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B978-3-437-43690-1.10002-6

10.1016/B978-3-437-43690-1.10002-6

978-3-437-43690-1

Grundstruktur von L--Aminosäuren.

a) Räumliche Darstellung. Die Aminogruppe, die Carboxylgruppe und zwei weitere Substituenten sind tetraedrisch an das -Kohlenstoffatom gebunden. –R (Rest) symbolisiert eine der 20 verschiedenen Aminosäureseitenketten.

b) Stereochemie der Aminosäuren. Das -Kohlenstoffatom ist asymmetrisch substituiert und befindet sich in der Mitte eines Tetraeders. In der perspektivischen Darstellung weisen die schwarzen Dreiecke vor die Papierebene und die gestrichelten hinter die Papierebene. Die absolute Konfiguration entspricht der L-Form.

c) In der Fischer-Projektionsformel (zweidimensionale Darstellung) wird dieser Zusammenhang durch Striche angedeutet.

Darstellung der L- und der D-Konfiguration der Aminosäure Valin. Zur Verdeutlichung der räumlichen Symmetrie ist die Spiegelebene gestrichelt eingezeichnet.

Struktur von Valinomycin. In diesem makrozyklischen Antibiotikum kommt die D-Aminosäure D-Valin als Baustein neben L-Valin und sog. Hydroxysäuren vor. Die Verknüpfung der Bausteine erfolgt durch Peptidbindungen (unten) und Lactonbrücken. Der antibiotische Effekt von Valinomycin besteht darin, dass es hochspezifisch K+-Ionen komplexieren und durch Biomembranen leiten kann, daher auch die Bezeichnung Ionophor.

Extinktions- bzw. Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren. Die Lichtextinktion (-absorption) der wässrigen Lösungen von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan wird in Abhängigkeit von der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts untersucht.

Titrationskurve von Alanin.

Protolysegleichgewichte von Alanin, Asparaginsäure und Lysin. Die Prozentwerte in Klammern geben an, zu welchem Anteil die betreffenden Gruppen ionisiert vorliegen.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.

a) Chromatographiesystem zum Nachweis von Aminosäuren. Die Apparatur besteht aus einer Pumpe, die den Eluenten aus den Reservoirs der verschiedenen Lösungsmittel mischt, einer Trennsäule und einem Detektor. Aufgrund der hohen Packungsdichte des Säulenmaterials muss man die mobile Phase mit hohen Drücken durchpressen.

b) HPLC-Chromatogramm eines Aminosäuregemischs. Die Komponenten des Gemischs werden auf einer als Umkehrphase (reversed phase) bezeichneten HPLC-Säule getrennt. Die Elution erfolgt durch einen Puffer-Acetonitril-Gradienten, bei dem der Acetonitrilanteil mit der Zeit kontinuierlich erhöht wird, sodass die Hydrophobie der mobilen Phase sukzessive steigt. Die Aminosäuren werden vor dem Säulenlauf mit ortho-Phthalaldehyd modifiziert. Die entstehenden Derivate können aufgrund ihrer Absorption oder Fluoreszenz detektiert werden. Im abgebildeten Chromatogramm wird die Fluoreszenzemission gemessen und in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.

Biogene Amine der Signalübertragung.

Peptidbindung.

a) Partieller Doppelbindungscharakter durch Mesomeriestabilisierung.

b) Planarer Charakter der Peptidbindung (Amidebene) in der trans-Orientierung: Einfachbindungen bestehen zwischen dem C- und dem C*-Atom (0,151 nm) sowie zwischen N und dem nächsten C (0,146 nm). Die CO-Doppelbindung misst nur 0,124 nm. Die Bindungslänge zwischen dem C und N der Peptidbindung liegt zwischen Einfach- und Doppelbindung (0,133 nm), daher die Bezeichnung partieller Doppelbindungscharakter.

c) Geometrie der Peptidgruppe. Die Substituenten des C- und des N-Atoms der Peptidbindung – also die beiden benachbarten -Kohlenstoffatome – liegen entweder in cis- oder trans-Orientierung vor.

Strukturhierarchie von Proteinen am Beispiel des Hämoglobins. Die höchste Organisationsebene ist die Quartärstruktur. Sie existiert nur für solche Proteine, die aus einer Zusammenlagerung mehrerer Polypeptidketten bestehen. Bei genauerer Betrachtung wird die Aufgliederung in unterschiedliche Polypeptidketten deutlich, diese haben eine Tertiärstruktur. Weitere Vergrößerung zeigt, dass die Faltung des Proteins von Komponenten der Sekundärstruktur (hier: -Helices) geprägt ist. Diese Elemente werden durch die räumliche Ordnung der sequenziell verknüpften Aminosäuren, die Primärstruktur, erzeugt.

Sequenzen von Rhodopsin.

a) Multipler Sequenzvergleich von orthologen Proteinen am Beispiel des Sehfarbstoffs Rhodopsin. Identische Aminosäuren bei allen Organismen sind gelb hinterlegt. Die entsprechenden Proteinsequenzen wurden aus der Swiss-Prot-Datenbank zusammengetragen und der Sequenzvergleich mit dem Computerprogramm CLUSTALW berechnet. Die Namenskürzel OPSD_ sind originale Datenbankeinträge, die für das Protein und den Ursprungsorganismus stehen. Weitere Abkürzungen: BUFBU Kröte (Bufo bufo), CARAU Goldfisch (Carassius auratus), CANFA Hund (Canis familiaris), BOVIN Rind (Bos taurus), HUMAN Mensch (Homo sapiens). Die Sterne unterhalb der Sequenzanordnung markieren identische Reste, Doppelpunkte und Punkte für stark und weniger ausgeprägt konservierte Substitutionen.

b) Der phylogenetische Stammbaum stellt die sich aus dem Sequenzvergleich ergebenden relativen Verwandtschaftsverhältnisse der betrachteten Proteine graphisch dar. Die Verbindungslinien zwischen den Proteinen sind umso kürzer, je größer der Grad der Aminosäuresequenzverwandtschaft ist.

Multipler Sequenzvergleich von paralogen Proteinen am Beispiel von Proteinen der humanen Ras-Superfamilie.

a) RASH, RASK, RHEB, RHOA, RAC1, RAB10 und RAN sind paraloge Proteine, die in der Signaltransduktionskette wichtige Funktionen als GTP-bindende Schalter annehmen. Die Sequenzbezeichnungen und die Markierungen des Sequenzkonservierungsgrades entsprechen denen in Abb. 2.11a. Die invarianten Positionen sind zusätzlich in Gelb hervorgehoben. Die blaue Box markiert die konservierten Sequenzbereiche (G1–G5), die in dieser Klasse von membranassoziierten GTP-bindenden Proteinen gefunden werden.

b) Strukturmodell von Ras (RASH) im GTP-gebundenen Zustand. Die nucleotidbindenden Bereiche G1–G5 sind blau unterlegt. Ebenfalls skizziert ist die C-terminale Anheftungsstelle (CAAX-Box) für die Farnesylgruppe. Es handelt sich dabei um eine posttranslationale Modifikation.

Stabilisierung der Raumstruktur eines Peptids.

a) In einem kurzen, linearen Peptid ist die relative Anordnung der Aminosäurereste im Raum prinzipiell noch nicht festgelegt. Die Struktur eines Peptids wird in diesem Beispiel durch die Abfolge der Aminosäuren bestimmt. Die Kontakte der Aminosäureseitenketten erfolgen an den Oberflächen (Van-der-Waals-Oberflächen) der Atome, die durch ihre Van-der-Waals-Anziehungs- und Abstoßungskräfte bestimmt werden.

b) Raumstrukturstabilisierende Wechselwirkungen von Aminosäuren.

Raumstruktur von Insulin. Die A- und B-Kette sind intermolekular durch zwei Disulfidbrücken verbunden. Zusätzlich existiert noch eine intramolekulare Bindung zwischen zwei Cysteinresten der A-Kette.

Sekundärstrukturelement -Helix.

a) Im Kugel-Stab-Modell ist die Abfolge des Rückgrats gezeichnet. In der Farbkodierung sind die C'-Atome schwarz, C grau, Sauerstoff rot und Stickstoff blau dargestellt. Von den Aminosäureseitenketten werden der Übersichtlichkeit halber nur die C-Atome (violett) gezeigt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen N–H und CO sind gestrichelt eingetragen.

b) Schematische Abbildung einer -Helix. Diese Darstellungsform wird oft in Strukturbildern gewählt, um einen groben Überblick über die Topologie eines Proteins zu geben. Die Ganghöhe der Helix und ihr Durchmesser sind eingezeichnet.

c) Helixraddarstellung der -Helix (Ansicht von oben in Richtung der Helixachse).

-Faltblatt-Struktur.

a) Ein einzelner -Strang in typischer Zickzackstruktur von der Seite gesehen, die Aminosäureseitenketten (violette Kugeln) zeigen abwechselnd in entgegengesetzte Richtungen.

b) Schematische Pfeildarstellung eines einzelnen -Strangs. Die Pfeilrichtung gibt den Verlauf der Polypeptidkette an, dabei weist die Pfeilspitze auf den C-Terminus des Strangs.

c) Mehrere -Stränge sind zu einem antiparallelen -Faltblatt angeordnet (von oben gesehen). Die Aminosäureseitenketten liegen über und unter der Papierebene.

Spezielle Sekundärstrukturen.

a) Kollagentripelhelix. Drei nichtidentische helikale Stränge sind miteinander verwoben. Strukturstabilisierende Wasserstoffbrücken bilden sich nicht innerhalb, sondern zwischen den einzelnen Ketten aus.

b) und c) Struktur des Seidenfibroins. Schematische Darstellung der Anordnung der antiparallelen Polypeptidketten, die sich in mehreren Lagen übereinanderlagern. In der Darstellung der Van-der-Waals-Oberflächen wird die Wechselwirkung zwischen den gestapelten -Faltblattlagen deutlich.

Strukturmodell von Myoglobin. Das Protein ist aus -Helices aufgebaut, die durch Schleifen miteinander verknüpft sind. Der Cofaktor Häm B wird über besondere Aminosäureliganden an das Protein gebunden. Die Komplexierung erfolgt durch Wechselwirkung des Stickstoffs von Histidin 93 (gelb) mit dem Zentralatom Eisen (grün) des Hämmoleküls (schwarz).

Leucin-Zipper-Motiv.

a) Beispiel des heterodimeren Transkriptionsfaktorkomplexes cMyc/Max, bei dem zwei -Helices (in Rot und Blau) aneinanderbinden. Die beiden Sekundärstrukturelemente sind eng verzahnt, weil sie durch Wechselwirkung von hydrophoben Aminosäureseitenketten, bevorzugt Leucin, eine reißverschlussartige Struktur bilden.

b) Die Verzahnung wird besonders deutlich, wenn man die beiden -Helices auseinanderzieht.

Ausbildung von parallelen und antiparallelen -Faltblättern.

a) Verknüpfung von zwei antiparallelen -Strängen über eine Schleife.

b) Die Schleife ist bei paralleler -Stranganordnung wesentlich länger; es gibt zwei verschiedene räumliche Orientierungen (rechts- und linkshändiges Motiv, zur Vereinfachung nicht dargestellt).

c) An die Stelle einer Schleife kann auch eine Helixstruktur treten, es gibt ebenfalls die zwei rechts- und linksgängigen sterischen Anordnungen.

--Supersekundärstruktur am Beispiel ausgewählter Proteine. Gezeigt sind die schematischen Anordnungen der Sekundärstrukturelemente (Topologien) sowie die Raumstrukturen (rot helikale, blau faltblattartige Sekundärstruktur).

a) Topologie und b) Struktur von Flavodoxin.

c) Topologie und d) Struktur von Carboxypeptidase. In diesen Proteinen bilden die -Stränge ein zentrales, leicht verdrilltes Faltblatt.

e) Topologie der Triosephosphat-Isomerase und ihre Raumstruktur: von der Seite (f) und von oben (g) gesehen. In den --Barrel-Proteinen bilden die -Stränge eine fassartige Anordnung.

Strukturvorhersagen eines unbekannten Proteins durch verschiedene Sekundärstrukturvorhersageprogramme. Die Sekundärstruktur eines unbekannten Proteins aus der Genomsequenz des Bakteriums Enterococcus hirae (nur Ausschnitt gezeigt) wurde mittels verschiedener Computervorhersageprogramme berechnet. Oben: partielle Sequenz des Proteins Unk_7585500, darunter: Ergebnisse der verschiedenen Programme (h -Helix, e -Strang, t Umkehrung [Turn], c Schleife [keine Standardsekundärstruktur], Sec. Cons. Konsensus [(gemeinsamer Nenner der errechneten Strukturvorhersagen]).

Struktur eines Zinkfingerelements.

a) Schema der topologischen Anordnung des Faltblatt-Schleife-Helix-Motivs.

b) Dreidimensionale Struktur und Ligandenumgebung des Zinkfingerproteins ZIF268 einer Maus, es enthält drei Zinkfingerelemente. Nur die Seitenketten der Zn-bindenden Aminosäuren Cystein und Histidin sind herausgestellt. Die blauen Kugeln entsprechen den von Cystein-SH und Histidin-N komplexierten Zinkatomen.

c) Schema der Ligandenumgebung des Zn durch die Primärstruktur von ZIF268 (Ausschnitt).

d) Strukturdarstellung der Ligandenumgebung. Die Liganden sind in ihrer Sequenzabfolge nummeriert.

Struktur von Calcium-bindenden (grüne Kugeln) EF-Hand-Motiven.

a) Sequenzvergleich verschiedener Proteine mit drei EF-Hand-Motiven in der Helix-Schleife-Helix-Architektur. Nur die invarianten Aminosäuren sind rot markiert.

b) Topologie des Helix-Loop-Helix-EF-Hand-Motivs.

c) Dreidimensionale Struktur von Calmodulin mit vier EF-Hand-Motiven.

d) Schema der Ligandenumgebung des Ca durch die Primärstruktur von Troponin C (Ausschnitt).

e) Strukturdarstellung der Ligandenumgebung. Die Liganden sind in ihrer Sequenzabfolge nummeriert.

Darstellungsverfahren von molekularen Strukturen am Beispiel von Insulin.

a) Die topologische Darstellung gibt den Verlauf der Sekundärstrukturelemente wieder. Hierbei werden die Helixanteile schematisch als Spiralen abgebildet (Abb. 2.15; noch einfacher als Spiralband oder Zylinder) und die Faltblattanteile als Streifen oder Pfeilsymbole dargestellt (Abb. 2.16).

b) Strichdarstellung des Insulins, bei der alle Aminosäureseitenketten mitgezeichnet sind.

c) Kalottenmodell. Die einzelnen Atome sind mit ihren Van-der-Waals-Radien repräsentiert.

d) Oberflächendarstellung des Moleküls (rot negative, blau positive Ladung).

Domänenstruktur der Pyruvat-Kinase.

a) Die verschiedenen Faltungseinheiten einer Polypeptidkette des tetrameren Proteins sind in unterschiedlichen Farben dargestellt. Einzelheiten im Text.

b) Organisation von Polypeptidketten in verschiedene Domänen, gezeigt am Beispiel von Proteasen der Blutgerinnung bzw. Fibrinolyse. Verschiedene kleine Proteinmoleküle bilden Module, die zum fertigen Protein kombiniert werden. Beim Prototyp Chymotrypsin formen zwei Domänen das aktive Enzym (insgesamt 243 Aminosäuren). Mit Chymotrypsin evolutionär verwandte Domänen sind auch bei Urokinase, Faktor IX und Plasminogen vorhanden. Weitere Module wie das dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) homologe Peptid (53 Aminosäuren), die etwa 85 Aminosäuren lange Kringle-Domäne und die Ca2+-bindende Domäne (auch Abb. 2.23e) werden linear vor die proteolytischen Module geschaltet.

Quartärstrukturen von Proteinen. Polypeptide können sich zu Oligomeren assoziieren.

a) Hexamere Struktur von Insulin (Monomerstruktur Abb. 2.25). Die sechs Polypeptidketten sind u.a. durch Bindung an ein binukleäres Zinkzentrum (blaue Kugeln in der Mitte) gebunden, wobei jedes Polypeptid mit einem Histidinliganden zur Koordinierung des Metalls beiträgt.

b) Tetramere Struktur von Pyruvat-Kinase (Monomerstruktur Abb. 2.26)

Verteilung der isomeren Formen der Lactat-Dehydrogenase in Geweben. Die Kombinationen der Isoformen M und H ergeben fünf verschiedene tetramere Enzyme

(a), deren gewebsspezifische Verteilung dargestellt ist

(b). Die Isoenzyme unterscheiden sich anhand ihrer isoelektrischen Punkte und können mit Ionenaustauschchromatographie oder durch Elektrophorese im Stärkegel oder auf Zelluloseacetatfolien voneinander getrennt und quantifiziert werden. Dies ist durch unterschiedliche Größe und Intensität der Kreise dargestellt.

Kovalente Modifikationen von Proteinen. Die Aminosäuren im Proteingerüst sind schwarz, die spezifischen Substituenten rot gezeichnet. Selenocystein (a), N-Formylmethionin (b), 3-Hydroxyprolin (c), 4-Hydroxyprolin (d), S-Farnesylcysteinmethylester (e), S-Palmitoylcystein (f), N-Myristoylglycin (g), Phosphoserin (h), Phosphotyrosin (i), N-Acetylglucosaminylasparagin (N-gekoppelter Zucker) (j), N-Acetylglucosaminylserin (O-gekoppelter Zucker) (k).

a) Faltungsintermediat (molten globule). Bei der Proteinfaltung bilden sich zuerst die Sekundärstrukturelemente der Polypeptidkette aus. Diese orientieren sich zunächst in einer relativ lockeren, wenig kondensierten Form, in der hydrophobe Oberflächen aneinandergelagert sind. Danach orientieren sich die Sekundärstrukturelemente in die stabile Tertiärstruktur um.

b–e) Energieflächenprofile bei der Faltung von Proteinen, dargestellt als Trichterdiagramm. Die Abbildung stellt die Energiezustände in verschiedensten Stadien auf dem Weg zum fertig gefalteten Protein dar (die Energie des Systems wird auf der senkrecht zur Kreisebene stehenden Achse angezeigt). Der Kreisradius ist ein Maß für die Kompaktheit des gefalteten Proteins. Je weiter der Faltungsprozess voranschreitet, je kleiner also der Radius wird, desto mehr verringert sich die Anzahl der verschiedenen Einstellmöglichkeiten: Der Kreisumfang wird immer kleiner. Mit fortschreitender Gestaltung des fertigen Proteins wird der Konformationsraum immer stärker eingeschränkt, bis im Endzustand nur noch eine mögliche Proteinkonformation übrig bleibt.

b) Flaches Profil. Proteine müssen lange suchen, bis sie in den Trichter hineinfallen.

c) Flaches Profil mit Rinne für bevorzugten Faltungsweg.

d) Steiles Profil. Proteine fallen aus allen möglichen Konformationszuständen ohne Umwege in den Trichter.

e) Steiles, aber unebenes Profil. Bevor die Proteine in den Trichter hinabfallen, müssen sie energetische Hindernisse überwinden.

Dreidimensionale Struktur des Prionproteins PrPC beim Rind. Man sieht das C-terminale Fragment, gezeigt sind nur die Aminosäuren 124–227. Das N-terminale Peptid bildet keine geordnete Struktur. PrPC hat überwiegend -helikale Sekundärstruktur. Bei der umgefalteten pathogenen Form PrPSc stellt man sich vor, dass der C-terminale Abschnitt im Gegensatz zur zellulären Form PrPC nur noch 30% -Helix-, aber 45% -Faltblatt-Anteil besitzt.

Fehlfaltungsmechanismen bei Proteinen.

a) Mechanismus der Prionenreplikation. Die spontane Umwandlung von PrPC (gelb) in PrPSc ist unter normalen Umständen ein seltener Prozess, da eine hohe Energiebarriere für die Umfaltung besteht. Durch Kontakt mit einem bereits präformierten infektiösen Prionenpartikel (oligomeres PrPSc) wird die Umfaltung stark begünstigt. Die weitere Anlagerung von PrPC führt zum Wachstum des PrPSc-Partikels bis zu einer kritischen Länge, die den Zerfall in Tochterpartikel zur Folge hat.

b) Kinetik der Bildung von Amyloidfibrillen (Keimbildungsmodell). Die Bildung von Amyloidfibrillen ist ein kooperativer Prozess ähnlich der Entstehung von Kristallen aus Kristallisationskeimen. Die Umwandlung der nativen (gelb) in die fehlgefaltete (blau) Monomerkonformation sowie die nachfolgenden Monomeranlagerungsschritte bis zur Formation eines Keims erfolgen langsam (Keimbildungsphase). Weitere Anlagerung von Monomeren an den einmal gebildeten Keim vollzieht sich dann erheblich schneller (Elongationsphase). Dieser Vorgang wird durch die blaue Kurve der Aggregatbildung dargestellt. In einer frühen Phase kann dieser Prozess durch Zugabe von Keimpartikeln drastisch beschleunigt werden (dargestellt durch die rote Kurve der Aggregatbildung).

Architektur von Membranproteinen und ihre Anordnung in der Lipiddoppelschicht. a, b) Periphere Membranproteine: Kovalente Anheftung über einen GPI-Anker (a) und über Kohlenwasserstoffketten (b; Fettsäuren, Isoprenoide).

c, d) Integrale Membranproteine, bei denen die Proteinmasse überwiegend im hydrophoben Bereich der Membranebene angesiedelt ist: einfach membrandurchspannendes Protein mit einer (c) oder zwei (d) unterschiedlich orientierten hydrophilen Domänen.

e) Mehrfach membrandurchspannendes Protein

Struktur von Rhodopsin. Rhodopsin ist aus sieben -helikalen Polypeptidabschnitten aufgebaut, die die Membran mehr oder weniger senkrecht durchqueren.

a) Laterale Ansicht in der Membranebene mit zeichnerisch ergänzten Lipiden.

b) Aufsicht desselben Moleküls (ohne Lipide). Es werden zwei Schichten von Polypeptidketten deutlich, die den kovalent an das Apoprotein gebundenen Cofaktor Retinal einbetten. Dieser ist in (c) in der im Grundzustand des Proteins vorkommenden Konformation gezeichnet.

d) -adrenerger Rezeptor mit gebundenem Ligand (blau). Der graue Anteil entspricht T4-Lysozym, das mit gentechnischen Methoden in den Rezeptor eingefügt wurde, um das Protein für Strukturuntersuchungen zu stabilisieren.

Hydropathiediagramm von Rhodopsin.

Biologischer Abbau von Proteinen. Ubiquitin, der Marker für abzubauende Proteine wird durch Bindung an Enzym 1 (E1) durch Ausbildung einer (Iso-)Peptidbindung kovalent gebunden und an das Enzym E2 weitergegeben, das einen Komplex mit spezifischen Erkennungsmolekülen (E3 bzw. F-Box-Proteine) für Substratproteine bildet: Nach Andocken an den Rezeptor empfangen die Zielproteine ein oder mehrere (kettenartig aneinandergehängte) Ubiquitinmoleküle und sind damit als Substrate für das Proteasom markiert. Das Substratprotein wird vom 26S-Proteasomkomplex aufgenommen, entfaltet und durch die im Inneren des Kernkomplexes gelagerten Proteasen in Oligopeptide bzw. Aminosäuren gespalten.

Peptidsynthese nach Merrifield. Auf einem Kunststoffpartikel (Polymerkügelchen) werden die Aminosäuren, vom C-Terminus ausgehend, Schritt für Schritt aneinandergeheftet. Die Carboxylgruppen werden durch Derivatisierung chemisch aktiviert (Carboxylaktivator). Schutzgruppen an den Aminogruppen sorgen dafür, dass nur das auf die Festphase geschichtete Peptid mit der Aminosäure und nicht die Aminosäuren in der Lösung untereinander gekoppelt werden. Zum Schluss wird das Peptid chemisch vom Kunstharzpartikel abgetrennt und chromatographisch gereinigt. Der Übersichtlichkeit halber sind in dieser schematischen Abbildung keine molekularen Details dargestellt. Einzelheiten kann man in Lehrbüchern der organischen Chemie nachlesen.

Prinzip der Zentrifugation.

a) In einem Ausschwingrotor werden die im Zentrifugenbecher suspendierten Fragmente im Schwerefeld aufgetrennt. Bestimmende Größen für die Trennungseigenschaften sind hierbei der Abstand des Zentrifugenbechers r von der Rotationsachse, die Umdrehungszahl des Rotors und der Sedimentationskoeffizient s des zu zentrifugierenden Partikels. Die Wanderungsgeschwindigkeit v des Partikels im Zentrifugalfeld errechnet sich aus der Gleichung v 2 r s. Je größer der Sedimentationskoeffizient s, desto schneller sedimentieren die Partikel.

b) Sedimentationskoeffizienten von subzellulären Partikeln und von gelösten Proteinen. Die Einheit des Sedimentationskoeffizienten s ist S (Svedberg). 1 S entspricht einem Wert von 1013 s.

c) Übersicht der differenziellen Zentrifugationstechnik. Aus dem Homogenat werden durch aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte schwere von leichten Partikeln abgetrennt. Im Überstand befindet sich nach der Ultrazentrifugation ( 100.000 g) das wässrig verdünnte Zytosol, aus dem sich in nachfolgenden Trennschritten direkt Proteine isolieren lassen.

Chromatographische Trennverfahren.

a) Prinzip der Gelfiltration. Die Makromoleküle können je nach Größe in die Poren der Gelkügelchen eindringen. Die Elution erfolgt durch einen Puffer mit konstanter Ionenstärke. Kleine Proteine verteilen sich im Porengeflecht, während große Moleküle aus den Poren ausgeschlossen sind und dadurch zuerst eluiert werden.

b) Prinzip der Ionenaustauscherchromatographie am Beispiel eines Anionenaustauschers. Die positiv geladenen Matrixkügelchen binden die anionischen Proteinmoleküle umso stärker, je höher ihr Ladungsgrad ist. Die Elution erfolgt durch Laufmittel mit ansteigender Salzkonzentration.

c) Prinzip der Affinitätschromatographie am Beispiel einer Nickel-Affinitätssäule. Ein komplexes Proteingemisch wird auf die Säule geladen, jedoch binden nur oligohistidinmarkierte Proteine an die auf Gelkugeln immobilisierten Nickelionen. Bei der Elution werden alle nichtbindenden Proteine herausgespült. Schließlich wird das gebundene Protein durch Verdrängung mit puffergelöstem Histidin oder Imidazol von der Säule gewaschen.

