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Grundstruktur von L--Aminosäuren.
a) Räumliche Darstellung. Die Aminogruppe, die Carboxylgruppe und zwei weitere Substituenten sind tetraedrisch an das -Kohlenstoffatom gebunden. –R (Rest) symbolisiert eine der 20 verschiedenen Aminosäureseitenketten.
b) Stereochemie der Aminosäuren. Das -Kohlenstoffatom ist asymmetrisch substituiert und befindet sich in der Mitte eines Tetraeders. In der perspektivischen Darstellung weisen die schwarzen Dreiecke vor die Papierebene und die gestrichelten hinter die Papierebene. Die absolute Konfiguration entspricht der L-Form.
c) In der Fischer-Projektionsformel (zweidimensionale Darstellung) wird dieser Zusammenhang durch Striche angedeutet.

Darstellung der L- und der D-Konfiguration der Aminosäure Valin. Zur Verdeutlichung der räumlichen Symmetrie ist die Spiegelebene gestrichelt eingezeichnet.

Struktur von Valinomycin. In diesem makrozyklischen Antibiotikum kommt die D-Aminosäure D-Valin als Baustein neben L-Valin und sog. Hydroxysäuren vor. Die Verknüpfung der Bausteine erfolgt durch Peptidbindungen (unten) und Lactonbrücken. Der antibiotische Effekt von Valinomycin besteht darin, dass es hochspezifisch K+-Ionen komplexieren und durch Biomembranen leiten kann, daher auch die Bezeichnung Ionophor.

Extinktions- bzw. Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren. Die Lichtextinktion (-absorption) der wässrigen Lösungen von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan wird in Abhängigkeit von der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts untersucht.

Titrationskurve von Alanin.

Protolysegleichgewichte von Alanin, Asparaginsäure und Lysin. Die Prozentwerte in Klammern geben an, zu welchem Anteil die betreffenden Gruppen ionisiert vorliegen.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
a) Chromatographiesystem zum Nachweis von Aminosäuren. Die Apparatur besteht aus einer Pumpe, die den Eluenten aus den Reservoirs der verschiedenen Lösungsmittel mischt, einer Trennsäule und einem Detektor. Aufgrund der hohen Packungsdichte des Säulenmaterials muss man die mobile Phase mit hohen Drücken durchpressen.
b) HPLC-Chromatogramm eines Aminosäuregemischs. Die Komponenten des Gemischs werden auf einer als Umkehrphase (reversed phase) bezeichneten HPLC-Säule getrennt. Die Elution erfolgt durch einen Puffer-Acetonitril-Gradienten, bei dem der Acetonitrilanteil mit der Zeit kontinuierlich erhöht wird, sodass die Hydrophobie der mobilen Phase sukzessive steigt. Die Aminosäuren werden vor dem Säulenlauf mit ortho-Phthalaldehyd modifiziert. Die entstehenden Derivate können aufgrund ihrer Absorption oder Fluoreszenz detektiert werden. Im abgebildeten Chromatogramm wird die Fluoreszenzemission gemessen und in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.

Biogene Amine der Signalübertragung.

Peptidbindung.
a) Partieller Doppelbindungscharakter durch Mesomeriestabilisierung.
b) Planarer Charakter der Peptidbindung (Amidebene) in der trans-Orientierung: Einfachbindungen bestehen zwischen dem C- und dem C*-Atom (0,151 nm) sowie zwischen N und dem nächsten C (0,146 nm). Die CO-Doppelbindung misst nur 0,124 nm. Die Bindungslänge zwischen dem C und N der Peptidbindung liegt zwischen Einfach- und Doppelbindung (0,133 nm), daher die Bezeichnung partieller Doppelbindungscharakter.
c) Geometrie der Peptidgruppe. Die Substituenten des C- und des N-Atoms der Peptidbindung – also die beiden benachbarten -Kohlenstoffatome – liegen entweder in cis- oder trans-Orientierung vor.

Strukturhierarchie von Proteinen am Beispiel des Hämoglobins. Die höchste Organisationsebene ist die Quartärstruktur. Sie existiert nur für solche Proteine, die aus einer Zusammenlagerung mehrerer Polypeptidketten bestehen. Bei genauerer Betrachtung wird die Aufgliederung in unterschiedliche Polypeptidketten deutlich, diese haben eine Tertiärstruktur. Weitere Vergrößerung zeigt, dass die Faltung des Proteins von Komponenten der Sekundärstruktur (hier: -Helices) geprägt ist. Diese Elemente werden durch die räumliche Ordnung der sequenziell verknüpften Aminosäuren, die Primärstruktur, erzeugt.

