großen Glasträger bis zu 10.000 verschiedene DNA-Moleküle Platz.
Grundlage der Gendiagnostik mit der Chip-Technologie (Abb. 15.10) ist wiederum die molekulare Hybridisierung. Die DNA-Moleküle auf dem Chip sind einzelsträngig. Sie werden mit der zu untersuchenden genomischen DNA des Patienten oder mit der in cDNA umgeschriebenen gesamten mRNA einer Gewebeprobe hybridisiert. Im Unterschied zu den Southern- und Northern-Blot-Verfahren wird allerdings die Gesamtheit aller Nucleinsäuremoleküle, die untersucht werden sollen, markiert. Hierfür verwendet man Fluoreszenzfarbstoffe. Auf dem Chip zeigt dann ein Fluoreszenzsignal an, dass an einer bestimmten Stelle eine Bindung der Nucleinsäure aus dem Patientenmaterial stattgefunden hat. Da man die Sequenz der DNA-Probe an dieser Stelle kennt, lässt sich somit auf das Vorhandensein und die Menge der zu untersuchenden Nucleinsäure schließen.
Die große Bedeutung der DNA-Chips für die Gendiagnostik liegt in der Möglichkeit, effizient die Expression oder Fehlexpression sehr vieler Gene gleichzeitig untersuchen zu können oder ein krankheitsverdächtiges Gen in Hinblick auf eine Vielzahl von Mutationen zu analysieren. Nur ein Teil der heute bekannten auf Gendefekten beruhenden Erkrankungen wird durch eine einzige Mutation hervorgerufen. Für die Untersuchung der Genexpression liegt der Vorteil darin, dass eine Zelle oder ein Gewebe in einem einzigen Experiment auf die Expression sämtlicher Gene hin untersucht werden kann.

Klinik

p53 ist ein Gen, das eine entscheidende Rolle in der Kontrolle der Zellproliferation spielt. Es ist das mit Abstand am häufigsten durch Mutation veränderte Gen, das man in Tumoren des Menschen gefunden hat. Man hat an vielen verschiedenen Stellen des Gens Mutationen gefunden, die – jede für sich – zu einer Fehlfunktion des p53-Proteins führen. Wegen der Vielzahl der möglichen Veränderungen und der hohen Anzahl zu testender Gewebe benötigt man ein besonders effizientes Verfahren zum Nachweis von Mutationen. Für die Herstellung des p53-Chips hat man die gesamte, 1262 Basen lange kodierende Sequenz des Gens durch kurze, synthetische Oligonucleotide dargestellt. Dabei wurde nicht nur die normale Sequenz zugrunde gelegt, sondern es wurden sämtliche bekannten und v.a. auch die noch nicht bekannten, aber theoretisch möglichen Mutationen durch entsprechende Oligonucleotide berücksichtigt. Alle Oligonucleotide wurden an definierten Positionen des Chips aufgetragen. Die genomische DNA aus Zellen der zu untersuchenden Person wird nun isoliert, einzelsträngig gemacht, in kurze Stücke zerlegt und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Unter DNA-Hybridisierungsbedingungen binden nur die DNA-Fragmente an die entsprechenden Oligonucleotide, zu denen sie die gleiche DNA-Sequenz aufweisen. Dies ist in einem speziellen Detektor als Fluoreszenzsignal an bestimmten Stellen des Chips erkennbar ist. Enthält die Probanden-DNA eine Mutation im p53-Gen, so bindet das entsprechende DNA-Fragment nicht an das Oligonucleotid mit der Normalsequenz (Wildtypoligonucleotid), sondern an das Mutationsoligonucleotid.

Tumoren weisen je nach Histotyp und Malignitätsstadien ein sehr spezifisches Muster der Genexpression auf, dessen Kenntnis von entscheidender Bedeutung für Diagnostik und Therapie sein kann. Für die Erstellung solcher Genexpressionsprofile eröffnet die DNA-Chip-Technologie eine neue Dimension. Mehrere tausend bis zehntausend verschiedener klonierter cDNA-Moleküle werden auf Chips von der Größe eines Glasobjektträgers aufgetragen. Die gesamte mRNA der Tumorzellen wird in einzelsträngige cDNA umgeschrieben und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Nach der Hybridisierung zeigt ein Fluoreszenzsignal an einer bestimmten Stelle des Chips die Expression des entsprechenden Gens an. Darüber hinaus kann auch die Stärke des Signals etwas über die Expressionsstärke des Gens aussagen.

Genetischer Fingerabdruck

Mini- und Mikrosatelliten-DNA
Mini- und Mikrosatelliten sind Genorte (Loci), an denen kurze, identische Sequenzabschnitte so zusammengefügt sind, dass die Leserichtung der Sequenz immer gleich bleibt. Man bezeichnet sie deshalb auch als direkte oder Tandem-Repeats, im Gegensatz zu Sequenzwiederholungen, bei denen sich die Leserichtung umkehrt (den sog. indirekten Repeats).
Die Sequenzen, die sich in diesen Abschnitten mehrfach wiederholen, sind beliebig. Die Länge der wiederholten Sequenz reicht im Allgemeinen von zwei Nucleotiden bis zu 100. Bis zu 10 Basen lange Repeat-Einheiten bezeichnet man als Mikrosatelliten, 10–100 Basen lange Einheiten als Minisatelliten. Die Anzahl der Wiederholungen variiert von zwei bis drei bis zu mehreren hundert. Ein Mini- oder Mikrosatellit einer ganz bestimmten Sequenz kommt meist nicht nur einmal im Genom vor, sondern mehrfach und an verschiedenen chromosomalen Orten, wobei die Anzahl der Sequenzwiederholungen aber von Genort zu Genort verschieden ist.
Variabilität und Spezifität
Bestimmte Mini- und Mikrosatelliten sind von besonderem Interesse für die Medizin, da die Anzahl ihrer Sequenzwiederholungen, also die Gesamtlänge des Mikrosatelliten, zwischen einzelnen Individuen unterschiedlich ist. Sie werden nach den Mendel-Regeln vererbt; ein Kind hat damit an einem Satellitenlocus auf beiden Chromosomen je einen Repeat mit der Anzahl der Sequenzwiederholungen, die bei seinem Vater bzw. bei seiner Mutter vorkommen.
Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei nicht verwandte Menschen an einem Genort einen bestimmten Mini- oder Mikrosatelliten der gleichen Länge besitzen, ist gering. Betrachtet man die Länge mehrerer verschiedener Loci, so ist die Chance, dass überhaupt zwei Individuen der gesamten Weltbevölkerung das gleiche Muster zeigen, außerhalb sinnvoller Wahrscheinlichkeitsbetrachtungen. Andererseits ist ein ähnliches Muster ein verlässlicher Indikator für einen gewissen Grad genetischer Verwandtschaft. Eineiige Zwillinge haben sogar ein identisches Muster.
Anwendung
Mini- und Mikrosatelliten eignen sich hervorragend zur Individuenerkennung und sind wertvolle diagnostische Hilfsmittel für die Humangenetik und Gerichtsmedizin (Vaterschaftsnachweis, Tätererkennung). Sie sind aufgrund ihres hohen Informationsgehalts den klassischen Individualmerkmalen wie Blutgruppen oder Isoenzymen weit überlegen.
Vom juristischen Standpunkt aus sind Mini- und Mikrosatelliten auch deshalb besonders geeignet, weil sie sich v.a. in den nichtkodierenden Bereichen des menschlichen Genoms, also in Introns und in intergenischen Regionen (Spacer) befinden. Sie enthalten somit keine Informationen über Eigenschaften der Person, ganz im Gegensatz zu den Markern auf Proteinbasis (z.B. Blutgruppen). Paradoxerweise herrscht in der Gesellschaft eine gerade umgekehrte – molekulargenetisch unbegründete – Einschätzung vor, die die Einführung einer sinnvollen forensischen Nutzung der Mini- und Mikrosatellitenanalyse lange Zeit erschwert hat.
Die Analyse von Mini- und Mikrosatelliten erfolgt mittels PCR (Abb. 15.11). Jeder Repeat-Locus wird von nicht wiederholten singulären (Single-copy-)Sequenzen flankiert. Mit PCR-Primern aus diesen flankierenden Sequenzen erhält man Produkte, deren Länge der Anzahl der Sequenzwiederholungen entspricht. Verschieden lange Mini- oder Mikrosatelliten von verschiedenen Personen lassen sich somit einfach anhand der Länge ihrer PCR-Produkte eindeutig erkennen.