Solubilisierung von Membranproteinen.

a) Struktur einiger Detergenzien. Natriumdodecylsulfat (SDS von Sodium dodecylsulfate) ist ein denaturierendes Detergenz und wird für die Gelektrophorese eingesetzt. Andere Detergenzien (z.B. Triton X-100, Cholsäure oder n-Octylglucosid) bewahren die native Proteinstruktur und werden zur Solubilisierung und Reinigung mit chromatographischen Verfahren genutzt.

b) Prinzip der Solubilisierung von Membranproteinen durch amphiphile Substanzen. Die Detergenzien verdrängen durch ihre hydrophoben Enden die im natürlichen Zustand an der Oberfläche der Proteine bindenden Lipidmoleküle. Es bilden sich monodisperse Detergenz-Protein-Komplexe aus. Die polaren Enden der Detergenzien wechselwirken mit dem Lösungsmittel.

Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE).

a) Elektrophoreseapparat.

b) Polyacrylamid-Gel nach Trennung von Probenmolekülen und Molekülmassenmarkerproteinen.

c) Bestimmung der Molekülmasse eines Proteins aus der Eichkurve.

d) Zweidimensionale Gelelektrophorese eines Ganzzellextrakts löslicher Proteine aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis. In der ersten Dimension wurde eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Die Separation erfolgte im pH-Gradienten entsprechend der isoelektrischen Punkte der Proteine. Der Gelstreifen wurde ausgeschnitten und quer auf einem denaturierenden (SDS-)Elektrophoresegel nach der Molekülmasse getrennt.

Western-Blot.

a) Elektrotransfer vom Elektrophoresegel auf Membran. Die Apparatur besteht aus einem Puffertank, der ein Sandwich aus Elektroden, saugfähigem Papier, dem Elektrophoresegel und der Blottingmembran (Nitrozellulose) enthält. Der über die Elektroden auf das Elektrophoresegel geleitete elektrische Strom lässt die im Gel separierten Proteinmoleküle auf die Membran wandern, wo sie immobilisiert werden. Es entsteht ein Abklatsch des ursprünglich auf dem Gel erzeugten Proteinmusters. Die Blottingmembran wird dann mit spezifischen Indikatorsondenmolekülen inkubiert. Beim Immunoblot nimmt man zum spezifischen Proteinnachweis spezifische, primäre Antikörper gegen das zu detektierende Protein. Danach markiert man die Proteinflecken mit einem enzymgekoppelten sekundären Antikörper, der den primären Antikörper und damit das nachzuweisende Protein durch eine nachfolgende enzymatische Farbreaktion sichtbar macht.

b) Immunoblotting am Beispiel des Hamster-Prionproteins PrP. Der Test beruht auf der Resistenz des krankhaften Prionproteins gegenüber dem proteolytischen Enzym Proteinase K. Hirnextrakte von normalen (enthalten PrPC) und erkrankten (enthalten PrPC und PrPSc) Tieren wurden mit Proteinase K behandelt, auf einem denaturierenden Elektrophoresegel getrennt, auf Nitrozellulose geblottet und mit Antikörpern gegen PrP entwickelt. Normale Extrakte ohne (Bahn 1) und nach erfolgter Proteinase-K-Behandlung (Bahn 2). Bahn 3: krankhafte Extrakte ohne erfolgte Proteinase-K-Behandlung und nach Behandlung (Bahn 4). Das ausbleibende Signal des PrP in Bahn 2 und die Existenz einer deutlichen Bande in Bahn 4 sprechen dafür, dass das erkrankte Tier proteaseresistentes PrPSc aufweist.

MALDI-Massenspektroskopie.

a) Funktionsprinzip. Die in eine lichtempfindliche Matrix eingebettete Probe wird durch Laserblitz desorbiert und im elektrischen Feld beschleunigt. Je leichter die Moleküle bei gleicher Ladung sind, umso schneller fliegen sie zum Detektor, sodass sich die Molmasse aus der Flugzeit ergibt.

b) Massenspektrometrische Analyse eines Gemischs aus Cytochrom c, Ubiquitin und Myoglobin.

c) Massenfingerprint von Ovalbumin nach tryptischem Verdau.

Aufklärung dreidimensionaler Strukturen mittels Röntgenkristallographie.

a) Mithilfe des Hanging-drop-Verfahrens wird durch Dampfdiffusion die Proteinlösung langsam, innerhalb von Tagen bis Wochen, aufkonzentriert, bis sich die Moleküle zu Kristallen anordnen.

b) Photographie eines in einem Hanging drop gebildeten Proteinkristalls (Länge ca. 250 m).

c) Schematischer Aufbau eines Röntgendiffraktometers. Die von der Röntgenquelle ausgehenden Strahlen treffen auf den Proteinkristall und werden aufgrund der regelmäßigen Struktur des Kristalls gestreut.

d) Die von den Streuzentren des Kristalls ausgehenden Röntgenstrahlen erzeugen ein für das Protein typisches Beugungsbild. (b) und (d) stammen vom menschlichen RAN-Protein (bereits in Abb. 2.12 erwähnt).

Struktur der 20 proteinogenen Aminosäuren, eingeteilt nach den Hauptsubstanzklassen

Tab. 2.1
Trivialname Dreibuchstabencode Einbuchstabencode Molekülmasse pKa-Wert Hydropathieindex Seitenkette R
hydrophobe Aminosäuren, aliphatisch
Glycin Gly G 57 0,4
Alanin Ala A 71 1,8
Valin Val V 99 4,2
Cystein Cys C 103 2,5
Methionin Met M 131 1,9
Isoleucin Ile I 113 4,5
Leucin Leu L 113 3,8
aromatisch
Phenylalanin Phe F 147 2,8
aromatisch
Tyrosin Tyr Y 163 1,3
Tryptophan Trp W 186 0,9
hydrophile Aminosäuren, neutral
Serin Ser S 87 0,8
Threonin Thr T 101 0,7
Prolin (Iminosäure) Pro P 97 1,6
Asparagin Asn N 114 3,5
Glutamin Gln Q 128 3,5
Histidin His H 137 6,0 3,2
geladen (bei physiologischem pH)
Asparaginsäure Asp D 114 3,9 3,5
Glutaminsäure Glu E 128 4,1 3,5
Lysin Lys K 129 10,6 3,9
Arginin Arg R 157 12,5 4,5

Neben dem Trivialnamen sind der Drei- und der Einbuchstabencode aufgeführt. Letzterer erscheint nicht immer logisch, weil man aufgrund gleicher Anfangsbuchstaben der Trivialnamen schwer zu merkende Kürzel eingeführt hat. Alle -Aminosäuren haben dieselbe Grundstruktur (Abb. 2.1a) und besitzen individuelle Seitenketten (Reste), die für die spezifischen Eigenschaften der Moleküle verantwortlich sind. Außerdem sind die Hydropathieindizes angegeben. Die Werte geben den Grad an Hydrophobie einzelner Aminosäurereste an. Polare Reste haben sogar negative Werte (äußerst geringe Hydrophobie). Neben den Molekülmassen sind bei protonierbaren Aminosäuren auch die pKa-Werte aufgelistet.

pKa-Werte und isoelektrische Punkte der Aminosäuren Alanin, Asparaginsäure und Lysin

Tab. 2.2
Aminosäure Art der Seitenkette pKa-Wert -COOH -NH3+ -COOH -NH3+ isoelektrischer Punkt arithmetisch gemittelt aus
Alanin CH3-Gruppe nicht protonierbar 2,3 9,8 6,0 -COOH und -NH3+
Asparaginsäure –COOH 2,1 9,8 3,9 3,0 -COOH und -COOH
Lysin –NH3 + 2,1 9,0 10,6 9,8 -NH3+ und -NH3+

Beispiele biologisch wirksamer Peptide

Tab. 2.3
Name Strukturmerkmal Funktion
Glutathion -Glutamat-Cystein-Glycin (Tripeptid) Thiolpuffer, in Erythrozyten hält es Cysteinreste von Proteinen im reduzierten Zustand und stabilisiert den zweiwertigen Zustand des Eisens
Vasopressin 9 Aminosäuren mit 1 Disulfidbrücke stimuliert die Rückresorption von Wasser in die distalen Tubuli der Niere (antidiuretisches Hormon)
Ciclosporin (aus Pilzen) 11 teilweise modifizierte Aminosäuren, zyklisch unterdrückt die Abstoßungsreaktion bei Transplantationen
Glucagon 29 Aminosäuren stimuliert den Glykogenabbau und erhöht damit den Blutzuckerspiegel
Insulin 2 Peptidketten: A-Kette mit 21 Aminosäuren, B-Kette mit 30 Aminosäuren, 3 Disulfidbrücken stimuliert die Glykogensynthese und senkt damit den Blutzuckerspiegel
Adenocorticotropin (ACTH) 39 Aminosäuren stimuliert Umwandlung von Cholesterin in Pregnenolon
epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) 53 Aminosäuren mit 3 Disulfidbrücken regt das Wachstum von Epidermis- und Epithelzellen an
-Amanitin aus Knollenblätterpilz 8 teilweise ungewöhnliche Aminosäuren, zyklisch tödliches Gift, bindet an RNA-Polymerase II und blockiert Bildung von mRNA

Strukturstabilisierende Wechselwirkungen in Peptiden und Proteinen

Tab. 2.4
Art Bindungsenergie/kJmol-1 Bindungscharakter beteiligte Gruppen
Einfachbindung (zum Vergleich) 360 kovalent Kohlenstoffatome (-C–C-)
Disulfidbrücke 170 kovalent Schwefelatome von Cystein (-S–S-)
ionische Bindung 12–17 elektrostatisch positiv und negativ geladene Reste
dipolare Wechselwirkung < 12 elektrostatisch polare Reste
Wasserstoffbrücke 2–6 kovalent/elektrostatisch Peptidgruppen CO und N–H; polare und geladene Reste
hydrophobe Wechselwirkung 4 temporär elektrostatisch aliphatische und aromatische hydrophobe Reste

Strukturparameter von Sekundärstrukturelementen

Tab. 2.5
Sekundärstrukturelement Bindungswinkel Periode (Reste pro Wiederholungseinheit) Vorschub pro Rest (nm)
-Helix 57 47 3,6 0,15
310-Helix 49 26 3,0 0,20
-Helix 57 70 4,4 0,115
-Faltblatt/antiparallel 139 +135 2,0 0,34
-Faltblatt/parallel 119 +113 2,0 0,32

Proteine

M. Lübben

  • 2.1

    Aminosäuren und Peptide 32

  • 2.1.1

    Struktur der Aminosäuren32

  • 2.1.2

    Allgemeine Eigenschaften von Aminosäuren33

  • 2.1.3

    Peptidbindung39

  • 2.2

    Aufbau von Proteinen 41

  • 2.2.1

    Primärstruktur42

  • 2.2.2

    Stabilisierende Wechselwirkungen45

  • 2.2.3

    Sekundärstrukturen48

  • 2.2.4

    Supersekundärstrukturen51

  • 2.2.5

    Tertiärstruktur54

  • 2.2.6

    Quartärstruktur58

  • 2.3

    Posttranslationale Zustandsänderungen 59

  • 2.3.1

    Proteinmodifikationen59

  • 2.3.2

    Faltung von Proteinen62

  • 2.3.3

    Membranproteine65

  • 2.4

    Biologischer Abbau von Proteinen 68

  • 2.5

    Isolierung und Charakterisierung von Proteinen 69

Praxisfall

Herr und Frau K. sind seit über 56 Jahren verheiratet. Immer schon hat Frau K. den gemeinsamen Haushalt geführt und ihren schwer gehbehinderten Ehemann versorgt. In den letzten Monaten ist Frau K. jedoch sehr vergesslich geworden. Minttlerweile ist sie unentwegt auf der Suche nach gewöhnlichen Gebrauchsgegenständen, und häufig steht sie dafür sogar nachts auf. Obwohl sie es gegenüber ihrem Arzt und ihren Angehörigen nicht zugeben will, hat sie große Schwierigkeiten, einfache Alltagsverrichtungen zu bewältigen. Ihre zeitliche und räumliche Orientierung ist stark eingeschränkt, und ihr Erleben und Empfinden ist phasenweise stark vergangenheitsverhaftet. Auffällig ist auch, dass sie vertraute Personen, wie ihre Schwiegertochter und ihre Enkel, immer öfter nicht erkennt. Trotz erheblichen Widerwillens der Patientin weist der Hausarzt Frau K. in die gerontopsychiatrische Abteilung des städtischen Krankenhauses ein, um den erkennbaren Demenzzustand diagnostisch zu klären. Die Kernspin- und Computertomographien ergeben keine Auffälligkeiten. Neuropsychologische Tests bestätigen, dass Frau K. einen schweren Verlust von Gehirn- und Gedächtnisleistungen hat, der typischerweise bei Morbus Alzheimer auftritt. Diese Krankheit ist durch massive Ablagerungen des von einem Vorläuferprotein abgespaltenen Amyloid--Peptids im Extrazellularraum des Hirns gekennzeichnet. Parallel zur Einleitung sozialtherapeutischer Maßnahmen erhält Frau K. eine medikamentöse Behandlung mit Acetylcholinesterasehemmern, wodurch die Krankheit zwar nicht geheilt, ihr Fortschreiten aber verlangsamt wird.

Zur Orientierung

Proteine stellen die vielseitigste und wichtigste Klasse von Biomolekülen dar. Ihr kaum vorstellbarer Variantenreichtum kommt durch ein sehr einfaches Bauprinzip zustande, das auf der Verknüpfung von nur 20 Aminosäuren basiert und die Faltung in zahlreiche Raumstrukturen ermöglicht. Proteine bestimmen maßgeblich die äußere und innere Gestalt sowie die Funktionen von Organismen, Organen, Zellen und subzellulären Organisationsformen – im gesunden wie im krankhaften Zustand. Um grundlegende Prozesse und Zusammenhänge des Lebens zu begreifen, muss man letztlich auf molekularer Ebene die Proteine verstehen, die direkt oder indirekt an normalen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Hier liegt der Schlüssel zur Entwicklung von Strategien, um Krankheiten wirksam bekämpfen zu können.

Das Gesamtinventar der Proteine einer Zelle ist in der DNA kodiert. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms sowie die bisher erfolgte Auswertung und Interpretation des genomischen Informationsgehalts verdeutlichen die immense Vielfalt. Biochemiker und Mediziner haben das ehrgeizige Ziel, Strukturen und molekulare Mechanismen möglichst aller Proteine zu entschlüsseln; allerdings wird das noch viele Jahre dauern.

Aminosäuren und Peptide

Struktur der Aminosäuren

Aufbau
Die Grundbausteine aller bakteriellen, pflanzlichen und tierischen Proteine sind die 20 sog. proteinogenen Aminosäuren (Standardaminosäuren). Von den etwa 500 natürlich vorkommenden Aminosäuren sind sie diejenigen, die durch den genetischen Code spezifiziert werden. Alle proteinogenen Aminosäuren haben den gleichen Grundaufbau (Abb. 2.1a). Sie bestehen aus einer Carboxylgruppe (–COOH) und einer Aminogruppe (–NH2), die an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden sind. Da sich die Nomenklatur der Kohlenstoffatome nach der Position relativ zur COOH-Gruppe richtet, nennt man dieses Kohlenstoffatom auch C. Daran anschließende Kohlenstoffe werden ihrer Reihenfolge entsprechend mit C, C, C, C usw. bezeichnet. Eine analoge Nomenklatur gilt für gebundene funktionelle Gruppen. Außer der Carboxyl- und der Aminogruppe sind an das C-Atom noch ein Wasserstoffatom und ein mit –R bezeichneter spezifischer Rest gebunden, der die charakteristischen Eigenschaften der Aminosäure prägt und als Seitenkette bezeichnet wird.
Das C-Atom ist räumlich von vier Substituenten umgeben. Man kann es sich in der Mitte eines Tetraeders platziert vorstellen, an dessen Ecken die Bindungspartner liegen (Abb. 2.1b). In der als Fischer-Projektion bezeichneten Schreibweise (Abb. 2.1c) wird die dreidimensionale Tetraederstruktur als zweidimensionale – also als auf die Papierebene projizierte – Anordnung wiedergegeben.
Stereochemie
Die vier Substituenten des C-Atoms sind verschieden (man spricht auch von asymmetrischer Substitution), es gibt daher zwei verschiedene Möglichkeiten, die vier Substituenten im Raum anzuordnen. Beide Formen lassen sich nicht miteinander zur Deckung bringen und verhalten sich wie Bild und Spiegelbild (Abb. 2.2). Das C-Atom bildet ein sog. chirales Zentrum. Die beiden zueinander spiegelbildlichen Isomere (D- und L-Form) werden auch als Enantiomere bezeichnet.
Von den beiden möglichen Konfigurationen am C-Atom ist für die Biochemie der Aminosäuren die L-Form wichtig. Alle proteinogenen Aminosäuren haben diese L-Konfiguration, und alle bekannten Proteine sind aus ihnen aufgebaut. Warum diese Konfiguration von der Natur so einseitig bevorzugt wird, ist unbekannt.
Stereochemische Nomenklatur Zur eindeutigen Bezeichnung der Enantiomerenkonfiguration wird in der organischen Chemie heutzutage auch die R/S-Schreibweise verwendet. Diese von Cahn, Ingold und Prelog vorgeschlagene Nomenklatur gibt den Orientierungssinn einer Drehung wieder, der sich bei Betrachtung des Tetraeders aus der Reihenfolge ergibt, in der die Substituenten nach abnehmender Priorität gebunden sind (zu den sog. Prioritätsregeln, nach denen die Gruppen sortiert werden, Lehrbücher der Chemie). Die Symbole R (rectus) und S (sinister) entsprechen bei den Aminosäuren prinzipiell den älteren Bezeichnungen D (dexter) und L (laevus). Die Begriffe der D- und L-Form wurden ursprünglich aus der Fähigkeit der reinen Enantiomere abgeleitet, die Ebene von eingestrahltem linear polarisiertem Licht nach rechts (+) oder links (–) zu drehen. Man nennt asymmetrisch substituierte Kohlenstoffatome, die dieses Phänomen verursachen, deshalb auch optische Zentren.
In einem Isomerengemisch aus gleichen Anteilen der Enantiomere, einem sog. Racemat, heben sich die beiden Beiträge der entgegengesetzten Drehrichtungen und damit die optische Aktivität auf. Aus der Drehrichtung + oder – kann man aber nicht automatisch ableiten, ob es sich um die D- oder L-Konfiguration handelt, daher war die Einführung einer weniger irreführenden Nomenklatur sinnvoll. Sie hat sich jedoch bei Aminosäuren noch nicht durchgesetzt.

Schon gewusst

D-Aminosäuren wurden als Bestandteile in einigen mikrobiellen Antibiotika (z.B. dem Ionophor Valinomycin (D-Valin, Abb. 2.3), aber auch als Bausteine von bakteriellen Zellwänden (D-Alanin und D-Glutaminsäure) identifiziert.

MERKE

Das gemeinsame Merkmal der -Aminosäuren sind die am C gelegene Carboxyl- und Aminogruppe. Das C-Atom in biogenen Aminosäuren liegt überwiegend in der stereochemischen L-Konfiguration vor.

Struktur und Klassifikation proteinogener Aminosäuren
Die biologisch vorkommenden Aminosäuren unterscheiden sich in der Struktur der Seitenkette –R. In der Regel werden nur 20 verschiedene Aminosäuren zum Aufbau der Proteine benutzt. Man bezeichnet sie deshalb als proteinogene Aminosäuren (Tab. 2.1). Ausnahmen sind durch posttranslationale Modifikationen veränderte Aminosäuren (unten) und das seltene Selenocystein sowie bei bestimmten Mikroorganismen das Pyrrolysin. Neben dem Trivialnamen hat es sich als praktisch erwiesen, für die Aminosäuren eine Abkürzungsschreibweise einzuführen, den Dreibuchstaben- und den Einbuchstabencode (Tab. 2.1).

Allgemeine Eigenschaften von Aminosäuren

Chemische Eigenschaften
Grundsätzlich kann man die Reste in zwei Klassen einteilen, je nachdem, wie sie die Löslichkeit der Aminosäure in Wasser vermitteln können (Tab. 2.1).
Hydrophobe Aminosäuren Diese wasserabweisenden Aminosäuren zeichnen sich durch mehr oder weniger lange Kohlenwasserstoffketten aus, die durch aufeinanderfolgende CH2-Gruppen gekennzeichnet sind. Man nennt sie auch aliphatische Aminosäuren. Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin gehören zu den typischen Vertretern dieser Gruppe. Eine gewisse Sonderstellung nimmt Glycin ein, das als Rest nur ein Wasserstoffatom enthält, relativ gut wasserlöslich ist und außerdem keine Enantiomeren bildet, weil zwei der vier Substituenten an C identisch sind (Wasserstoff). Auffällig sind außerdem die schwefelhaltige Aminosäure Methionin, bei der die Kohlenstoffkette durch ein Schwefelatom unterbrochen wird, und die sog. Iminosäure Prolin, deren Aminostickstoff jeweils einbindig mit dem C- und dem C-Atom verbunden ist und ein Imin ausbildet, sodass sich eine ringförmig geschlossene Kette formt. Auch die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan (Tab. 2.1) sind hydrophob. Ihre Reste bestehen aus einem carbozyklischen Ring, der nur aus Kohlenstoffatomen gebildet wird, oder aus zwei heterozyklischen Ringen, die dann außer Kohlenstoff noch ein anderes Atom enthalten, wie hier Stickstoff. Solche Ringsysteme werden in der organischen Chemie als Aromaten bezeichnet. Aufgrund der energetischen Lage ihrer - und *-Orbitale können die Aromaten ultraviolettes Licht absorbieren (Abb. 2.4).
Hydrophile Aminosäuren Die wasserliebenden bzw. -bindenden Aminosäuren verfügen über polare Reste, die gute Löslichkeit vermitteln (Tab. 2.1). Serin und Threonin zählen aufgrund ihrer undissoziierten OH-Gruppen zu den neutralen hydrophilen Aminosäuren. Eine weitere neutrale Aminosäure ist die schwefelhaltige Aminosäure Cystein, da die Thiolgruppe, deren pKa-Wert bei ungefähr 8 liegt, bei physiologischem pH undissoziiert ist. Histidin kann bei physiologischem pH-Wert teilweise auch in geladener Form vorliegen, weil sich die Aminosäureseitenkette aufgrund der freien Elektronenpaare am Stickstoff basisch verhält (pKa 6) und demzufolge ein gewisser Anteil der Moleküle ein Proton binden kann. Diese Basizität ist z.B. in aktiven Zentren von Enzymen nützlich, in denen basenkatalysierte Reaktionen ablaufen. Deutlich polaren Charakter haben Glutamin und Asparagin, die zwar aliphatische Seitenketten haben, an deren Enden sich aber die stark polarisierte Säureamidgruppe –CONH2 befindet.
Besonders ausgeprägte Ladungseigenschaften besitzen die sauren Aminosäuren Glutaminsäure und Asparaginsäure, deren Seitenketten bei physiologischem pH dissoziiert in anionischer, also negativ geladener Form vorliegen. Ähnliches gilt für die basischen Aminosäuren Lysin und Arginin, die unter den gleichen Bedingungen Protonen binden können und kationisch sind, also eine positive Ladung tragen.
Aufgrund ihrer Heterogenität lassen sich die Aminosäuren also nicht immer leicht in ein Klassifizierungsschema fassen. Die aromatische Aminosäure Tyrosin hat aufgrund ihrer OH-Gruppe natürlich einen gewissen polaren Charakter. Andererseits müsste man Histidin streng genommen als Aromat einstufen, da der Imidazolrest die formalen chemischen Kriterien der Aromatizität erfüllt. Histidin hat allerdings praktisch keine Extinktion bei 280 nm. Aufgrund der teilweisen Protonierung bei neutralem pH-Wert kann man es sogar zu den geladenen Aminosäuren zählen.

MERKE

Die biologisch relevanten 20 proteinogenen L--Aminosäuren sind strukturell nach einem einheitlichen Grundprinzip aufgebaut. Ihre chemischen Eigenschaften werden von den funktionellen Gruppen der individuellen Reste R bestimmt.

Blick ins Labor

Aromatische Aminosäuren absorbieren Licht im für den Menschen unsichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Sie verleihen diese Eigenschaft auch an die von ihnen aufgebauten Proteine. Für die Ultraviolettabsorption der meisten Proteine bei etwa 280 nm sind die intensiven Absorptionsmaxima von Tryptophan und Tyrosin bei dieser Wellenlänge verantwortlich (Abb. 2.4). Die Spektralphotometrie macht sich dieses Prinzip zur qualitativen und quantitativen Stoffanalyse zunutze. Ein Maß für die Eigenschaft einer Probe, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren, ist die Extinktion (in der englischsprachigen Literatur auch Absorption). Diese Eigenschaft wird als Extinktionsspektrum, oder Absorptionsspektrum, graphisch dargestellt, indem die Extinktion über der Absorptionswellenlänge aufgetragen wird (Abb. 2.4). Der Name Extinktion bezieht sich auf die (teilweise) Auslöschung des eingestrahlten Anregungslichts nach Passage der Probe. Man misst das Verhältnis (I0/I) der Intensitäten des eingestrahlten (I0) und des austretenden Lichts (I). Der Logarithmus dieses Intensitätsverhältnisses log (I0/I) ist die Extinktion (E), für die das Lambert-Beer-Gesetz gilt:

log I0/I E c d

Die Extinktion ist proportional zur molaren Konzentration des gelösten Stoffs c (in mol L1 oder M) und zur Schichtdicke d der Probe (in cm, der Dicke von Probenküvetten). Die Proportionalitätskonstante wird als Extinktionskoeffizient bezeichnet und ist eine stoffspezifische Konstante. Da die Extinktion eine dimensionslose Größe ist, muss der Extinktionskoeffizient die Einheit mol1 Lcm1 besitzen. Neben den Aminosäuren absorbieren viele biologische Moleküle Licht im ultravioletten und ggf. auch im sichtbaren Wellenlängenbereich; aus der Lage der Extinktionsmaxima kann man diese Stoffe qualitativ nachweisen. Voraussetzung zur quantitativen Bestimmung mithilfe der Extinktion ist die Kenntnis der substanzspezifischen Extinktionskoeffizienten. Nichtaromatische Aminosäuren haben praktisch keine Absorption im Wellenlängenbereich von 240 bis 300 nm.