Sequenzen von Rhodopsin.
a) Multipler Sequenzvergleich von orthologen Proteinen am Beispiel des Sehfarbstoffs Rhodopsin. Identische Aminosäuren bei allen Organismen sind gelb hinterlegt. Die entsprechenden Proteinsequenzen wurden aus der Swiss-Prot-Datenbank zusammengetragen und der Sequenzvergleich mit dem Computerprogramm CLUSTALW berechnet. Die Namenskürzel OPSD_ sind originale Datenbankeinträge, die für das Protein und den Ursprungsorganismus stehen. Weitere Abkürzungen: BUFBU Kröte (Bufo bufo), CARAU Goldfisch (Carassius auratus), CANFA Hund (Canis familiaris), BOVIN Rind (Bos taurus), HUMAN Mensch (Homo sapiens). Die Sterne unterhalb der Sequenzanordnung markieren identische Reste, Doppelpunkte und Punkte für stark und weniger ausgeprägt konservierte Substitutionen.
b) Der phylogenetische Stammbaum stellt die sich aus dem Sequenzvergleich ergebenden relativen Verwandtschaftsverhältnisse der betrachteten Proteine graphisch dar. Die Verbindungslinien zwischen den Proteinen sind umso kürzer, je größer der Grad der Aminosäuresequenzverwandtschaft ist.

Multipler Sequenzvergleich von paralogen Proteinen am Beispiel von Proteinen der humanen Ras-Superfamilie.
a) RASH, RASK, RHEB, RHOA, RAC1, RAB10 und RAN sind paraloge Proteine, die in der Signaltransduktionskette wichtige Funktionen als GTP-bindende Schalter annehmen. Die Sequenzbezeichnungen und die Markierungen des Sequenzkonservierungsgrades entsprechen denen in Abb. 2.11a. Die invarianten Positionen sind zusätzlich in Gelb hervorgehoben. Die blaue Box markiert die konservierten Sequenzbereiche (G1–G5), die in dieser Klasse von membranassoziierten GTP-bindenden Proteinen gefunden werden.
b) Strukturmodell von Ras (RASH) im GTP-gebundenen Zustand. Die nucleotidbindenden Bereiche G1–G5 sind blau unterlegt. Ebenfalls skizziert ist die C-terminale Anheftungsstelle (CAAX-Box) für die Farnesylgruppe. Es handelt sich dabei um eine posttranslationale Modifikation.

Stabilisierung der Raumstruktur eines Peptids.
a) In einem kurzen, linearen Peptid ist die relative Anordnung der Aminosäurereste im Raum prinzipiell noch nicht festgelegt. Die Struktur eines Peptids wird in diesem Beispiel durch die Abfolge der Aminosäuren bestimmt. Die Kontakte der Aminosäureseitenketten erfolgen an den Oberflächen (Van-der-Waals-Oberflächen) der Atome, die durch ihre Van-der-Waals-Anziehungs- und Abstoßungskräfte bestimmt werden.
b) Raumstrukturstabilisierende Wechselwirkungen von Aminosäuren.

Raumstruktur von Insulin. Die A- und B-Kette sind intermolekular durch zwei Disulfidbrücken verbunden. Zusätzlich existiert noch eine intramolekulare Bindung zwischen zwei Cysteinresten der A-Kette.

Sekundärstrukturelement -Helix.
a) Im Kugel-Stab-Modell ist die Abfolge des Rückgrats gezeichnet. In der Farbkodierung sind die C'-Atome schwarz, C grau, Sauerstoff rot und Stickstoff blau dargestellt. Von den Aminosäureseitenketten werden der Übersichtlichkeit halber nur die C-Atome (violett) gezeigt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen N–H und CO sind gestrichelt eingetragen.
b) Schematische Abbildung einer -Helix. Diese Darstellungsform wird oft in Strukturbildern gewählt, um einen groben Überblick über die Topologie eines Proteins zu geben. Die Ganghöhe der Helix und ihr Durchmesser sind eingezeichnet.
c) Helixraddarstellung der -Helix (Ansicht von oben in Richtung der Helixachse).

-Faltblatt-Struktur.
a) Ein einzelner -Strang in typischer Zickzackstruktur von der Seite gesehen, die Aminosäureseitenketten (violette Kugeln) zeigen abwechselnd in entgegengesetzte Richtungen.
b) Schematische Pfeildarstellung eines einzelnen -Strangs. Die Pfeilrichtung gibt den Verlauf der Polypeptidkette an, dabei weist die Pfeilspitze auf den C-Terminus des Strangs.
c) Mehrere -Stränge sind zu einem antiparallelen -Faltblatt angeordnet (von oben gesehen). Die Aminosäureseitenketten liegen über und unter der Papierebene.

Spezielle Sekundärstrukturen.
a) Kollagentripelhelix. Drei nichtidentische helikale Stränge sind miteinander verwoben. Strukturstabilisierende Wasserstoffbrücken bilden sich nicht innerhalb, sondern zwischen den einzelnen Ketten aus.
b) und c) Struktur des Seidenfibroins. Schematische Darstellung der Anordnung der antiparallelen Polypeptidketten, die sich in mehreren Lagen übereinanderlagern. In der Darstellung der Van-der-Waals-Oberflächen wird die Wechselwirkung zwischen den gestapelten -Faltblattlagen deutlich.

