Grundstruktur von L--Aminosäuren.

a) Räumliche Darstellung. Die Aminogruppe, die Carboxylgruppe und zwei weitere Substituenten sind tetraedrisch an das -Kohlenstoffatom gebunden. –R (Rest) symbolisiert eine der 20 verschiedenen Aminosäureseitenketten.

b) Stereochemie der Aminosäuren. Das -Kohlenstoffatom ist asymmetrisch substituiert und befindet sich in der Mitte eines Tetraeders. In der perspektivischen Darstellung weisen die schwarzen Dreiecke vor die Papierebene und die gestrichelten hinter die Papierebene. Die absolute Konfiguration entspricht der L-Form.

c) In der Fischer-Projektionsformel (zweidimensionale Darstellung) wird dieser Zusammenhang durch Striche angedeutet.

Darstellung der L- und der D-Konfiguration der Aminosäure Valin. Zur Verdeutlichung der räumlichen Symmetrie ist die Spiegelebene gestrichelt eingezeichnet.

Struktur von Valinomycin. In diesem makrozyklischen Antibiotikum kommt die D-Aminosäure D-Valin als Baustein neben L-Valin und sog. Hydroxysäuren vor. Die Verknüpfung der Bausteine erfolgt durch Peptidbindungen (unten) und Lactonbrücken. Der antibiotische Effekt von Valinomycin besteht darin, dass es hochspezifisch K⁺-Ionen komplexieren und durch Biomembranen leiten kann, daher auch die Bezeichnung Ionophor.

Extinktions- bzw. Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren. Die Lichtextinktion (-absorption) der wässrigen Lösungen von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan wird in Abhängigkeit von der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts untersucht.

Titrationskurve von Alanin.

Protolysegleichgewichte von Alanin, Asparaginsäure und Lysin. Die Prozentwerte in Klammern geben an, zu welchem Anteil die betreffenden Gruppen ionisiert vorliegen.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.

a) Chromatographiesystem zum Nachweis von Aminosäuren. Die Apparatur besteht aus einer Pumpe, die den Eluenten aus den Reservoirs der verschiedenen Lösungsmittel mischt, einer Trennsäule und einem Detektor. Aufgrund der hohen Packungsdichte des Säulenmaterials muss man die mobile Phase mit hohen Drücken durchpressen.

b) HPLC-Chromatogramm eines Aminosäuregemischs. Die Komponenten des Gemischs werden auf einer als Umkehrphase (reversed phase) bezeichneten HPLC-Säule getrennt. Die Elution erfolgt durch einen Puffer-Acetonitril-Gradienten, bei dem der Acetonitrilanteil mit der Zeit kontinuierlich erhöht wird, sodass die Hydrophobie der mobilen Phase sukzessive steigt. Die Aminosäuren werden vor dem Säulenlauf mit ortho-Phthalaldehyd modifiziert. Die entstehenden Derivate können aufgrund ihrer Absorption oder Fluoreszenz detektiert werden. Im abgebildeten Chromatogramm wird die Fluoreszenzemission gemessen und in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.

Biogene Amine der Signalübertragung.

Peptidbindung.

a) Partieller Doppelbindungscharakter durch Mesomeriestabilisierung.

b) Planarer Charakter der Peptidbindung (Amidebene) in der trans-Orientierung: Einfachbindungen bestehen zwischen dem C_{- und dem C*-Atom (0,151 nm) sowie zwischen N und dem nächsten C (0,146 nm). Die CO-Doppelbindung misst nur 0,124 nm. Die Bindungslänge zwischen dem C und N der Peptidbindung liegt zwischen Einfach- und Doppelbindung (0,133 nm), daher die Bezeichnung partieller Doppelbindungscharakter.}

c) Geometrie der Peptidgruppe. Die Substituenten des C- und des N-Atoms der Peptidbindung – also die beiden benachbarten -Kohlenstoffatome – liegen entweder in cis- oder trans-Orientierung vor.