MERKE

Die Molekularbiologie lieferte eine Reihe von Methoden zur Diagnostik von Veränderungen in der Struktur und Expression von Genen. Mittels molekularer Hybridisierung werden Veränderungen in der DNA durch Southern-Blot-, Veränderungen in der RNA durch Northern-Blot-Analysen erfasst. Um Punktmutationen zu finden, werden allelspezifische Oligonucleotide als Hybridisierungssonden oder als PCR-Primer eingesetzt. Mit DNA-Chips können Veränderungen der Expression vieler wichtiger Gene eines Zelltyps simultan erfasst oder ein Gen auf eine Vielzahl von möglichen Mutationen untersucht werden. Mikrosatelliten sind nichtkodierende Sequenzen unterschiedlicher Länge im Genom, deren Veränderung bei bestimmten Tumoren in der Onkologie und deren individuenspezifische Muster in der forensischen Medizin diagnostische Bedeutung haben.

Genetisch veränderte Organismen

Gentechnisch modifizierte Organismen (GMOs)

Definitionen
Fremd-DNA, die in eine Zelle eingebracht wird, wird meist nach kurzer Zeit wieder abgebaut. Solche Zellen werden als transient (vorübergehend) transgen bezeichnet. Gelangt die Fremd-DNA in die Nähe der zelleigenen DNA, kann sie in seltenen Fällen sogar in diese eingebaut werden. Sie wird bei der nächsten Replikationsrunde mit dupliziert und an die Tochterzellen weitergegeben. So entsteht eine stabil transgene Zelle. Die eingebaute Fremd-DNA wird auch als Transgen bezeichnet.
Bei vielzelligen Organismen kann die stabile Integration der Fremd-DNA entweder in den normalen Körperzellen (Soma) oder in den Geschlechtszellen (Keimbahn) erfolgen. Beim Gentransfer in die Keimbahn erhalten alle Nachkommen das Transgen. Es handelt sich nun um gentechnisch modifizierte Organismen (GMOs). Durch klassische Züchtung hergestellte Varianten gelten nicht als GMOs.
Auch jede E.-coli- oder Hefezelle, die durch Transformation ein rekombinantes Plasmid erhalten hat, ist bereits ein transgener Organismus oder GMO. Der Begriff transgen weist auf die Anwesenheit der Fremd-DNA hin. Er wird jedoch im allgemeinen Sprachgebrauch hauptsächlich im Zusammenhang mit höheren Organismen verwendet. Da sich durch das Einschleusen von gezielt veränderten Genen die Eigenschaften des transgenen Organismus beeinflussen lassen, haben GMOs eine wichtige Bedeutung in der Landwirtschaft und in der Medizin erlangt.

Schon gewusst

Transgene Nutzpflanzen, die z.B. ein Transgen tragen, das ihnen Resistenz gegen bestimmte Schädlinge oder eine höhere Widerstandskraft gegenüber den Nebenwirkungen von Unkrautvernichtungsmitteln (Herbizide) verleiht, werden weltweit erprobt und kommerziell verwertet. Bereits 1997 wurden in den USA auf 25% der Anbaufläche gentechnisch veränderte Sojabohnen (sog. Gensoja) angepflanzt, die ein fremdes Gen für eine Resistenz gegen Chemikalien tragen, die zur Vernichtung von Unkräutern eingesetzt werden. Aufgrund der Resistenz ist die gentechnisch veränderte Sojapflanze unempfindlich für hohe Dosen des Herbizids.

Sicherheitsbedenken
Insbesondere die GMOs haben zu ethisch oder sicherheitstechnisch begründeten Widerständen gegen die Gentechnologie im Allgemeinen geführt. Während bei medizinisch begründeten Arbeiten die ethischen Bedenken in den Hintergrund treten, werden den Sicherheitsbedenken umfangreiche, staatlich kontrollierte Schutzmaßnahmen und Arbeitsvorschriften gegenübergestellt. Außerdem muss festgestellt werden, dass in über 25 Jahren gentechnologischer Arbeiten bisher kein sicherheitsrelevanter Vorfall bekannt wurde.

MERKE

Organismen, in die ein neues Gen eingeführt oder deren Genbestand auf andere Weise mithilfe rekombinanter DNA-Techniken verändert wurde, bezeichnet man als transgene Organismen oder gentechnisch modifizierte Organismen (GMOs).

Gentechnikgesetz
Gentechnische Arbeiten unterliegen besonderen Sicherheitsvorschriften, die durch das Gentechnikgesetz geregelt werden. Dies betrifft die Herstellung und den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen (GMOs), z.B. die Vermehrung von Bakterien, die ein rekombinantes Plasmid tragen, die Herstellung einer transgenen Maus oder die Gentherapie eines Patienten. Das Ausmaß der zu treffenden Schutzmaßnahmen richtet sich nach dem angenommenen Gefährdungspotenzial des GMO für den Gentechniker selbst, die Bevölkerung und die Umwelt. Gentechnische Arbeiten und die Räume, in denen sie durchgeführt werden, müssen angemeldet und genehmigt werden, und sie unterliegen einer strengen Kontrolle. Rein biochemische Arbeitsschritte, wie das Zusammenligieren zweier DNA-Fragmente oder sämtliche PCR-Techniken, sind keine gentechnischen Arbeiten im Sinne des Gesetzes. Auch die Verwendung gentechnisch hergestellter, rekombinanter Medikamente unterliegt lediglich, genau wie konventionelle Produkte, den Bestimmungen des Arzneimittelgesetzes, was eine breite und unproblematische Anwendung in der Praxis ermöglicht.
Genetische Veränderungen
Prinzipiell stehen drei Möglichkeiten der gentechnischen Modifikation zur Verfügung: der Ersatz eines Gens, die Inaktivierung eines Gens (sog. Gen-Knock-out) und die Addition eines Gens.
Transgene Mäuse
Der Begriff transgene Maus hat sich (nicht ganz korrekt) zur Bezeichnung von Mausstämmen eingebürgert, die ein zusätzliches Gen tragen. Die Mausstämme, bei denen ein Gen inaktiviert wurde, bezeichnet man als Knock-out- oder K.-o.-Mäuse, ist sich aber dabei bewusst, dass beide Gruppen im Sinne der Definition GMOs sind.
Die inzwischen routinemäßige Herstellung transgener Mäuse hat der Medizin eine neue Dimension eröffnet. Zum einen ist der ultimative Funktionstest für ein normales oder bei einem Krankheitsprozess verändertes Gen die Analyse seiner Wirkungen im Kontext des Gesamtorganismus. Zum anderen lassen sich in dem neben dem Menschen am besten untersuchten Wirbeltierorganismus durch das Einführen oder Ausschalten von Genen Tiermodelle für menschliche Krankheiten erzeugen, die bisher nicht zur Verfügung standen.

Einfacher Gentransfer

Mikroinjektion
Für den Gentransfer bei Wirbeltieren wird die Mikroinjektion der Fremd-DNA in den Zellkern oder das Zytoplasma verwendet. Für das relativ einfache Verfahren der Genaddition (Abb. 15.12) wird das Gen in seiner ursprünglichen oder experimentell veränderten Form zunächst in Bakterien vermehrt, gereinigt und von Vektorsequenzen befreit. Für die Herstellung transgener Mäuse werden von gerade begatteten Weibchen durch Ausspülen des Eileiters die befruchteten Eizellen entnommen, bei denen es noch nicht zur Verschmelzung der Kerne von Ei- und Samenzelle gekommen ist. Mit einer äußerst feinen Glasnadel wird die DNA-Lösung in den väterlichen Vorkern (Pronucleus) injiziert. Die so behandelten Eizellen werden dann in Ammenmütter übertragen.
Integration und Transmission
Die Integration des Transgens ist ein zufälliges Ereignis. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein injiziertes DNA-Molekül in das Mausgenom eingebaut wird, ist extrem gering und sicher eher ein Unfall bei den DNA-Reparatur- und Replikationsprozessen in der frühen Embryonalentwicklung. Da jedoch Tausende von Genkopien injiziert wurden, wird die Chance für den Unfall stark erhöht. Auch der Integrationsort ist zufällig und nicht vorhersehbar.
Nach der Geburt werden die Mäuse mittels PCR oder durch Southern-Blot-Analyse auf die Anwesenheit des Transgens untersucht. Der Anteil der Tiere, die die fremde DNA in ihre Chromosomen integriert haben, variiert zwischen einigen wenigen bis zu 30%.
Die positiven Tiere werden für die Weiterzucht verwendet und bei Bedarf rein züchtende (homozygote) Linien für das Transgen hergestellt.
Nach ähnlichen Verfahren ist es heutzutage möglich, transgene Varianten von den meisten wichtigen Labororganismen für die biomedizinische Forschung und von vielen Nutztieren herzustellen. Es existieren transgene Stämme von Fischen, Laborratten, Schweinen, Schafen und vielen anderen Tieren.

MERKE

Das Einschleusen fremder Gene bei der Labormaus erfolgt durch Mikroinjektion in Zellkerne frühester Embryonalstadien.