Strukturmodell von Myoglobin. Das Protein ist aus -Helices aufgebaut, die durch Schleifen miteinander verknüpft sind. Der Cofaktor Häm B wird über besondere Aminosäureliganden an das Protein gebunden. Die Komplexierung erfolgt durch Wechselwirkung des Stickstoffs von Histidin 93 (gelb) mit dem Zentralatom Eisen (grün) des Hämmoleküls (schwarz).

Leucin-Zipper-Motiv.
a) Beispiel des heterodimeren Transkriptionsfaktorkomplexes cMyc/Max, bei dem zwei -Helices (in Rot und Blau) aneinanderbinden. Die beiden Sekundärstrukturelemente sind eng verzahnt, weil sie durch Wechselwirkung von hydrophoben Aminosäureseitenketten, bevorzugt Leucin, eine reißverschlussartige Struktur bilden.
b) Die Verzahnung wird besonders deutlich, wenn man die beiden -Helices auseinanderzieht.

Ausbildung von parallelen und antiparallelen -Faltblättern.
a) Verknüpfung von zwei antiparallelen -Strängen über eine Schleife.
b) Die Schleife ist bei paralleler -Stranganordnung wesentlich länger; es gibt zwei verschiedene räumliche Orientierungen (rechts- und linkshändiges Motiv, zur Vereinfachung nicht dargestellt).
c) An die Stelle einer Schleife kann auch eine Helixstruktur treten, es gibt ebenfalls die zwei rechts- und linksgängigen sterischen Anordnungen.

--Supersekundärstruktur am Beispiel ausgewählter Proteine. Gezeigt sind die schematischen Anordnungen der Sekundärstrukturelemente (Topologien) sowie die Raumstrukturen (rot helikale, blau faltblattartige Sekundärstruktur).
a) Topologie und b) Struktur von Flavodoxin.
c) Topologie und d) Struktur von Carboxypeptidase. In diesen Proteinen bilden die -Stränge ein zentrales, leicht verdrilltes Faltblatt.
e) Topologie der Triosephosphat-Isomerase und ihre Raumstruktur: von der Seite (f) und von oben (g) gesehen. In den --Barrel-Proteinen bilden die -Stränge eine fassartige Anordnung.

Strukturvorhersagen eines unbekannten Proteins durch verschiedene Sekundärstrukturvorhersageprogramme. Die Sekundärstruktur eines unbekannten Proteins aus der Genomsequenz des Bakteriums Enterococcus hirae (nur Ausschnitt gezeigt) wurde mittels verschiedener Computervorhersageprogramme berechnet. Oben: partielle Sequenz des Proteins Unk_7585500, darunter: Ergebnisse der verschiedenen Programme (h -Helix, e -Strang, t Umkehrung [Turn], c Schleife [keine Standardsekundärstruktur], Sec. Cons. Konsensus [(gemeinsamer Nenner der errechneten Strukturvorhersagen]).

Struktur eines Zinkfingerelements.
a) Schema der topologischen Anordnung des Faltblatt-Schleife-Helix-Motivs.
b) Dreidimensionale Struktur und Ligandenumgebung des Zinkfingerproteins ZIF268 einer Maus, es enthält drei Zinkfingerelemente. Nur die Seitenketten der Zn-bindenden Aminosäuren Cystein und Histidin sind herausgestellt. Die blauen Kugeln entsprechen den von Cystein-SH und Histidin-N komplexierten Zinkatomen.
c) Schema der Ligandenumgebung des Zn durch die Primärstruktur von ZIF268 (Ausschnitt).
d) Strukturdarstellung der Ligandenumgebung. Die Liganden sind in ihrer Sequenzabfolge nummeriert.

Struktur von Calcium-bindenden (grüne Kugeln) EF-Hand-Motiven.
a) Sequenzvergleich verschiedener Proteine mit drei EF-Hand-Motiven in der Helix-Schleife-Helix-Architektur. Nur die invarianten Aminosäuren sind rot markiert.
b) Topologie des Helix-Loop-Helix-EF-Hand-Motivs.
c) Dreidimensionale Struktur von Calmodulin mit vier EF-Hand-Motiven.
d) Schema der Ligandenumgebung des Ca durch die Primärstruktur von Troponin C (Ausschnitt).
e) Strukturdarstellung der Ligandenumgebung. Die Liganden sind in ihrer Sequenzabfolge nummeriert.

Darstellungsverfahren von molekularen Strukturen am Beispiel von Insulin.
a) Die topologische Darstellung gibt den Verlauf der Sekundärstrukturelemente wieder. Hierbei werden die Helixanteile schematisch als Spiralen abgebildet (Abb. 2.15; noch einfacher als Spiralband oder Zylinder) und die Faltblattanteile als Streifen oder Pfeilsymbole dargestellt (Abb. 2.16).
b) Strichdarstellung des Insulins, bei der alle Aminosäureseitenketten mitgezeichnet sind.
c) Kalottenmodell. Die einzelnen Atome sind mit ihren Van-der-Waals-Radien repräsentiert.
d) Oberflächendarstellung des Moleküls (rot negative, blau positive Ladung).