Strukturhierarchie von Proteinen am Beispiel des Hämoglobins. Die höchste Organisationsebene ist die Quartärstruktur. Sie existiert nur für solche Proteine, die aus einer Zusammenlagerung mehrerer Polypeptidketten bestehen. Bei genauerer Betrachtung wird die Aufgliederung in unterschiedliche Polypeptidketten deutlich, diese haben eine Tertiärstruktur. Weitere Vergrößerung zeigt, dass die Faltung des Proteins von Komponenten der Sekundärstruktur (hier: -Helices) geprägt ist. Diese Elemente werden durch die räumliche Ordnung der sequenziell verknüpften Aminosäuren, die Primärstruktur, erzeugt.

Sequenzen von Rhodopsin.

a) Multipler Sequenzvergleich von orthologen Proteinen am Beispiel des Sehfarbstoffs Rhodopsin. Identische Aminosäuren bei allen Organismen sind gelb hinterlegt. Die entsprechenden Proteinsequenzen wurden aus der Swiss-Prot-Datenbank zusammengetragen und der Sequenzvergleich mit dem Computerprogramm CLUSTALW berechnet. Die Namenskürzel OPSD_ sind originale Datenbankeinträge, die für das Protein und den Ursprungsorganismus stehen. Weitere Abkürzungen: BUFBU Kröte (Bufo bufo), CARAU Goldfisch (Carassius auratus), CANFA Hund (Canis familiaris), BOVIN Rind (Bos taurus), HUMAN Mensch (Homo sapiens). Die Sterne unterhalb der Sequenzanordnung markieren identische Reste, Doppelpunkte und Punkte für stark und weniger ausgeprägt konservierte Substitutionen.

b) Der phylogenetische Stammbaum stellt die sich aus dem Sequenzvergleich ergebenden relativen Verwandtschaftsverhältnisse der betrachteten Proteine graphisch dar. Die Verbindungslinien zwischen den Proteinen sind umso kürzer, je größer der Grad der Aminosäuresequenzverwandtschaft ist.

Multipler Sequenzvergleich von paralogen Proteinen am Beispiel von Proteinen der humanen Ras-Superfamilie.

a) RASH, RASK, RHEB, RHOA, RAC1, RAB10 und RAN sind paraloge Proteine, die in der Signaltransduktionskette wichtige Funktionen als GTP-bindende Schalter annehmen. Die Sequenzbezeichnungen und die Markierungen des Sequenzkonservierungsgrades entsprechen denen in Abb. 2.11a. Die invarianten Positionen sind zusätzlich in Gelb hervorgehoben. Die blaue Box markiert die konservierten Sequenzbereiche (G1–G5), die in dieser Klasse von membranassoziierten GTP-bindenden Proteinen gefunden werden.

b) Strukturmodell von Ras (RASH) im GTP-gebundenen Zustand. Die nucleotidbindenden Bereiche G1–G5 sind blau unterlegt. Ebenfalls skizziert ist die C-terminale Anheftungsstelle (CAAX-Box) für die Farnesylgruppe. Es handelt sich dabei um eine posttranslationale Modifikation.

Stabilisierung der Raumstruktur eines Peptids.

a) In einem kurzen, linearen Peptid ist die relative Anordnung der Aminosäurereste im Raum prinzipiell noch nicht festgelegt. Die Struktur eines Peptids wird in diesem Beispiel durch die Abfolge der Aminosäuren bestimmt. Die Kontakte der Aminosäureseitenketten erfolgen an den Oberflächen (Van-der-Waals-Oberflächen) der Atome, die durch ihre Van-der-Waals-Anziehungs- und Abstoßungskräfte bestimmt werden.

b) Raumstrukturstabilisierende Wechselwirkungen von Aminosäuren.

Raumstruktur von Insulin. Die A- und B-Kette sind intermolekular durch zwei Disulfidbrücken verbunden. Zusätzlich existiert noch eine intramolekulare Bindung zwischen zwei Cysteinresten der A-Kette.