Blick ins Labor

Ein großer gesellschaftlicher Streit wurde um die Patentierbarkeit von GMOs ausgetragen. 1991 erhielt die Harvard-Universität aber dann auch von dem Europäischen Patentamt das Patent auf die Onco-Maus. Dabei handelt es sich um verschiedene transgene Mäusestämme, die in ihrem Genom zusätzliche Gene tragen, die so konstruiert wurden, dass die Mäuse – spezifisch für das entsprechende Transgen – zu einem bestimmten Lebensalter Hauttumoren, B-Zell-Tumoren oder Mammatumoren, entwickeln. Diese Mäuse sind wertvolle Modelle für die Erforschung von Ursachen und Therapien der Krebserkrankungen. Die Tiere reagieren auch besonders empfindlich auf krebserregende Stoffe. Die Tumoren treten dann zu einem erheblich früheren Zeitpunkt und mit höherer Häufigkeit auf. Deshalb sind sie auch sensitive Testsysteme für die Gefährlichkeit von Substanzen.

Klinik

Die Chorea Huntington ist eine Erbkrankheit des Menschen, die bei den Betroffenen zu regellosen, plötzlich einschießenden, unwillkürlichen und häufig asymmetrischen Bewegungen (Veitstanz) durch eine zentralnervöse Schädigung führt. Diese Symptome sind von einer progressiven Demenz begleitet. Die Erkrankung beruht auf einer Vermehrung eines Basentripletts (CAG) im translatierten Bereich des HD-Gens (HD von Huntington disease). Das Basentriplett kodiert für die Aminosäure Glutaminsäure. Wenn der durch die Triplettvermehrung bedingte Polyglutaminsäureabschnitt im Protein eine bestimmte Länge überschreitet, wird das Protein funktionsunfähig, und die betroffene Person erkrankt.

Chorea Huntington ist als Erkrankung bisher nur beim Menschen bekannt. Im HD-Gen der Maus findet keine Triplettvermehrung statt. Durch Einschleusen des menschlichen HD-Gens mit der Triplettvermehrung erhielt man einen Mausstamm, der die Symptome der Chorea Huntington zeigt und damit zum ersten Mal ein tierexperimentelles System für die medizinische Forschung über diese schwere Erkrankung bietet.

Knock-out-Mäuse

Genaustausch
Homologe Rekombination
Um Gene gegen mutierte Versionen austauschen zu können, macht man sich einen natürlichen biochemischen Prozess zunutze, den wir bereits bei der DNA-Reparatur kennengelernt haben und der Grundlage des Crossing-over in der Meiose ist, nämlich die homologe Rekombination. Wenn zwei DNA-Stränge über einen Bereich von ca. 1–2 kb sequenzidentisch (homolog) sind, kann es zu einem Aufbrechen und anschließenden wechselseitigen Verschmelzen der beiden DNA-Moleküle kommen. Sind zwei solcher homologer Bereiche durch einen Sequenzabschnitt getrennt, der nicht länger als einige hundert bis tausend Basen ist, wird dieses nichthomologe Zwischenstück zusammen mit den sequenzidentischen Bereichen in ein anderes DNA-Molekül eingebaut (Abb. 15.13).
Selektion in vitro
Der Vorgang, dass Fremd-DNA über homologe Rekombination aufgenommen wird, ist jedoch extrem selten. Er passiert mit einer Häufigkeit von 0,1–1% im Vergleich zur sequenzunabhängigen, zufälligen Integration von Fremd-DNA (oben), die wiederum selbst schon ein extrem seltenes Ereignis ist. Es bedarf deshalb komplizierter Selektionssysteme, deren Anwendung nur in Zellkultur möglich ist. Das nichthomologe Zwischenstück kann z.B. ein Gen für eine Zytostatikaresistenz enthalten. Nach der Selektion aller Zellen, die die Fremd-DNA integriert haben, können mittels spezifischer PCR (ein Primer passt zum nichthomologen Zwischenstück, der andere bindet außerhalb des homologen Abschnitts in der Ziel-DNA) diejenigen herausgesucht werden, bei denen tatsächlich die homologe Rekombination stattgefunden hat.

MERKE

Der Austausch eines Gens gegen eine gentechnisch veränderte Kopie erfolgt durch homologe Rekombination und ist ein extrem seltenes Ereignis.

Embryonale Stammzellen
Will man den Effekt des Genaustauschs in einem gesamten Organismus untersuchen, muss an diese Zellkulturen eine ganz besondere Anforderung gestellt werden: Es muss möglich sein, aus den gentechnisch veränderten Zellen einen kompletten Organismus zu regenerieren. Diese Eigenschaft weisen die embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) auf. Nimmt man einige Zellen aus dem frühen Embryonalstadium der Blastozyste in einem speziellen Nährmedium in Kultur, so vermehren sie sich über viele Generationen, ohne wie die im Embryo verbliebenen Geschwisterzellen in ihrer normalen Entwicklung voranzuschreiten und sich zu den verschiedenen Zelltypen zu differenzieren, die den Embryo oder den erwachsenen Organismus ausmachen. Sie behalten jedoch die Potenz dazu.
Retransplantiert man die in vitro kultivierten ES-Zellen in eine Empfängerblastozyste, nehmen sie wieder ihre normale Entwicklung auf und beteiligen sich an der Organbildung. Dabei entsteht eine Chimäre, ein Organismus, der z.T. aus den Zellen des Empfängerembryos besteht und z.T. aus den differenzierten ES-Zellen. Wenn solche ES-Zellen in die Keimbahn des Empfängers gelangen, können Ei- oder Spermienzellen aus ihnen werden. Auf diese Weise werden in der nächsten Generation Mäuse erhalten, deren eine parentale Hälfte des Genoms der der ES-Zellen entspricht.
Knock-out-Mäuse
Wurden die ES-Zellen genetisch verändert, z.B. durch Austausch eines Gens gegen dessen mutierte Version, so sind diese Mäuse heterozygot für das neue Gen. Durch weitere Kreuzungen erhält man dann Tiere, bei denen beide Kopien des Gens mutiert sind (Abb. 15.14). Wurde die Mutation so gesetzt, dass kein funktionelles Genprodukt mehr hergestellt wird, lässt sich in den sog. K.-o.-Mäusen der Effekt des Fehlens eines Gens studieren. Daraus können dann Rückschlüsse auf die eigentliche Funktion des Gens gezogen werden.

MERKE

Gentechnisch veränderte Organismen entstehen durch Addition, Austausch oder Inaktivierung eines Gens. Bei der Maus können durch Mikroinjektion von klonierter DNA in den väterlichen Vorkern zusätzliche Gene eingeführt werden, die stabil in das Genom integriert werden. Der Genaustausch oder Knock-out erfolgt in vitro in embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination. Nach Rücktransplantation der genetisch veränderten Zellen in Empfängerembryonen entwickeln sich Chimären. Gelangen die manipulierten Stammzellen in die Keimbahn, können in den nächsten Generationen Tiere erhalten werden, die homozygot für die genetische Veränderung sind. Durch Genaddition und Gen-Knock-out lässt sich die Funktion medizinisch relevanter Gene aufklären, und es wurden wertvolle Krankheitsmodelle erhalten.