Neben der Absorption zeigen die aromatischen Aminosäuren auch Fluoreszenz. Dieses physikalische Phänomen beruht in der Wiederaussendung eines absorbierten Lichtquants mit verminderter Energie. Mit geeigneten Detektoren erlaubt die Fluoreszenz Nachweise von Aminosäuren und Proteinen mit erheblich höherer Empfindlichkeit.

Säure-Base-Eigenschaften von Aminosäuren
Im Lösungsmittel Wasser bilden Aminosäuren ein Protolysegleichgewicht aus. Die Carboxyl- und Aminogruppen am C-Atom reagieren mit Wasser, sie können also protoniert oder deprotoniert werden. Die Carboxylgruppe hat einen niedrigen pKa-Wert (Tab. 2.2) und verhält sich nach der Gleichung:
–COOH + H2O –COO + H3O+ (Protonierung von Wasser, Deprotonierung der Carboxylgruppe)
Die Aminogruppe dagegen reagiert basisch, hat also einen hohen pKa-Wert (Tab. 2.2) und nimmt ein Proton auf, das z.B. vom Wasser kommt:
–NH2 + H2O –NH3+ + OH (Protonierung der Aminogruppe, Deprotonierung von Wasser)
Weil sie Protonen sowohl aufnehmen als auch abgeben können, gehören die Aminosäuren zu den Ampholyten. Wegen ihrer Grundarchitektur haben die Carboxylgruppe schwach sauren und die Aminogruppe einen schwach basischen Charakter.
Für die mathematische Beschreibung gilt die Henderson-Hasselbalch-Gleichung, die die Puffereigenschaften eines konjugierten Säure-Base-Paars angibt:
pH pKa + log [Base] Säure
Die Pufferwirkung hängt vom Logarithmus des Konzentrationsverhältnisses [Base]/[Säure] ab und ist optimal bei pH pKa. Dies zeigt die Titrationskurve von Alanin in Abb. 2.5. Bei niedrigem pH-Wert sind die beiden funktionellen Gruppen protoniert, es sind also zwei Protonen pro Alanin gebunden. Durch sukzessive Zugabe von OH-Ionen erhöht sich der pH-Wert, ein Proton wird abgegeben. In Abschnitten der höchsten Kurvensteilheit verursachen Änderungen des Protonierungsgrads die geringsten Änderungen im pH-Wert. Die Pufferwirkung der -Carboxylgruppe ist bei pKa 2,3 am stärksten. Dies gilt auch für den basischen Bereich der pH-Skala: Wenn der pH dem pKa-Wert der -Aminogruppe entspricht (pKa 9,7), ist auch hier das Maximum des Puffereffekts erreicht.

MERKE

Aminosäuren verhalten sich ampholytisch, d.h., sie können Protonen aufnehmen oder abgeben. Demnach sind sie sowohl Basen als auch Säuren.

Isoelektrischer Punkt (IEP)
Zwischen den beiden pKa-Werten der Carboxyl- und Aminogruppe liegt ein Bereich, in dem kleinste Änderungen des Protonierungsgrads zu erheblichen Schwankungen des pH-Werts führen (Abb. 2.5). Hier erreicht die Pufferkapazität ein Minimum, und der Wendepunkt der Kurve entspricht dem isoelektrischen Punkt (IEP) von Alanin. Der IEP markiert den pH-Wert, bei dem die Aminosäure sowohl einfach positiv als auch einfach negativ geladen ist, also als Zwitterion mit einer Nettoladung von null vorliegt (Abb. 2.6). Im elektrischen Feld würde die Aminosäure also weder wie ein negativ geladenes Anion noch wie ein positiv geladenes Kation wandern, sondern wäre wegen der Ladungskompensation nach außen hin neutral und bliebe stehen. Man kann den isoelektrischen Punkt von Alanin aus dem arithmetischen Mittel der beiden pKa-Werte berechnen (Tab. 2.2).
Anders sieht die Situation bei Asparaginsäure aus, die eine zusätzliche Carboxylgruppe in der -Position enthält. Der pKa-Wert liegt aufgrund des +I-Effekts der Methylengruppe mit 3,9 etwas höher als der pKa-Wert des -COOH, daher wird der IEP dieser Aminosäure bei völliger Protonierung der Aminogruppe nur noch durch den jeweiligen Protonierungsgrad der beiden Carboxylgruppen bestimmt. Der +I-Effekt (induktiver Effekt) beruht von einer Ladungsasymmetrie von Methyl- und Methylengruppen, die von unterschiedlichen Elektronegativitäten von Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen stammt. Folge ist eine stärkere negative Partialladung am Kohlenstoff, welche die positiv geladenen Protonen der benachbarten Carboxylgruppe besser festhalten kann, daher der erhöhte pKa-Wert. Rechnerisch erfasst man den IEP durch das arithmetische Mittel von den pKa-Werten beider Carboxylgruppen. Er ist somit in den sauren Bereich verschoben: Am IEP von 3,0 ist die Aminogruppe zu 100% protoniert, die beiden Carboxylgruppen sind dagegen nur zu je 11,2 bzw. 88,8% deprotoniert (Abb. 2.6).
Bei Lysin ist die Situation genau entgegengesetzt. Ist die -Carboxylgruppe vollständig deprotoniert, dann ist der jeweilige Protonierungsgrad der beiden Aminogruppen für die Festlegung des IEP verantwortlich: Die -Aminogruppe mit einem pKa-Wert von 10,6 verschiebt den IEP auf einen Wert von 9,8 (arithmetisches Mittel der pKa-Werte von beiden Aminogruppen). Bei pH IEP ist die Carboxylgruppe zu 100% ionisiert, wogegen sich die kompensatorische positive Ladung zu 13,7 bzw. 86,3% auf die beiden Aminogruppen verteilt (Abb. 2.6).

MERKE

Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Nettoladung von Aminosäuren gleich null.

Pufferwirkung
Neben verschiedenen anorganischen Puffersystemen wie Hydrogen/Dihydrogenphosphat oder Kohlendioxid/Bicarbonat tragen Proteine zur pH-Stabilisierung im intra- und extrazellulären Raum bei, wenn auch nur äußerst geringfügig. Aus der Henderson-Hasselbalch-Gleichung folgt, dass die Pufferwirkung des betrachteten Systems bei pH pKa am größten ist, weil an diesem Punkt die pH-Änderungen bei Zugabe einer definierten Säure- oder Basedosis minimal sind. Betrachtet man die pKa-Werte der Aminosäurereste (Tab. 2.2), so puffern im physiologischen pH-Bereich nur die Aminosäuren Histidin und Cystein. Außerhalb des pKa-Bereichs ihrer -Amino- und -Carboxylgruppen haben Aminosäuren mit ungeladenen Resten überhaupt keine Pufferwirkung.

MERKE

Im Vergleich zu den anorganischen Säure-Base-Paaren ist bei physiologischem pH-Wert der Beitrag von Aminosäureseitenketten zur Gesamtpufferwirkung im Blut geringfügig.

Blick ins Labor

Der qualitative und quantitative Nachweis von Aminosäuren wird mit chromatographischen Methoden durchgeführt. Es handelt sich hierbei um ein Trennverfahren, bei dem sich die Komponenten eines zu trennenden komplexen Gemischs in verschiedene Phasen aufteilen. Unter Phasen versteht man nicht miteinander mischbare Stoffe mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. Bei der sog. Verteilungschromatographie besteht eine der Phasen aus festem Material, meist ein Pulver oder Gel mit bindenden Oberflächeneigenschaften. Man nennt sie deshalb feste oder auch stationäre Phase. Die andere, flüssige oder mobile Phase wird von einer Flüssigkeit gebildet. Mobile und stationäre Phase unterscheiden sich in ihren chemischen Eigenschaften, z.B. der Hydrophobie. Die chromatographische Trennung erfolgt, weil die zu trennenden Stoffe unterschiedliche Affinitäten zu den Phasen haben, je nachdem, ob sie selbst stärker oder schwächer hydrophob sind (Tab. 2.1). Bei der Entwicklung des Chromatogramms, im Fall der Säulenchromatographie auch Elution genannt, reichern sich die aufzutrennenden Stoffe aus dem Gemisch in einer der beiden Phasen an. Sie verteilen sich also auf die Phasen, bis sie völlig voneinander separiert sind. Früher hat man fast ausschließlich über Dünnschichtchromatographie getrennt, mit einem lösungsmittelbenetzten Kieselgelpartikel als stationäre Phase und einer mobilen Phase aus Lösungsmittelgemisch. Der Nachweis erfolgte über Sprühreagenzien, die eine kovalente Bindung mit den Aminosäuren eingehen. Ein Beispiel hierfür ist die Ninhydrinreaktion. Das Verfahren hat allerdings eine relativ geringe Reproduzierbarkeit und lässt sich schlecht automatisieren, sodass heutzutage zur Aminosäuretrennung überwiegend die sog. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt wird (HPLC von high performance liquid chromatography, Abb. 2.7a).

HPLC-Technik. Bei diesem säulenchromatographischen Verfahren (Abb. 2.7a) dienen mit Kohlenwasserstoff-(Octadecyl-)Gruppen kovalent modifizierte Kieselgele als stationäre Phase (reversed phase). Das an sich polare Kieselgel ist durch Kohlenwasserstoffbindung stark hydrophobisiert, deshalb binden sich die Aminosäuren zunächst daran. Die Elution erfolgt mit der mobilen Phase, einem hydrophoben Lösungsmittelgemisch, das durch die Trennsäule über die stationäre Phase geleitet wird. Je größer die Hydrophobie einer Aminosäure, umso höher ist ihr Bindungsvermögen an das Säulenmaterial, und ein umso größeres Eluentenvolumen muss die Säule durchströmen, damit sich die Aminosäure von der stationären Phase ablöst. Bei gegebener Flussrate dient die Retentionszeit als Kenngröße zur Identifikation einer Komponente. Abb. 2.7b zeigt ein typisches Chromatogramm einer Aminosäuretrennung. Die einzelnen Komponenten werden durch eine chemische Derivatisierungsreaktion für den Detektor sichtbar gemacht, da nur wenige Aminosäuren charakteristische Absorptions- oder Fluoreszenzeigenschaften besitzen.

Aminosäuren als Stoffwechselintermediate und Botenstoffe
Neben den proteinogenen Aminosäuren gibt es noch eine Reihe von ähnlich aufgebauten Substanzen, die nicht in Proteinen erscheinen, aber als -, - oder -Aminosäuren wichtige Intermediate in Stoffwechselwegen darstellen. Außerdem können sie als Bestandteile in Coenzymen oder als Signalüberträger vorkommen. Vertreter dieser Gruppe sind u.a. Ornithin und Citrullin, die in dem für die Stickstoffelimination notwendigen Harnstoffzyklus anfallen. -Alanin ist eine Vorstufe für das komplex aufgebaute Coenzym A. Im Unterschied zur proteinogenen Aminosäure -Alanin befindet sich die Aminogruppe am -Kohlenstoffatom. Bestimmte Aminosäuren wie Glutamat, Glycin, GABA (-Aminobuttersäure) und Taurin haben in freier Form eine wichtige Funktion als Botenstoffe im zentralen Nervensystem. Als Signalüberträger kommt außerdem eine Reihe von Derivaten der Aminosäuren in Betracht, die durch Decarboxylierung entstehen und als biogene Amine bezeichnet werden (Abb. 2.8).
Essenzielle Aminosäuren
Nur Mikroorganismen können alle proteinogenen Aminosäuren selbst herstellen. Für den menschlichen Organismus sind einige davon essenziell, d.h., wir müssen sie mit der Nahrung zuführen. Hierzu gehören die aromatischen und die verzweigtkettigen Aminosäuren sowie Methionin, Lysin, Histidin und Threonin. Alle übrigen kann der Mensch selbst biosynthetisch herstellen. Einige dieser endogen erzeugten Aminosäuren werden auch als semi-essenziell bezeichnet, da sie nur unter bestimmten Bedingungen, z.B. im Wachstum oder bei Krankheit, zugeführt werden müssen.

Schon gewusst

Künstlich hergestellte Aminosäuren sind medizinisch wichtig, weil sie für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Patienten, die künstlich (parenteral) ernährt werden müssen, z.B. aufgrund von Darmerkrankungen, bekommen sie als Infusionslösungen. Wenn Aminosäuren für diese Zwecke synthetisch hergestellt werden, fallen dabei allerdings meist Gemische von gleichen Anteilen der D- und L-Isomere an. Die chemische Produktion bzw. Isolation von stereoisomeren Aminosäuren ist aufwändig und ziemlich kostspielig, sodass man, um stereochemisch reine Stoffe zu produzieren, auf die Fähigkeiten von hoch spezialisierten Mikroorganismen zurückgreift. Dieses biotechnologische Herstellungsverfahren hat auch deshalb große wirtschaftliche Bedeutung, weil die Lebensmittelindustrie die Produkte in großem Umfang als Nahrungsmittelzusätze verwendet.

MERKE

Einige der proteinogenen Aminosäuren müssen mit der Nahrung zugeführt werden.

Peptidbindung

Kovalente Verknüpfung von Aminosäuren
Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften können Amino- und Carboxylgruppen miteinander reagieren. Unter formaler Abspaltung eines Wassermoleküls, einer sog. Kondensationsreaktion, bilden die funktionellen Gruppen ein Säureamid. Wenn die beiden verknüpften funktionellen Gruppen von den C-Atomen verschiedener Aminosäuren stammen, entsteht ein Dipeptid.
Nach diesem Prinzip können Aminosäuren auch zu längeren, unverzweigten Ketten verbunden werden. In Tab. 2.3 sind einige biologisch und medizinisch relevante Peptide exemplarisch aufgeführt. Man bezeichnet sie nach den griechischen Zahlwörtern als Tri-, Tetra-, Pentapeptide usw. oder ganz allgemein auch als Oligopeptide, wenn sie eine Kettenlänge von etwa 20 Aminosäuren nicht überschreiten. Längere Ketten nennt man Polypeptide. Proteine sind dagegen einfach, aus einer Polypeptidkette, oder komplex, aus mehreren Polypeptidketten, aufgebaut. In einem linearen Polypeptid bilden die sich ständig wiederholenden Peptidbindungen das Rückgrat, das man nach den C-Atomen der aneinandergereihten Aminosäuren auch als C-Kette bezeichnet. Übereinkunftsgemäß orientiert man bei der schematischen Darstellung von Polypeptiden das freie Aminoende, den N-Terminus, immer nach links und nummeriert, von dort beginnend, die Aminosäuren bis zum freien Carboxylende, dem C-Terminus.

MERKE

Aminosäuren werden durch Kondensation von Amino- und Carboxylgruppen zu Peptiden verknüpft.

Die Bildung von Peptidbindungen ist ein endergoner Prozess, d.h., man muss Energie aufwenden, damit die beiden Moleküle verknüpft werden können. Bei der Biosynthese der Peptidbindung (Kap. 13.4) wird diese Energie durch ATP und GTP bereitgestellt. Für die Bildung des einfachen Dipeptids Glycylglycin nach der Reaktion
2 Glycin Glycylglycin + H2O
beträgt die benötigte Energie +27,6 kJmol1. Im thermodynamischen Gleichgewicht lägen dabei hauptsächlich die Ausgangssubstanzen und nicht die Produkte vor. Die Peptidbindungen in der Natur sind jedoch sehr stabil, weil die Rückreaktion der Bindungsaufspaltung (Hydrolyse) nur extrem langsam verläuft.

Schon gewusst

Stabilität von Peptidbindungen

Unter nahezu physiologischen Bedingungen beträgt die Halbwertszeit einer Peptidbindung ungefähr 7 Jahre. Die Lebensdauer sinkt allerdings mit zunehmender Temperatur drastisch. Bei 250 C ist sie auf 1 min reduziert, wodurch zumindest ein theoretisches Limit für die maximale Überlebenstemperatur von Organismen festgelegt ist. Immerhin gibt es marine thermophile Archaebakterien, die unter erhöhtem Druck noch bei 110C optimal wachsen. Bei sehr niedrigen pH-Werten wird die Peptidbindung protoniert (unten) und noch schneller hydrolysiert. Zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung behandelt man Polypeptide für 24 h bei 105C mit 6 mol L1 HCl. Die meisten Aminosäuren überstehen diese Behandlung und können danach quantifiziert werden (Abb. 2.9).
Planare Struktur der Peptidbindung
Man kann aus den strukturellen Eigenschaften der Peptidbindung bereits viel über den Aufbau von Peptiden und Proteinen lernen. Die Einfachbindung (-Bindung) des von zwei verschiedenen Aminosäuren bereitgestellten Stickstoffs und Kohlenstoffs (N–C-Bindung) ist zusätzlich stabilisiert: Sie liegt innerhalb von mesomeren Grenzstrukturen vor, wie alle Säureamidbindungen (Abb. 2.9a). Das freie Elektronenpaar des Stickstoffatoms kann in die N–C-Bindung einschwingen, dabei wird der Stickstoff positiv geladen. Um die Vierbindigkeit von Kohlenstoff aufrechtzuerhalten, muss eine der CO-Bindungen zum Sauerstoff herausschwingen, dabei wird der Sauerstoff aufgrund der elektrischen Überschussladung negativ. Dieser durch die Mobilität der Elektronenpaare bedingte Schwingungsprozess ist für die Resonanzstabilisierung der Peptidbindung verantwortlich. Zusätzlich zur N–C-Einfachbindung bildet sich temporär eine weitere Bindung (-Bindung) aus, weil die p-Orbitale der Kohlenstoff- und Stickstoffatome überlappen. Der N–C-Bindung schreibt man deshalb partiellen Doppelbindungscharakter zu (Abb. 2.9a). Die freie Drehbarkeit um die N–C-Achse ist durch die hinzukommende -Bindung verhindert. Man kann sich daher die starre Peptidbindung als eine planare Anordnung der Atome O–C–N–H vorstellen (Abb. 2.9b). Man spricht hier auch von der Amid- oder Peptidebene, die zwischen zwei C-Atomen aufgespannt ist (farblich unterlegte Fläche in Abb. 2.9b). Die Struktur der Polypeptidkette ist wie eine Aneinanderreihung von Peptidebenenelementen, deren Winkel relativ zueinander die Raumstruktur des Proteins bestimmen. Die Basizität der -Aminogruppe ist im Gegensatz zur freien Aminosäure verschwunden, da das für die Protonenbindung erforderliche freie Elektronenpaar nicht mehr lokalisiert am Stickstoff zur Verfügung steht.

MERKE

Aufgrund des partiellen Doppelbindungscharakters ist die Peptidbindung planar und starr.

Konformation
Die Konformation von Peptidbindungen – und damit auch die mögliche Orientierung von Seitenketten – ist bestimmt durch die Einstellmöglichkeiten der verschiedenen Torsionswinkel und , das sind die Drehwinkel der Achse von C–C*- bzw. N–C-Bindungen. So wird die relative Lage der Peptidebenen festgelegt (Abb. 2.9b). Die Drehung um die Peptidbindung ist aufgrund der teilweisen Doppelbindung erheblich eingeschränkt. Es gibt daher nur zwei mögliche Orientierungen, in denen die C–N-Bindungsachse um 180 gedreht ist (Abb. 2.9c), eine cis- oder eine trans-Konformation. Aus sterischen Gründen ist die trans-Form um den Faktor 1000 begünstigt; in der cis-Stellung stoßen sich die C-Atome und die Aminosäureseitenketten (angefangen mit dem C-Atom) wegen ihrer räumlichen Nähe ab. Wenn der Stickstoff der C–N-Bindung aus der Iminogruppe von Prolin stammt, schrumpft das Verhältnis trans : cis auf 4 : 1, weil die cis-Form aufgrund des zyklischen Charakters dieser Seitenkette stärker begünstigt wird.
Um die bei der Synthese und der Faltung von prolinhaltigen Proteinen erfolgende statistische Mehrbildung der cis-Konformation zu korrigieren, wird die Isomerisierung der cis- und trans-Formen von Peptidbindungen des Prolins in vivo durch ein Enzym ca. 300fach beschleunigt. Diese Umwandlung erledigt ein sog. Faltungshelferprotein, die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase.

Klinik

Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase: ein Faltungshelfer mit Doppeljob. Neben seiner Funktion bei der Isomerisierung der Peptidbindung ist das Protein ein Moonlighter (engl. für eine Person mit mehren Arbeitsstellen) mit hoher medizinischer Relevanz: Das Molekül verfügt überraschenderweise auch über die biologische Funktion eines Cyclophilins. Es besitzt eine Bindungsstelle für Ciclosporine, das sind zyklische Oligopeptide, die aus Pilzen gewonnen werden. Im ciclosporingebundenen Zustand ist es an der Hemmung von T-Zell-vermittelten Immunantworten beteiligt (Kap. 26.8). Damit ist das Protein in seiner Rolle als Cyclophilin für die immunsuppressive Wirkung von Ciclosporin verantwortlich und spielt eine wesentliche Rolle in der Transplantationsmedizin.

Theoretisch ist die Drehbarkeit bei Einfachbindungen zwar uneingeschränkt; praktisch können die Torsionswinkel und der beiden Einfachbindungen in unmittelbarer Nachbarschaft zur Peptidbindung (Abb. 2.9b) aber nur bestimmte Wertebereiche annehmen, die von der Struktur der Aminosäureseitenkette abhängen. Damit wird auch der Konformationsraum der Polypeptide innerhalb der höheren Strukturhierarchien festgelegt (unten). Bestimmte Winkelkombinationen kommen besonders häufig vor. Diese Vorzugseinstellungen sind charakteristisch für bestimmte Strukturelemente von Polypeptidketten, die sog. Sekundärstrukturen (Tab. 2.5).

MERKE

Die der Peptidbindung benachbarten Bindungen sind theoretisch frei drehbar, nehmen aber bestimmte Vorzugswinkel ein.

Aufbau von Proteinen

Der räumliche Aufbau von Proteinen gliedert sich in verschiedene Strukturebenen, die sich hierarchisch anordnen lassen (Abb. 2.10). Die Primärstruktur besteht in der linearen Kette von Aminosäuren. Diese kann ungeordnet sein oder kurze, geordnete, wenige Aminosäuren umfassende Sekundärstrukturen ausbilden.
Die Abfolge und räumliche Ordnung der Sekundärstrukturelemente bilden die nächsthöhere Ebene aus. Wenn die relative Anordnung dieser Elemente in lokalen charakteristischen Mustern erfolgt, die man bei vielen Proteinen wiederfindet, spricht man gelegentlich auch von Supersekundärstrukturen. Bezogen auf das vollständige Polypeptid bezeichnet man diese Ordnungsebene als Tertiärstruktur. Oft wird in diesem Zusammenhang der Begriff Domäne verwendet. Domänen sind voneinander unabhängige Faltungseinheiten von Proteinen, die sich strukturell und/oder funktionell abgrenzen lassen. Zusammenlagerungen von Tertiärstrukturelementen, die sich aus identischen oder verschiedenen Aminosäureketten (Monomere) zusammensetzen, bilden schließlich die Quartärstruktur eines Proteins aus (Homo- bzw. Heterooligomer).

MERKE

Die Strukturhierarchie bei Proteinen gliedert sich in die Strukturebenen der Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur.

Primärstruktur

Die Abfolge von Aminosäuren bestimmt die Primärstruktur von Proteinen, man spricht auch von der Sequenz. Diese lineare Abfolge im Polypeptid ist durch die Abfolge von Basentripletts in der DNA bestimmt. Bei der Zusammenstellung von möglichen Aminosäureabfolgen gibt es eine kaum vorstellbare Anzahl von Kombinationsmöglichkeiten. Könnten aus dem verfügbaren Arsenal der Aminosäuren alle beliebigen Verknüpfungen vorgenommen werden, ergäbe dies bei 20 Aminosäurebausteinen bei einem vergleichsweise kleinen, aus nur 100 Gliedern bestehenden Polypeptid 20100 (10130) verschiedene Proteine.
Aminosäuresequenzen Gegenwärtig werden die meisten Informationen über Aminosäuresequenzen durch Sequenzierungen der für die Proteine kodierenden genomischen DNA gewonnen. DNA-Sequenzierungen sind viel einfacher und schneller durchzuführen. Das beweist die wachsende Zahl vollständig sequenzierter Genome von mehr als 200 pathogenen und nichtpathogenen Bakterien, aber auch von zahlreichen Eukaryonten wie Fadenwürmern, Fruchtfliegen, Mäusen und dem Menschen. Diese Informationen sind in riesigen Datenbanken gespeichert und der Öffentlichkeit frei zugänglich. Man kann die Datenflut allerdings nur noch mithilfe von Computern übersehen. Mit ausgeklügelten bioinformatischen Verfahren leisten selbst einfache Rechner unschätzbare Dienste bei der Struktur- und Funktionsanalyse bereits im Vorfeld experimenteller Arbeiten. Für kompliziertere Fragestellungen gibt es Anwenderprogramme, die über das Internet abgefragt werden können (Literatur).