Sekundärstrukturelement -Helix.

a) Im Kugel-Stab-Modell ist die Abfolge des Rückgrats gezeichnet. In der Farbkodierung sind die C'-Atome schwarz, C _{grau, Sauerstoff rot und Stickstoff blau dargestellt. Von den Aminosäureseitenketten werden der Übersichtlichkeit halber nur die C-Atome (violett) gezeigt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen N–H und CO sind gestrichelt eingetragen.}

b) Schematische Abbildung einer -Helix. Diese Darstellungsform wird oft in Strukturbildern gewählt, um einen groben Überblick über die Topologie eines Proteins zu geben. Die Ganghöhe der Helix und ihr Durchmesser sind eingezeichnet.

c) Helixraddarstellung der -Helix (Ansicht von oben in Richtung der Helixachse).

-Faltblatt-Struktur.

a) Ein einzelner -Strang in typischer Zickzackstruktur von der Seite gesehen, die Aminosäureseitenketten (violette Kugeln) zeigen abwechselnd in entgegengesetzte Richtungen.

b) Schematische Pfeildarstellung eines einzelnen -Strangs. Die Pfeilrichtung gibt den Verlauf der Polypeptidkette an, dabei weist die Pfeilspitze auf den C-Terminus des Strangs.

c) Mehrere -Stränge sind zu einem antiparallelen -Faltblatt angeordnet (von oben gesehen). Die Aminosäureseitenketten liegen über und unter der Papierebene.

Spezielle Sekundärstrukturen.

a) Kollagentripelhelix. Drei nichtidentische helikale Stränge sind miteinander verwoben. Strukturstabilisierende Wasserstoffbrücken bilden sich nicht innerhalb, sondern zwischen den einzelnen Ketten aus.

b) und c) Struktur des Seidenfibroins. Schematische Darstellung der Anordnung der antiparallelen Polypeptidketten, die sich in mehreren Lagen übereinanderlagern. In der Darstellung der Van-der-Waals-Oberflächen wird die Wechselwirkung zwischen den gestapelten -Faltblattlagen deutlich.

Strukturmodell von Myoglobin. Das Protein ist aus -Helices aufgebaut, die durch Schleifen miteinander verknüpft sind. Der Cofaktor Häm B wird über besondere Aminosäureliganden an das Protein gebunden. Die Komplexierung erfolgt durch Wechselwirkung des Stickstoffs von Histidin 93 (gelb) mit dem Zentralatom Eisen (grün) des Hämmoleküls (schwarz).

Leucin-Zipper-Motiv.

a) Beispiel des heterodimeren Transkriptionsfaktorkomplexes cMyc/Max, bei dem zwei -Helices (in Rot und Blau) aneinanderbinden. Die beiden Sekundärstrukturelemente sind eng verzahnt, weil sie durch Wechselwirkung von hydrophoben Aminosäureseitenketten, bevorzugt Leucin, eine reißverschlussartige Struktur bilden.

b) Die Verzahnung wird besonders deutlich, wenn man die beiden -Helices auseinanderzieht.

Ausbildung von parallelen und antiparallelen -Faltblättern.

a) Verknüpfung von zwei antiparallelen -Strängen über eine Schleife.

b) Die Schleife ist bei paralleler -Stranganordnung wesentlich länger; es gibt zwei verschiedene räumliche Orientierungen (rechts- und linkshändiges Motiv, zur Vereinfachung nicht dargestellt).

c) An die Stelle einer Schleife kann auch eine Helixstruktur treten, es gibt ebenfalls die zwei rechts- und linksgängigen sterischen Anordnungen.

--Supersekundärstruktur am Beispiel ausgewählter Proteine. Gezeigt sind die schematischen Anordnungen der Sekundärstrukturelemente (Topologien) sowie die Raumstrukturen (rot helikale, blau faltblattartige Sekundärstruktur).

a) Topologie und b) Struktur von Flavodoxin.

c) Topologie und d) Struktur von Carboxypeptidase. In diesen Proteinen bilden die -Stränge ein zentrales, leicht verdrilltes Faltblatt.

e) Topologie der Triosephosphat-Isomerase und ihre Raumstruktur: von der Seite (f) und von oben (g) gesehen. In den --Barrel-Proteinen bilden die -Stränge eine fassartige Anordnung.