Gentechnische Medikamente

Bedeutung rekombinanter Proteine

Übersicht
Biotechnologie
Die Fortschritte der rekombinanten DNA-Technologie ermöglichen neue, effizientere Verfahren und neue Produkte für die Diagnose und Therapie von Krankheiten. Das entsprechende Arbeitsfeld ist eine Teildisziplin der Biotechnologie. Vielfach werden die Begriffe Gentechnologie und Biotechnologie synonym verwendet. Unter Biotechnologie versteht man jedoch ganz allgemein die Herstellung oder Veränderung von chemischen oder biochemischen Molekülen oder biologischen Produkten mithilfe lebender Organismen oder von Teilen von Organismen im Rahmen industrieller Prozesse. Dazu gehören auch in der Menschheitsgeschichte uralte Verfahren wie die alkoholische Gärung zur Herstellung von Bier und Wein (die auch heute noch 75% des Umsatzes der Biotechnologie ausmachen). Klassische medizinische Produkte der Biotechnologie sind Antibiotika (z.B. Penicillin und Cephalosporine) aus der großtechnischen Anzucht von Mikroorganismen, Impfstoffe zur aktiven und passiven Immunisierung sowie monoklonale Antikörper.
Gentechnische Arzneimittel
Der revolutionäre Beitrag der Gentechnologie zur Biotechnologie besteht nicht nur in der gezielten Verbesserung der Produktionssysteme (Mikroorganismen, Zellkulturen). Für die Medizin ist v.a. bedeutsam, dass es möglich ist, Proteine, die gar nicht oder nur in geringen Mengen zur Verfügung standen, therapeutisch nutzbar zu machen und darüber hinaus natürliche Proteine in subtiler und beabsichtigter Weise zu verändern, um sie pharmakologisch zu verbessern. Die Gentechnologie ist längst nicht mehr auf die natürlich vorkommenden Gensequenzen angewiesen. Durch DNA-Synthese lässt sich in vitro jede beliebige Nucleotidsequenz herstellen. Methoden der Molekularbiologie erlauben durch Restriktionsverdau und Religation die Deletion, Insertion und Neukombination von Gensegmenten. Durch In-vitro-Mutagenese lassen sich einzelne Basen gezielt austauschen. So können die Eigenschaften von Proteinen verbessert oder sogar Proteine mit völlig neuen Eigenschaften konstruiert werden (Proteindesign).
Seit 1982, als mit dem Humaninsulin das erste rekombinante Medikament in den USA auf den Markt kam, haben diese Produkte ständig an Bedeutung gewonnen und sind aus der medizinischen Praxis nicht mehr wegzudenken. Eine Auswahl heute gebräuchlicher Arzneimittel zeigt Tab. 15.2.
Vorteile gentechnischer Medikamente
Die Bedeutung gentechnischer Arzneimittel soll an einigen Beispielen erläutert werden.
Sicherheit
Somatotropin (Wachstumshormon) ist ein Protein, das während der Wachstumsphase von der Hypophyse sezerniert wird und in den Erfolgsorganen Zellwachstum und Zellvermehrung bewirkt. Kinder mit einem angeborenen Defizit an Wachstumshormon erreichen niemals eine normale Körpergröße. Durch regelmäßige Injektionen des Proteins kann bei diesen Kindern das Wachstum stimuliert und der sog. hypophysäre Kleinwuchs verhindert werden. Allerdings hat nur das menschliche Somatotropin diese Wirkung, tierisches Hormon ist unwirksam. Früher musste das Hormon aus den Hypophysen Verstorbener isoliert werden. Es stand deshalb nur in geringen Mengen zur Verfügung und war wegen des aufwändigen Herstellungsverfahrens fast unerschwinglich. Darüber hinaus war mit der Gewinnung des Proteins ein unüberwindbares Problem verknüpft. Aus einer einzelnen Hypophyse lässt sich mit biochemischen Methoden wegen der geringen Menge an Somatotropin kein Hormon isolieren. Es müssen erst Hunderte von Hypophysen gesammelt und vereinigt werden, bevor mit dem Gesamthomogenat ein Extraktionsprozess gestartet werden kann. Ist nur eine einzige Hypophyse mit einem Krankheitserreger (z.B. Creutzfeldt-Jakob-Krankheit) kontaminiert, gelangt die Infektion in die gesamte Produktion. Auf diese Weise wurden zahlreiche behandelte Kinder mit einem tödlichen Erreger infiziert.
Ein ähnliches Problem gab es bei der Behandlung der Bluterkrankheit (Hämophilie). Weil ein Protein der Blutgerinnungskaskade fehlt, kommt es bei Verletzungen nicht zur Gerinnung, und die erkrankten Personen verbluten. Die Substitution des Gerinnungsfaktors, bei dem es sich meist um den Faktor VIII handelt ( Hämophilie A), ermöglicht solchen Patienten ein fast normales Leben. Bei der Gewinnung von Faktor VIII wurden bisher Blutkonserven verwendet, bei denen es vorkommen konnte, dass darunter auch Blut von nicht diagnostizierten HIV-Infizierten war. Auf diese Art wurden viele Bluter durch die Therapie ihrer Gerinnungsstörung zu AIDS-Patienten.
Verfügbarkeit
Viele pharmakologisch aktive Proteine sind artspezifisch, d.h., nur das menschliche Protein ist beim Menschen wirksam. Das entsprechende Protein aus Tieren hat keine oder nur eingeschränkte Wirkung. Außerdem werden artfremde Proteine in vielen Fällen als Antigene erkannt und können bei wiederholter Anwendung zu Komplikationen führen.
Durch gezielte Veränderung der Aminosäuresequenz können sogar Proteine hergestellt werden, die eine bessere Wirksamkeit als das natürliche Protein zeigen.

Klinik

Interferone sind äußerst wirksame antivirale und immunstimulatorische Proteine aus der Klasse der Zytokine. Sie wirken ausschließlich artspezifisch und kommen im Blut in so geringen Mengen vor, dass an eine pharmakologische Anwendung vor der Gentechnikära nicht zu denken war. Durch gentechnische Produktion stehen diese Substanzen in ausreichender Menge zur Verfügung.

Auch für den Fall, dass tierische Proteine wirksam sind, z.B. das Schweineinsulin zur Behandlung des Diabetes mellitus, bietet das rekombinante Produkt Vorteile. Die einzige Aminosäure, in der sich das Insulin von Schwein und Mensch unterscheidet, reicht aus, um bei Patienten eine Immunreaktion gegen das tierische Protein auszulösen. Das gentechnisch hergestellte Humaninsulin ist natürlich nicht immunogen.

Insulin bildet in neutraler Lösung, in der es injiziert wird, Aggregate (Hexamere). Nach der Injektion dissoziieren die Hexamere in der Subkutis zunächst in Dimere und nur langsam in Monomere. Daraus ergibt sich die bekannte Verzögerung der Resorption und des Wirkungseintritts bei der Insulintherapie. Durch Austausch zweier Aminosäuren in der -Kette wurde ein Insulin erzeugt, das nach der Injektion rascher dissoziiert und eine schnellere Resorption ergibt. Damit stehen Diabetespatienten zusätzlich kurzwirksame Insuline mit schnellem Wirkungseintritt zur Verfügung, die keine langen Zeitabstände zwischen dem Insulinspritzen und dem Essen mehr erfordern.

Nebenwirkungen
Neben den offensichtlichen Vorteilen gentechnischer Pharmaka wird immer wieder die Frage nach möglichen Nachteilen gestellt. Nach den über zehnjährigen praktischen Erfahrungen gibt es keine Hinweise auf unerwartete oder unerwünschte Nebenwirkungen, die mit der rekombinanten Natur oder den Herstellungsverfahren dieser Medikamente in Zusammenhang gebracht werden können.