Blick ins Labor

Um die rapide anwachsenden Nucleinsäure- und Proteindatenbanken über spezifische Moleküle abfragen zu können, ist ein Computer mit Internetanschluss aus dem Labor nicht mehr fortzudenken. Zahlreiche Dienstleister im World Wide Web stellen Wissenschaftlern Unmengen von Datenmaterial über Sequenzen, Strukturen, Funktionen und Interaktionen von Biomolekülen zur Verfügung. Viele dieser Dienste sind für Studenten und akademische Forscher kostenfrei. Die moderne Disziplin der Bioinformatik sorgt dafür, dass Datenbanken und die hierfür erforderlichen Computerprogramme, mit denen man relevante Informationen zeitsparend extrahieren kann, ständig aktualisiert und weiterentwickelt werden. Jedes biochemische Projekt wird heutzutage zuerst virtuell oder auch in silico vorbereitet, bevor es in das reale Labor geht, in dem die in-vitro-Experimente durchgeführt werden. Neben vielen anderen Web-Services bietet das NCBI (National Center for Biotechnology Information) ein umfassendes Portal, das besonders für Einsteiger extrem nützlich ist (Literatur). Neben der sinnvollen Durchführung von Literaturrecherchen lassen sich DNA-, Proteinsequenzdatenbanken und Strukturdatenbanken effizient abfragen. Besonders hilfreich für Forschung und Klinik sind die Datenbanken, in denen alle wichtigen Aspekte von humanen genetischen Erkrankungen deponiert sind. Hier ist v.a. die Datenbank OMIM (Online Mendelian Inheritance of Man) erwähnenswert (Literatur). Neben den Sequenzdaten normaler und krankheitsauslösender Gene bzw. Proteine im Zusammenhang mit Erbkrankheiten findet man dort pathologische, diagnostische und therapeutische Informationen und umfangreiche Bibliographien.

Vergleich von Aminosäuresequenzen
Für die schnelle Identifikation von Aminosäuresequenzen (ebenso wie von DNA-Sequenzen) gibt es schnell arbeitende Suchprogramme. Man kann aus multiplen Sequenzvergleichen bereits wichtige Informationen über die molekulare Struktur und Funktion ablesen. Die evolutionären Verwandtschaftsbeziehungen der heutigen Lebewesen existieren auf allen zellulären Organisationsstufen, so auch auf Primärstrukturebene. Die Ausdifferenzierung von funktionell und strukturell gleichartigen Proteinen innerhalb verschiedener Organismen kann man sich entwicklungsgeschichtlich als Produkt von aufeinanderfolgenden Mutationsereignissen der Primärstruktur vorstellen. Die Aminosäureabfolge von Proteinen ist daher ein aufschlussreiches Maß für den Grad der Verwandtschaft auf molekularer Ebene. Prozentuale Messgrößen dafür sind die sog. Sequenzidentität sowie die Sequenzähnlichkeit. Eng verwandte Proteine haben einen großen Anteil identischer ( konservierter) Aminosäurepositionen oder zumindest konservative Substitutionen, bei denen eine Mutation den originalen Charakter der Aminosäure nur geringfügig ändert. Beispiele sind der Austausch einer basischen gegen eine andere basische Aminosäure (Lysin gegen Arginin) bzw. einer sauren gegen eine saure (Glutaminsäure gegen Asparaginsäure). Invariante Regionen bzw. konservierte Positionen in homologen Proteinen bilden Module mit einer charakteristischen Raumstruktur, die auf besondere funktionelle Relevanz hinweisen. Dies ist offensichtlich in Primärstrukturbereichen ausgeprägt, die für die spezifische Fähigkeit zur Bindung eines Liganden oder eine bestimmte katalytische Aktivität verantwortlich sind. Der hohe biologische Nutzen ist hierbei für den selektiven Druck verantwortlich, der entwicklungsgeschichtlich für die geringe Variabilität dieser Strukturelemente sorgt.
Informationen über den Verwandtschaftsgrad von Aminosäuresequenzen gewinnt man aus Sequenzvergleichen. Man kann die Analyse auf DNA- oder auf Proteinebene durchführen, weil die Sequenzinformationsgehalte der beiden Biomoleküle wegen des genetischen Codes äquivalent sind. Man kann aus diesen Daten auch Stammbäume kreieren, welche die molekulare Phylogenie beschreiben. Wenn die miteinander verglichenen Aminosäuresequenzen von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen, spricht man von Sequenzhomologie. Die von homologen Genen kodierten Proteine bilden aufgrund ihrer Sequenzverwandtschaft bei gleicher Funktion eine Proteinfamilie. Sind die Proteine miteinander verwandt und haben unterschiedliche Funktionen (z.B. unterschiedliche Ligandenbindung oder katalytische Aktivität), fasst man sie unter dem Begriff Superfamilie zusammen. Homologe Gene für Proteine gleicher Funktion, die aus verschiedenen Organismen stammen, bezeichnet man auch als Orthologe. Sie sind für den Vergleich der verschiedenen Spezies wichtig. Abb. 2.11 zeigt einen multiplen Sequenzvergleich des Sehfarbstoffes Rhodopsin verschiedener Organismen und den aus dem Grad der Sequenzverwandtschaft graphisch dargestellten molekularen Stammbaum.
Innerhalb eines Organismus können durch sog. Genduplikationen auch Paraloge entstehen. Darunter versteht man mehrere Kopien eines Gens, deren Produkte zwar sequenzverwandt sind, aber unterschiedliche Funktionen ausüben. Abb. 2.12 verdeutlicht dies am Beispiel von Vertretern der sog. Ras-Superfamilie des Menschen. Ras und verwandte Proteine sind membranassoziierte Komponenten der zellulären Signalübertragung, die wie ein molekularer GTP-bindender Schalter funktionieren. Sie bekommen chemische Signale von membranintegralen Rezeptoren übermittelt und leiten diese an verschiedene Effektoren weiter (Kap. 22).

Schon gewusst

Der Verwandtschaftsgrad zweier Aminosäuresequenzen in Prozent identischer Aminosäurepositionen lässt sich leicht angeben, sobald man die Sequenzen optimal aligniert hat. Hier verbirgt sich jedoch ein Problem: Es gibt Einfügungen bzw. Auslassungen von Aminosäuren in Sequenzen, die einen positionsgenauen binären Vergleich unmöglich machen. Nahtloses Alignieren wird erst möglich, indem man durch Einführung von Lücken Insertionen/Deletionen ausgleicht. Mit der ausschließlichen Beschränkung auf die invarianten Regionen zweier Sequenzen unterschätzt man den tatsächlichen Ähnlichkeitsgrad, weil konservierte Substitutionen die dreidimensionale Struktur und Funktionalität von Modulen praktisch kaum beeinflussen. Den Konservierungsgrad von Aminosäureaustauschen kann man mithilfe sog. Substitutionsmatrizen quantifizieren. Sie liefern ein genaueres Maß für die Sequenzverwandtschaft von Proteinen.

Dem Sequenzvergleich verwandter Proteine kommt eine weitere wichtige Funktion zu: die Analyse der am stärksten konservierten Regionen. Sie lässt sich gut bei Sequenzen mit geringerem Verwandtschaftsgrad realisieren, weil dort nur noch die funktionell wichtigsten Bereiche erhalten sind. Auf diese Weise kann man in den Proteinsequenzen wichtige Muster oder Sequenzmotive identifizieren. In Abb. 2.12a befindet sich beispielsweise am C-Terminus die sog. CAAX-Box (X steht für eine x-beliebige Aminosäure), ein Sequenzsignal, das für die kovalente Anheftung von Farnesylgruppen und damit für die Membranassoziierung entscheidend ist (unten). Aus den konservierten Bereichen (blaue Boxen) sind funktionell wichtige Regionen abzulesen, die für die molekulare Schalterfunktion des Ras wichtig sind, der Bindung von GTP. Diese Bereiche sind in dem Strukturmodell von Ras (Abb. 2.12b) in Blau hervorgehoben.

MERKE

Aminosäuresequenzvergleiche, also der Vergleich der Primärstrukturen von Proteinen, liefern wichtige Informationen über ihre Verwandtschaft und funktionelle Motive.

Stabilisierende Wechselwirkungen

Da die zu den einzelnen Aminosäuren gehörigen Atome nicht punktförmig sind (Van-der-Waals-Radien), haben die Polypeptidketten eine definierte Raumstruktur (Abb. 2.13a), die von Reihenfolge und Art der Seitenketten abhängt. Entsprechend der konformationellen Freiheitsgrade, die durch die planare Peptidbindung und die Winkeleinstellung der benachbarten -Kohlenstoffatome bedingt sind, gibt es zahlreiche Strukturvariationen. Die genaue Oberflächenstruktur des Peptids wird durch zusätzliche Wechselwirkungen von verschiedenen funktionellen Gruppen untereinander und mit dem Lösungsmittel, meist Wasser, bestimmt.
Warum aber bilden Aminosäuren überhaupt eine dreidimensionale Struktur aus? Die Abfolge der Aminosäuren und die Vielfalt der Einstellmöglichkeiten der Torsionswinkel und sollten theoretisch eine Großzahl verschiedener räumlicher Anordnungen erlauben. Entsprechend dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik sollten die Polypeptidketten hochgradig ungeordnet sein und einen Zustand maximaler Entropie anstreben. Geordnete Strukturen werden jedoch ermöglicht, weil und aus sterischen Gründen bestimmte Bereiche von Vorzugswinkeln haben. Vor allem aber wirken der statistischen Unordnung in einem Peptid die einzelnen Elemente des Rückgrats und der Seitenketten innerhalb der Aminosäureabfolge entgegen, denn sie nehmen energieminimierte Orientierungen zueinander an. Auf diese Weise ergibt sich die charakteristische Konformation des Peptids. Beispielsweise stoßen sich gleichsinnig geladene Reste oder hydrophile und hydrophobe Aminosäuren ab. Eine Reihe von kovalenten und nichtkovalenten Wechselwirkungen stabilisiert die Konformation (Abb. 2.13b, Tab. 2.4).
Disulfidbrücken
Die Disulfidbrücke ist eine kovalente Bindung zweier Cysteinmoleküle. Das Reaktionsprodukt heißt Cystin und bildet sich durch Abspaltung der Wasserstoffe der –SH-Gruppen von beiden Aminosäuren:
Cystin ist also ein Oxidationsprodukt, das nur bei hohem Redoxpotenzial entstehen kann. Das Standardredoxpotenzial für die Oxidation von Cystein beträgt –0,25 V. Disulfidbrücken bilden sich also in Gegenwart von Sauerstoff spontan aus (Standardredoxpotenzial des Redoxpaars O2/H2O +0,8 V). Daher liegen funktionell wichtige Disulfidbrücken nicht in der relativ reduzierenden Umgebung des Zytoplasmas, das aufgrund des hohen O2-Verbrauchs der Mitochondrien anaerob ist, sondern finden sich hauptsächlich in der Außenseite der Zytoplasmamembran in extrazytoplasmatischen und sezernierten Proteinen. Hier finden sie aufgrund der hohen Sauerstoffkonzentration oxidierende Bedingungen vor, welche die Dehydrierung der SH-Gruppen begünstigen.
Disulfidbrücken bilden sich nur selten zwischen benachbarten Gruppen der Peptidkette aus. Die beteiligten Cysteinreste sind meist räumlich weit voneinander entfernt. Es gibt intra- und intermolekulare Disulfidbrücken, d.h., sie können innerhalb einer Polypeptidkette verlaufen oder auch zwei verschiedene Ketten miteinander verbinden. Am Beispiel des reifen Insulinmoleküls (Abb. 2.14) ist deutlich zu sehen, wie zwei verschiedene Ketten (A- und B-Kette) durch zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. In der A-Kette gibt es außerdem noch eine intramolekulare Brücke. Im Proinsulin, einer funktionell inaktiven Vorstufe des Insulins, sind die beiden Ketten durch das sog. C-Peptid linear verknüpft. Bei der Biosynthese wird das C-Peptid aus Proinsulin nach der Ausbildung der Disulfidbrücken herausgeschnitten. Die Disulfidbrücken stabilisieren die Raumstrukturen der Proteine und sind deshalb essenziell für die biologische Funktion. Insulin verliert nach reduktiver Spaltung der Disulfidbrücken seine Wirkung.

Schon gewusst

Man kann Disulfidbrücken auch künstlich in Proteine einfügen. Im praktischen Leben macht man sich das bei der Fixierung von Dauerwellen zunutze: Hier werden die S–S-Brücken, die die Polypeptidstränge der Keratinproteine in den Haaren quervernetzen, durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel gespalten, sodass die freien Thiolgruppen der Cysteine entstehen. In diesem Zustand modelliert man die Haare in die gewünschte Frisur und leitet durch Zugabe eines Oxidationsmittels die erneute Disulfidbrückenbildung ein. Die Polypeptidketten werden vernetzt und in der neuen Orientierung stabilisiert. Es sind also kovalente Bindungen, die die Locken in Form halten.

Nichtkovalente Bindungen
Ionische Wechselwirkungen
Ionenbindungen, auch Salzbrücken genannt, entstehen aus der Wechselwirkung von entgegengesetzt geladenen Gruppen, also negativ geladenen Carboxylat- und positiven Guanidinium- oder Ammoniumgruppen (Abb. 2.13b). Die Bindungen sind relativ stark, besonders im Inneren des Proteins, weil hier die elektrostatische Anziehung nicht so stark durch das Lösungsmittel Wasser abgeschwächt wird. Schwächere elektrostatische Wechselwirkungen beruhen auf den Eigenschaften von ungeladenen, aber polaren Resten (Partialladungen). Beispiele hierfür sind die Interaktionen, die von den polaren Aminosäureseitenketten von Glutamin und Asparagin ausgehen.
Wasserstoffbrücken
Sie gehören ebenfalls zu den elektrostatischen Wechselwirkungen, haben jedoch auch einen erheblich ausgeprägten kovalenten Bindungsanteil (Abb. 2.13b). Eine Wasserstoffbrücke beruht auf der Eigenschaft elektronegativer Atome X, z.B. Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel, Elektronen aus kovalenten Bindungen zu Wasserstoff an sich zu ziehen und diese damit stark zu polarisieren. Die Bindungen O–H+, N–H+ und S–H+ sind eindeutig durch die positive Partialladung am Wasserstoffatom und die negative Partialladung am elektronegativen Atom X charakterisiert. Eine Wasserstoffbrücke (Abb. 2.13b) bildet sich, wenn sich ein anderes elektronegatives Atom Y einer solchen X–H-Bindung nähert:
X–H+ + Y X–H+ Y
Das Wasserstoffatom H ist dann sowohl mit dem Donor X–H als auch mit dem Akzeptor Y verbunden. Die Distanz der beiden Zentren X und Y ist dabei deutlich kürzer als der theoretisch berechnete Van-der-Waals-Abstand, welcher der Summe der sog. Van-der-Waals-Radien aller beteiligten Atome entspricht. Er ist bei maximaler Annäherung der Atome ohne gegenseitige Durchdringung gegeben. Sind die Distanzen der Atome X, Y und H kürzer als die Van-der-Waals-Abstände, so liegt eine Bindung vor, die bei der Wasserstoffbrückenbindung eine Länge von 0,26–0,32 nm (Abstand zwischen X und Y) hat.
Die Wasserstoffbrücke hat sowohl elektrostatische als auch kovalente Anteile und ist am stärksten, wenn sich die Atome X, Y und H in einer Linie befinden. Die Energie der Wasserstoffbrückenbindung liegt bei 10–40 kJ mol–1 und damit weit unter der kovalenter Bindungen (> 400 kJ mol–1). Entscheidend ist aber, dass in Peptiden die Summe zahlreicher Wasserstoffbrückenbindungen zur Gesamtstabilität des Moleküls beiträgt.
Hydrophobe Wechselwirkungen
Auch unpolare Gruppen können miteinander assoziieren. Auf atomarer Ebene werden die Interaktionen durch Van-der Waals-Kräfte dominiert, die eine Summe von abstoßenden und anziehenden Anteilen darstellen. Es handelt sich v.a. um temporäre (induzierte), dipolare Wechselwirkungen. Sie kommen oft bei der Zusammenlagerung wasserabstoßender Seitenketten vor (Abb. 2.13b). Da aliphatische und aromatische Seitenketten schlecht wasserlöslich sind (Tab. 2.1), assoziieren sie aufgrund ihres lipophilen Charakters wie kleine Öltröpfchen, die sich in Wasser zu einem großen Öltropfen zusammenlagern. Es handelt sich also um eine Wechselwirkung, bei der das Lösungsmittel Wasser geradezu ausgeschlossen wird. Durch die Assoziation von hydrophoben Molekülen zu einem größeren Komplex wird die hydrophobe Oberfläche, die eine hochgeordnete Ausrichtung der umgebenden Wassermolekülen bewirkt, verringert und damit die Entropie durch Freisetzung von Wassermolekülen erhöht. Dieser stabilisierende Effekt ist besonders wichtig bei Aminosäuren, die in das Innere von Proteinen ragen. Generell kann man sagen, dass Proteine außen eher hydrophil und innen überwiegend hydrophob sind.

MERKE

Die dreidimensionale Struktur von Polypeptidketten wird durch kovalente sowie durch nichtkovalente Bindungen unterschiedlicher Stärke ausgeprägt.

Sekundärstrukturen

Die Sekundärstruktur der Peptidkette entsteht durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Atomen des Peptidrückgrats. Bilden sich die Wasserstoffbrücken zwischen nahe zusammenliegenden Aminosäureresten der Peptidkette, entsteht eine -Helix. Bei der anderen häufigen Form der Sekundärstruktur, dem -Faltblatt, sind weit voneinander entfernt liegende Aminosäurereste durch Wasserstoffbrücken verbunden.
-Helix
Bei der -Helix handelt es sich um eine rechtsgängige Spiralstruktur (Abb. 2.15a, b), bei der die Wasserstoffbrückenbindungen in die Richtung der Helixachse weisen. Schematisch wird die -Helix durch ein spiralig gewundenes Band symbolisiert (Abb. 2.15b), was für die vereinfachte Darstellung komplexer Makromolekülstrukturen nützlich ist. Der Abstand zwischen gleichwertigen Positionen der Schraube, also die Ganghöhe der Schraube, beträgt 0,54 nm, und eine Windung wird von 3,6 Aminosäureresten gebildet (Tab. 2.5). Das bedeutet, die Kette schraubt sich um 0,15 nm pro Aminosäurerest vorwärts, was man als Translation der Schraube bezeichnet. Die Atome des Rückgrats sind dicht gepackt, sodass sich günstige Van-der-Waals-Wechselwirkungen bilden. Die Stabilisierung in Helixachse erfolgt durch Wasserstoffbrückenbindungen von der N–H-Gruppe der Peptidbindung n mit dem Sauerstoff der CO-Gruppe der Peptidbindung n + 4 (Abb. 2.15a). Dies gilt natürlich nur für die innen liegenden Reste von hinreichend langen Helices, weil die Peptidbindungen am Helixanfang und -ende keine Wasserstoffbrückenbindungspartner haben. Bei Wasserstoffbrücken in normalen -Helices misst der Abstand von den N- zu den O-Atomen 0,27 bis 0,29 nm.
Nicht alle Aminosäuren sind für die Helixbildung geeignet. Glycin hat aufgrund seiner fehlenden Seitenkette nur wenig eingeschränkte konformationelle Flexibilität. Am wenigsten geeignet ist die starre Iminosäure Prolin, da das an der Peptidbindung beteiligte Stickstoffatom in die Seitenkette eingebunden ist und wegen des fehlenden Wasserstoffatoms keine Wasserstoffbrücke bilden kann. Man bezeichnet Prolin deshalb auch als Helixbrecher.
Helixoberfläche. Schaut man sich die -Helix in Achsenrichtung an (Abb. 2.15c), so wird deutlich, dass die Aminosäureseitenketten nach außen zeigen. Diese können somit Wechselwirkungen zu anderen Sekundärstrukturelementen bilden. In der Aminosäuresequenz aufeinanderfolgende Reste sind in der Helix um einen Winkel von etwa 100 versetzt. Die Polarität der Seitenketten bestimmt die Oberflächeneigenschaften der Helix. Bei amphipathischen Helices sind bestimmte Bereiche mehr oder weniger stark polar ausgeprägt. An der Außenseite ziehen sich hydrophile oder hydrophobe Streifen entlang, z.B. kann die eine Seite vollständig hydrophil, die andere hydrophob sein. Die Helix hat einen Durchmesser von etwa 0,5 nm. Sie ist innen keineswegs hohl, sondern wegen der Van-der-Waals-Radien der Atome des Polypeptidrückgrats vollständig ausgefüllt (oben).
-Strang und -Faltblatt
Neben der -Helix ist die zweite wichtige, reguläre Sekundärstrukturform das -Faltblatt. Das Hauptelement dieser Struktur ist der sog. -Strang (Abb. 2.16). Er entspricht einer maximal gestreckten Polypeptidkette. In Abb. 2.16a ist ein -Strang in der Seitenansicht dargestellt. Das Peptidrückgrat bildet eine typische Zickzackstruktur aus, wobei die Aminosäureseitenketten zwei Streifen bilden, die sich ober- und unterhalb des Rückgrats befinden. In der Symbolschrift der Strukturbiologen steht für den -Strang ein dicker Pfeil, der vom N- zum C-Terminus des Strukturelements zeigt (Abb. 2.16b). Allerdings ist ein einzelner -Strang für sich nicht beständig, da keine stabilisierenden Wasserstoffbrücken innerhalb der Kette gebildet werden. Richtig stabil wird die Konformation durch Einbau des -Strangs in ein -Faltblatt, bei dem sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den einzelnen Strängen ausbilden. Die Stränge können hierbei parallel oder antiparallel angeordnet sein (Tab. 2.5).
Abb. 2.16c zeigt ein aus antiparallel angeordneten -Strängen aufgebautes Faltblatt in der Aufsicht. In dieser Darstellung wird deutlich, dass die Wasserstoffbrücken zwischen den einzelnen Strängen verlaufen und mehr oder weniger senkrecht zur Strangachse angeordnet sind. Die Aminosäureseitenketten ragen nach oben oder unten (relativ zur Papierebene) und bilden Schichten aus, die mit benachbarten Faltblättern interagieren können. Über diese Seitenkettenschichten kann der Kontakt zu einem benachbarten Faltblatt vermittelt werden.

Schon gewusst

Es gibt Strukturproteine, die vorwiegend aus -Faltblättern aufgebaut sind. Ein Beispiel hierfür ist das Seidenfibroin des Seidenspinners (Bombyx mori), das das Hauptprotein der Seide darstellt. Abb. 2.17b zeigt den typischen Aufbau der antiparallelen Aminosäureseitenketten, die ein Faltblatt bilden. Die Faltblätter lagern sich schichtweise aneinander, wobei die Aminosäureseitenketten in den Ebenen eng aneinanderrücken (Abb. 2.17c). Der Abstand zwischen den C-Atomen in verschiedenen Ebenen beträgt 0,35–0,57 nm. Es bleibt kein Platz für große Aminosäurereste, sodass bevorzugt Wechselwirkungen kleiner, repetitiver Seitenketten auftreten. Der besondere Vorteil dieser atomaren Anordnung besteht in der geradezu unglaublichen mechanischen Stabilität, Zugfestigkeit und Elastizität dieses Gebildes: Würde man ein hinreichend ausgedehntes Netz aus Spinnenseidenfäden, die ebenfalls aus Seidenfibroin bestehen, von der Dicke eines Bleistifts ausbringen, so könnte man einen Jumbojet aus vollem Flug einfangen.

MERKE

Die häufigsten Sekundärstrukturelemente in Proteinen sind die -Helix und der die -Faltblätter ausbildende -Strang.

Sekundärstrukturelemente in spezialisierten Proteinen
Kollagenhelix
Einen ebenfalls spiraligen Bau hat die Kollagenhelix (Kap. 20.2). Sie ist durch den hohen Gehalt der Aminosäuren Glycin und Prolin (bzw. Hydroxyprolin) gekennzeichnet, die etwa 50% der Zusammensetzung ausmachen. In der Sequenz kommt sehr häufig das Muster Gly–X–Y vor, wobei häufig X Prolin und Y Hydroxyprolin entsprechen. Die Aminosäure Hydroxyprolin entsteht während der Kollagenbiosynthese durch posttranslationale Modifikation (Kap. 2.3.1). Die Polypeptidkette ist eine linksgängige Helix, die aufgrund des hohen Prolingehalts, aber nicht durch Wasserstoffbrückenbindungen in Helixachse stabilisiert wird. Die Kette ist mit zwei weiteren, nichtidentischen Polypeptidketten verdrillt (Abb. 2.17a). Dieses Gebilde wird als Kollagentripelhelix bezeichnet. Zwischen den einzelnen Polypeptidketten bilden sich laterale Wasserstoffbrücken aus. Die Tripelhelix hat einen Durchmesser von 1,4 nm und erreicht normalerweise eine Länge von 300 nm. Im Elektronenmikroskop hat man jedoch schon Kollagenmoleküle bis zu 2,8 m beobachtet.
Die biosynthetische Reifung des Proteins ist ein komplizierter Prozess, der verschiedene posttranslationale Modifikationen einschließt (Kap. 2.3.1). Es gibt eine Reihe von Erbkrankheiten, die auf Funktionsdefekte verschiedener daran beteiligter Enzyme zurückzuführen sind. Aufgrund seiner linearen Struktur bildet Kollagen Mikrofibrillen und Fasernetze, die in verschiedenen Gewebetypen vorkommen, hauptsächlich Bindegewebe, Sehnen und Bändern, Knorpel und Knochen. Kollagen ist mit einem Anteil von 25% am Gesamtprotein das häufigste Protein bei Säugetieren. Auch wirtschaftlich gesehen ist Kollagen als Ausgangsmaterial für die Gelatineproduktion wichtig.
Keratinhelix
Das in Haaren, Nägeln oder Hufen oder in zytoskelettalen Intermediärfilamenten vorkommende Strukturprotein -Keratin besteht aus rechtsgängigen -Helices, die sich jeweils zu viert zu einer – auch Protofilament genannten – linksgängigen Superhelix organisieren. Jeweils acht dieser Protofilamente assoziieren zu einem 10 nm dicken Intermediärfilament (Kap. 20).

Schon gewusst

Neben den bisher genannten Polypeptidkonformationen gibt es noch weitere Strukturelemente (Tab. 2.5). Hierzu gehören helikale Formen wie die 310-Helix, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Rest n und n + 3 gekennzeichnet ist. Die Bezeichnung stammt von den drei Aminosäureresten pro Windung und zehn kovalenten Bindungen, die zwischen Wasserstoffbrückendonor und -akzeptor gelegen sind. Die 310-Helix ist somit etwas gestreckter als die klassische -Helix, die nach dieser Nomenklatur 3,613-Helix heißen müsste. Eine andere Variante ist die sog. -Helix, die etwas loser gewunden ist, da in ihr Wasserstoffbrücken zwischen den Aminosäuren n und n+5 bestehen. Diese Sekundärstrukturformen kommen in Proteinen nur selten vor.