Domänenstruktur der Pyruvat-Kinase.
a) Die verschiedenen Faltungseinheiten einer Polypeptidkette des tetrameren Proteins sind in unterschiedlichen Farben dargestellt. Einzelheiten im Text.
b) Organisation von Polypeptidketten in verschiedene Domänen, gezeigt am Beispiel von Proteasen der Blutgerinnung bzw. Fibrinolyse. Verschiedene kleine Proteinmoleküle bilden Module, die zum fertigen Protein kombiniert werden. Beim Prototyp Chymotrypsin formen zwei Domänen das aktive Enzym (insgesamt 243 Aminosäuren). Mit Chymotrypsin evolutionär verwandte Domänen sind auch bei Urokinase, Faktor IX und Plasminogen vorhanden. Weitere Module wie das dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) homologe Peptid (53 Aminosäuren), die etwa 85 Aminosäuren lange Kringle-Domäne und die Ca2+-bindende Domäne (auch Abb. 2.23e) werden linear vor die proteolytischen Module geschaltet.

Quartärstrukturen von Proteinen. Polypeptide können sich zu Oligomeren assoziieren.
a) Hexamere Struktur von Insulin (Monomerstruktur Abb. 2.25). Die sechs Polypeptidketten sind u.a. durch Bindung an ein binukleäres Zinkzentrum (blaue Kugeln in der Mitte) gebunden, wobei jedes Polypeptid mit einem Histidinliganden zur Koordinierung des Metalls beiträgt.
b) Tetramere Struktur von Pyruvat-Kinase (Monomerstruktur Abb. 2.26)

Verteilung der isomeren Formen der Lactat-Dehydrogenase in Geweben. Die Kombinationen der Isoformen M und H ergeben fünf verschiedene tetramere Enzyme
(a), deren gewebsspezifische Verteilung dargestellt ist
(b). Die Isoenzyme unterscheiden sich anhand ihrer isoelektrischen Punkte und können mit Ionenaustauschchromatographie oder durch Elektrophorese im Stärkegel oder auf Zelluloseacetatfolien voneinander getrennt und quantifiziert werden. Dies ist durch unterschiedliche Größe und Intensität der Kreise dargestellt.

Kovalente Modifikationen von Proteinen. Die Aminosäuren im Proteingerüst sind schwarz, die spezifischen Substituenten rot gezeichnet. Selenocystein (a), N-Formylmethionin (b), 3-Hydroxyprolin (c), 4-Hydroxyprolin (d), S-Farnesylcysteinmethylester (e), S-Palmitoylcystein (f), N-Myristoylglycin (g), Phosphoserin (h), Phosphotyrosin (i), N-Acetylglucosaminylasparagin (N-gekoppelter Zucker) (j), N-Acetylglucosaminylserin (O-gekoppelter Zucker) (k).

a) Faltungsintermediat (molten globule). Bei der Proteinfaltung bilden sich zuerst die Sekundärstrukturelemente der Polypeptidkette aus. Diese orientieren sich zunächst in einer relativ lockeren, wenig kondensierten Form, in der hydrophobe Oberflächen aneinandergelagert sind. Danach orientieren sich die Sekundärstrukturelemente in die stabile Tertiärstruktur um.
b–e) Energieflächenprofile bei der Faltung von Proteinen, dargestellt als Trichterdiagramm. Die Abbildung stellt die Energiezustände in verschiedensten Stadien auf dem Weg zum fertig gefalteten Protein dar (die Energie des Systems wird auf der senkrecht zur Kreisebene stehenden Achse angezeigt). Der Kreisradius ist ein Maß für die Kompaktheit des gefalteten Proteins. Je weiter der Faltungsprozess voranschreitet, je kleiner also der Radius wird, desto mehr verringert sich die Anzahl der verschiedenen Einstellmöglichkeiten: Der Kreisumfang wird immer kleiner. Mit fortschreitender Gestaltung des fertigen Proteins wird der Konformationsraum immer stärker eingeschränkt, bis im Endzustand nur noch eine mögliche Proteinkonformation übrig bleibt.
b) Flaches Profil. Proteine müssen lange suchen, bis sie in den Trichter hineinfallen.
c) Flaches Profil mit Rinne für bevorzugten Faltungsweg.
d) Steiles Profil. Proteine fallen aus allen möglichen Konformationszuständen ohne Umwege in den Trichter.
e) Steiles, aber unebenes Profil. Bevor die Proteine in den Trichter hinabfallen, müssen sie energetische Hindernisse überwinden.

Dreidimensionale Struktur des Prionproteins PrPC beim Rind. Man sieht das C-terminale Fragment, gezeigt sind nur die Aminosäuren 124–227. Das N-terminale Peptid bildet keine geordnete Struktur. PrPC hat überwiegend -helikale Sekundärstruktur. Bei der umgefalteten pathogenen Form PrPSc stellt man sich vor, dass der C-terminale Abschnitt im Gegensatz zur zellulären Form PrPC nur noch 30% -Helix-, aber 45% -Faltblatt-Anteil besitzt.