Produktion rekombinanter Proteine

Die gentechnologische Herstellung von Proteinen ist nur deshalb möglich, weil der genetische Code in allen Lebensformen der gleiche ist. Die wenigen bekannten Ausnahmen von dieser Regel betreffen Vorgänge oder Organismen, die gentechnologisch keine Rolle spielen. Auch die Transkription und Translation laufen selbst in so unterschiedlichen Spezies wie dem Darmbakterium E. coli und dem Menschen vom Prinzip her gleich ab. Somit ist gewährleistet, dass eine humane DNA-Sequenz nach Gentransfer auf E. coli in die gleiche Aminosäuresequenz übersetzt wird wie in einer menschlichen Zelle. Im Detail gibt es aber wichtige Unterschiede, die beachtet werden müssen. Sie betreffen v.a. die Genexpressionskontrolle, die Prozessierung der mRNA, die posttranslationalen Modifikationen und die Zielsteuerung innerhalb der intrazellulären Kompartimente sowie die Sekretion der Proteine (Abb. 15.15).
Promotoren
Damit ein Gen nach Transfer in einen anderen Organismus oder eine fremde Zelle transkribiert werden kann, muss es an seinem 5'-Ende einen Promotor besitzen. Wegen der großen Unterschiede in der Transkriptionskontrolle zwischen Pro- und Eukaryonten, aber auch innerhalb dieser Gruppen muss man Promotoren verwenden, die aus dem jeweiligen Wirtsorganismus stammen. Für die Expression eines humanen Proteins in E. coli benutzt man deshalb einen bakteriellen Promotor, für die Expression in Hefe einen Hefepromotor. Bei höheren Organismen spielt die Zelltypspezifität der Promotoren eine Rolle. Soll z.B. ein Protein aus neuronalen Zellen in einer Fibroblastenzellkultur exprimiert werden, muss der Promotor des Transgens zumindest fibroblastenspezifische Enhancer-Elemente enthalten.
Introns
Die Gene von Prokaryonten haben keine Introns. Deshalb fehlt den Bakterienzellen die Maschinerie, um Introns aus einem mRNA-Vorläufermolekül herauszuschneiden. Das Problem umgeht man am einfachsten, indem man einen cDNA-Klon verwendet, der ja bereits der fertig gespleißten mRNA entspricht. Andererseits hat es sich als günstig erwiesen, für die Expression in Zellen höherer Organismen zumindest ein Intron im Transgen zu belassen (sog. Mini-Gen).
Aminoterminales Formylmethionin
Bakterien verwenden als Initiatoraminosäure die modifizierte Aminosäure Formylmethionin. Da diese Veränderung für die Funktion und Immunogenität der meisten rekombinanten Proteine ohne Bedeutung ist, wird diesem Unterschied meist keine Beachtung geschenkt. Ist das Formylmethionin aus bestimmten Gründen unerwünscht, muss es enzymatisch oder chemisch aus dem fertigen Produkt entfernt werden.
Prä- und Propeptide
Eine Reihe von Enzymen und Hormonen enthält nach der Translation noch Bereiche, die im reifen, funktionsfähigen Protein nicht mehr enthalten sind. Sekretierte Proteine besitzen Signalsequenzen (Präpeptide), die für die Translokation in das endoplasmatische Retikulum benötigt werden. Auch Bereiche der Polypeptidkette, die für die korrekte Faltung notwendig sind oder die das Protein im Zustand einer inaktiven Vorstufe halten (Propeptide), sind in den biologisch aktiven Endprodukten nicht mehr vorhanden. Sie werden durch spezifische Proteasen entfernt. Um solche Proteine in Bakterien exprimieren zu können, müssen die für die Propeptide kodierenden DNA-Sequenzen aus dem Gen bzw. der cDNA entfernt werden.
Sekretion
Das Proteinsekretionssystem von E. coli unterscheidet sich grundsätzlich von dem eukaryontischer Zellen. Die Signalsequenz eines menschlichen Proteins wäre deshalb unwirksam. Man behilft sich damit, dass man die DNA-Sequenz, die für das eukaryontische Signalpeptid kodiert, durch eine entsprechende bakterielle Signalsequenz ersetzt. Oft fusioniert man sogar das zu exprimierende Gen mit einem großen Teil eines bakteriellen Proteins, das sezerniert wird. Dies garantiert ein effizientes Ausschleusen des gentechnologischen Proteins aus den Bakterienzellen. Das gewünschte Produkt muss dann allerdings noch enzymatisch oder chemisch abgespalten werden.
Warum ist die Sekretion eines rekombinanten Proteins wünschenswert? Dies hat allein technische Gründe. Werden die Proteine in das Bakterienwachstumsmedium abgegeben, lassen sie sich viel leichter aufreinigen. Auch die von einer bestimmten Bakterienmenge produzierte Masse von Fremdprotein ist erheblich größer (bis zu 1 g/L Medium), als wenn das Protein in den Zellen verbleibt.
Proteinfaltung
Nur wenn ein Protein seine korrekte dreidimensionale Struktur einnimmt, kann es seine Funktion ausüben. Auch viele physikochemische Eigenschaften, insbesondere die Löslichkeit im hydrophilen Zytoplasma oder in extrazellulären Flüssigkeiten, hängen wesentlich von der räumlichen Struktur ab. In vielen Fällen findet bei der Expression von Fremdproteinen in Bakterien keine korrekte Faltung statt. Insbesondere die Ausbildung der strukturstabilisierenden Disulfidbrücken ist oft falsch. Missgefaltete Proteine sind unlöslich, sie fallen im Zytoplasma der Bakterien aus und werden als parakristalline Präzipitate (sog. Einschlusskörper) sichtbar. Diese Einschlusskörper werden aufgereinigt und die enthaltenen Proteinmoleküle durch chemische Behandlung aufgelöst. Dabei werden die missgefalteten Proteine vollkommen zur linearen Polypeptidkette entfaltet. Die Proteinlösung wird dann über viele Tage hinweg unter geeigneten Ionen- und Temperaturbedingungen inkubiert, wobei sich ein Teil der Proteinketten spontan in die richtige Struktur faltet. Das Problem der Faltung – ein großes Hindernis in der Entwicklung vieler wichtiger gentechnischer Produkte – ist deshalb so schwierig zu lösen, weil wir die biochemischen und physikochemischen Vorgänge der natürlichen Faltungsprozesse in der Zelle bislang nur wenig verstanden haben.
Posttranslationale Modifikation
Eine Reihe von Proteinen muss für ihre volle Wirksamkeit durch Glykosylierung, das Anhängen lipophiler Moleküle (z.B. Isoprenylierung), durch Phosphorylierung und vieles mehr in ihre funktionsfähige Form überführt werden. In der Fähigkeit zur posttranslationalen Modifikation unterscheiden sich die Organismen und Zellsysteme, die für biotechnologische Produktionsverfahren nutzbar sind, grundsätzlich. E. coli führt keine der säugerzelltypischen Modifikationen durch. Auch der Eukaryont Hefe oder Insektenzellkulturen, die sehr effiziente Produktionssysteme für Fremdproteine bieten, sind in vielen Fällen nicht einsetzbar; sie nehmen nur die wirtszelltypische Modifikationen vor, die aber nicht immer ausreichend für ein biologisch aktives Protein sind. Aus diesem Grund müssen wichtige gentechnische Arzneimittel, wie der Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA, von tissue plasminogen activator) zur Behandlung von Herzinfarktpatienten oder der Faktor VIII für Bluterpatienten, in Säugerzellkulturen produziert werden. Diese Zellkulturen sind allerdings sehr aufwändig in der Handhabung und wegen der benötigten Kulturmedien teuer.

MERKE

Wegen der Universalität des genetischen Codes können menschliche Proteine von Zellen anderer Organismen und sogar von Bakterienzellen produziert werden. Bei funktionswichtigen posttranslationalen Modifikationen müssen aber Säugerzellen verwendet werden.

Pharming
Unter Pharming versteht man den Einsatz landwirtschaftlicher Nutztiere, die nach Modifikation ihres Genoms ein gentechnisches Produkt liefern. Diese Tiere produzieren normalerweise große Mengen eines oder weniger Proteine, was sie für die Landwirtschaft interessant macht. Beispielsweise besteht Schafwolle vornehmlich aus Keratin, die vom Seidenspinner produzierten Kokons aus Seidenfibroin, das Eiweiß des Hühnereis aus Albumin und die Milch von Kühen, Ziegen und Schafen aus Milcheiweißen. Transferiert man das Gen für ein gentechnisch interessantes Protein unter der Kontrolle eines entsprechenden Promotors in solche Tiere, so produzieren sie neben den natürlichen Produkten große Mengen des rekombinanten Proteins, das biologisch aktiv und mit den korrekten Modifikationen in leicht aufreinigbarer Form hergestellt wird. Im Gegensatz zu Zellkulturen ist das Pharming besonders kostengünstig.

Blick ins Labor

Das bekannteste Beispiel für Pharming ist das Schaf Tracy, das mit der Milch ein menschliches Protein in einer Konzentration von ca. 35 g/L produziert. Das hier verwendete Transgen besteht aus dem milchdrüsenspezifischen -Lactoglobulin-Promotor des Schafs und dem menschlichen 1-Antitrypsin-Gen. Patienten mit einem Defekt in diesem Gen entwickeln schwere Lungenfunktionsstörungen mit chronischen Lungenschäden. Die Symptome dieser Erkrankung können durch Gabe des Proteins (ähnlich der Insulinzufuhr bei Diabetes) gelindert werden. Andere Entwicklungen zielen darauf ab, z.B. menschliches Hämoglobin in Schweineblut herzustellen. Des Weiteren gibt es die Möglichkeit, Pflanzen so zu verändern, dass sie Proteine produzieren, die z.B. als Impfstoffe verwendet werden können.

MERKE

Durch die Kombination biotechnologischer Produktionsverfahren und gentechnisch veränderter Organismen ist es möglich, eine Reihe von Proteinen für therapeutische Zwecke zu nutzen, die nach herkömmlichen Verfahren nicht in ausreichender Menge oder nur mit einem hohen Kontaminationsrisiko zu gewinnen sind. Rekombinante Proteine werden meist in Bakterien, Hefen oder Säugerzellkulturen hergestellt. Die Expression erfolgt unter der Kontrolle wirtszelltypspezifischer Promotoren. Einige Proteine müssen die korrekten posttranslationalen Modifikationen aufweisen, um biologisch aktiv zu sein. Dies erfordert die Auswahl geeigneter Expressionssysteme. Durch den Einsatz gentechnisch veränderter Nutztiere können große Mengen von rekombinanten Proteinen in aktiver Form hergestellt werden.

Gentherapie

Gentherapeutische Verfahren

Formen der Gentherapie
Die Gentherapie ist ein neuartiger Ansatz zur Behandlung von genetischen Defekten aufgrund einer Erbkrankheit oder zur Therapie chronischer Krankheiten, z.B. Krebs oder chronische Infektionserkrankungen. Man unterscheidet:
  • Keimbahntherapie: Durch Einschleusen von DNA in embryonale Zellen eines frühen Entwicklungsstadiums entsteht ein stabil transgener Organismus. Die genetische Veränderung wird vererbt. Eingriffe, die zu einer Veränderung der Keimbahnzellen eines Menschen führen, werden aus ethischen Gründen abgelehnt, sind in der Praxis kaum durchführbar und darüber hinaus in Deutschland gesetzlich verboten.