Supersekundärstrukturen

Sekundärstrukturelemente wie -Helix und -Faltblatt kommen in verschiedenen Kombinationen im Protein vor. Die Anordnungen der Strukturelemente sind aber keineswegs zufällig. Es kommen charakteristische Verknüpfungsmuster vor, die in verwandten Proteinen für einen bestimmten strukturbildenden oder funktionellen Kontext verantwortlich sind. Innerhalb eines Polypeptids übernehmen bestimmte strukturelle Motive, die auch als Supersekundärstrukturen bezeichnet werden, sozusagen Teilaufgaben. Sie bestimmen – zusammen mit den restlichen Strukturelementen der Kette (unten) – die Gesamteigenschaften des Proteins. Dabei gilt grundsätzlich die Regel, dass Sekundärstrukturelemente, die in der Aminosäuresequenz aufeinanderfolgen, auch in der Supersekundärstruktur eng benachbart sind. Es gibt aber auch bestimmte strukturelle Motive, die erst durch spezifische Wechselwirkung unterschiedlicher Polypeptidketten zustande kommen. Dies ist z.B. der Fall bei sog. Coiled/coil-Strukturen (unten).
Supersekundärstrukturen legen auf struktureller Ebene die Architektur von Polypeptidketten fest. Dies kommt deutlich sichtbar in den -, - oder --Mustern von Proteinen zum Ausdruck.
-helikale Proteine
Ausschließlich aus -Helices aufgebaut sind beispielsweise Proteine wie Myoglobin (Abb. 2.18), das als Sauerstoffspeicher im Muskel dient, oder das eng verwandte Hämoglobin, das den Sauerstofftransport im Blut übernimmt. Einzelne Helixbereiche, die eine Länge zwischen vier und maximal 40 Aminosäuren besitzen, werden hier durch Schleifenbereiche mit unregelmäßiger Sekundärstruktur verbrückt. In der Gesamtansicht nehmen diese praktisch nur aus -Helices bestehenden Proteine eine globuläre (kugelartige) Gestalt an.
Spezielle helikale Motive
Coiled-coil-Strukturen – Leucin-Zipper
In anderen Proteinen können Bereiche von verschiedenen in einer Polypeptidkette verknüpften Helices oberflächlich miteinander wechselwirken, um lineare Strukturen zu stabilisieren. Dies ist bei dem sog. Coiled-coil-Strukturmotiv der Fall. Hier sind zwei in einer linksgängigen Superhelix vorliegende -Helices miteinander verwunden. Dieses Muster kommt bei verschiedenartigen Strukturproteinen vor, z.B. Myosin, Tropomyosin und Intermediärfilamentproteinen. Die Stränge binden über Oberflächenbereiche aneinander, die durch hydrophobe Aminosäureseitenketten gebildet werden. Die stabilisierende Wechselwirkung entsteht, weil hydrophobe Reste im Abstand von je drei bzw. vier Positionen aufeinanderfolgen, es bilden sich sog. Heptaden aus. Die hydrophoben Seitenketten der beiden Helices, die meist von Leucin stammen, sind dabei alternierend miteinander verzahnt. Die Assoziation wird durch hydrophobe Wechselwirkungen der Aminosäurereste vermittelt. Man bezeichnet diese Anordnung auch als Leucin-Zipper (engl. Zipper Reißverschluss) – ein Motiv, das auch in verschiedenen DNA-bindenden Proteinen wie Transkriptionsfaktoren auftaucht (Abb. 2.19a, b).
-Faltblatt-Proteine
Auch reine -Strukturen haben wir bereits kennengelernt, z.B. das Seidenfibroin, in dem antiparallele -Faltblätter schichtweise angeordnet sind. Die antiparallelen Stränge sind in -Strukturen durch kurze Schleifenregionen überbrückt (Abb. 2.20a). Bei paralleler Anordnung der -Stränge müssen die verbindenden Schleifen erheblich länger sein (Abb. 2.20b). Die Brücke kommt in zwei verschiedenen sterischen Orientierungen (rechts- und linksgängig) vor.
--Proteine
Anstelle der Schleifen können als Unterbrecher der -Stränge auch -Helices stehen (Abb. 2.20c). In Proteinen ist dies durch sog. --Strukturelemente realisiert. Hier folgen alternierend -Helix- und -Faltblatt-Elemente aufeinander. Aus einer großen Fülle von möglichen Beispielen seien hier nur Carboxypeptidase (Abb. 2.21a, b) und Flavodoxin (Abb. 2.21c, d) genannt. Hier bilden die -Stränge der alternierenden --Anordnung ein im Zentrum des Moleküls gelegenes -Faltblatt aus.
Eine weitere interessante achtfache --Anordnung findet sich bei den sog. --Barrel-Proteinen, in denen das -Faltblatt einen zentralen Ring (engl. Barrel Fass) bildet, der außen von -Helices umgeben ist. Diese Geometrie wird am Beispiel der Triosephosphat-Isomerase, einem wichtigen Glykolyseenzym (Abb. 2.21e–g), in Seiten- und Aufsicht deutlich. Dieses --Barrel-Strukturelement ist recht häufig bei Proteinen vertreten und findet sich auch bei anderen Enzymen des Glykolysestoffwechselwegs (Kap. 5.2).

Blick ins Labor

Oft ist es wünschenswert, bereits aus der Primärstruktur eines Polypeptids Aussagen über die höheren Strukturhierarchien ableiten zu können. Auf Strukturebene liefern computergestützte Rechenverfahren recht zuverlässige Ergebnisse. Es gibt verschiedene Strukturvorhersagemethoden, die auf der unterschiedlichen Neigung der Aminosäuren basieren, bestimmte Sekundärstrukturen einzunehmen. Bei diesen Verfahren wird also auf Erfahrungswerte zurückgegriffen, die u.a. auf einer riesigen Datenbasis aus bereits aufgeklärten dreidimensionalen Strukturen beruhen. Bei neueren (neuronalen Netzwerk-)Methoden werden unbekannte Polypeptide durch Sequenzvergleich (Abb. 2.22) möglichst eng verwandten Proteinen gegenübergestellt. Durch Minimierung des Fehlers wird dann die wahrscheinlichste Abfolge von Sekundärstrukturelementen bestimmt.

Spezielle Strukturmotive
Zinkfingermotiv
Bestimmte Anordnungen von -Helices sorgen für die spezifische Orientierung von funktionellen Gruppen, die für die Katalyse oder Signalübertragung verantwortlich sind. Beispielhaft werden hier zwei Fälle vorgestellt, in denen die Supersekundärstrukturen eine korrekte Positionierung von Metallionen in Proteinen ermöglichen. Verwirklicht ist dies beispielsweise bei den Zinkfingerelementen, in denen Zinkionen koordinativ an Schwefelatome von Cystein oder auch an Stickstoffatome von Histidin gebunden sind (Abb. 2.23a–d). Die Liganden der Metallionen werden über ein Faltblatt-Schleife-Helix-Sekundärstrukturmotiv bereitgestellt. Dieses Strukturelement findet man häufig bei DNA-bindenden Proteinen mit regulatorischen Eigenschaften. Für seine Namensgebung ist die oberflächliche Fingerform verantwortlich, mit der sich das Protein in komplementären Strukturen des Nucleinsäurebindepartners festklammert.
EF-Hand
Ein weiteres Beispiel für Metallbindung stellt das Helix-Loop-Helix-Motiv dar (engl. loop Schleife), das man u.a. bei calciumbindenden Proteinen findet und als EF-Hand bezeichnet. Der Name EF-Hand kommt von der Strukturbeschreibung des Proteins Paralbumin, in dem das gleichnamige Motiv erstmalig entdeckt wurde. Hierbei befindet sich die Metallbindungsstelle auf einer Schleife, die von zwei Helixabschnitten eingerahmt ist (Abb. 2.24a–e), die ihrerseits wie Zeigefinger (E-Helix) und Daumen (F-Helix) der rechten Hand angeordnet sind. Die Liganden für das Calciumion werden von den Seitenketten-Sauerstoffatomen von Aspartat- und Glutamatresten sowie vom Carbonylsauerstoff des Proteinrückgrats und von fest gebundenem Wasser gebildet. Das Strukturprinzip findet sich bei dem eukaryontischen Ca2+-Detektorprotein Calmodulin, ist aber auch bei dem Muskelprotein Troponin C und vielen anderen calciumbindenden Proteinen vorhanden.

MERKE

Die Sekundärstrukturelemente von Polypeptiden ordnen sich zu charakteristischen Strukturmotiven, die besondere Funktionalitäten ausbilden.

Tertiärstruktur

Die nächsthöhere Organisationsebene der Proteine bezeichnet man als Tertiärstruktur, in der sich die verschiedenen Elemente der Sekundär- und Supersekundärstrukturen relativ zueinander anordnen. Der Begriff Tertiärstruktur ist also eher formaler Art, da zu den bekannten Strukturmerkmalen keine neue Qualität hinzukommt. Es handelt sich lediglich um eine Summation des Inventars aller wesentlichen Einzelbausteine, die in einer Polypeptidkette vorkommen. Die Tertiärstruktur wird durch Cysteinbrücken und nichtkovalente Wechselwirkungen (Abb. 2.13b) stabilisiert.
Moleküldarstellungen mit dem Computer
Die graphischen Modelle bestimmter Strukturelemente in Proteinen haben wir bereits kennengelernt. Für das Verständnis der Biochemie von Proteinen ist es äußerst wichtig, eine möglichst klare Vorstellung von der dreidimensionalen Struktur der Makromoleküle zu bekommen. Mittlerweile sind die Raumstrukturen von mehr als 50 000 Proteinen geklärt (Stand: Dezember 2008). Die Raumkoordinaten ihrer Strukturen sind in der PDB (engl. protein data base) deponiert und stehen zum Download bereit. Um einen möglichst plastischen Eindruck zu bekommen, bedient man sich verschiedener, z.T. recht einfach zu bedienender Computerprogramme, die aus den in der Datenbank abgelegten Strukturkoordinaten der Biomoleküle Abbildungen der Strukturen erzeugen können. Einige dieser Graphikprogramme sind frei über das Internet erhältlich, wie z.B. Rasmol, Swiss-PDBviewer, Weblabviewer und Pymol (Literatur).

Blick ins Labor

Die große praktische Bedeutung der Molekülvisualisierungsverfahren kann man sich am Beispiel der Tertiärstruktur des Insulinmoleküls verdeutlichen. In Abb. 2.25 sind verschiedene graphische Darstellungsformen gezeigt, womit man völlig unterschiedliche Aspekte des Moleküls veranschaulichen kann: Die sog. topologische Darstellung zeigt den Verlauf der Polypeptidketten und liefert einen Überblick über die Tertiärstruktur. In ihr erkennt man die durch die Helix-, Faltblatt- und Schleifenregionen der Polypeptidketten repräsentierten Sekundärstrukturelemente (Abb. 2.25a). Detailliertere Informationen ergeben sich aus der Lage der Aminosäureseitenketten, die in der Strichdarstellung gezeichnet sind (Abb. 2.25b). Häufig ist aber gerade dieser Gehalt an Einzelheiten nicht erwünscht, weil er massiv auf Kosten der Übersichtlichkeit geht. Einen realistischen Eindruck von der Verteilung und dem wirklichen Platzbedarf der einzelnen Atome vermittelt das Kalottenmodell, bei dem die Größe der Kugeln den Van-der-Waals-Radien der Atome entspricht (Abb. 2.25c). Abb. 2.25d zeigt dagegen die Gestalt des Proteins aus der Sicht eines niedermolekularen Liganden, der mit dem Makromolekül wechselwirkt, also z.B. eine Bindung oder eine katalytische Umwandlungsreaktion eingeht. Dieses Bild lässt sich am einfachsten erstellen, indem man mithilfe von Computerprogrammen die Oberfläche des Zielproteins von einem Lösungsmittelmolekül (im biologischen System Wasser) als Oberflächensonde ertasten lässt. Verschiedene Farben machen die elektrostatische Ladungsverteilung auf der Proteinoberfläche sichtbar. Man nimmt hierbei an, dass die in das Lösungsmittel hineinragenden Aminosäureseitenketten dieselben pKa-Werte haben wie isolierte Aminosäuren in freier Lösung.

Schon gewusst

Neben dem Sequenzvergleich ist auch der Vergleich ihrer 3-D-Strukturen für ein tieferes Verständnis von Proteinen äußerst hilfreich. Strukturvergleiche sind insofern nützlich, weil strukturelle Verwandtschaftsverhältnisse auch noch nachweisbar sind, wenn die Proteine praktisch keine Sequenzähnlichkeit aufweisen. Eine systematische Einteilung der Proteine aufgrund ihrer Strukturverwandtschaft, z.B. bei Vorliegen bestimmter Strukturmotive, resultiert in sog. hierarchischen Klassifikationsschemata. Es handelt sich hierbei um Datenbanken, in denen Proteine nach ihren Verwandtschaftsgraden gruppiert, beschrieben und graphisch dargestellt werden. Natürlich sind diese Datenbanken im Internet abfragbar, die bekanntesten sind CATH (Class-Architecture-Topology-Homologous superfamily), PDB (engl. Protein Data Base) und SCOP (Structural Classification Of Proteins).

MERKE

Mit Computervisualisierungsmethoden kann man Modelle der dreidimensionalen Proteinstrukturen darstellen.

Proteindomänen
Faltungseinheiten von Polypeptiden
Bei Proteinen liegen in der Primärstruktur benachbarte Gruppen auch räumlich eng beieinander. Innerhalb längerer Polypeptidketten bilden bestimmte Aminosäuresequenzabschnitte zusammengehörige Einheiten, die additiv aus Sekundärstruktur- bzw. Supersekundärstrukturelementen organisiert sind. Diese unabhängigen Faltungseinheiten innerhalb eines Proteins bezeichnet man auch als Domänen. Sie sind gegeneinander abgegrenzt und durch ihre strukturelle oder funktionelle Geschlossenheit charakterisiert. Proteine gewinnen erst ab einer Länge von 30–40 Aminosäuren einen ausreichenden Zusammenhalt, sodass die Größe von Proteindomänen im Bereich von 40–400 Resten angesiedelt ist.
Zur Verdeutlichung ist in Abb. 2.26a eine Untereinheit des Glykolyseenzyms Pyruvat-Kinase gezeigt. Die dargestellte Polypeptidkette enthält vier verschiedene Domänen, die strukturell klar voneinander abgegrenzt und nur durch Schleifenmotive verbunden sind: Der N-terminale Abschnitt (orange) ist für die Bildung von Kontakten zwischen verschiedenen Untereinheiten des tetrameren Komplexes nötig. Im darauf folgenden --Barrel (blau) sind Substratbindungsstelle und das katalytische Zentrum lokalisiert. Eine weitere Domäne (grün), die aus zwei übereinanderliegenden -Faltblättern besteht, ist gewissermaßen in eine der Schleifen des Barrels eingehängt. Am C-Terminus befindet sich eine --Struktur (violett).

MERKE

Proteindomänen sind Polypeptideinheiten, die sich unabhängig von benachbarten Sequenzabschnitten in ihre Tertiärstruktur falten können.

Schon gewusst

Monofunktionelle und bifunktionelle Proteine. Verschiedene Domänen innerhalb einer singulären Polypeptidkette haben unterschiedliche Funktionen. Die Aufgabenverteilung einzelner Abschnitte geht so weit, dass selbst unterschiedliche chemische Reaktionen durch Faltungseinheiten von ein und derselben Polypeptidkette katalysiert werden können. Ein Beispiel für bifunktionelle Enzyme ist die Phosphofructo-Kinase-2/Fructose-2,6-Bisphosphatase-2 (PFK2/FBPase2), die zwei verschiedene Enzymaktivitäten auf den Domänen desselben Polypeptids beherbergt. Beide Reaktionen dienen zur Steuerung des zellulären Spiegels von Fructose-2,6-bisphosphat, einem Regulator der gegenläufigen Stoffwechselprozesse Glykolyse und Gluconeogenese (Kap. 5.2.2 und 5.2.4Kap. 5.2.2Kap. 5.2.4).

Modularer Aufbau
Besonders ausgeprägt ist der modulare Aufbau bei eukaryontischen Proteinen. In Abb. 2.26b wird dies am Beispiel einer Gruppe von Serin-Proteasen deutlich, die an Blutgerinnung und Fibrinolyse beteiligt sind. Ihre biologische Hauptfunktion liegt in der proteolytischen Spaltung von Peptidbindungen. Urokinase, Faktor IX und Plasminogen sind aus den zwei Domänen aufgebaut, die auch beim homologen Chymotrypsin, einem von der Bauchspeicheldrüse sezernierten Verdauungsenzym, für die Bildung des funktionell aktiven Makromoleküls sorgen. Weitere Module können in verschiedenen Variationen hinzukombiniert werden, was den Proteinen zusätzliche spezifische Eigenschaften verleiht. Auch wenn die genaue Funktion mancher Module unklar ist, können bestimmte Domänen für die Bindung von Ionen oder auch anderer makromolekularer Strukturen verantwortlich sein.
Bei Proteinen der teilweise komplexen biochemischen Signaltransduktionsketten (Kap. 22) werden z.B. Domänen mit enzymatischer Aktivität mit Andockmodulen (sog. SH2- oder SH3-Domänen; SH von src homology) verknüpft, die eine Wechselwirkung von verschiedenartigen Proteinoberflächen vermitteln. So ermöglichen sie, dass bestimmte zelluläre Signale zwischen einzelnen Proteinen durch spezifische Bindung übertragen werden. Strukturproteine wie Fibronektin oder Kollagen XII haben einen noch komplexeren modularen Aufbau. Mit einer Polypeptidkette von mehr als 30.000 Aminosäuren ist der Rekordhalter Titin. Das in Muskelzellen vorkommende Multidomänenprotein ist in einer Abfolge von mehreren verschiedenen Modulen, hauptsächlich Immunglobulin- und Fibronektindomänen, organisiert.

MERKE

Modulare Proteine bilden funktionelle Einheiten, die identische oder unterschiedliche Domänen in verschiedenen Kombinationen enthalten.

Quartärstruktur

Viele Proteine bestehen aus einer einzigen Polypeptidkette, sie kommen in der Natur als Monomere vor. Daneben gibt es eine große Anzahl von oligomeren Proteinen, die Komplexe aus mehreren identischen (Homooligomere) oder nichtidentischen Untereinheiten (Heterooligomere) bilden. Die Zusammensetzung und räumliche Anordnung von multimeren Proteinen werden als Quartärstruktur bezeichnet. Der Zusammenhalt der Peptidketten beruht auf nichtkovalenten Wechselwirkungen und kovalenten Bindungen. Abb. 2.27a zeigt die hexamere Struktur von Insulin, in der es vor der Sekretion in das Blut in den Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse gespeichert wird. Das homooligomere Assoziat wird durch zwei Zinkionen stabilisiert, die Bindungen mit den Stickstoffatomen von Histidinseitenketten eingehen und die einzelnen Untereinheiten verbrücken. Die eigentliche biologische Wirkung geht vom monomeren Protein aus.
Homooligomere Ein anderes Beispiel für einen homooligomeren Komplex ist die Pyruvat-Kinase (oben), deren tetramere Struktur in Abb. 2.27b gezeigt wird. In Komplexen mit identischen Untereinheiten stehen die einzelnen Komponenten durch kooperative Wechselwirkungen miteinander in Verbindung (Kap. 3.5.1). Diese Proteine haben meist eine komplexere Funktionsweise als die entsprechenden Monomere, zeichnen sich durch höhere Flexibilität aus und bieten vielfältige Angriffspunkte für regulatorisch wirksame Effektormoleküle. Dies gilt natürlich in besonderem Maße für das Hämoglobinmolekül (Abb. 2.10), das sich aus vier sauerstoffbindenden Untereinheiten zusammensetzt.
Heterooligomere Bei heterooligomeren Proteinen haben die einzelnen Untereinheiten verschiedenartige Eigenschaften und agieren arbeitsteilig. Dies ist z.B. bei den komplexen Funktionen der RNA-Polymerase der Fall, die bei Escherichia coli aus fünf verschiedenen Einheiten aufgebaut ist. Die biologische Funktion der individuellen Untereinheiten hängt von den anderen Komponenten ab. Auch viele Membranproteine sind Heterooligomere, z.B. Rezeptorproteine, Ionenkanäle oder transmembranäre Ionenpumpen. Hier haben manche Polypeptide bestimmte Aufgaben beim biosynthetischen Einbau in die Membran und bei der Bereitstellung von Cofaktoratomen oder -molekülen. Andere Untereinheiten besitzen Bindungsstellen für Substratmoleküle oder haben katalytische Aktivität.
Isoformen Von zahlreichen Proteinen gibt es mehrere Varianten, die als Isoformen bezeichnet werden. Sie können die Funktionalität des Proteins beeinflussen und spiegeln in ihrem Expressionsmuster eine ausgeprägte Gewebsspezifität wider. Sie unterscheiden sich durch den Aufbau der Polypeptidkette (Primärstruktur). Bei manchen oligomeren Proteinen kommt die Varietät der Isoformen durch Kombination verschiedener Monomere zustande. Die Lactat-Dehydrogenase (LDH) besteht aus vier Untereinheiten, die den Typen H (für Herz) und M (für Muskel) entsprechen. Aus den Monomeren kann sich das tetramere Enzym in fünf verschiedenen Isoformen zusammensetzen, die als Isoform LDH-1 (HHHH), LDH-2 (HHHM), LDH-3 (HHMM), LDH-4 (HMMM) und LDH-5 (MMMM) bezeichnet werden (Abb. 2.28a). Die Isoformen haben alle unterschiedliche LDH-Aktivität. Interessanterweise kommen alle Spezies in unterschiedlichen Konzentrationen in verschiedenen Geweben vor (Abb. 2.28b).

Klinik

Ein medizinisch relevantes Enzym ist die Kreatinkinase (CK), die als Dimer aus den Isoformen Typ M (für muscle) und B (für brain) besteht. Die drei Isoenzyme CK-MM, CK-MB und CK-BB haben gleiche enzymatische Aktivität, unterscheiden sich aber durch ihre Hemmbarkeit mit Antikörpern, die gegen die M-Untereinheit gerichtet sind. Die Isoformenzusammensetzung von Enzymen ist diagnostisch wichtig, weil bei Gewebsdefekten Proteine in Körperflüssigkeiten übertreten. Ein wichtiges Beispiel ist der Myokardinfarkt, bei dem aus zugrunde gegangenen Herzmuskelzellen CK in das Blut freigesetzt werden. Hier ist die Quantifizierung der herzspezifischen Isoform CK-MB von großer Bedeutung. Der zeitliche Verlauf des Serumspiegels dieses Enzyms gibt wichtige Aufschlüsse über den Zeitpunkt des Infarkteintritts. Die Enzymaktivitäten können sogar schon gemessen werden, bevor Änderungen im Elektrokardiogramm sichtbar werden.

Multienzymkomplexe Eine noch höhere Organisationsebene besteht in der Assoziation von Proteinen mit individuell verschiedenen katalytischen Eigenschaften. Diese Zusammenlagerungen bezeichnet man als Multienzymkomplexe. Im Fall des Fettsäure-Synthase-Komplexes sind z.B. die Enzymaktivitäten von sieben verschiedenen Einzelreaktionen der Fettsäurebiosynthese räumlich zusammengefasst. Der besondere Vorteil der damit verbundenen fließbandartigen Anordnung besteht darin, die Gesamtreaktion mit hoher Effizienz zu koordinieren. Ein weiteres Beispiel für diese Arbeitsweise stellt der Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzym-Komplex dar (Molekülmasse 5,3 MDa), der mit 30 nm Durchmesser noch größer als ein Ribosom ist. Auf ihm sind drei verschiedene Einzelaktivitäten vereinigt, die über Teilschritte zur Bildung des zentralen Metaboliten Acetyl-CoA führen.
Neben den rein aus Proteinen bestehenden Komplexen, die als Enzyme des Stoffwechsels vorkommen, gibt es hochorganisierte Zusammenlagerungen von Proteinen mit anderen Biomolekülen, die u.a. auch katalytische Aktivität aufweisen. Hierzu zählen beispielsweise der Transkriptionsinitiationskomplex (verschiedene Proteine assoziiert mit Template-DNA) zur Herstellung von mRNA oder das Ribosom (verschiedene Proteine assoziiert mit RNA-Molekülen) als Instrument der Proteinbiosynthese.

MERKE

Kombinationen mehrerer Untereinheiten oder verschiedener Proteine ermöglichen die funktionelle Bewältigung komplexer katalytischer Aktivitäten.