Strukturvorhersagen eines unbekannten Proteins durch verschiedene Sekundärstrukturvorhersageprogramme. Die Sekundärstruktur eines unbekannten Proteins aus der Genomsequenz des Bakteriums Enterococcus hirae (nur Ausschnitt gezeigt) wurde mittels verschiedener Computervorhersageprogramme berechnet. Oben: partielle Sequenz des Proteins Unk_7585500, darunter: Ergebnisse der verschiedenen Programme (h -Helix, e -Strang, t Umkehrung [Turn], c Schleife [keine Standardsekundärstruktur], Sec. Cons. Konsensus [(gemeinsamer Nenner der errechneten Strukturvorhersagen]).

Struktur eines Zinkfingerelements.

a) Schema der topologischen Anordnung des Faltblatt-Schleife-Helix-Motivs.

b) Dreidimensionale Struktur und Ligandenumgebung des Zinkfingerproteins ZIF268 einer Maus, es enthält drei Zinkfingerelemente. Nur die Seitenketten der Zn-bindenden Aminosäuren Cystein und Histidin sind herausgestellt. Die blauen Kugeln entsprechen den von Cystein-SH und Histidin-N komplexierten Zinkatomen.

c) Schema der Ligandenumgebung des Zn durch die Primärstruktur von ZIF268 (Ausschnitt).

d) Strukturdarstellung der Ligandenumgebung. Die Liganden sind in ihrer Sequenzabfolge nummeriert.

Struktur von Calcium-bindenden (grüne Kugeln) EF-Hand-Motiven.

a) Sequenzvergleich verschiedener Proteine mit drei EF-Hand-Motiven in der Helix-Schleife-Helix-Architektur. Nur die invarianten Aminosäuren sind rot markiert.

b) Topologie des Helix-Loop-Helix-EF-Hand-Motivs.

c) Dreidimensionale Struktur von Calmodulin mit vier EF-Hand-Motiven.

d) Schema der Ligandenumgebung des Ca durch die Primärstruktur von Troponin C (Ausschnitt).

e) Strukturdarstellung der Ligandenumgebung. Die Liganden sind in ihrer Sequenzabfolge nummeriert.

Darstellungsverfahren von molekularen Strukturen am Beispiel von Insulin.

a) Die topologische Darstellung gibt den Verlauf der Sekundärstrukturelemente wieder. Hierbei werden die Helixanteile schematisch als Spiralen abgebildet (Abb. 2.15; noch einfacher als Spiralband oder Zylinder) und die Faltblattanteile als Streifen oder Pfeilsymbole dargestellt (Abb. 2.16).

b) Strichdarstellung des Insulins, bei der alle Aminosäureseitenketten mitgezeichnet sind.

c) Kalottenmodell. Die einzelnen Atome sind mit ihren Van-der-Waals-Radien repräsentiert.

d) Oberflächendarstellung des Moleküls (rot negative, blau positive Ladung).

Domänenstruktur der Pyruvat-Kinase.

a) Die verschiedenen Faltungseinheiten einer Polypeptidkette des tetrameren Proteins sind in unterschiedlichen Farben dargestellt. Einzelheiten im Text.

b) Organisation von Polypeptidketten in verschiedene Domänen, gezeigt am Beispiel von Proteasen der Blutgerinnung bzw. Fibrinolyse. Verschiedene kleine Proteinmoleküle bilden Module, die zum fertigen Protein kombiniert werden. Beim Prototyp Chymotrypsin formen zwei Domänen das aktive Enzym (insgesamt 243 Aminosäuren). Mit Chymotrypsin evolutionär verwandte Domänen sind auch bei Urokinase, Faktor IX und Plasminogen vorhanden. Weitere Module wie das dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) homologe Peptid (53 Aminosäuren), die etwa 85 Aminosäuren lange Kringle-Domäne und die Ca²⁺-bindende Domäne (auch Abb. 2.23e) werden linear vor die proteolytischen Module geschaltet.