Fehlfaltungsmechanismen bei Proteinen.
a) Mechanismus der Prionenreplikation. Die spontane Umwandlung von PrPC (gelb) in PrPSc ist unter normalen Umständen ein seltener Prozess, da eine hohe Energiebarriere für die Umfaltung besteht. Durch Kontakt mit einem bereits präformierten infektiösen Prionenpartikel (oligomeres PrPSc) wird die Umfaltung stark begünstigt. Die weitere Anlagerung von PrPC führt zum Wachstum des PrPSc-Partikels bis zu einer kritischen Länge, die den Zerfall in Tochterpartikel zur Folge hat.
b) Kinetik der Bildung von Amyloidfibrillen (Keimbildungsmodell). Die Bildung von Amyloidfibrillen ist ein kooperativer Prozess ähnlich der Entstehung von Kristallen aus Kristallisationskeimen. Die Umwandlung der nativen (gelb) in die fehlgefaltete (blau) Monomerkonformation sowie die nachfolgenden Monomeranlagerungsschritte bis zur Formation eines Keims erfolgen langsam (Keimbildungsphase). Weitere Anlagerung von Monomeren an den einmal gebildeten Keim vollzieht sich dann erheblich schneller (Elongationsphase). Dieser Vorgang wird durch die blaue Kurve der Aggregatbildung dargestellt. In einer frühen Phase kann dieser Prozess durch Zugabe von Keimpartikeln drastisch beschleunigt werden (dargestellt durch die rote Kurve der Aggregatbildung).

Architektur von Membranproteinen und ihre Anordnung in der Lipiddoppelschicht. a, b) Periphere Membranproteine: Kovalente Anheftung über einen GPI-Anker (a) und über Kohlenwasserstoffketten (b; Fettsäuren, Isoprenoide).
c, d) Integrale Membranproteine, bei denen die Proteinmasse überwiegend im hydrophoben Bereich der Membranebene angesiedelt ist: einfach membrandurchspannendes Protein mit einer (c) oder zwei (d) unterschiedlich orientierten hydrophilen Domänen.
e) Mehrfach membrandurchspannendes Protein

Struktur von Rhodopsin. Rhodopsin ist aus sieben -helikalen Polypeptidabschnitten aufgebaut, die die Membran mehr oder weniger senkrecht durchqueren.
a) Laterale Ansicht in der Membranebene mit zeichnerisch ergänzten Lipiden.
b) Aufsicht desselben Moleküls (ohne Lipide). Es werden zwei Schichten von Polypeptidketten deutlich, die den kovalent an das Apoprotein gebundenen Cofaktor Retinal einbetten. Dieser ist in (c) in der im Grundzustand des Proteins vorkommenden Konformation gezeichnet.
d) -adrenerger Rezeptor mit gebundenem Ligand (blau). Der graue Anteil entspricht T4-Lysozym, das mit gentechnischen Methoden in den Rezeptor eingefügt wurde, um das Protein für Strukturuntersuchungen zu stabilisieren.

Hydropathiediagramm von Rhodopsin.

Biologischer Abbau von Proteinen. Ubiquitin, der Marker für abzubauende Proteine wird durch Bindung an Enzym 1 (E1) durch Ausbildung einer (Iso-)Peptidbindung kovalent gebunden und an das Enzym E2 weitergegeben, das einen Komplex mit spezifischen Erkennungsmolekülen (E3 bzw. F-Box-Proteine) für Substratproteine bildet: Nach Andocken an den Rezeptor empfangen die Zielproteine ein oder mehrere (kettenartig aneinandergehängte) Ubiquitinmoleküle und sind damit als Substrate für das Proteasom markiert. Das Substratprotein wird vom 26S-Proteasomkomplex aufgenommen, entfaltet und durch die im Inneren des Kernkomplexes gelagerten Proteasen in Oligopeptide bzw. Aminosäuren gespalten.

Peptidsynthese nach Merrifield. Auf einem Kunststoffpartikel (Polymerkügelchen) werden die Aminosäuren, vom C-Terminus ausgehend, Schritt für Schritt aneinandergeheftet. Die Carboxylgruppen werden durch Derivatisierung chemisch aktiviert (Carboxylaktivator). Schutzgruppen an den Aminogruppen sorgen dafür, dass nur das auf die Festphase geschichtete Peptid mit der Aminosäure und nicht die Aminosäuren in der Lösung untereinander gekoppelt werden. Zum Schluss wird das Peptid chemisch vom Kunstharzpartikel abgetrennt und chromatographisch gereinigt. Der Übersichtlichkeit halber sind in dieser schematischen Abbildung keine molekularen Details dargestellt. Einzelheiten kann man in Lehrbüchern der organischen Chemie nachlesen.