Posttranslationale Zustandsänderungen

Proteinmodifikationen

Proteine bestehen prinzipiell aus den 20 Aminosäuren, die im genetischen Code festgelegt sind. Zusätzlich tragen sie durch die Primärsequenz festgelegte Signale, in denen die Botschaft für eine chemische Modifikation bestimmter Gruppen verschlüsselt ist. Modifikationen können zu unterschiedlichen Zeitpunkten – während oder nach der Biosynthese – in das Protein eingefügt werden.
Translationale Modifikationen
Bestimmte Aminosäuren werden zu Beginn der Translation, nach Bindung an die Transfer-RNA, modifiziert. Hierzu gehört die Aminosäure N-Formylmethionin (Abb. 2.29b), die bei der Translation prokaryontischer Proteine am N-Terminus eingebaut wird (unten). Ein weitere Aminosäurevariante ist das Selenocystein (Abb. 2.29a), das auch als 21. proteinogene Aminosäure angesehen werden kann. Es wird über einen besonderen Mechanismus eingebaut (Kap. 13).
Posttranslationale Modifikationen
Nach Verknüpfung der Aminosäuren am Ribosom benötigen manche Proteine zusätzliche Veränderungen, um ihre zelluläre Funktion erfüllen zu können. Diese basieren auf chemischen Modifikationen der proteinogenen Aminosäuren an bestimmten funktionellen Gruppen. Man spricht von posttranslationalen Modifikationen, weil die chemischen Veränderungen enzymatisch erst nach Einbau der Aminosäure in die Proteinkette vorgenommen werden. Im Folgenden werden nur die häufigsten Varianten exemplarisch vorgestellt.
Aminosäuremodifikationen
Die Formylgruppe des bei Bakterien am N-Terminus eingebauten N-Formylmethionins (Abb. 2.29b) wird mithilfe einer Deformylase wieder entfernt, wenn die nachfolgende Aminosäure eine lange Seitenkette trägt. Bei ungefähr 50% aller Eukaryonten- und Prokaryontenproteine wird das Initiatormethionin, meist ein N-terminales Methionin, durch eine ribosomenassoziierte Methionin-Aminopeptidase von der Polypeptidkette abgespalten. Es handelt sich um das Beispiel einer proteolytischen Modifikation. In anderen Fällen wird die Abspaltung kleiner Peptide vom N-Terminus des Proteins genutzt, um die Enzymaktivität des Zielproteins zu kontrollieren (Kap. 3.5.2).
Kollagen enthält dauerhaft modifizierte Aminosäuren, hauptsächlich 3- oder 4-Hydroxyprolin (Abb. 2.29c, d), in geringerem Umfang auch Hydroxylysin, die durch Umwandlung von Prolin- und Lysinresten durch Prolyl- bzw. Lysylhydroxylasen gebildet werden. Diese lebenswichtigen Enzyme sind Metallproteine und benötigen Vitamin C als Cofaktor. Dessen Mangel löst die Krankheit Skorbut aus, da neu synthetisiertes Kollagen nicht weiter modifiziert und damit nicht mehr ausreichend stabilisiert wird. Eine weitere die Aktivität der Proteine regulierende Aminosäureabänderung ist die Vitamin-K-vermittelte -Carboxylierung von Glutaminsäureresten bei Wachstumsfaktoren und Proteinen des Blutgerinnungssystems.
Lipidanker
Einige Proteine werden mit Lipiden verknüpft (Abb. 2.29e–g). Häufig wird hierdurch die Bindung von ursprünglich löslichen Proteinen an Membranen vermittelt. Vor allem ist die Anheftung im N-terminalen Bereich der Proteine von Palmitoyl- (S-Acylierung von Cystein) oder Myristoylgruppen (N-Acylierung am N-terminalen Glycin) zu erwähnen. Komplexere Lipide wie die sog. Glykosylphosphatidylinositol-(GPI-)Anker gehören in diese Gruppe, wodurch z.B. das Prionprotein PrP modifiziert wird. Die Lipidanhaftung ist für die Assoziierung des Proteins mit der Zytoplasmamembran verantwortlich, wobei die Art der Modifikation über die Orientierung der hydrophilen Domäne entscheidet. Besonders wichtig ist die Lipidmodifikation für Proteine der Signaltransduktion. Die Farnesyl-Transferase erkennt die am C-Terminus gelegene CAAX-Box und überträgt einen Farnesylrest ( Prenylrest) auf die SH-Gruppe von C-Cystein-Resten, wie beispielsweise bei Proteinen der Ras-Superfamilie (Abb. 2.12).

Schon gewusst

Die Komplexität posttranslationaler Lipidmodifikationen sei am Beispiel des Signaltransduktionsproteins Ras beschrieben: Durch eine Farnesyl-Transferase wird zuerst der Farnesylrest mit seinen 15 Kohlenstoffatomen auf einen Cysteinrest übertragen. Letzterer stellt bei Ras die viertletzte Aminosäure des C-terminalen Endes dar (Abb. 2.12b). Als Donor dient Farnesyldiphosphat. Danach werden die drei C-terminalen Aminosäuren proteolytisch abgespalten, und eine Carboxymethyl-Transferase überträgt einen Methylrest auf die COOH-Gruppe (Abb. 2.29e), wobei als Substrat S-Adenosylmethionin verwendet wird. Beim sogenannten H-Ras wird in einer weiteren Reaktion Palmitinsäure auf zwei weitere, C-terminal gelegene Cysteinreste übertragen. Erst mit dieser letzten Modifikation kann Ras fest in der äußeren Membran verankert werden und seine intrazelluläre Signalfunktion übernehmen.

Acetylierungen
Durch besondere Transferasen wird der N-Terminus mancher Proteine acetyliert, insbesondere wenn die erste Aminosäure Glycin, Alanin, Serin oder Threonin ist. Der Grund hierfür ist unklar, wahrscheinlich spielt die Acetylierung eine Rolle als Signal für den Proteinabbau. Acetylierungen im Inneren von Proteinen treten u.a. bei Histonen auf, den im Chromatin vorkommenden DNA-Bindungsproteinen. Die reversible Acetylierung von Lysinresten am N-terminalen Ende der Histone wird durch Histon-Acetyl-Transferasen bzw. Histon-Deacetylasen katalysiert. Sie steht offensichtlich im Zusammenhang mit der Genexpressionskontrolle.
Phosphorylierungen
Sie stellen in der Biochemie eine wichtige Aminosäuremodifikaton dar: Durch Übertragung des energiereichen Phosphatrests von ATP auf die OH-Gruppen von Serin (Abb. 2.29h), Threonin oder Tyrosin (Abb. 2.29i) unter Bildung der entsprechenden Phosphatester werden die Ladungszustände der Aminosäuren drastisch verändert. Durch Bindung von Phosphat können die Proteine wie molekulare Schalter funktionieren, da sich durch das Anhängen der relativ großen, stark negativ geladenen Phosphatgruppe die Struktur und die chemischen Eigenschaften des Proteins erheblich verändern. So kann die phosphorylierte Form eine andere Funktion als die dephosphorylierte ausüben. Die Tyrosinphosphorylierung ist besonders in der intrazellulären Signaltransduktion wichtig. Die besondere Bedeutung der reversiblen Bildung von Phosphoserin liegt in der Regulation von interkonvertierbaren Enzymen, die an den Schaltstellen des Intermediärstoffwechsels sitzen. Diese Regulationsprozesse sind enzymatisch gesteuert: Für die Phosphatübertragung aus ATP sind Kinasen verantwortlich, und die proteingebundenen Phosphatgruppen werden durch Protein-Phosphatasen abgespalten.

Klinik

Tyrosinreste können auch sulfatiert werden. Hierbei wird das aktivierte Sulfat aus Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat (PAPS) durch das im trans-Golgi-Apparat lokalisierte integrale Membranprotein Tyrosylproteinsulfo-Transferase übertragen. Diese Vorgänge spielen eine Rolle bei Protein-Protein-Wechselwirkungen beim intrazytoplasmatischen Transport oder bei Sekretionsprozessen. Es ist möglich, dass die Sulfatierung des Chemokincorezeptors CCR5 die Infektion einer Zelle durch das humane Immunschwächevirus (HIV) erleichtert.

Kohlenhydratmodifikationen
Kohlenhydrate werden in verschiedensten Varianten an Proteine gekoppelt. Generell werden extrazelluläre Proteine im endoplasmatischen Retikulum (ER) und Golgi-Apparat durch Verknüpfung mit Oligosacchariden modifiziert. Diese Proteine werden entweder sezerniert, in der Membran verankert, oder sie sind für den Transport innerhalb von membranumschlossenen Organellen bestimmt. Zur Vereinfachung sind in Abb. 2.29j und k nur Bindungen mit einem monomeren Kohlenhydratsubstituenten gezeigt. Es handelt sich hierbei um sog. glykosidische Bindungen, die durch Wasserabspaltung entstehen, wenn sich die reaktive Gruppe des Zuckers entweder mit der OH-Gruppe von Serin bzw. Threonin oder mit der Aminogruppe von Asparagin verbindet. Nach Art der modifizierten Aminosäuregruppe unterscheidet man N- und O-gekoppelte Zuckerreste. Bei der N-gekoppelten Modifikation ist der Zucker durch eine -N-glykosidische Bindung an einen Asn-Rest gebunden, der Teil der Erkennungssequenz Asn–X–Ser/Thr ist, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt. Im Fall der O-Kopplung liegt entsprechend eine -O-glykosidische Bindung an die OH-Gruppe von Serin oder Threonin vor. Allerdings lassen sich hier die Signale, die die Zuckeranheftung steuern, nicht unmittelbar aus der Aminosäuresequenz des Proteins ablesen.
Glykosyltransferasen spielen auch eine Rolle bei der Biosynthese komplexer Glykoproteine, bei der verschiedene Kohlenhydrate untereinander verknüpft und ans Protein gehängt werden. Weit verbreitet sind Glykoproteine, in denen Sialinsäure beteiligt ist, eine N- oder O-substituierte Neuraminsäure.

Klinik

Transferrin ist ein Glykoprotein, das für den Eisentransport zuständig ist. Bei chronischem Alkoholkonsum wird die für die Übertragung von Sialinsäureresten verantwortliche Glykosyltransferase gehemmt, sodass im Vergleich zur Hauptkomponente Tetrasialo-Transferrin nur noch CDT (carbodefizientes Transferrin) gebildet wird, bestehend aus Disialo-, Monosialo- und Asialo-Transferrin. CDT kann durch einen Immunoassay oder durch HPLC quantifiziert werden. Sein Anteil im Blut beträgt im Normalfall weniger als 3% des Gesamttransferrins. Männer mit einem täglichen Alkoholkonsum von mehr als 60 g über drei Wochen hinweg erreichen einen CDT-Anteil von bis zu 18%. Die Halbwertszeit für die CDT-Erhöhung liegt bei zwei Wochen, sodass der Wert nach plötzlicher Abstinenz nicht sofort absinkt.

Die zellbiologischen Funktionen der Glykosylierung sind – wie die Struktur der oligomeren Kohlenhydrate selbst – komplex. Hervorzuheben ist ihre Rolle bei der Adressierung von neu synthetisierten Proteinen zu ihren subzellulären Kompartimenten. Besonders erwähnenswert ist die Abänderung der Oberflächenform von Proteinen durch die Zuckermodifikation, die für die Ausbildung von spezifischen Protein-Protein-Kontakten essenziell ist. Die Oligosaccharidkomponenten tragen erheblich zur Antigenität von Proteinen bei. Deutlich wird dies bei den AB0-Blutgruppen-Antigenen, bei denen O-gekoppelte Glykoproteine auf Zelloberflächen sitzen und Erkennungsstellen für Antikörper bilden.

Blick ins Labor

Neben den enzymatisch katalysierten Proteinmodifikationen gibt es auch solche, die durch spontane Reaktion mit Reaktanden entstehen, z.B. die Bindung von Glucose an Hämoglobin A (HbA 22). Die Anlagerung erfolgt über eine Zweistufenreaktion, bei der die Glucose zuerst mit der NH2-Gruppe des N-terminalen Valins der -Kette ein Aldimin ausbildet, das nachfolgend in ein Ketoamin umgelagert wird (Amadori-Umlagerung). Das Produkt, HbA1c, lässt sich durch IEF, durch Kationenaustauscherchromatographie oder mittels Immunoassay bestimmen. Der relative Anteil des glykierten Hämoglobins ist ein Maß für die im Zeitdurchschnitt im Blut vorliegende Glucosekonzentration. Der HbA1c-Wert ist quasi als Blutzuckergedächtnis anzusehen, das die mittlere Glucosekonzentration der vergangenen vier bis sechs Wochen wiedergibt, weil das unmodifizierte Hämoglobin aufgrund der Erythrozytenlebensdauer ständig regeneriert wird. Insofern ist die Messung von HbA1c ein wertvoller Parameter für die Beurteilung der Blutzuckerlage bei der Langzeitbeobachtung von Patienten mit Diabetes mellitus.

Klinik

Eine wichtige Folge der nichtenzymatischen Glykierung ist die Vernetzung von Kollagenmolekülen in den subendothelialen Schichten von Blutgefäßen bei chronischer Hyperglykämie. Die hierdurch erheblich verminderte Elastizität der Gefäßwände ist eine der maßgeblichen Ursachen von diabetischen Mikro- und Makroangiopathien.

MERKE

Durch kovalente Modifikationen an proteingebundenen Aminosäuren werden zusätzliche Funktionalitäten der Proteine erzeugt. Hierdurch erweitert sich die Proteinvielfalt erheblich über das im Genom vorhandene Potenzial hinaus.

Faltung von Proteinen

Die Aminosäuresequenz allein gibt noch keine Auskunft, ob das Protein eine vorhersagbare Raumstruktur einnimmt oder welche Funktion es ausübt. Erst wenn Proteine ihre endgültige individuelle Gestalt eingenommen haben, können sie ihre biologischen Funktionen ausüben, z.B. als Enzym oder Antikörper. Der Prozess, der zur typischen Struktur eines Proteins führt, heißt Faltung. Nicht jede willkürliche Sequenz von Aminosäuren faltet sich zu einer definierten Struktur. Künstlich hergestellte Peptide bleiben oft ungefaltet; hier wird das evolutionäre Prinzip der Selektion deutlich. Die in der Natur vorkommenden Proteine sind hinsichtlich ihrer Faltung optimiert: Aus der statistisch nahezu unvorstellbar großen Anzahl von möglichen Aminosäurekombinationen sind nur solche Sequenzen ausgewählt worden, die tatsächlich eine biologisch sinnvolle Faltung einnehmen.

Blick ins Labor

In vitro lassen sich Proteine am besten ausgehend vom vollständig denaturierten Zustand studieren. Völlige Entfaltung erreicht man durch Behandlung mit Denaturierungsmitteln wie 8 mol L–1 Harnstoff oder 6 mol L–1 Guanidiniumhydrochlorid. Damit kann man Polypeptide in eine Zufallsknäuelstruktur überführen und sie dabei trotzdem in Lösung halten. Wird das denaturierende Agens unter oxidierenden Bedingungen durch Verdünnung oder Dialyse abgetrennt, bildet sich die native Struktur zurück. Mit diesen Rückfaltungsexperimenten konnte demonstriert werden, dass allein die Aminosäuresequenz die dreidimensionale Struktur von Proteinen festlegt.

Energetische Aspekte der Faltung

Schon gewusst

Stellt man sich vor, dass ein Modellprotein aus nur 100 Aminosäuren besteht und jeder Rest nur zwei verschiedene Positionen einnehmen kann, so gibt es für die Polypeptidkette 2100 bzw. 1030 verschiedene Konformationen (der wirkliche Wert wird noch viel höher liegen!). Bei einer Verweildauer von nur 1 ps (1 Pikosekunde 10–12 s) pro Konformationszustand bräuchte das Protein 1030 10–12 s (1018 s 32 Mrd. Jahre), wenn es alle zur Verfügung stehenden Möglichkeiten austesten würde. Ein solcher Zeitraum übersteigt sogar das Alter des Universums. Diese Rechnung spiegelt das sog. Levinthal-Paradox wider, benannt nach dem amerikanischen Biologen Cyrus Levinthal. Es beinhaltet, dass die Natur offenbar wesentlich schnellere Wege der Proteinfaltung gefunden hat.

Beim Faltungsprozess kann das Protein ein oder mehrere mehr oder weniger stabile Zwischenzustände (Intermediate) einnehmen. Praktisch kann man sich ein Faltungsintermediat (molten globule) als kondensierte Vorläuferform vorstellen, in der die Sekundärstrukturelemente bereits gebildet sind, noch nicht aber die Tertiärstruktur des fertigen Proteins. Dieser Vorgang der Proteinfaltung in zwei Stufen ist summarisch in Abb. 2.30a zusammengefasst. Die Sekundärstrukturelemente bilden sich nach relativ kurzer Zeit, die Faltung einer -Helix benötigt 0,1–10 s. Die Triebkraft für die Bildung eines solchen Zwischenprodukts beruht auf der Zusammenlagerung hydrophober Oberflächenanteile, um das polare Lösungsmittel Wasser abzuschirmen. Im weiteren Verlauf bildet sich die endgültige Tertiärstruktur aus, die wesentlich kompakter als das Molten globule ist. Als generelle Regel gilt, dass auch im gefalteten Endzustand die hydrophoben Anteile in das Innere des Proteins gerichtet sind, während polare Seitenketten eher auf der Oberfläche liegen, auf der sie mit dem Wasser besseren Kontakt aufnehmen können. Ausnahme sind integrale Membranproteine (unten).
Am sog. Trichtermodell (Abb. 2.30b–e) kann man sich den Energieverlauf der Proteinfaltung veranschaulichen. Das Protein muss dabei so lange über eine Energiefläche möglicher Zustände wandern, bis sich eine stabile Konformation einstellt. Die Proteine sind bestrebt, einen möglichst energiearmen Endzustand zu erreichen (Minimum rote, nach unten zeigende Spitzen). Daher stammt die Triebkraft für den Faltungsprozess. Basierend auf diesem Grundmodell, sind verschiedene Szenarien möglich. Die Situation in Abb. 2.30b illustriert das Levinthal-Paradox und ist in der Realität die unwahrscheinlichste Variante: Das Protein irrt lange auf einem Niveau mit nahezu unendlich vielen energetisch gleichwertigen Konformationen umher, bis es zum stabilen Endzustand gelangt. In Abb. 2.30c gibt es viele Wege, die zum Endzustand führen. Allerdings existiert eine Faltungsrinne, die stark begünstigt zum Energieminimum führt. Auch hier müsste das Protein lange nach einem Startpunkt suchen, von dem es über einen singulären Weg zum Ziel kommt. Viel realistischer ist die Annahme, dass ein Protein von vielen verschiedenen Startpunkten durch schrittweise Energieabsenkung direkt zum Minimum gelangt (Abb. 2.30d). Auf diesen Wegen erreicht das Protein relativ schnell Zwischenzustände (Abb. 2.30e), von denen es erst nach Überwindung oder Umschiffung von Energiebarrieren in die stabile Konformation übergeht.

MERKE

Die Ausbildung der energetisch günstigsten Proteinkonformation (Proteinfaltung) erfolgt durch Bildung von Faltungsintermediaten mit schrittweise absinkendem Energiegehalt.

Faltungshelferproteine
Zytoplasmatische Proteine werden an Polyribosomen hergestellt. Proteintranslation und -faltung sind aufeinander abgestimmt: Die Faltung ist vermutlich ein cotranslationaler bzw. cotranslokationaler Vorgang, der mit dem Austritt der Polypeptidkette aus dem Ribosom zu korrelieren scheint. Prokaryonten synthetisieren Proteine bis zu zehnmal schneller als Eukaryonten, und dementsprechend falten sich auch ihre Proteine schneller. In der Zelle wird die Faltung von Proteinen durch verschiedene Enzyme unterstützt.
Faltungsisomerasen Die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase ist für die Umwandlung von cis-trans-Peptidbindungen verantwortlich (Kap. 2.1.3). Für die korrekte Ausbildung von Disulfidbrücken in den extrazytoplasmatischen oder für die Sekretion bestimmten Polypeptiden sorgt das Enzym Protein-Disulfid-Isomerase, indem es die Kombinationen von S–S-Bindungen von Cysteinresten durchprobiert, bis sich optimale Paarungen gebildet haben, bei denen ein Energieminimum erreicht ist. Dieser Vorgang spielt sich v.a. im endoplasmatischen Retikulum ab (Kap. 17).
Chaperone Prominenteste Faltungshelfer sind die sog. Chaperone (engl. chaperon[e] Aufsichtsperson, Anstandsdame). In diese Klasse von Proteinen gehören auch die Hitzeschockproteine (Hsp), die ihre Bezeichnung wegen ihres drastisch vermehrten Auftretens nach kurzfristiger Temperaturerhöhung bekommen haben. Sie bilden Komplexe mit (z.B. thermisch) entfalteten Proteinen. Durch den Hitzeschock verlieren manche Proteine ihre native Raumstruktur, weil u.a. die Tertiärstruktur stabilisierende Wechselwirkungen gelöst werden. Man spricht auch von Hitzedenaturierung. Denaturierte Proteine müssen in der Zelle schnell abgefangen werden, da sie im entfalteten Zustand ihre hydrophoben Oberflächen nach außen stülpen und so aggregieren würden. Hitzeschockproteine reparieren die denaturierten Proteine, indem sie die Rückfaltung unterstützen.
Es gibt nur wenige verschiedenartige Chaperone, die für bestimmte Zellkompartimente typisch sind. Ein Faltungshelfer ist dabei für eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine verantwortlich. Allein daher ist es unmöglich, dass die Faltungshelfer für jedes Protein individuelle Faltungswege katalysieren, denn dann müsste jedes Protein seinen eigenen Faltungshelfer haben. Hier stößt man auf ein Prioritätsproblem, denn Faltungshelferproteine selbst müssen auch gefaltet werden.
Katalytisch funktionieren Chaperone wahrscheinlich, indem sie einen Käfig um Proteine bauen, in dem sich die Faltung abspielen kann. Sie halten das zu faltende Protein (Substratprotein) in Position und erleichtern die Ausbildung von Wechselwirkungen, die es dem Substratprotein ermöglichen, aus evtl. energetisch metastabilen Faltungsnebenminima herauszukommen und in den Zustand der niedrigsten Energie zu gelangen (in Abb. 2.30 die tiefste Stelle im Faltungstrichter). Durch Einengen des Konformationsraums kommt es so zu einer drastischen Geschwindigkeitserhöhung der katalysierten Faltungsreaktion.

MERKE

Faltungshelferproteine erleichtern die Faltung eines neu synthetisierten oder denaturierten Proteins und vermindern die zelluläre Konzentration von unvollständig gefalteten, falsch gefalteten oder ungefalteten Proteinen.

Proteinfehlfaltungskrankheiten
Krankhafte Proteinaggregationen in vivo
Die Proteinbiosynthesemaschinerie ist ein hocheffektiver Apparat, der entsprechend den zellspezifischen Anforderungen funktionsfähige Produkte herstellt. Durch Herstellungsfehler können falsche Faltungen entstehen. Die defekten Proteine werden normalerweise von der Zelle erkannt, aussortiert und abgebaut. Es gibt allerdings Zustände, bei denen sich inkorrekt gefaltete Proteine in der Zelle anhäufen, was zu krankhaften Funktionsausfällen führen kann. Die Fehlfaltung führt dann zur vermehrten Ausbildung von -Strang-Anteilen, die sich zu Faltblättern formieren und aufgrund der Stabilisierung durch Wasserstoffbrückenbindungen zu komplexen Protomeren polymerisieren können. Diese ausgedehnten, länglichen Aggregate bezeichnet man als Amyloidfibrillen. Im Rahmen der Alzheimer-Krankheit kommen Ablagerungen des Amyloid--Proteins im Gehirn vor. Beim Morbus Parkinson finden sich in der Substantia nigra vorwiegend aus dem Protein -Synuclein gebildete Aggregate, die sog. Lewy-Körper.
Viele Proteine können unter nichtphysiologischen Bedingungen, z.B. bei extrem niedrigem pH-Wert, zur Umfaltung und zur Ausbildung von Amyloidfibrillen gezwungen werden. Natürliche Proteine scheinen demnach bereits das Potenzial zur Ausbildung verschiedener stabiler Konformationen zu besitzen. Unter normalen Bedingungen ist die natürliche Konformation am wahrscheinlichsten; dies erklärt, warum das Auftreten von Proteinfehlfaltungskrankheiten äußerst selten ist. Bei genetisch bedingten Krankheiten können mutationsbedingt veränderte Proteine entstehen, bei denen die natürliche Konformation erheblich destabilisiert ist und daher die Fehlfaltung begünstigt wird.
Bei neurodegenerativen Krankheiten wie Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Scrapie oder BSE sterben Hirnzellen ab. Das Hirngewebe ist durch ein löchrig-schwammartiges Aussehen gekennzeichnet. Für die zerebralen Läsionen macht man Aggregate von Proteinen mit vorwiegend -Faltblatt-artiger Struktur verantwortlich. Diese Komplexe bestehen größtenteils aus Prionen (engl. proteinaceous infectious agents), einer fehlgefalteten Variante (PrPSc) des natürlichen Zellproteins PrPC (zelluläre Form des Prionproteins), das im gesunden Zustand einen beträchtlichen Anteil an -helikalen Sekundärstrukturelementen aufweist (Abb. 2.31).
Ungewöhnlich am Prionenkonzept ist die These, dass das PrPC allein, also ohne biologische Beteiligung von Nucleinsäuren, verantwortlich für die konformationelle Änderung des Polypeptids und der biologischen Übertragbarkeit seiner pathologischen Variante PrPSc sei. Das PrPC ist ein normal vorkommendes, über ein Glykolipid an die Membran von Nervenzellen gebundenes Protein mit noch unbekannter Funktion. Seine dreidimensionale Struktur ist in Abb. 2.31 dargestellt. Man vermutet, dass die Prionenerkrankungen durch eine Umwandlung von PrpC in die krankheitsverursachende Konformationsvariante PrPSc (Scrapie-Form des Prionproteins) ausgelöst werden, die einen signifikant höheren Anteil an -Faltblatt-Struktur enthält. Gegenwärtig diskutierte Modelle der Prionenvermehrung und der Kinetik der Amyloidfibrillenbildung sind in Abb. 2.32a und b dargestellt. PrPSc ist im Gegensatz zu PrPC proteolyseresistent und kann durch Proteasen nicht abgebaut werden, was man zum diagnostischen Nachweis der Krankheit an Rinderhirnen nutzt (Abb. 2.41 b).