Quartärstrukturen von Proteinen. Polypeptide können sich zu Oligomeren assoziieren.

a) Hexamere Struktur von Insulin (Monomerstruktur Abb. 2.25). Die sechs Polypeptidketten sind u.a. durch Bindung an ein binukleäres Zinkzentrum (blaue Kugeln in der Mitte) gebunden, wobei jedes Polypeptid mit einem Histidinliganden zur Koordinierung des Metalls beiträgt.

b) Tetramere Struktur von Pyruvat-Kinase (Monomerstruktur Abb. 2.26)

Verteilung der isomeren Formen der Lactat-Dehydrogenase in Geweben. Die Kombinationen der Isoformen M und H ergeben fünf verschiedene tetramere Enzyme

(a), deren gewebsspezifische Verteilung dargestellt ist

(b). Die Isoenzyme unterscheiden sich anhand ihrer isoelektrischen Punkte und können mit Ionenaustauschchromatographie oder durch Elektrophorese im Stärkegel oder auf Zelluloseacetatfolien voneinander getrennt und quantifiziert werden. Dies ist durch unterschiedliche Größe und Intensität der Kreise dargestellt.

Kovalente Modifikationen von Proteinen. Die Aminosäuren im Proteingerüst sind schwarz, die spezifischen Substituenten rot gezeichnet. Selenocystein (a), N-Formylmethionin (b), 3-Hydroxyprolin (c), 4-Hydroxyprolin (d), S-Farnesylcysteinmethylester (e), S-Palmitoylcystein (f), N-Myristoylglycin (g), Phosphoserin (h), Phosphotyrosin (i), N-Acetylglucosaminylasparagin (N-gekoppelter Zucker) (j), N-Acetylglucosaminylserin (O-gekoppelter Zucker) (k).

a) Faltungsintermediat (molten globule). Bei der Proteinfaltung bilden sich zuerst die Sekundärstrukturelemente der Polypeptidkette aus. Diese orientieren sich zunächst in einer relativ lockeren, wenig kondensierten Form, in der hydrophobe Oberflächen aneinandergelagert sind. Danach orientieren sich die Sekundärstrukturelemente in die stabile Tertiärstruktur um.

b–e) Energieflächenprofile bei der Faltung von Proteinen, dargestellt als Trichterdiagramm. Die Abbildung stellt die Energiezustände in verschiedensten Stadien auf dem Weg zum fertig gefalteten Protein dar (die Energie des Systems wird auf der senkrecht zur Kreisebene stehenden Achse angezeigt). Der Kreisradius ist ein Maß für die Kompaktheit des gefalteten Proteins. Je weiter der Faltungsprozess voranschreitet, je kleiner also der Radius wird, desto mehr verringert sich die Anzahl der verschiedenen Einstellmöglichkeiten: Der Kreisumfang wird immer kleiner. Mit fortschreitender Gestaltung des fertigen Proteins wird der Konformationsraum immer stärker eingeschränkt, bis im Endzustand nur noch eine mögliche Proteinkonformation übrig bleibt.

b) Flaches Profil. Proteine müssen lange suchen, bis sie in den Trichter hineinfallen.

c) Flaches Profil mit Rinne für bevorzugten Faltungsweg.

d) Steiles Profil. Proteine fallen aus allen möglichen Konformationszuständen ohne Umwege in den Trichter.

e) Steiles, aber unebenes Profil. Bevor die Proteine in den Trichter hinabfallen, müssen sie energetische Hindernisse überwinden.

Dreidimensionale Struktur des Prionproteins PrP^C beim Rind. Man sieht das C-terminale Fragment, gezeigt sind nur die Aminosäuren 124–227. Das N-terminale Peptid bildet keine geordnete Struktur. PrP^C hat überwiegend -helikale Sekundärstruktur. Bei der umgefalteten pathogenen Form PrP^Sc stellt man sich vor, dass der C-terminale Abschnitt im Gegensatz zur zellulären Form PrP^C nur noch 30% -Helix-, aber 45% -Faltblatt-Anteil besitzt.