Prinzip der Zentrifugation.
a) In einem Ausschwingrotor werden die im Zentrifugenbecher suspendierten Fragmente im Schwerefeld aufgetrennt. Bestimmende Größen für die Trennungseigenschaften sind hierbei der Abstand des Zentrifugenbechers r von der Rotationsachse, die Umdrehungszahl des Rotors und der Sedimentationskoeffizient s des zu zentrifugierenden Partikels. Die Wanderungsgeschwindigkeit v des Partikels im Zentrifugalfeld errechnet sich aus der Gleichung v 2 r s. Je größer der Sedimentationskoeffizient s, desto schneller sedimentieren die Partikel.
b) Sedimentationskoeffizienten von subzellulären Partikeln und von gelösten Proteinen. Die Einheit des Sedimentationskoeffizienten s ist S (Svedberg). 1 S entspricht einem Wert von 1013 s.
c) Übersicht der differenziellen Zentrifugationstechnik. Aus dem Homogenat werden durch aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte schwere von leichten Partikeln abgetrennt. Im Überstand befindet sich nach der Ultrazentrifugation ( 100.000 g) das wässrig verdünnte Zytosol, aus dem sich in nachfolgenden Trennschritten direkt Proteine isolieren lassen.

Chromatographische Trennverfahren.
a) Prinzip der Gelfiltration. Die Makromoleküle können je nach Größe in die Poren der Gelkügelchen eindringen. Die Elution erfolgt durch einen Puffer mit konstanter Ionenstärke. Kleine Proteine verteilen sich im Porengeflecht, während große Moleküle aus den Poren ausgeschlossen sind und dadurch zuerst eluiert werden.
b) Prinzip der Ionenaustauscherchromatographie am Beispiel eines Anionenaustauschers. Die positiv geladenen Matrixkügelchen binden die anionischen Proteinmoleküle umso stärker, je höher ihr Ladungsgrad ist. Die Elution erfolgt durch Laufmittel mit ansteigender Salzkonzentration.
c) Prinzip der Affinitätschromatographie am Beispiel einer Nickel-Affinitätssäule. Ein komplexes Proteingemisch wird auf die Säule geladen, jedoch binden nur oligohistidinmarkierte Proteine an die auf Gelkugeln immobilisierten Nickelionen. Bei der Elution werden alle nichtbindenden Proteine herausgespült. Schließlich wird das gebundene Protein durch Verdrängung mit puffergelöstem Histidin oder Imidazol von der Säule gewaschen.

Solubilisierung von Membranproteinen.
a) Struktur einiger Detergenzien. Natriumdodecylsulfat (SDS von Sodium dodecylsulfate) ist ein denaturierendes Detergenz und wird für die Gelektrophorese eingesetzt. Andere Detergenzien (z.B. Triton X-100, Cholsäure oder n-Octylglucosid) bewahren die native Proteinstruktur und werden zur Solubilisierung und Reinigung mit chromatographischen Verfahren genutzt.
b) Prinzip der Solubilisierung von Membranproteinen durch amphiphile Substanzen. Die Detergenzien verdrängen durch ihre hydrophoben Enden die im natürlichen Zustand an der Oberfläche der Proteine bindenden Lipidmoleküle. Es bilden sich monodisperse Detergenz-Protein-Komplexe aus. Die polaren Enden der Detergenzien wechselwirken mit dem Lösungsmittel.

Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE).
a) Elektrophoreseapparat.
b) Polyacrylamid-Gel nach Trennung von Probenmolekülen und Molekülmassenmarkerproteinen.
c) Bestimmung der Molekülmasse eines Proteins aus der Eichkurve.
d) Zweidimensionale Gelelektrophorese eines Ganzzellextrakts löslicher Proteine aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis. In der ersten Dimension wurde eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Die Separation erfolgte im pH-Gradienten entsprechend der isoelektrischen Punkte der Proteine. Der Gelstreifen wurde ausgeschnitten und quer auf einem denaturierenden (SDS-)Elektrophoresegel nach der Molekülmasse getrennt.

Western-Blot.
a) Elektrotransfer vom Elektrophoresegel auf Membran. Die Apparatur besteht aus einem Puffertank, der ein Sandwich aus Elektroden, saugfähigem Papier, dem Elektrophoresegel und der Blottingmembran (Nitrozellulose) enthält. Der über die Elektroden auf das Elektrophoresegel geleitete elektrische Strom lässt die im Gel separierten Proteinmoleküle auf die Membran wandern, wo sie immobilisiert werden. Es entsteht ein Abklatsch des ursprünglich auf dem Gel erzeugten Proteinmusters. Die Blottingmembran wird dann mit spezifischen Indikatorsondenmolekülen inkubiert. Beim Immunoblot nimmt man zum spezifischen Proteinnachweis spezifische, primäre Antikörper gegen das zu detektierende Protein. Danach markiert man die Proteinflecken mit einem enzymgekoppelten sekundären Antikörper, der den primären Antikörper und damit das nachzuweisende Protein durch eine nachfolgende enzymatische Farbreaktion sichtbar macht.
b) Immunoblotting am Beispiel des Hamster-Prionproteins PrP. Der Test beruht auf der Resistenz des krankhaften Prionproteins gegenüber dem proteolytischen Enzym Proteinase K. Hirnextrakte von normalen (enthalten PrPC) und erkrankten (enthalten PrPC und PrPSc) Tieren wurden mit Proteinase K behandelt, auf einem denaturierenden Elektrophoresegel getrennt, auf Nitrozellulose geblottet und mit Antikörpern gegen PrP entwickelt. Normale Extrakte ohne (Bahn 1) und nach erfolgter Proteinase-K-Behandlung (Bahn 2). Bahn 3: krankhafte Extrakte ohne erfolgte Proteinase-K-Behandlung und nach Behandlung (Bahn 4). Das ausbleibende Signal des PrP in Bahn 2 und die Existenz einer deutlichen Bande in Bahn 4 sprechen dafür, dass das erkrankte Tier proteaseresistentes PrPSc aufweist.