Klinik

Ein ganz anderer Fall von Fehlfaltung liegt bei der Sichelzellanämie vor. Bei dieser Erkrankung ist der tetramere Blutfarbstoff Hämoglobin betroffen (Abb. 2.10, Quartärstruktur des adulten Hämoglobins: 22). Hier führt eine Punktmutation auf Position 6 der -Untereinheit von Glutaminsäure nach Valin zu dramatischen Konsequenzen. Das Produkt wird als Sichelzellhämoglobin (HbS) bezeichnet. Die Punktmutation erzeugt einen hydrophoben Bereich auf der Oberfläche des Proteins. Die hierdurch entstehende Strukturvorwölbung passt genau in eine komplementäre hydrophobe Tasche an einer anderen Stelle des HbS, sofern das mutierte Hämoglobin in der desoxygenierten Form vorliegt. Es bilden sich langkettige Polymere von HbS aus, die man sogar elektronenmikroskopisch als Fibrillen erkennen kann. Bei homozygoten Genträgern entsteht die tödliche Sichelzellanämie, weil die langen Fasern des polymerisierten funktionell inaktiven HbS im desoxygenierten Zustand die Erythrozyten versteifen und ihnen so eine sichelförmige Morphologie aufzwingen. Bei heterozygoten Trägern liegt aber nur etwa die Hälfte der -Untereinheiten verändert vor, und die Sichelzellbildung ist weniger ausgeprägt. Interessanterweise sind die Träger resistent gegen die Infektion mit der Tropenkrankheit Malaria. Der Malariaparasit Plasmodium falciparum, der seinen Lebenszyklus teilweise im Erythrozyten verbringt, säuert das Zellinnere leicht an, was die Sichelzellumwandlung erleichtert. Sind aber erst einmal Sichelzellen gebildet, erhöht sich durch die Schädigung der Zytoplasmamembranen die Permeabilität für K+-Ionen, die vermehrt aus den Erythrozyten austreten. Dieser Verlust an intrazellulärem K+ ist dafür verantwortlich, dass die Parasiten absterben.

MERKE

Fehlgefaltete Proteine können leicht aggregieren und fatale Krankheitszustände auslösen.

Membranproteine

Membranen bilden Barrieren, die eine Durchmischung von Bestandteilen verschiedener Kompartimente verhindern. Zweidimensionale, aus amphiphilen Lipiden aufgebaute Lipiddoppelschichten grenzen Zellen und Zellorganellen ab. Diese Barrieren dürfen keine völlige Abschottung von der Außenwelt bilden, sondern müssen vielseitige und komplexe biologische Prozesse der Zell-Zell-Anheftung, der Signaltransduktion und des Stofftransports erlauben. Ermöglicht wird das durch zahlreiche, eng mit der Membran assoziierte Proteine. Die hohe Relevanz dieser heterogenen Klasse von Proteinen wird durch ihre enorme Vielfalt deutlich: Innerhalb des Genoms der Bäckerhefe kodiert allein ein Drittel der etwa 6000 Gene für Membranproteine.
Struktur von Membranproteinen
Die Architektur der Proteine innerhalb der Membran kann sehr unterschiedlich sein, eine allgemeine Einteilung lässt sich Abb. 2.33 entnehmen. Membranproteine können, ebenso wie lösliche Proteine, als Monomere vorkommen, aber auch in den unterschiedlichsten Zuständen als Homo- oder Heterooligomere.
Periphere Membranproteine
Bei peripheren Membranproteinen ist das Protein nur durch einen massenmäßig geringen Teil in der Membran verankert (Abb. 2.33a, b). Der größere Anteil ragt nach außen in die benachbarten hydrophilen Kompartimente und hat stark polare Eigenschaften, wie man sie sonst bei wasserlöslichen Proteinen findet. Löst man ihre Membranverankerung, so verhalten sich diese Proteine in ihren funktionellen Eigenschaften demnach wie lösliche Proteine. Membrananker entstehen durch kovalente Anheftung von Lipiden, die in die Membranphase eintauchen (Abb. 2.33). Dies ist bei den sog. GPI-(Glykosylphosphatidylinositol-)Ankern der Fall (Abb. 2.33a), welche die hydrophile Proteindomäne immer zur extrazytoplasmatischen Membranseite orientieren. Die Immobilisierung der Proteine kann auch über andere lipophile Substituenten erfolgen, z.B. durch langkettige Isoprenoide (Farnesol Abb. 2.29c oder Geranylgeranol), durch ein bis drei aliphatische Kohlenwasserstoffketten (Palmitinsäure, Myristinsäure, Abb. 2.29f, g) oder durch eine Kombination von Aliphaten und Isoprenoiden (Abb. 2.33b). Derart modifizierte Proteine weisen mit ihrer hydrophilen Domäne immer auf die Zytoplasmaseite der Membran, wie z.B. das Signaltransduktionsmolekül Ras (Kap. 2.3.1).
Integrale Membranproteine
Integrale Membranproteine sind mit mindestens einem Polypeptiddurchgang fest in der Membran verbunden (Abb. 2.33c, d). Wesentliches Merkmal des transmembranären Segments ist der extrem ausgeprägte hydrophobe Charakter der beteiligten Aminosäuren. Die Seitenketten ragen in den lipophilen Bereich und bilden intensive hydrophobe Wechselwirkungen mit den Membranlipiden aus, wodurch die Membranbindung enorm stabilisiert wird. Die Membran einfach durchspannende Proteine haben entweder eine oder zwei Domänen, die in die membranbenachbarten hydrophilen Bereiche hineinragen.
Eine prinzipiell ähnliche Architektur weisen die mehrfach membrandurchspannenden Proteine auf. Ihre Transmembranbereiche sind überwiegend im hydrophoben Bereich der Lipiddoppelschicht versenkt, und sie können, je nach Funktion, mit angehefteten hydrophilen Domänen ausgestattet sein oder nicht (Abb. 2.33e). Der Natur ihrer Umgebung entsprechend haben die Transmembranbereiche gleichfalls hydrophobe Oberflächen, durch die sie optimal mit den sie umgebenden Lipiden wechselwirken können.
Die Struktur der Polypeptidkette ist im membrandurchspannenden Bereich meist -helikal. Diese Form ist besonders geeignet, weil bei einer Abfolge von hydrophilen Aminosäuren die hydrophoben Reste nach außen, also zu den Membranbestandteilen, zeigen, während die eher hydrophilen Bereiche der -Kohlenstoff-Kette sich innen befinden. In seltenen Fällen liegt ein reines -Faltblatt vor, wie z.B. bei den Porinen, einer Proteingruppe, die in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien vorzufinden ist. Ein wichtiges Beispiel für ein integrales Membranprotein mit sieben Transmembrandurchgängen ist das Sehpigment Rhodopsin, der Lichtrezeptor der Retina (Abb. 2.34a, b). Dieses Protein ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) für Licht. Seine Funktion besteht in der visuellen Signalrezeption und -weiterleitung in das Zellinnere. Rhodopsin kann mithilfe des Cofaktors Retinal (Abb. 2.34c) Lichtquanten mit Energien aus dem sichtbaren Bereich absorbieren. Die photochemisch induzierte Konformationsänderung des Cofaktors wird auf das Protein übertragen, das seinerseits mittels Konformationsänderung das Signal an stromab gelegene Signaltransduktionsproteine weitergibt und somit das Lichtsignal innerhalb der Zelle weiterleitet.

Klinik

Membranproteine haben als potenzielle Angriffspunkte für Medikamente eine erhebliche Bedeutung in der Medizin. Großes Interesse an detaillierten Strukturen besteht bei der molekularen Erforschung von Krankheitsprozessen, aber auch bei der Target-Suche für die Entwicklung neuer Pharmaka, die an strukturell und funktionell wichtige Bindungsstellen andocken und dadurch die Zielproteine agonistisch oder antagonistisch beeinflussen können. Besondere Bedeutung als molekulare Zielstrukturen haben die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR von G protein-coupled receptors), die als integrale Membranproteine mit sieben mutmaßlich membrandurchspannenden Regionen eine dem Rhodopsin (Abb. 2.34) ähnelnde Architektur aufweisen und in zellulären Signaltransduktionsketten vorkommen. Rhodopsin ist der erste GPCR, dessen dreidimensionale Struktur mit hoher Auflösung erforscht worden ist. Diese wird als Leitstruktur für die Modellierung pharmakologisch relevanter GPCR genutzt, zumal mit dem Liganden Retinal eine mögliche Bindestelle für potenzielle Pharmaka modellierbar ist. Ein weiterer prominenter Vertreter dieser vielfältigen Gruppe von Molekülen ist beispielsweise der -adrenerge Rezeptor, der für die Bindung des Hormons Adrenalin und die molekulare Auslösung seiner Wirkungen verantwortlich ist.

Blick ins Labor

Um erste Informationen über die Struktur von Membranproteinen zu erhalten, kann man anhand der Aminosäuresequenz das Hydrophobieprofil berechnen und damit membrandurchspannende Regionen aufspüren. Dies ist in Abb. 2.35 für Rhodopsin gezeigt. Für jeweilige Fenster von 19 benachbarten Aminosäuren wird, zusammengefasst aus den Hydrophobiewerten der einzelnen Reste (Tab. 2.1), ein Hydropathieindex berechnet, der über die Sequenzposition aufgetragen wird. In grober Näherung ergeben sich aus dem gesamten Sequenzprofil Maxima des Hydropathieindex, aus dem man Hinweise auf mögliche Transmembranregionen erhalten kann. Das Vorkommen von mehreren Maxima im Hydropathiediagramm weist auf die Existenz von sieben transmembranären Regionen hin und wird durch die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur bestätigt. Streng genommen gilt diese Überlegung aber nur für -helikale Proteine, weil Proteine mit überwiegender -Faltblatt-Struktur im Hydropathiediagramm völlig unauffällig sind. Ein Beispiel hierfür ist das tief in die äußere Membran von E. coli eingebettete Porin. Es würde mit der Hydropathieanalyse allein nicht als Membranprotein zu erkennen sein.

MERKE

Membranproteine sind, bedingt durch ihre Verankerung in der Lipidphase, komplizierter aufgebaut als lösliche Proteine. Sie haben vielfältige Aufgaben, u.a. in der Signaltransduktion, im Stofftransport und in der Energiewandlung.

Biologischer Abbau von Proteinen

Proteinfunktionen werden durch biologischen Abbau inaktiviert und somit aus der Zelle entfernt. Über die bloße Elimination hinaus hat dieser Prozess eine erhebliche allgemeine zellbiologische Bedeutung. Obwohl die freie Enthalpie der Hydrolyse der Peptidbindung negativ ist, sind für den biologischen Abbau von Proteinen spezielle Enzyme nötig, die Proteasen. Das sind Enzyme, die durch einen hydrolytischen Mechanismus Polypeptidketten spalten (Abb. 3.15). Neben den Serin-Proteasen gibt es noch Cystein-, Aspartyl- und Metalloproteasen. Diese unterscheiden sich durch die im aktiven Zentrum beteiligten katalytischen Reste und haben unterschiedliche Aktivierungsstrategien (Kap. 3.3.5).
Proteasen des Verdauungstrakts
Diese haben besondere Bedeutung beim Aufschluss der Nahrungseiweiße im Magen-Darm-Trakt, in dem der Proteinabbau extrazellulär verläuft. Wichtig sind hier v.a. die in den Verdauungssäften des Magens und Duodenums enthaltenen Endopeptidasen (Spaltung innerhalb der Peptidkette) Pepsin und Trypsin, die ihre katalytische Wirkung bei unterschiedlichen pH-Werten entfalten. Die weitere Zersetzung erfolgt im Dünndarm, in dem Exopeptidasen die endständigen Aminosäuren der Proteinfragmente freisetzen. Diese werden von der Darmmukosa resorbiert und können für die Energiegewinnung oder zur Proteinsynthese verwendet werden.

Schon gewusst

Ganz andere Funktionen als der Nahrungsmittelaufschluss hat der intra- und extrazelluläre Abbau von Proteinen. Es handeltsich hierbei um einen lebenswichtigen Prozess, der dazu dient, die Anpassung an wechselnde Situationen zu ermöglichen, indem überschüssige, nicht mehr benötigte und fehlgefaltete Proteine entsorgt werden. In den meisten Zellen sind dafür Lysosomen zuständig, die viele Proteasen enthalten. Diese sind mit dem Abbau bestimmter Proteinsubstrate befasst. Typische Vertreter lysosomaler Proteasen (oder Cathepsine) sind die Enzyme Elastase und Kollagenase, die Strukturproteine hydrolysieren. Die Alterung der Haut (Runzeln und Falten) ist mit einer erhöhten Aktivität der Kollagenasen verbunden. Diese werden durch Ultraviolettstrahlung aktiviert. Eine gesunde Hautbräunung führt also unaufhaltsam zu schnellerer Alterung der Haut.

Proteasomen
Nicht alle Zelltypen besitzen Lysosomen (z.B. Erythrozyten), können aber trotzdem schädliche oder unbrauchbare Proteine beseitigen. Es gibt noch eine andere, im Zytosol lokalisierte Müllbeseitigungsmaschinerie, das in allen Zellen vorkommende Proteasom. Dieser oligomere Komplex hat eine Molekülmasse von ungefähr 2 MDa bzw. einen Sedimentationskoeffizienten von 26S und liegt in etwa 30.000 Kopien pro Zelle vor. Grob gesehen hat er eine hantelförmige Gestalt (Abb. 2.36) und besteht aus zahlreichen Polypeptiden. Im Kernbereich der Hantel liegen aufeinandergestapelt die proteolytisch aktiven Polypeptide, die das Substratprotein in seine Bestandteile zerlegen. Den Enden des Kernkomplexes sitzen Strukturen auf, die den Eingangs- und Ausgangsbereich deckelartig schließen. An dieser Stelle des Proteasoms sind Module lokalisiert, die für spezifische Erkennung, energieabhängige Entfaltung und Transport des Substratproteins sorgen.
Die für den Abbau vorgesehenen Proteine werden mittels spezifischer, intrazellulär vorkommender Rezeptoren, sog. F-Box-Proteine, die Substraterkennungsstrukturen besitzen, durch kovalente Bindung mit dem aus 76 Aminosäuren bestehenden Protein Ubiquitin, einem zellulären Abbausignalmolekül, markiert (Abb. 2.36). Die Ubiquitinmoleküle können perlenkettenartig aneinandergereiht mit dem Substratprotein verknüpft sein. Das durch Bindung von Polyubiquitin zum Abbau freigegebene Protein wird von dem Proteasomkomplex erkannt und aufgenommen. Die Proteasen des Kernkomplexes zerlegen die Proteine bis hin zu Oligopeptiden und einzelnen Aminosäuren (Abb. 2.36). Mit monomerem Ubiquitin markierte Proteine werden dagegen nicht abgebaut, sie werden von anderen Zellkomponenten mit einer Ubiquitin-Bindedomäne erkannt und können somit Signalfunktionen ausüben.

MERKE

Proteine werden durch proteolytische Enzyme aus der Zelle eliminiert. Das Proteasom ist eine makromolekulare Degradationsmaschine, die ubiquitinylierte Substratproteine abbaut.

Isolierung und Charakterisierung von Proteinen

Nicht nur für die Forschung, sondern auch in der medizinischen Diagnostik und Therapie sind Proteine mit höchstem Reinheitsgrad von großer Bedeutung. Es gibt zwei grundsätzliche Möglichkeiten, Proteine zu gewinnen: Man kann sie synthetisch herstellen oder aus einem komplexen Biomolekülgemisch isolieren.
Synthetische Herstellung von Proteinen
Oligopeptide und Peptide bis zu einer Länge von ca. 60 Aminosäuren kann man auch durch chemische Synthese herstellen. Hierbei werden die teilweise mit Schutzgruppen blockierten Aminosäuren nach Aktivierung der Carboxylgruppen durch eine Kondensationsreaktion verknüpft, wobei das entstehende Peptid aus praktischen Gründen auf einem Kunstharzpartikel immobilisiert ist. Das Prinzip dieser sog. Merrifield-Synthese ist in Abb. 2.37 schematisch dargestellt. Diese Technik erlaubt es außerdem, durch chemische Verfahren veränderte oder natürliche isotopenmarkierte Aminosäuren (z.B. radioaktive Tracer) einzubauen.

Klinik

Man setzt synthetische Peptide in der Forschung für die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften von Enzymen oder Signaltransduktionsproteinen ein, wobei sie z.B. als Substrate oder Inhibitoren dienen. Um Anti-Peptid-Antikörper herzustellen, koppelt man sie als künstliche Epitope an immunogene Makromoleküle. Darüber hinaus sind Peptide als pharmakologische Effektoren wichtig. So stimulieren Erythropoetin(EPO-)Derivate die Blutbildung. Nach erfolgter Chemotherapie oder nach Knochenmarktransplantationen unterstützen EPO, Wachstumsfaktoren und Interleukin-3 die Myelopoese. Das synthetische Peptid Interferon- hat antineoplastische und antivirale Wirkung und wird deswegen in der Behandlung der chronischen Hepatitis C genutzt.

Ein besonders erwähnenswerter Vorteil der chemischen Synthese von Peptiden liegt in der Möglichkeit, funktionell wichtige posttranslationale Modifikationen synthetisch direkt einzubauen, wie Phosphorylierungen, Amidierungen, Acylierungen usw. Aus praktischen und finanziellen Gründen werden heute Peptide und Proteine oftmals gentechnisch hergestellt (Kap. 15).
Isolation subzellulärer Fragmente durch differenzielle Zentrifugation
In der Natur kommen Proteine meist in komplexen Gemischen vor. Zur ihrer Isolierung gibt es viele mögliche Strategien.
Es ist sinnvoll, schon vor einer biochemischen Proteinreinigung das fragliche Protein aus dem biologischen Material anzureichern. Die Reinigung beginnt mit dem Zerkleinern des Untersuchungsgewebes und dem schonenden Zellaufschluss (Homogenisation) in einem bei neutralem pH gepufferten, isotonen oder schwach hypotonen Medium, damit die subzellulären Bestandteile, wie Zellorganellen bzw. deren Bruchstücke, weitgehend erhalten bleiben.
Diese Fragmente können nun durch Zentrifugation nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Hierbei werden die in einem Zentrifugenbecher suspendierten Bruchstücke durch Zentrifugalbeschleunigung in einem Rotor voneinander getrennt, wobei je nach gewähltem Schwerefeld und Zentrifugationsdauer die schwereren Komponenten sedimentieren und die leichteren in Suspension bleiben (Abb. 2.38a). Die Sedimentationsgeschwindigkeit v eines Partikels ist proportional zu einer stoffabhängigen Konstante, dem Sedimentationskoeffizienten s, der formal die Dimension 1 S hat (S steht für Svedberg; 1 S entspricht 10–13 s). In Abb. 2.38b ist der Sedimentationskoeffizient für eine Reihe von Zellorganellen, Bakterien und anderen subzellulären Bestandteilen aufgelistet, ebenso von Viren, großen Nucleinsäuren oder isolierten Proteinen. Je kleiner der Wert ist, umso stärker muss das Zentrifugalfeld sein, um das Partikel zu sedimentieren. Man kann somit Zellbestandteile unterschiedlichen Gewichts durch geschickte Wahl aufeinanderfolgender Zentrifugationsschritte voneinander trennen. Dies wird v.a. bei der differenziellen Zentrifugation genutzt (Abb. 2.38c). Dabei können nacheinander grobe Zelltrümmer von Mitochondrien und Lysosomen von Mikrosomen und den Zytoplasmabestandteilen getrennt werden. Durch Dichtegradientenzentrifugation kann man die Auftrennung subzellulärer Partikel noch erheblich verfeinern, denn Membrankomponenten verschiedener Zellorganellen zeigen deutliche Dichteunterschiede, die auf den unterschiedlichen Anteilen von Lipiden und Proteinen beruhen. Je höher der Proteinanteil, umso größer ist die Dichte der Partikel.

Blick ins Labor

Man erzeugt Dichtegradienten, indem man zwei Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte in kontinuierlich verändertem Mischungsverhältnis in Zentrifugenröhrchen übereinanderschichtet, sodass die Flüssigkeitsdichte einen stetig verlaufenden Gradienten bekommt ( 1–1,4 g cm–3). Dazu verwendet man z.B. verschieden konzentrierte wässrige Lösungen von Saccharose, Glycerin oder geeigneten Makromolekülen. Die Probe wird als dünne Schicht oben aufgetragen. Im Zentrifugalfeld werden die Partikel beschleunigt und so lange transportiert, bis das Probenmaterial im Gradientenmedium eine Dichtezone erreicht hat, die der Partikeleigendichte entspricht (Schwebedichte). Es kommt so zur Auftrennung der verschiedenen subzellulären Fragmente entsprechend den unterschiedlichen Dichten. Durch vorsichtiges Anstechen des Gradientenröhrchens und Abpumpen der einzelnen Dichtefraktionen kann man die gereinigten subzellulären Partikel isolieren.

Chromatographische Trennverfahren
Proteine können aufgrund ihrer Löslichkeit in bestimmten Medien separiert werden. In Gegenwart bestimmter Fällungsmittel nimmt die Löslichkeit einzelner Proteine innerhalb eines Gemischs ab, die Proteine fallen aus der Lösung aus und können z.B. durch Zentrifugation abgetrennt werden. Als Fällungsmittel können organische Lösungsmittel oder wässrige Lösungen mit bestimmtem pH-Wert oder Salzgehalt (z.B. konzentrierte Ammoniumsulfat-Lösung) dienen.
Nach Ausschöpfung der Fällungstrennung ist es oft nötig, weitere Separationsstrategien zu verwenden, deren Prinzipien, auf molekularen Eigenschaften wie Größe, Oberflächenladung, Hydrophobie oder Ligandenaffinität beruhen. Hierbei wird das komplexe Gemisch von wässrig gelösten Proteinen durch Säulenchromatographie aufgetrennt. Das Chromatographiematerial ist in einem Rohr aufgeschüttet, durch das die proteinhaltige Lösung geleitet wird, und hält die Proteine nach ihren stofflichen Eigenschaften zurück.
Gelfiltrationschromatographie
Dieses häufig genutzte Verfahren beruht auf der unterschiedlichen Größe der Proteine. Als Trennmaterial setzt man feine Kügelchen ein, die von mikroskopisch kleinen internen Kanälen durchzogen sind, durch die sich – je nach Größe – die Proteine hindurchzwängen können. Kleine Moleküle, die in die Kanäle hineinpassen, müssen bei der Elution viel längere Wege zurücklegen als große (Abb. 2.39a). Letztere werden aus den Kugeln ausgeschlossen und zuerst ausgespült, die kleinen Proteine folgen. Die aufgefangenen Eluatfraktionen spiegeln also die Größenverteilung der in der Probe vorhandenen Makromoleküle wider.
Ionenaustauschchromatographie
Das Trennprinzip dieses Verfahrens beruht auf der unterschiedlichen, durch Seitenketten der geladenen Aminosäuren bedingten Ladungsverteilung auf der Oberfläche der Makromoleküle (Abb. 2.39b). Das Gemisch wird bei niedriger Salzkonzentration auf die Säule aufgetragen. Dabei binden die Proteine fest an die Trennphase, und zwar umso fester, je höher ihre Oberflächenladung ist. Bei der folgenden Elution mit einem salzhaltigen Puffer wird die Bindungskraft der Makromoleküle aufgeweicht: Zuerst werden bei niedriger Salzkonzentration die schwach bindenden Proteine gelöst, aus der Säule ausgeschwemmt und in getrennten Fraktionen aufgefangen. Bei höheren Salzkonzentrationen werden schließlich auch die fest bindenden, hoch geladenen Proteine abgelöst. Es resultiert eine Verteilung der nach der Ladung separierten Proteine in den verschiedenen Fraktionen.

Blick ins Labor

Außer geladenen (hydrophilen) Gruppen haben Proteine auf ihren Oberflächen unterschiedliche Anordnungen von wasserabstoßenden Regionen. Auch diese stoffliche Eigenschaft kann zur Trennung herangezogen werden. Dabei werden Proteine je nach Grad ihrer Oberflächenhydrophobie an ein wasserabstoßendes Säulenmaterial mehr oder weniger stark gebunden und selektiv ausgewaschen. Man nennt dieses Verfahren hydrophobe Interaktionschromatographie. Die hiermit eng verwandte Umkehrphasenchromatographie (reversed phase) wird vornehmlich für die Trennung von Peptiden oder niedermolekularen Stoffgemischen verwendet (Kap. 2.1.2, Abb. 2.7).

Affinitätschromatographie
Auf der außergewöhnlichen Spezifität biologischer Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und ihren Liganden beruht das Prinzip der Affinitätschromatographie. Es können z.B. Bindungsaffinitäten an Nucleotide, Coenzyme, Kohlenhydrate, Pharmaka oder auch an andere Makromoleküle genutzt werden, wenn diese Stoffe auf dem Säulenmaterial fest verankert sind, ohne die spezifischen Bindungseigenschaften zu beeinträchtigen. Die zu isolierenden Proteine müssen bestimmte Bindungsstellen für den Liganden besitzen. Aufgrund der Bindungsaffinität kommt es beim Probenauftrag zu einer Wechselwirkung an den oberflächlich auf dem Chromatographiematerial immobilisierten Liganden, und das Protein wird spezifisch auf der Säule festgehalten. Alle anderen Moleküle, die keine besondere Affinität zum Liganden aufweisen, können die Säulenmatrix ungehindert passieren. Die Abtrennung des fest gebundenen Stoffs von der Säulenmatrix erfolgt mit einer Waschlösung, die den spezifischen Liganden im Überschuss enthält. Der in Lösung befindliche und der immobilisierte Ligand konkurrieren um die Bindungsstellen, was zur Ablösung von der Säule und zur Elution des Proteins führt (Abb. 2.39c).

Schon gewusst

Falls die zu separierenden Proteine keine Affinität zu natürlichen oder leicht handhabbaren Liganden besitzen, kann man ihnen durch gentechnische Manipulation (Proteindesign) (Kap. 15) spezifische Bindungseigenschaften einfügen. Man heftet in der DNA-Sequenz sog. Tags an den N- oder C-Terminus des Proteins. Die zusätzliche DNA-Sequenz kodiert für eine Abfolge von Aminosäuren, die aufgrund ihrer Sequenz bestimmte Erkennungseigenschaften aufweisen. So bindet z.B. das aus zwölf Aminosäuren bestehende Strep-Tag an immobilisiertes Streptavidin (Kap. 4). Eine andere Form angehängter Erkennungssequenzen stellt das Oligohistidin-Tag dar: Kurze Ketten von sechs bis acht Histidinresten haben die Eigenschaft, Übergangsmetallionen zu komplexieren (Kap. 2.2) Wenn die Übergangsmetalle (Ni2+, Cu2+, Zn2+) an einem Säulenmaterial immobilisiert sind, kann eine chromatographische Trennung aufgrund der Bindungsaffinitäten erfolgen. So ist es möglich, die oligohistidinmarkierten Proteine aus komplexen Gemischen herauszufischen. Die Elution erfolgt in diesem Fall durch Auswaschen mit Lösungen der Aminosäure Histidin oder Imidazol (entspricht der Seitenkette von Histidin, Tab. 2.1).