Fehlfaltungsmechanismen bei Proteinen.

a) Mechanismus der Prionenreplikation. Die spontane Umwandlung von PrP^C (gelb) in PrP^Sc ist unter normalen Umständen ein seltener Prozess, da eine hohe Energiebarriere für die Umfaltung besteht. Durch Kontakt mit einem bereits präformierten infektiösen Prionenpartikel (oligomeres PrP^Sc) wird die Umfaltung stark begünstigt. Die weitere Anlagerung von PrP^C führt zum Wachstum des PrP^Sc-Partikels bis zu einer kritischen Länge, die den Zerfall in Tochterpartikel zur Folge hat.

b) Kinetik der Bildung von Amyloidfibrillen (Keimbildungsmodell). Die Bildung von Amyloidfibrillen ist ein kooperativer Prozess ähnlich der Entstehung von Kristallen aus Kristallisationskeimen. Die Umwandlung der nativen (gelb) in die fehlgefaltete (blau) Monomerkonformation sowie die nachfolgenden Monomeranlagerungsschritte bis zur Formation eines Keims erfolgen langsam (Keimbildungsphase). Weitere Anlagerung von Monomeren an den einmal gebildeten Keim vollzieht sich dann erheblich schneller (Elongationsphase). Dieser Vorgang wird durch die blaue Kurve der Aggregatbildung dargestellt. In einer frühen Phase kann dieser Prozess durch Zugabe von Keimpartikeln drastisch beschleunigt werden (dargestellt durch die rote Kurve der Aggregatbildung).

Architektur von Membranproteinen und ihre Anordnung in der Lipiddoppelschicht. a, b) Periphere Membranproteine: Kovalente Anheftung über einen GPI-Anker (a) und über Kohlenwasserstoffketten (b; Fettsäuren, Isoprenoide).

c, d) Integrale Membranproteine, bei denen die Proteinmasse überwiegend im hydrophoben Bereich der Membranebene angesiedelt ist: einfach membrandurchspannendes Protein mit einer (c) oder zwei (d) unterschiedlich orientierten hydrophilen Domänen.

e) Mehrfach membrandurchspannendes Protein

Struktur von Rhodopsin. Rhodopsin ist aus sieben -helikalen Polypeptidabschnitten aufgebaut, die die Membran mehr oder weniger senkrecht durchqueren.

a) Laterale Ansicht in der Membranebene mit zeichnerisch ergänzten Lipiden.

b) Aufsicht desselben Moleküls (ohne Lipide). Es werden zwei Schichten von Polypeptidketten deutlich, die den kovalent an das Apoprotein gebundenen Cofaktor Retinal einbetten. Dieser ist in (c) in der im Grundzustand des Proteins vorkommenden Konformation gezeichnet.

d) -adrenerger Rezeptor mit gebundenem Ligand (blau). Der graue Anteil entspricht T4-Lysozym, das mit gentechnischen Methoden in den Rezeptor eingefügt wurde, um das Protein für Strukturuntersuchungen zu stabilisieren.

Hydropathiediagramm von Rhodopsin.

Biologischer Abbau von Proteinen. Ubiquitin, der Marker für abzubauende Proteine wird durch Bindung an Enzym 1 (E1) durch Ausbildung einer (Iso-)Peptidbindung kovalent gebunden und an das Enzym E2 weitergegeben, das einen Komplex mit spezifischen Erkennungsmolekülen (E3 bzw. F-Box-Proteine) für Substratproteine bildet: Nach Andocken an den Rezeptor empfangen die Zielproteine ein oder mehrere (kettenartig aneinandergehängte) Ubiquitinmoleküle und sind damit als Substrate für das Proteasom markiert. Das Substratprotein wird vom 26S-Proteasomkomplex aufgenommen, entfaltet und durch die im Inneren des Kernkomplexes gelagerten Proteasen in Oligopeptide bzw. Aminosäuren gespalten.