MALDI-Massenspektroskopie.
a) Funktionsprinzip. Die in eine lichtempfindliche Matrix eingebettete Probe wird durch Laserblitz desorbiert und im elektrischen Feld beschleunigt. Je leichter die Moleküle bei gleicher Ladung sind, umso schneller fliegen sie zum Detektor, sodass sich die Molmasse aus der Flugzeit ergibt.
b) Massenspektrometrische Analyse eines Gemischs aus Cytochrom c, Ubiquitin und Myoglobin.
c) Massenfingerprint von Ovalbumin nach tryptischem Verdau.

Aufklärung dreidimensionaler Strukturen mittels Röntgenkristallographie.
a) Mithilfe des Hanging-drop-Verfahrens wird durch Dampfdiffusion die Proteinlösung langsam, innerhalb von Tagen bis Wochen, aufkonzentriert, bis sich die Moleküle zu Kristallen anordnen.
b) Photographie eines in einem Hanging drop gebildeten Proteinkristalls (Länge ca. 250 m).
c) Schematischer Aufbau eines Röntgendiffraktometers. Die von der Röntgenquelle ausgehenden Strahlen treffen auf den Proteinkristall und werden aufgrund der regelmäßigen Struktur des Kristalls gestreut.
d) Die von den Streuzentren des Kristalls ausgehenden Röntgenstrahlen erzeugen ein für das Protein typisches Beugungsbild. (b) und (d) stammen vom menschlichen RAN-Protein (bereits in Abb. 2.12 erwähnt).