  • Somatische Gentherapie: Die DNA wird in bestimmte Körperzellen eingebracht. Mit der somatischen Gentherapie kann ausschließlich das erkrankte Individuum behandelt werden, das eingeschleuste Genmaterial wird nicht an die Nachkommen weitergegeben. Wenn man in der Medizin heute von Gentherapie spricht, bezieht man sich grundsätzlich fast immer auf die somatische Therapie.

Genetische Veränderung ex vivo
Der Gentransfer in die Somazellen kann auf zwei Wegen erfolgen. Wenn Zellen aus dem Körper entnommen werden und für einen gewissen Zeitraum in einem Kulturmedium gezüchtet werden können, bieten sich eine Reihe von standardisierten Methoden an, die Fremd-DNA in die Zellen zu bringen. Dieses Verfahren bezeichnet man als Ex-vivo-Gentransfer. Zum einen nehmen Zellen in der Kultur reine DNA aus dem Zellmedium auf, insbesondere wenn sie in kleinen Kristallen zusammen mit Calciumphosphat angeboten wird. Zum anderen können Zellen, die in einer DNA-Lösung schwimmen, durch Anlegen eines starken elektrischen Feldes an die Suspension dazu gebracht werden, die DNA aufzunehmen (Elektroporation). Schließlich kann DNA mithilfe von Liposomen transferiert werden. Dies sind meist positiv geladene künstliche Lipidmembranvesikel, die die DNA umhüllen. Treffen Liposomen auf die negativ geladenen Zellmembranen, so verschmelzen sie mit diesen und entlassen ihren Inhalt in die Zelle. Auch stehen verlässliche molekularbiologische Tests zur Verfügung, um zu gewährleisten, dass das Transgen stabil in das Genom der Empfängerzellen integriert wurde und die gewünschte Funktion korrekt ausführt, z.B. die Expression des Proteins, das aufgrund des genetischen Defekts von den Empfängerzellen nicht produziert werden kann.
Genetische Veränderung in vivo
Nur wenige Zelltypen lassen sich ex vivo genetisch manipulieren. Die meisten Zellen des kindlichen und erwachsenen menschlichen Organismus lassen sich nicht in vitro kultivieren. Bedeutsam ist der Gentransfer in Zellkultur deshalb nur für die teilungsfähigen Zellen des Bluts und für Zellen aus Tumoren.
Um DNA in die Zellen im Patienten einzubringen (In-vivo-Gentransfer), benötigt man geeignete Vektoren. Grundsätzlich werden virale und nichtvirale Vektoren unterschieden. Zu den gebräuchlichsten Vektoren gehören Retroviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren sowie Herpesviren. Die Vektor-DNA wurde gentechnologisch verändert, indem ein Teil der Virus-DNA entfernt wurde, um so für die zu transferierende therapeutische DNA Platz zu schaffen. Dabei hat man v.a. die Gene entfernt, die für die Virusvermehrung essenziell sind. Dadurch wird sichergestellt, dass die Viren sich im Patienten nicht mehr wie bei einer normalen Infektion vermehren können. Weitere Manipulationen des Vektors haben zum Ziel, die Infektiosität zu erhöhen und die Immunogenität zu verringern.
  • Retroviren: Sie infizieren nur sich teilende Zellen. Danach integrieren sie in das Wirtsgenom. Dadurch wird eine andauernde Expression des Transgens garantiert. Nachteilig ist noch die geringe Effizienz der Infektion. Retrovirale Vektoren führen zu einer irreversiblen genetischen Veränderung der Zellen des Patienten, und sie leiten sich von einer Gruppe von Viren ab, die u.a. Tumoren induzieren können und zu denen auch das AIDS-auslösende HIV gehört.

  • Herpesviren (z.B. Epstein-Barr-Virus): Sie haben ein großes zirkuläres Genom (ca. 170 kb), das in mehreren Kopien als eigenständiges Minichromosom (Episom) im Kern der infizierten Zelle vorliegt und sich eigenständig vermehrt. So bleiben sie über viele Zellzyklen in den Wirtszellen präsent. Probleme bestehen noch in der Herstellung der nichtpathogenen, ungefährlichen Viren.

  • Adenovirale Vektoren: Ihr Vorteil ist, dass sie auch sich nicht teilende (sog. postmitotische) Zellen infizieren können, z.B. die Zellen des Nervensystems. Nachteilig ist, dass sie nicht in das Genom integrieren. Sie gehen deshalb rasch verloren und ermöglichen damit nur eine transiente Expression der Fremd-DNA. Außerdem zeigen sie eine relativ hohe Immunogenität.

  • Nichtvirale Vektoren: Hierzu gehören v.a. die Liposomen. Dies sind Partikel mit einer Lipidhülle unterschiedlicher Zusammensetzung. In diese Hülle, die mit der Zielzellmembran verschmelzen kann, wird die DNA eingeschlossen. Nach Fusion mit der Zelle gelangt der Inhalt des Liposoms in das Zytoplasma.

Auch die Injektion von reiner DNA kann zur Expression führen. Insbesondere Muskelzellen zeichnen sich durch eine effiziente Expression nach diesen einfachen Transferverfahren aus.
RNA-Interferenz
Unter RNA-Interferenz versteht man den Prozess, bei dem durch kurze, doppelsträngige, endogene oder von außen in eine eukaryontische Zelle eingebrachte RNA-Moleküle ein RNA-Molekül, das die gleiche Sequenz enthält, abgebaut wird.
Künstliche RNA-Interferenz
siRNA
Durch Prozessierung langer doppelsträngiger RNA-Moleküle (z.B. in der Form von sog. Haarnadelschleifen) durch das Enzym Dicer, eine Nuclease aus der RNase-III-Familie, entstehen kurze, 21–23 Nucleotide lange, doppelsträngige RNA-Moleküle (short interfering RNA, siRNA). Diese werden in die Zelle eingebracht und dort durch eine Helicase entwunden. Die Einzelstrangmoleküle binden an einen Proteinkomplex in Zellen höherer Organismen, der als RISC (RNA-induced silencing complex) bezeichnet wird. Mit dem Einbau der siRNA erhält RISC die Spezifität, eine zelleigene RNA zu binden, die die komplementäre Sequenz enthält. Der Ribonucleinproteinkomplex zerschneidet die Zielsequenz in der Mitte des Hybridmoleküls (Abb. 15.16).
Anwendung
RNA-Interferenz ist eine vielversprechende Methode zur Ausschaltung krankheitsrelevanter Gene. Interferierende RNA-Moleküle (RNAi) lassen sich nach bestimmten Regeln für viele Gene vorhersagen. Sie werden dann entweder direkt synthetisch hergestellt und mit verschiedenen Methoden in die Zellen eingebracht, oder es werden DNA-Konstrukte verwendet, von denen die entsprechenden Vorläufermoleküle abgelesen werden. Letztere werden dann von der zelleigenen Dicer-RNase prozessiert.
Natürliche RNA-Interferenz
miRNA
Als Mikro-RNA (miRNA) werden regulatorische RNA-Moleküle bezeichnet, die ebenfalls durch das Enzym Dicer aus ca. 70 Nuleotiden langen Transkripten generiert werden, die Haarnadelstrukturen bilden. Sie werden aus der genomischen DNA von Pflanzen und Tieren in der Form eines längeren Precursor-Moleküls abgelesen. Man hat bisher Hunderte dieser miRNA-Moleküle gefunden. Sie dienen offensichtlich der Genkontrolle als negative Regulatoren der Expression von Genen in der Embryonalentwicklung und bei der Kontrolle des Zellzyklus und des Zellstoffwechsels. Auch die miRNA-Moleküle werden von RISC gebunden. Im Gegensatz zu den siRNA-Molekülen sind sie jedoch nicht über die ganze Länge zur Zielsequenz einer mRNA komplementär; sie bilden in der Mitte des Doppelstrangs eine Beule, wo sonst im RISC die doppelsträngige RNA zerschnitten wird. Der Mechanismus der miRNA-Interferenz ist die Inhibierung der Translation der Ziel-RNA (Abb. 15.16).