Peptidsynthese nach Merrifield. Auf einem Kunststoffpartikel (Polymerkügelchen) werden die Aminosäuren, vom C-Terminus ausgehend, Schritt für Schritt aneinandergeheftet. Die Carboxylgruppen werden durch Derivatisierung chemisch aktiviert (Carboxylaktivator). Schutzgruppen an den Aminogruppen sorgen dafür, dass nur das auf die Festphase geschichtete Peptid mit der Aminosäure und nicht die Aminosäuren in der Lösung untereinander gekoppelt werden. Zum Schluss wird das Peptid chemisch vom Kunstharzpartikel abgetrennt und chromatographisch gereinigt. Der Übersichtlichkeit halber sind in dieser schematischen Abbildung keine molekularen Details dargestellt. Einzelheiten kann man in Lehrbüchern der organischen Chemie nachlesen.

Prinzip der Zentrifugation.

a) In einem Ausschwingrotor werden die im Zentrifugenbecher suspendierten Fragmente im Schwerefeld aufgetrennt. Bestimmende Größen für die Trennungseigenschaften sind hierbei der Abstand des Zentrifugenbechers r von der Rotationsachse, die Umdrehungszahl des Rotors und der Sedimentationskoeffizient s des zu zentrifugierenden Partikels. Die Wanderungsgeschwindigkeit v des Partikels im Zentrifugalfeld errechnet sich aus der Gleichung v 2 r s. Je größer der Sedimentationskoeffizient s, desto schneller sedimentieren die Partikel.

b) Sedimentationskoeffizienten von subzellulären Partikeln und von gelösten Proteinen. Die Einheit des Sedimentationskoeffizienten s ist S (Svedberg). 1 S entspricht einem Wert von 10¹³ s.

c) Übersicht der differenziellen Zentrifugationstechnik. Aus dem Homogenat werden durch aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte schwere von leichten Partikeln abgetrennt. Im Überstand befindet sich nach der Ultrazentrifugation ( 100.000 g) das wässrig verdünnte Zytosol, aus dem sich in nachfolgenden Trennschritten direkt Proteine isolieren lassen.

Chromatographische Trennverfahren.

a) Prinzip der Gelfiltration. Die Makromoleküle können je nach Größe in die Poren der Gelkügelchen eindringen. Die Elution erfolgt durch einen Puffer mit konstanter Ionenstärke. Kleine Proteine verteilen sich im Porengeflecht, während große Moleküle aus den Poren ausgeschlossen sind und dadurch zuerst eluiert werden.

b) Prinzip der Ionenaustauscherchromatographie am Beispiel eines Anionenaustauschers. Die positiv geladenen Matrixkügelchen binden die anionischen Proteinmoleküle umso stärker, je höher ihr Ladungsgrad ist. Die Elution erfolgt durch Laufmittel mit ansteigender Salzkonzentration.

c) Prinzip der Affinitätschromatographie am Beispiel einer Nickel-Affinitätssäule. Ein komplexes Proteingemisch wird auf die Säule geladen, jedoch binden nur oligohistidinmarkierte Proteine an die auf Gelkugeln immobilisierten Nickelionen. Bei der Elution werden alle nichtbindenden Proteine herausgespült. Schließlich wird das gebundene Protein durch Verdrängung mit puffergelöstem Histidin oder Imidazol von der Säule gewaschen.

Solubilisierung von Membranproteinen.

a) Struktur einiger Detergenzien. Natriumdodecylsulfat (SDS von Sodium dodecylsulfate) ist ein denaturierendes Detergenz und wird für die Gelektrophorese eingesetzt. Andere Detergenzien (z.B. Triton X-100, Cholsäure oder n-Octylglucosid) bewahren die native Proteinstruktur und werden zur Solubilisierung und Reinigung mit chromatographischen Verfahren genutzt.

b) Prinzip der Solubilisierung von Membranproteinen durch amphiphile Substanzen. Die Detergenzien verdrängen durch ihre hydrophoben Enden die im natürlichen Zustand an der Oberfläche der Proteine bindenden Lipidmoleküle. Es bilden sich monodisperse Detergenz-Protein-Komplexe aus. Die polaren Enden der Detergenzien wechselwirken mit dem Lösungsmittel.

Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE).

a) Elektrophoreseapparat.

b) Polyacrylamid-Gel nach Trennung von Probenmolekülen und Molekülmassenmarkerproteinen.

c) Bestimmung der Molekülmasse eines Proteins aus der Eichkurve.

d) Zweidimensionale Gelelektrophorese eines Ganzzellextrakts löslicher Proteine aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis. In der ersten Dimension wurde eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Die Separation erfolgte im pH-Gradienten entsprechend der isoelektrischen Punkte der Proteine. Der Gelstreifen wurde ausgeschnitten und quer auf einem denaturierenden (SDS-)Elektrophoresegel nach der Molekülmasse getrennt.

Western-Blot.

a) Elektrotransfer vom Elektrophoresegel auf Membran. Die Apparatur besteht aus einem Puffertank, der ein Sandwich aus Elektroden, saugfähigem Papier, dem Elektrophoresegel und der Blottingmembran (Nitrozellulose) enthält. Der über die Elektroden auf das Elektrophoresegel geleitete elektrische Strom lässt die im Gel separierten Proteinmoleküle auf die Membran wandern, wo sie immobilisiert werden. Es entsteht ein Abklatsch des ursprünglich auf dem Gel erzeugten Proteinmusters. Die Blottingmembran wird dann mit spezifischen Indikatorsondenmolekülen inkubiert. Beim Immunoblot nimmt man zum spezifischen Proteinnachweis spezifische, primäre Antikörper gegen das zu detektierende Protein. Danach markiert man die Proteinflecken mit einem enzymgekoppelten sekundären Antikörper, der den primären Antikörper und damit das nachzuweisende Protein durch eine nachfolgende enzymatische Farbreaktion sichtbar macht.

b) Immunoblotting am Beispiel des Hamster-Prionproteins PrP. Der Test beruht auf der Resistenz des krankhaften Prionproteins gegenüber dem proteolytischen Enzym Proteinase K. Hirnextrakte von normalen (enthalten PrP^C) und erkrankten (enthalten PrP^C und PrP^Sc) Tieren wurden mit Proteinase K behandelt, auf einem denaturierenden Elektrophoresegel getrennt, auf Nitrozellulose geblottet und mit Antikörpern gegen PrP entwickelt. Normale Extrakte ohne (Bahn 1) und nach erfolgter Proteinase-K-Behandlung (Bahn 2). Bahn 3: krankhafte Extrakte ohne erfolgte Proteinase-K-Behandlung und nach Behandlung (Bahn 4). Das ausbleibende Signal des PrP in Bahn 2 und die Existenz einer deutlichen Bande in Bahn 4 sprechen dafür, dass das erkrankte Tier proteaseresistentes PrP^Sc aufweist.

MALDI-Massenspektroskopie.

a) Funktionsprinzip. Die in eine lichtempfindliche Matrix eingebettete Probe wird durch Laserblitz desorbiert und im elektrischen Feld beschleunigt. Je leichter die Moleküle bei gleicher Ladung sind, umso schneller fliegen sie zum Detektor, sodass sich die Molmasse aus der Flugzeit ergibt.

b) Massenspektrometrische Analyse eines Gemischs aus Cytochrom c, Ubiquitin und Myoglobin.

c) Massenfingerprint von Ovalbumin nach tryptischem Verdau.

Aufklärung dreidimensionaler Strukturen mittels Röntgenkristallographie.

a) Mithilfe des Hanging-drop-Verfahrens wird durch Dampfdiffusion die Proteinlösung langsam, innerhalb von Tagen bis Wochen, aufkonzentriert, bis sich die Moleküle zu Kristallen anordnen.

b) Photographie eines in einem Hanging drop gebildeten Proteinkristalls (Länge ca. 250 m).

c) Schematischer Aufbau eines Röntgendiffraktometers. Die von der Röntgenquelle ausgehenden Strahlen treffen auf den Proteinkristall und werden aufgrund der regelmäßigen Struktur des Kristalls gestreut.

d) Die von den Streuzentren des Kristalls ausgehenden Röntgenstrahlen erzeugen ein für das Protein typisches Beugungsbild. (b) und (d) stammen vom menschlichen RAN-Protein (bereits in Abb. 2.12 erwähnt).