Solubilisierung von Membranproteinen
Membranproteine lassen sich nicht so einfach reinigen wie lösliche Proteine. Sie müssen zuerst aus ihrer natürlichen Lipidumgebung herausgetrennt und in Lösung gehalten werden, weil sie sonst irreversibel aggregieren würden. Die lösungsvermittelnden Eigenschaften haben amphiphile Detergenzien, die auf der einen Seite hydrophob sind und am anderen Ende hydrophilen Charakter aufweisen (Abb. 2.40). Die solubilisierende Wirkung der Detergenzien beruht darauf, dass ihre hydrophoben Bereiche an die hydrophoben Proteinoberflächen binden, während die hydrophilen Bereiche mit den polaren Solvensmolekülen wechselwirken.
Quantitativer Proteinnachweis
Quantitative Proteinbestimmungsverfahren gehören zu den Routinetechniken im biochemischen und klinisch-chemischen Labor. Hier sollen nur die gebräuchlichsten Verfahren genannt werden. Am einfachsten ist die auf dem Vorhandensein aromatischer Aminosäuren (Tab. 2.1, Abb. 2.4) beruhende Messung der Lichtabsorption bei 280 nm. Dieser Test ist schnell und empfindlich, nachteilig ist aber die Abhängigkeit von der Aminosäurezusammensetzung der Probe, denn nur die aromatischen Aminosäuren absorbieren UV-Licht. Generell ist diese Methode wegen des möglichen Tyndall-Effekts (Lichtstreuung) bei biologischen Proben störanfällig. Durch Komplexbildung von Stickstoffatomen der Peptidbindungen von denaturierten Proteinen mit Cu2+-Ionen wird in der Biuretreaktion die Anzahl der in der Probe vorhandenen Aminosäureverknüpfungen bestimmt. Allerdings ist dieser Test relativ unempfindlich.
Proteintrennung im elektrischen Feld
Hauptanliegen der Proteinanalytik ist es, Proteine aus einem komplexen Gemisch zu isolieren und qualitativ und quantitativ nachzuweisen, u.a. um den Erfolg einer Proteinreinigung zu überprüfen.
Die weitverbreitete und wichtigste Methode dabei ist die Elektrophorese. Sie beruht auf der Wanderung der geladenen Proteinmoleküle im elektrischen Feld. Die in Puffer gelösten Proteine werden nach Auftrag auf spezielles Oberflächenmaterial (Zelluloseacetat) bzw. in Gelen aus Agarose oder quervernetztem Polyacrylamid getrennt (Abb. 2.41). Das Gel hat verschiedene Funktionen: Es stabilisiert die wässrige Trennphase und bildet aufgrund seiner dreidimensionalen Netzstruktur mikroskopische Poren in der Größenordnung der zu trennenden Teilchen aus. Durch diese Poren müssen sich die Proteine nach Anlegung der elektrischen Spannung bei ihrer Wanderung hindurchzwängen und werden je nach ihrer Größe abgebremst.

Blick ins Labor

In der nativen Elektrophorese, bei der die unbehandelten Proteine in natürlicher, strukturell und funktionell intakter Form untersucht werden, separiert man die Proteine nach Ladung und Molekülmasse (entspricht in grober Näherung der Größe eines Proteins). Nach diesen Kriterien sollte im Idealfall jedes Protein an einer individuellen Position im Gel auftauchen. Beispielsweise gelingt es mit dieser Methode, Isoenzyme (z.B. der Lactat-Dehydrogenase, Abb. 2.28) aufgrund ihrer geringen Ladungsunterschiede nachzuweisen und ihre verschiedenen Anteile zu quantifizieren. Neben der Reinheitsabschätzung kann man mit diesem Verfahren nach abgeschlossener Trennung u.a. auch die enzymatische Aktivität der im Gel aufgetrennten Proteine testen. Zum spezifischen Enzymnachweis werden teilweise dieselben Methoden wie in der Histochemie angewendet. Man versucht also, enzymatisch aktive Proteinflecken zu lokalisieren. Dazu wird das Gel nach dem Lauf in einer Substratlösung inkubiert und der enzymatische Umsatz in situ durch Farb- oder Fällungsreaktionen sichtbar gemacht.

Eine besonders wichtige Methode ist die denaturierende Elektrophorese, bei der die Proteine vor der Trennung mit Agenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt werden, um ihre dreidimensionale Struktur zu entfalten. Da hierbei die Quartärstruktur der Proteine zerstört wird, kann die SDS-Elektrophorese auch Auskunft über die Untereinheitenzusammensetzung von oligomeren Proteinen geben. Zur vollständigen Entfaltung werden die Disulfidbrücken des Proteins reduktiv mit Mercaptoethanol gespalten. Durch Bindung des anionischen SDS auf den linearisierten Polypeptidmolekülen bekommen die Komplexe eine einheitliche Oberflächenladung, sodass die Trennung im Gel praktisch nur noch nach der Größe und somit nach der Masse erfolgt (Abb. 2.41a, b). So ist es möglich, die Molekülmasse unbekannter Polypeptide durch Vergleich mit Markerproteinen zu bestimmen (Abb. 2.41b, c). Die eigentlich farblosen Proteine auf dem Gel werden nach der Trennung durch den unspezifischen, aber stark bindenden intensiven Farbstoff Coomassie-Brillantblau sichtbar. Erheblich höhere Nachweisempfindlichkeiten erreicht man durch Färbung mit Silber oder mit Fluoreszenzfarbstoffen. Spezifische Proteinnachweise erfolgen häufig durch Western-Blotting. Hierbei wird ein Abdruck des Elektrophoresegels erzeugt, bei dem die elektrophoretisch getrennten Proteine auf eine Membran übertragen werden, die mit verschiedenen hochspezifischen Nachweisreagenzien (Liganden, chromogene Substrate, Immunreagenzien) behandelt werden kann (Abb. 2.42).

Blick ins Labor

Eine andere Methode der elektrophoretischen Proteintrennung beruht auf den unterschiedlichen isoelektrischen Punkten der Proteine. Der IEP von Proteinen ( Polyaminosäuren) ist analog zu dem der Aminosäuren definiert. Allerdings kann man diese Größe nicht einfach aus der Aminosäurezusammensetzung berechnen, da sich im gefalteten Protein elektrische Ladungen von Seitenketten gegenseitig beeinflussen. Bei der isoelektrischen Fokussierung (IEF) wandern die Proteine entweder im nativen oder durch 8 mol L–1 Harnstoff entfalteten Zustand in einem durch das Gel stabilisierten pH-Gradienten, bis sie am isoelektrischen Punkt (Nettoladung 0) liegen bleiben. Aufgrund geringer Unterschiede des IEP von verschiedenen Hämoglobinvarianten (unterschiedliche Isoformen sowie mutierte Versionen) kann man mithilfe der IEF Polymorphismen des Blutfarbstoffs anhand des spezifischen Bandenmusters diagnostizieren. Außerdem kann man glykiertes Hämoglobin nachweisen, das in erhöhter Konzentration im Blut von Diabetikern vorkommt (Kap. 2.3.1). Durch Kombination von IEF mit denaturierender Elektrophorese (zweidimensionale Gelelektrophorese, Abb. 2.41d) erzielt man hochaufgelöste Trennungen komplexer Gemische. Dies ist bei der Analyse von zellulären Proteinexpressionsmustern wichtig.

Spezifische Proteinnachweise
Je nach Fragestellung gibt es eine Reihe von Techniken zur qualitativen Identifikation von Proteinen. Besonders einfach ist die Anwendung bei Proteinen, die aufgrund von chromophoren, kovalent oder nichtkovalent gebundenen Cofaktoren spezifische Absorptionsspektren im Sichtbaren besitzen, z.B. Hämoglobin, Cytochrom c oder Rhodopsin. Auf der Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen immunologische Nachweise bestimmter Proteine, sofern spezifische Antikörper gegen das Zielprotein vorliegen. Dieses Prinzip nutzen wichtige klinisch-diagnostische Nachweisverfahren wie der Radio-, Fluoreszenz- und Enzymimmunoassay (RIA, FIA, ELISA), die spezifische und hochempfindliche Werkzeuge (Kap. 26) sind. Der Western-Blot (Abb. 2.42) stellt eine weitere außerordentlich wichtige immunologische Proteinnachweismethode dar: Hierzu werden die Proteine aus dem Elektrophoresegel auf ein spezielles Folienmaterial transferiert (geblottet) und durch den hinzugegebenen Antikörper immunspezifisch angefärbt. Mit beträchtlich höherem Aufwand kann man die Art eines foliengebundenen Proteins praktisch eindeutig bestimmen: Mithilfe des Edman-Abbaus ermittelt man die Proteinsequenz, indem man schrittweise durch chemische Reaktionen die Aminosäuren, vom N-Terminus ausgehend, abspaltet und identifiziert. Heutzutage wird diese Analytik automatisch durchgeführt, mithilfe sog. Sequenatoren.

Blick ins Labor

Von großer Bedeutung für die moderne Analytik ist die Massenspektrometrie. Durch die MALDI-Massenspektrometrie (matrix-assisted laser desorption ionization, Abb. 2.43) werden Molekülmassen von Ionen anhand ihrer Flugdauer im Hochvakuum bestimmt. Dabei werden die in eine Matrix eingebetteten Proteine durch Laserbestrahlung schonend ionisiert, in die Gasphase befördert und im Hochspannungsfeld beschleunigt. Die Flugzeit bis zum Erreichen des Detektors ist ein Maß für das Masse-Ladungs-Verhältnis des fraglichen Proteins. Ebenfalls auf sanfter Ionisation beruht die ESI-Massenspektrometrie (Elektrosprayionisation), mit der man sogar massenspektrometrische Peptidsequenzierungen vornehmen kann.

Analyse des Proteoms
Unter dem Begriff Proteom versteht man das gesamte Proteinexpressionsmuster einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus unter bestimmten Bedingungen. Die Komplexität eukaryontischer Organismen auf Proteinebene ist noch viel höher als die Anzahl der Gene. Beim Menschen schätzt man bei einer Genzahl von 25.000–30.000, dass bis zu 1.000.000 verschiedene Proteine existieren. Diese hohe Zahl von Proteinen kommt durch verschiedenartige Prozesse wie alternatives Spleißen und durch vielfältige posttranslationale Modifikationen (Kap. 2.3.1) zustande, die für eine erhebliche Diversifizierung der Genprodukte sorgen.
Bei der Proteomanalyse verschafft man sich einen qualitativen und quantitativen Überblick über alle (nachweisbaren) tatsächlich exprimierten Proteine und deren posttranslationale Modifikationen. Dies ergibt eine exakte biochemische Zustandsbeschreibung und ist für die Grundlagenforschung, medizinische Diagnostik und pharmakologische Forschung von großer Bedeutung. Für die Medizin eröffnet sich damit die Möglichkeit, Proteinmuster in Abhängigkeit vom Krankheitszustand oder nach Gabe von Medikamenten zu analysieren. In jeder Proteinkomponente, die sich im Proteom quantitativ (Proteinmenge) oder qualitativ (durch Modifikation) ändert, stecken diagnostische Informationen. Man muss prinzipiell davon ausgehen, dass jedes der betroffenen Proteine direkt oder indirekt mit dem Krankheitsbild in Zusammenhang steht und damit ein potenzieller Angriffsort für ein Medikament sein könnte. Die qualitative Identifikation der sich zellzustandsbedingt ändernden Proteine ist daher wesentlich für die Pharmaforschung, um Biomarker zu entwickeln.
Das Genom stellt das gesamte Inventar der möglichen Proteine dar, das Proteom zeigt dagegen an, welcher Anteil dieses Potenzials realisiert wird, entweder direkt oder in modifizierter Form. Voraussetzung für die Proteomanalyse sind Techniken, welche die bis zu 10.000 verschiedenen in biologischen Materialien vorkommenden Proteine spezifisch anzeigen können. Die Kombination von Elektrophorese und Massenspektrometrie ist das am häufigsten angewandte Nachweisverfahren. Durch zweidimensionale Elektrophorese wird die Probe in die einzelnen Proteinkomponenten aufgetrennt. Die isolierten Proteinflecken werden aus dem Gel herausgeschnitten und durch Verdau mit spezifisch spaltenden Proteasen wie Trypsin fragmentiert. Die Identifikation der Proben erfolgt mithilfe der MALDI-Massenspektrometrie, indem die Massen der entstehenden Peptidfragmente bestimmt werden (Abb. 2.42). Jedes Protein liefert ein bestimmtes Muster, den Massenfingerprint, aus dem durch Datenbankvergleich die einzelnen Proteine genau bestimmt werden können.
Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen
Strukturaufklärung von 2-D- und 3-D-Kristallen
Für die rationelle Entwicklung von Pharmaka muss man die Struktur ihrer Targets erforschen, also die molekularen Wirkorte der Effektoren an biologischen Makromolekülen. Die Detailkenntnis der molekularen Architektur von Bindungsstellen zwischen pharmakologischer Substanz und Zielmolekül ermöglicht es, ganz gezielt Wirkstoffe mit gewünschten sterischen und funktionellen Eigenschaften zu konstruieren. Um Information über dreidimensionale Strukturen von Proteinen zu bekommen, werden unterschiedliche physikalische Methoden eingesetzt. Sehr große Einzelmoleküle oder Komplexe, z.B. Viruspartikel, Ribosomen oder Proteinquartärstrukturen, kann die Elektronenmikroskopie abbilden, allerdings bei relativ niedriger Auflösung. Das bildgebende Potenzial wird erheblich erhöht, wenn man geordnete Gebilde wie zwei- oder dreidimensionale Kristalle analysiert, die aus einer regelmäßigen Anordnung von zahlreichen Einzelmolekülen bestehen.
Die kleinste Einheit eines Kristalls ist die Elementarzelle, durch deren Wiederholung in allen Raumrichtungen man sich den Aufbau des gesamten Kristalls vorstellen kann. Die einzelnen Proteinmoleküle sind über Oberflächenkontakte miteinander verbunden. Proteinkristalle stellen relativ lose Gebilde dar, weil sie große Zwischenräume enthalten, die mit Lösungsmittel gefüllt sind. Wegen des hohen Wassergehalts haben Proteine in den Kristallen die gleichen Strukturen wie in Lösung. Am besten lassen sich hochgereinigte Proteine kristallisieren. Proteinkristalle stellt man aus hochkonzentrierten übersättigten Lösungen her. Abb. 2.44a zeigt den einfachen experimentellen Aufbau, mit dem durch Dampfdiffusion den Proteinlösungen kontinuierlich Wasser entzogen wird, bis der Kristall abgeschieden wird (Abb. 2.44b).

Blick ins Labor

Dampfdiffusion In der geschlossenen und abgedichteten Probenkammer (Abb. 2.44a) stehen das proteinhaltige Probentröpfchen (oben) und das Reservoir (unten) über die Gasphase in Verbindung miteinander. Das Reservoir enthält eine hochkonzentrierte Fällungsmittellösung, die aufgrund ihres chemischen Potenzials Wasser aus der oberhalb des Reservoirs befindlichen Gasphase aufnimmt. Das Probentröpfchen hat eine niedriger konzentrierte Fällungsmittellösung, die ständig Wasser in die Gasphase abgibt. Es folgt eine stetige Volumenabnahme des Probentröpfchens, und das hierin gelöste Protein wird langsam aufkonzentriert, bis sich geordnete dreidimensionale Kristalle ausbilden.

Strukturaufklärung Dreidimensionale Strukturinformation auf atomarer Ebene erhält man durch Röntgenanalyse der Kristalle unter Einsatz des in Abb. 2.44c schematisch dargestellten Aufbaus. Die Röntgenstrahlen wechselwirken mit den Elektronenhüllen der regelmäßig angeordneten Probenatome. Die Überlagerung der an den Atomen gestreuten Strahlen ergibt je nach Raumrichtung eine Verstärkung oder Auslöschung des Signals. Die resultierenden Beugungsmuster (Abb. 2.44d) werden mit Detektoren aufgefangen. In den Intensitäten der abgebildeten Reflexe ist bereits die Strukturinformation enthalten. Diese Strukturfaktoren werden unter Einbeziehung sog. Phaseninformation computergestützt in eine Elektronendichtekarte umgerechnet, in die man iterativ ein Modell der zu bestimmenden Struktur einpasst.

Kernresonanzspektroskopie
Eine andere hochauflösende Methode ist die Kernresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie). Hierbei werden die magnetischen Eigenschaften der Probenmoleküle ausgenutzt: Die NMR-Strukturaufklärung beruht auf der Messung der Wechselwirkungen räumlich benachbarter Spins (vornehmlich 1H), woraus man die Entfernung einzelner Proteingruppen bestimmen kann. Für die NMR-Spektroskopie werden keine Kristalle benötigt; um gute Signale zu liefern, müssen die Proteine aber gut löslich sein. Außerdem müssen sie mit stabilen (nicht radioaktiven) Isotopen (2H, 13C, 15N) markiert werden, um die komplexen Probensignale zuordnen zu können. Auf dem Kernresonanzprinzip basiert auch ein bildgebendes Diagnoseverfahren (Kernspintomographie), bei dem die Darstellung auf der chemischen Umgebung von 1H in unterschiedlichen Gewebetypen beruht.

Blick ins Labor

Es wäre wünschenswert, wenn man aus der Primärstruktur direkt die Raumstruktur des Makromoleküls ablesen könnte. Die Raumstrukturen von sequenzähnlichen Proteinen sind je nach Verwandtschaftsgrad weitgehend identisch, sodass man aus dem Aminosäuresequenzvergleich auch viel über Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen sowie über die Funktionen unbekannter Proteine lernen kann. Gegenwärtige Computerverfahren zur Strukturberechnung bauen auf der bekannten dreidimensionalen Struktur (Tertiärstrukturvorhersage) eines engen Verwandten des fraglichen Proteins auf (Homology-Modelling). Bei ausreichend hoher Sequenzähnlichkeit kann die dreidimensionale Struktur des Zielproteins aus den Raumkoordinaten der Atome berechnet werden.

MERKE

Die Herstellung, Reinigung und Analytik von Proteinen sind für die Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie von immenser Bedeutung.

Zusammenfassung

Aminosäuren

Aminosäuren haben vielfältige Funktionen. Sie sind Botenstoffe, Nährstoffe und v.a. die elementaren Bausteine der Proteine. Ihr chemisches Grundgerüst ist immer gleich. Physiologisch kommt fast ausschließlich die L-Konfiguration vor. Die NH2- und die COOH-Gruppe der -Aminocarbonsäuren bestimmen ihre chemischen Reaktionen. Sie verhalten sich wie Säuren und Basen. Außerdem werden die Eigenschaften durch die funktionellen Gruppen der Seitenketten beeinflusst. Die 20 proteinogenen Aminosäuren können hydrophobe (aromatische und aliphatische) und hydrophile Reste haben. Letztere sind entweder neutral oder positiv bzw. negativ geladen.

Peptidbindung

Die Verknüpfung von Aminosäuren zur Bildung von Peptiden und Proteinen erfolgt über eine Säureamidbindung zwischen der -Carboxylgruppe und der -Aminogruppe zweier Aminosäuren. Die Bindungsknüpfung durch Wasserabspaltung erfolgt zwar endergon, aber die Peptidbindung ist aus kinetischen Gründen stabil. Die C–N-Peptidbindung liegt in verschiedenen mesomeren Grenzstrukturen vor. Sie ist resonanzstabilisiert und hat daher teilweisen Doppelbindungscharakter, ist also nicht frei drehbar. Sterisch sind zwei Konformationen möglich, die cis- und die trans-Form. Energetisch ist die trans-Konformation erheblich bevorzugt, außer wenn die Iminogruppe von Prolin an der Peptidbindung beteiligt ist. Die der Peptidbindung benachbarten C–C- und C–N-Einfachbindungen sind in einem gewissen Winkelbereich drehbar.

Proteinstruktur

Im Aufbau von Proteinen gibt es eine strukturelle Hierarchie. Die Primärstruktur ist durch die Aminosäuresequenz bestimmt. -Helix und -Faltblatt sind die wesentlichen Elemente der Sekundärstrukturen, die vorwiegend durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert werden. Supersekundärstrukturen sind typische wiederkehrende Kombinationen dieser Elemente. Domänen als individuelle Faltungseinheiten haben strukturelle oder funktionelle Teilaufgaben im Gesamtprotein. Modulare Proteine sind aus verschiedenen, teilweise hochrepetitiv angeordneten Einzeldomänen zusammengesetzt. Die relative Anordnung dieser Baugruppen zueinander macht die Tertiärstruktur aus. Die Elemente werden mittels intramolekularer ionischer Bindungen oder kovalent durch Disulfidbrücken verknüpft, aber auch durch nichtkovalente, schwache Bindungen wie polare und hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten. Als Quartärstruktur eines Proteins bezeichnet man Komplexe mehrerer identischer oder verschiedener Polypeptidketten.

Faltung

Um bestimmungsgemäß zu funktionieren, müssen Proteine eine korrekte Faltung einnehmen. Im theoretisch verfügbaren Konformationsraum gibt es definierte Faltungswege und -mechanismen, die das Erreichen der richtigen dreidimensionalen Struktur garantieren. Entgleisungen bei der Proteinfaltung können sich in verschiedenen Krankheitsbildern äußern, bei denen sich fehlgefaltete Proteine ansammeln. Chaperone als intrazelluläre Faltungshelfer sorgen für molekulare Ordnung. Die ohnehin beträchtliche Diversität von Proteinen wird zusätzlich zu den in der genetischen Kodierung festgeleg ten 20 Aminosäuren durch posttranslationale Modifikationen erhöht. Dabei können niedermolekulare anorganische (Phosphat, Sulfat) oder organische Reste bzw. Moleküle anderer biochemischer Stoffklassen (Lipide, Kohlenhydrate) übertragen werden. Diese chemischen Veränderungen modulieren bestimmte Struktur- und Funktionszustände des gereiften Proteins. Membranproteine unterscheiden sich von löslichen Proteinen durch ihre Lokalisation in der Lipiddoppelschicht. Sie kommen in Grenzflächen von Zellen und Organellen vor und haben wichtige Funktionen beim Stofftransport, bei der Energiewandlung und der Signaltransduktion.

Abbau

Proteine und Proteinaktivitäten können durch Proteinabbau eliminiert werden. Hier sind v.a. lysosomale Proteasen und das zytoplasmatisch lokalisierte Proteasom wirksam.

Isolation und Charakterisierung

Um Proteine auch molekular zu verstehen, muss man strukturelle und funktionelle Eigenschaften am gereinigten Biomolekül analysieren. Hierzu ist es erforderlich, die Proteine aus den natürlichen Quellen oder genetisch manipulierten Organismen zu isolieren. Durch differenzielle Zentrifugation kann man biologisches Material in subzelluläre Partikel fraktionieren. Gereinigte Proteine erhält man durch chromatographische Methoden, die auf der Trennung nach Größe, dem Ionenaustauscher-, Hydrophobie- oder dem Affinitätsprinzip beruhen. Für die qualitative und quantitative Charakterisierung der Proteine sind elektrophoretische und chemische Verfahren wichtig. Auch die Massenspektrometrie wird eingesetzt

Fragen

  • 1.

    Wieso gehört Glycin nicht zu den optisch aktiven Aminosäuren?

  • 2.

    Unter welchen Bedingungen klassifiziert man Aminosäuren in sauer bzw. basisch? Welche Aminosäuren dieser Art kennen Sie?

  • 3.

    Warum ist die Peptidbindung so stabil?

  • 4.

    Die Aminosäureabfolge von Proteinen kann man durch Edman-Abbau bestimmen. Gibt es alternative Verfahren, Proteinsequenzen zu ermitteln?

  • 5.

    Warum werden die -Helix als kondensierte und der -Strang als ausgedehnte Sekundärstruktur angesehen?

  • 6.

    Wodurch ist die Stabilität von Proteinen begründet?

  • 7.

    Worin besteht der Vorteil der modularen Zusammensetzung von Multidomänenproteinen? [Domänen. Kopienzahl. Proteinfunktionen]

  • 8.

    Sie sollen einen diagnostischen Test entwickeln, mit dem Sie HbS von HbA trennen können. Welche instrumentellen Techniken bieten sich hierfür an? Begründen Sie Ihre Entscheidung. Denken Sie an Interaktion mit chromatographischen Trennmaterialien und das Verhalten von Proteinen im elektrischen Feld.

  • 9.

    Wie können Sie Proteinbanden voneinander trennen, die auf einem SDS-Elektrophoresegel comigrieren?

  • 10.

    Wie kann man bestimmen, ob ein Protein Disulfidbrücken hat?

  • 11.

    Woran liegt es, dass Proteine, die aus einem extrem hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren bestehen, trotzdem wasserlöslich sind?

  • 12.

    Was besagt das Vorkommen invarianter Regionen in Proteinen?

  • 13.

    Durch welche Faktoren ist die Hydrophobie von Membranproteinen bedingt?

  • 14.

    Was sind konservative Substitutionen in Proteinen? Benennen Sie Beispiele hierfür.

  • 15.

    Sie sollen einen Proteinmarker finden, der sich für die Diagnose einer neu entdeckten Stoffwechselkrankheit eignet. Wie gehen Sie experimentell vor?

  • 16.

    Fehlgefaltete Proteine werden in der Zelle normalerweise rückgefaltet oder proteolytisch abgebaut. Warum greifen diese Strategien nicht beim Prionprotein?

Weiterführende Informationen und Datenbanken als Weblinks
Nucleinsäure- und Proteindatenbanken über spezifische Moleküle: http://www.ncbi.nih.gov/
Aspekte von humanen genetischen Erkrankungen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?dbOMIM
Swiss-Prot-Datenbank: http://www.expasy.org
Sequenzvergleichrechner: http://www.ebi.ac.uk/clustalw
SCOP (structural classification of proteins): http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/
Graphikprogramme, die mit Strukturkoordinaten der Biomoleküle Abbildungen erstellen: Rasmol http://www.umass.edu/microbio/rasmol/
Swiss-PDBviewer http://www.expasy.org/spdbv/ weblabviewer
005 IMPP-Fragen

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