Anwendungen der Gentherapie

Die Gentherapie befindet sich ungeachtet der großen Bedeutung, die ihr weltweit beigemessen wird, derzeit noch in der Experimentierphase und der klinischen Erprobung. Die eine Zielgruppe von Erkrankungen sind solche, bei denen es aufgrund eines genetischen Defekts, z.B. durch Ausfall eines Enzyms, zu schweren Stoffwechselstörungen kommt. Dabei handelt es sich meist um die klassischen monogenen Erbkrankheiten. Durch den Gentransfer soll eine nicht defekte Kopie des betroffenen Gens eingeführt werden, von der dann das betroffene Genprodukt in ausreichender Menge und mit voller Funktion hergestellt wird. Einer der besonders erfolgreichen Therapieversuche ist unten beschrieben (Klinik-Kasten). Ein anderes großes Feld sind Tumorerkrankungen. Aufgrund des hohen Aufwands und noch vieler ungelöster praktischer Probleme ist dieses besonders vielversprechende Gebiet der Medizin bisher nur langsam vorangekommen.
Gensubstitutionstherapie
Tab. 15.3 gibt eine Zusammenstellung von häufigen Erbkrankheiten, die für eine Gensubstitutionstherapie in Frage kommen. Voraussetzung ist, dass das krankheitsverursachende Gen in der Wildtypversion kloniert zur Verfügung steht und die biochemischen Prozesse, die zum Krankheitsbild führen, genau verstanden sind.

Klinik

Ashanti De Silva litt seit ihrer Geburt an einer seltenen, meist aber tödlich verlaufenden Krankheit, dem sog. schweren kombinierten Immundefekt (SCID, severe combined immunodeficiency). Sie hatte von beiden Eltern eine fehlerhafte Version des Gens für Adenosin-Desaminase (ADA) geerbt. Der Ausfall des Gens schädigt v.a. die Vorläuferzellen der Lymphozyten. Die Konsequenz ist ein völliges Ausbleiben der Abwehrreaktionen des Körpers gegen Infektionen. Für Kinder wie Ashanti wird damit selbst der harmloseste Erreger zur lebensgefährlichen Bedrohung. Ein Leben ist für SCID-Patienten nur in absolut keimfreier Umgebung unter permanenten Quarantänebedingungen möglich. Am 14. September 1990 wurde Ashanti De Silva im Alter von vier Jahren von einem Ärzteteam des National Institute of Health in Bethesda, in der Nähe von Washington, unter der Leitung von W. French Anderson, R. Michael Blaese und Kenneth W. Culver gentherapeutisch behandelt. Ihrem Blut wurden Immunzellen entnommen, in die eine korrekte Version des ADA-Gens eingeschleust wurde. Die gentechnisch veränderten Zellen wurden der Patientin anschließend wieder infundiert. Der Behandlungsversuch verlief erfolgreich. Nach vier solcher Infusionen im Abstand von je vier Wochen verbesserte sich ihr Zustand erheblich. Inzwischen kann Ashanti mithilfe weiterer, gelegentlicher Auffrischungsbehandlungen ein normales Leben führen und voller Lebensfreude die gleichen Dinge tun wie andere Altersgenossen auch.

Mittlerweile wurden ca. 20 weitere SCID-Patienten mit diesem Verfahren behandelt, die sich bis auf ein Kind wohlauf befinden. In einem Fall kam es jedoch durch die Gentherapie zu einem Zwischenfall: Das Transgen inserierte in der Nähe des LMO2-Gens, das bei der Entstehung bestimmter Leukämieformen bei Kindern oft aktiviert wird. Offensichtlich hat die Insertion des Transgens eine onkogene Aktivierung ausgelöst, die dann zusammen mit anderen Faktoren zum Ausbruch der Tumorerkrankung bei dem Gentherapiepatienten führte.
Die Gentherapie ist heutzutage noch eine experimentelle Therapie, die wie jedes neue Verfahren in Hinblick auf ihr Risiko noch nicht vollständig abgeschätzt werden kann. Allerdings wird der zu erwartende Erfolg, insbesondere in Hinblick auf die vielen schweren und anders nicht zu behandelnden oder zu heilenden Erkrankungen, außerordentlich hoch eingestuft. Bis heute sind bereits über 1000 genehmigte Gentherapieversuche am Menschen weltweit unternommen worden.
Gentherapie bei Tumorerkrankungen
Das zweite große Anwendungsfeld der Gentherapie ist die Onkologie. Drei Zielstrukturen sind dabei von Interesse.
Genetische Modifikation von Tumorzellen
Ähnlich der Gensubstitutionstherapie bei Erbkrankheiten erscheint es bei einem durch Ausfall einer Genfunktion hervorgerufenen Tumor (Tumorsuppressorgene) sinnvoll, die intakte Kopie dieses Gens wieder einzuführen. Beruht der Tumor auf der Überaktivität eines Onkogens, kann mittels Antisense-RNA oder siRNA die Überexpression neutralisiert werden. Schließlich versucht man durch Einbringen von Genen für Enzyme, die nichttoxischen Substanzen in toxische Metaboliten umwandeln (Suizidgene), die Tumorzellen gezielt zu zerstören.
Modifikation der Immunantwort
Viele Tumorzellen exprimieren an ihrer Zelloberfläche Moleküle (tumorassoziierte Antigene), die sie prinzipiell für das Immunsystem erkennbar machen. Trotzdem ist die Immunantwort gegen Tumorzellen schlecht bis gar nicht vorhanden. Aus diesem Grund versucht man, die Tumorzellen mit zusätzlichen Genen auszustatten, die zur Produktion von Zytokinen führen; das sind Moleküle, die Immunzellen anlocken und aktivieren. Auch durch das Einbringen von Tumorantigen erkennenden Rezeptoren in die Immunzellen des Patienten lässt sich die Antitumor-Immunantwort verbessern.
Modifikation hämatopoetischer Stammzellen
Bei der Chemotherapie von Tumoren werden als Nebenwirkung die proliferativen Stammzellen des Bluts geschädigt. Dies limitiert die maximal einsetzbare Dosis entscheidend. Durch eine Ex-vivo-Gentherapie der Stammzellen mit Genen, die diesen Zellen eine Resistenz gegen das Zytostatikum vermitteln, z.B. das Multi-drug-resistance-Gen oder die Dihydrofolat-Reduktase, und anschließende Stammzelltransplantation kann eine Erhöhung der verträglichen Dosis erreicht werden.

MERKE

Gentherapie ist die genetische Veränderung von somatischen Zellen durch Gentransfer. Bei hämatopoetischen Zellen und Tumorzellen kann der Gentransfer in Zellkultur erfolgen (Ex-vivo-Therapie), während in andere Zelltypen Gene mittels viraler Vektoren transferiert werden. Bei Erbkrankheiten wird die Funktion des defekten Gens durch das Transgen übernommen. Bei Tumorerkrankungen sollen die Krebszellen gezielt abgetötet oder die Immunantwort und die Zytostatikawirksamkeit erhöht werden.

Xenotransplantation und therapeutisches Klonen

Xenotransplantation
Wegen des Mangels an menschlichen Spenderorganen wurden Versuche unternommen, transplantierbare tierische Organe zu entwickeln, die nicht mehr abgestoßen werden, weil sie die mit dem Empfänger kompatiblen HLA-(MHC-)Moleküle auf ihrer Zelloberfläche tragen. Die Verwendung tierischer Spenderorgane für den Menschen ist allerdings mit dem Risiko behaftet, dass evtl. für das Spendertier ungefährliche – und dadurch unerkannte – Krankheitserreger auf den Empfänger übertragen und dort virulent werden.
Humane Stammzellen
Embryonale Stammzellen
Ähnlich wie bei der Maus lassen sich aus frühen menschlichen Embryonen Zelllinien gewinnen, die sich in vitro nahezu unbegrenzt vermehren lassen. Durch den Zusatz bestimmter Wachstums- und Differenzierungsfaktoren zum Kulturmedium können die embryonalen Zellen veranlasst werden, sich zu verschiedenen Zelltypen zu differenzieren, z.B. Nerven-, Muskel- oder Blutzellen. Sie stehen dann zum Zellersatz bei Verletzungen und degenerativen Erkrankungen zur Verfügung. Jedoch muss die immunologische Kompatibilität zwischen Empfänger und den von dem Embryo abstammenden Zellen gewährleistet sein. Es erscheint möglich, eine große Sammlung immunologisch verschiedener embryonaler Stammzellen anzulegen. Die Entwicklung von Organen aus embryonalen Zellen ist bislang nicht gelungen.
Allerdings gibt es eine Reihe ethischer Bedenken wegen der kommerziellen Nutzung humaner Embryonen und der zumindest theoretischen Möglichkeit, analog zu ES-Zell-Technologie bei der Maus, Chimären herzustellen.
Adulte Stammzellen
Die meisten Gewebe des erwachsenen Organismus enthalten neben den differenzierten Zellen, die die Gewebs- oder Organfunktion übernehmen, auch noch undifferenzierte Zellen, die bei Verletzung oder Abnutzung durch Teilung und anschließende Differenzierung einer der beiden Tochterzellen den Zellersatz gewährleisten. Es ist gelungen, solche adulten Stammzellen in Kultur zu nehmen, zu vermehren und in vitro ihre Differenzierung zu voll funktionsfähigen spezialisierten Zellen des entsprechenden Gewebes auszulösen (Abb. 15.17). Auch hier ergibt sich bei der Transplantation in den Patienten das Problem der immunologischen Kompatibilität.
Therapeutisches Klonen
Bei einigen Versuchstieren ist es möglich, den Zellkern aus embryonalen oder sogar vollständig differenzierten, adulten Zellen zu entnehmen und in eine Eizelle einzupflanzen, der vorher der eigene (haploide) Zellkern entfernt wurde. Der implantierte (diploide) Zellkern kann dann spontan die Entwicklung eines normalen Embryos bis hin zu einem gesunden erwachsenen Tier steuern. Das Verfahren ist allerdings nur in seltenen Fällen erfolgreich. Da die so hergestellten Tiere die identische Genausstattung wie der Kernspender haben, handelt es sich um Klone.
Das Schaf Dolly war das erste Säugetier, das als Klon von einer Ammenmutter geboren wurde. Es alterte allerdings vorzeitig. Klone wurden von Fischen, Fröschen, Mäusen, Katzen, Hunden und einer Reihe landwirtschaftlicher Nutztiere hergestellt.
Die Strategie des therapeutischen Klonens beruht auf der Vorstellung, von einem Patienten aus einer gesunden Zelle den Zellkern zu gewinnen, diesen in eine menschliche, entkernte Empfängereizelle einzupflanzen und sich anschließend bis zum Embryonalstadium entwickeln zu lassen, aus dem dann embryonale Stammzellen gewonnen werden können. Diese werden dann zu dem benötigten Gewebe differenziert und zum Gewebeersatz verwendet. Da die in vitro generierten Zellen genetisch identisch mit dem Patienten sind, gibt es keine Abstoßungsreaktion.

Zusammenfassung

Gentechnik

DNA-Abschnitte werden in vitro neu kombiniert. Die gezielte Rekombination erfolgt nach Verdau mit Restriktionsenzymen. Nach Ligation in einen Vektor kann eine Insert-DNA in eine Zelle eingebracht werden, in der das rekombinante DNA-Molekül vermehrt wird. Dieser Prozess wird als Klonierung bezeichnet. RNA wird nach Umschreiben in eine cDNA entsprechend kloniert. Die Gesamtheit aller Sequenzen eines Genoms in klonierter Form ergibt eine Genbank. Die Isolation von gesuchten Genen aus einer Genbank erfolgt mit klonierten Proben durch molekulare Hybridisierung.
Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist die rein enzymatische Vermehrung von DNA in vitro mittels einer temperaturstabilen Polymerase. Die maschinell gesteuerte Reaktion ist eine Abfolge von Replikationszyklen.
Die Entschlüsselung der Basenabfolge eines DNA-Moleküls geschieht durch eine Polymerasereaktion, bei der die zu analysierende Sequenz zum Doppelstrang ergänzt wird. Durch Kettenabbruchnucleotide entsteht eine Vielzahl verkürzter DNA-Stränge, die vom Anfang der gesuchten Sequenz bis zum Ende jede Basenposition repräsentieren.
Wird eine fremde DNA-Sequenz in das Genom integriert, entsteht ein transgener oder genetisch modifizierter Organismus (GMO). Dabei kann zusätzliche genetische Information eingeschleust oder das Gen durch eine mutierte Version ersetzt werden. Bei Knock-out-Mäusen wird der Genaustausch mittels homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen vorgenommen. Nach Transplantation der genetisch manipulierten Zellen entstehen Chimären. Nach Transmission durch die Keimbahn erhält man Tiere, die genetisch von der veränderten embryonalen Stammzelle abstammen.
Rekombinante Proteine mit pharmakologischer Wirksamkeit können in Bakterien, Hefen, Säugerzellen und ganzen Tieren hergestellt werden. Das Transgen wird unter der Kontrolle wirtszellspezifischer Promotoren exprimiert. Aufgrund der Universalität des genetischen Codes ist eine korrekte Proteinsequenz des fremden Genprodukts garantiert. Posttranslationale Modifikationen sind wirtszellabhängig.

Gendiagnostik

Der Nachweis von Punktmutationen und kleinen Deletionen bzw. Insertionen erfolgt mit PCR oder Genchips, Aberrationen von 100 bis mehreren 1 000 bp mit Southern-Blot. Chromsomale Mutationen werden mittels FISH detektiert. Pathologische Veränderungen in der Expression einzelner Gene werden durch Northern-Blot oder mittels RT-PCR nachgewiesen. Um das Expressionsprofil eines ganzen Gewebes oder Organs zu analysieren, stehen Expressionschips zur Verfügung.
Mikrosatelliten sind repetitive Abschnitte der DNA, die meist außerhalb kodierender Sequenzen liegen. Sie variieren in ihrer Länge zwischen einzelnen Individuen. Deshalb eignen sie sich zur Individuenerkennung als genetischer Fingerabdruck.

Gentherapie

Genetische Defekte können durch Einführung des entsprechenden korrekten Gens korrigiert werden. Das Einschleusen des Transgens erfolgt ex vivo oder in vivo in somatische Zellen des Patienten. Als Vektoren dienen modifizierte Viren. Zum Ausschalten unerwünschter Gene bietet die RNA-Interferenz eine vielversprechende Möglichkeit.
Embryonale und adulte Stammzellen können in vitro zu funktionellen Zellen und Geweben differenziert werden. Sie sollen in Zukunft zum Gewebe- bzw. Organersatz verwendet werden. Beim therapeutischen Klonen sollen Zellkerne aus gesunden Zellen des Patienten in embryonale Stammzellen transferiert werden. Die von diesen manipulierten embryonalen Stammzellen abgeleiteten Gewebe sind wegen des gleichen Immunotyps für die Transplantation in den Patienten besonders geeignet.

Fragen

  • 1.

    Sie sollen für eine rezessive Erbkrankheit, die auf eine Punktmutation im Gen X zurückzuführen ist, ein Krankheitsmodell in der Labormaus erstellen. Beschreiben Sie die Vorgehensweise. Denken Sie dabei an embryonale Stammzellen, homologe Rekombination und Chimären.

  • 2.

    Welche Behandlungsmöglichkeiten eröffnet die Gentherapie? Denken Sie dabei an Erbkrankheiten und Krebserkrankungen.

  • 3.

    Welche Bedeutung haben Restriktionsendonucleasen für die Gentechnik? Denken Sie dabei an Sequenzspezifität und Restriktionsfragmentlängen.

  • 4.

    Sie sollen einen Vektor konstruieren, um ein menschliches Proteinhormon in Zellkulturen zu produzieren. Besonders geeignet für dieses Protein sind CHO-Zellen (CHO Chinese hamster ovary). Welche Bestandteile muss der Vektor enthalten? Denken Sie dabei an Promotor, Selektion und Signalpeptid.

  • 5.

    Zur Entwicklung eines PCR-Tests für eine krankheitsauslösende Mutation steht die Sequenzinformation um die Mutationsstelle zur Verfügung: 5'...ATTGCCTAAGTCCGAGCTGAACCCGATTAAGGCTAT...3' Bei den betroffenen Patienten sind die markierten Positionen (Fettmarkierung) deletiert. Die Sequenz 500 Basenpaare weiter in 3'-Richtung lautet: 5'...GCATTTGATCCATGGGCCTATTTTAGCCCATTGATGC...3' Schlagen Sie Primersequenzen von 18 Nucleotiden Länge vor, um das gesunde Allel bzw. das mutierte Allel spezifisch in der PCR als Produkt zu amplifizieren.

  • 6.

    Mittels PCR wurde DNA für eine Sequenzierungsreaktion von einem Patienten erhalten, der von seiner Mutter eine normale Sequenz des Gens Y (5'...GGATCTGAATCCGTA...3') und von seinem Vater ein mutiertes Gen (5'...GGATCTGGATCCGTA...3') geerbt hat. Wie sieht das Ergebnis der Sequenzierung des gesamten PCR-Produkts mit den radioaktiven Verfahren (analog Abb. 15.8b) und dem automatisierten Fluoreszenzverfahren (analog Abb. 15.8c) aus?

  • 7.

    Wie funktioniert eine Mikrosatellitenanalyse? Was kann das Ergebnis verfälschen? Denken Sie dabei an Repeat-Anzahl und Mutationen.

  • 8.

    Beschreiben Sie die Klonierung eines Inserts in einem Plasmidvektor.

  • 9.

    Wie kann ein Gen durch Erstellung einer cDNA-Bank isoliert werden?

019 IMPP-Fragen

Holen Sie sich die neue Medizinwelten-App!

Schließen