Struktur der 20 proteinogenen Aminosäuren, eingeteilt nach den Hauptsubstanzklassen
Trivialname | Dreibuchstabencode | Einbuchstabencode | Molekülmasse | pKa-Wert | Hydropathieindex | Seitenkette R |
hydrophobe Aminosäuren, aliphatisch | ||||||
Glycin | Gly | G | 57 | 0,4 |
![]() |
|
Alanin | Ala | A | 71 | 1,8 |
![]() |
|
Valin | Val | V | 99 | 4,2 |
![]() |
|
Cystein | Cys | C | 103 | 2,5 |
![]() |
|
Methionin | Met | M | 131 | 1,9 |
![]() |
|
Isoleucin | Ile | I | 113 | 4,5 |
![]() |
|
Leucin | Leu | L | 113 | 3,8 |
![]() |
|
aromatisch | ||||||
Phenylalanin | Phe | F | 147 | 2,8 |
![]() |
|
aromatisch | ||||||
Tyrosin | Tyr | Y | 163 | 1,3 |
![]() |
|
Tryptophan | Trp | W | 186 | 0,9 |
![]() |
|
hydrophile Aminosäuren, neutral | ||||||
Serin | Ser | S | 87 | 0,8 |
![]() |
|
Threonin | Thr | T | 101 | 0,7 |
![]() |
|
Prolin (Iminosäure) | Pro | P | 97 | 1,6 |
![]() |
|
Asparagin | Asn | N | 114 | 3,5 |
![]() |
|
Glutamin | Gln | Q | 128 | 3,5 |
![]() |
|
Histidin | His | H | 137 | 6,0 | 3,2 |
![]() |
geladen (bei physiologischem pH) | ||||||
Asparaginsäure | Asp | D | 114 | 3,9 | 3,5 |
![]() |
Glutaminsäure | Glu | E | 128 | 4,1 | 3,5 |
![]() |
Lysin | Lys | K | 129 | 10,6 | 3,9 |
![]() |
Arginin | Arg | R | 157 | 12,5 | 4,5 |
![]() |
Neben dem Trivialnamen sind der Drei- und der Einbuchstabencode aufgeführt. Letzterer erscheint nicht immer logisch, weil man aufgrund gleicher Anfangsbuchstaben der Trivialnamen schwer zu merkende Kürzel eingeführt hat. Alle -Aminosäuren haben dieselbe Grundstruktur (Abb. 2.1a) und besitzen individuelle Seitenketten (Reste), die für die spezifischen Eigenschaften der Moleküle verantwortlich sind. Außerdem sind die Hydropathieindizes angegeben. Die Werte geben den Grad an Hydrophobie einzelner Aminosäurereste an. Polare Reste haben sogar negative Werte (äußerst geringe Hydrophobie). Neben den Molekülmassen sind bei protonierbaren Aminosäuren auch die pKa-Werte aufgelistet.
pKa-Werte und isoelektrische Punkte der Aminosäuren Alanin, Asparaginsäure und Lysin
Aminosäure | Art der Seitenkette | pKa-Wert -COOH | -NH3+ | -COOH | -NH3+ | isoelektrischer Punkt arithmetisch gemittelt aus |
Alanin | CH3-Gruppe nicht protonierbar | 2,3 | 9,8 | – | – | 6,0 -COOH und -NH3+ |
Asparaginsäure | –COOH | 2,1 | 9,8 | 3,9 | – | 3,0 -COOH und -COOH |
Lysin | –NH3 + | 2,1 | 9,0 | – | 10,6 | 9,8 -NH3+ und -NH3+ |
Beispiele biologisch wirksamer Peptide
Name | Strukturmerkmal | Funktion |
Glutathion | -Glutamat-Cystein-Glycin (Tripeptid) | Thiolpuffer, in Erythrozyten hält es Cysteinreste von Proteinen im reduzierten Zustand und stabilisiert den zweiwertigen Zustand des Eisens |
Vasopressin | 9 Aminosäuren mit 1 Disulfidbrücke | stimuliert die Rückresorption von Wasser in die distalen Tubuli der Niere (antidiuretisches Hormon) |
Ciclosporin (aus Pilzen) | 11 teilweise modifizierte Aminosäuren, zyklisch | unterdrückt die Abstoßungsreaktion bei Transplantationen |
Glucagon | 29 Aminosäuren | stimuliert den Glykogenabbau und erhöht damit den Blutzuckerspiegel |
Insulin | 2 Peptidketten: A-Kette mit 21 Aminosäuren, B-Kette mit 30 Aminosäuren, 3 Disulfidbrücken | stimuliert die Glykogensynthese und senkt damit den Blutzuckerspiegel |
Adenocorticotropin (ACTH) | 39 Aminosäuren | stimuliert Umwandlung von Cholesterin in Pregnenolon |
epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) | 53 Aminosäuren mit 3 Disulfidbrücken | regt das Wachstum von Epidermis- und Epithelzellen an |
-Amanitin aus Knollenblätterpilz | 8 teilweise ungewöhnliche Aminosäuren, zyklisch | tödliches Gift, bindet an RNA-Polymerase II und blockiert Bildung von mRNA |
Strukturstabilisierende Wechselwirkungen in Peptiden und Proteinen
Art | Bindungsenergie/kJmol-1 | Bindungscharakter | beteiligte Gruppen |
Einfachbindung (zum Vergleich) | 360 | kovalent | Kohlenstoffatome (-C–C-) |
Disulfidbrücke | 170 | kovalent | Schwefelatome von Cystein (-S–S-) |
ionische Bindung | 12–17 | elektrostatisch | positiv und negativ geladene Reste |
dipolare Wechselwirkung | < 12 | elektrostatisch | polare Reste |
Wasserstoffbrücke | 2–6 | kovalent/elektrostatisch | Peptidgruppen CO und N–H; polare und geladene Reste |
hydrophobe Wechselwirkung | 4 | temporär elektrostatisch | aliphatische und aromatische hydrophobe Reste |
Strukturparameter von Sekundärstrukturelementen
Sekundärstrukturelement | Bindungswinkel | Periode (Reste pro Wiederholungseinheit) | Vorschub pro Rest (nm) | |
-Helix | 57 | 47 | 3,6 | 0,15 |
310-Helix | 49 | 26 | 3,0 | 0,20 |
-Helix | 57 | 70 | 4,4 | 0,115 |
-Faltblatt/antiparallel | 139 | +135 | 2,0 | 0,34 |
-Faltblatt/parallel | 119 | +113 | 2,0 | 0,32 |
Proteine
-
2.1
Aminosäuren und Peptide 32
-
2.1.1
Struktur der Aminosäuren32
-
2.1.2
Allgemeine Eigenschaften von Aminosäuren33
-
2.1.3
Peptidbindung39
-
2.2
Aufbau von Proteinen 41
-
2.2.1
Primärstruktur42
-
2.2.2
Stabilisierende Wechselwirkungen45
-
2.2.3
Sekundärstrukturen48
-
2.2.4
Supersekundärstrukturen51
-
2.2.5
Tertiärstruktur54
-
2.2.6
Quartärstruktur58
-
2.3
Posttranslationale Zustandsänderungen 59
-
2.3.1
Proteinmodifikationen59
-
2.3.2
Faltung von Proteinen62
-
2.3.3
Membranproteine65
-
2.4
Biologischer Abbau von Proteinen 68
-
2.5
Isolierung und Charakterisierung von Proteinen 69
Praxisfall
Herr und Frau K. sind seit über 56 Jahren verheiratet. Immer schon hat Frau K. den gemeinsamen Haushalt geführt und ihren schwer gehbehinderten Ehemann versorgt. In den letzten Monaten ist Frau K. jedoch sehr vergesslich geworden. Minttlerweile ist sie unentwegt auf der Suche nach gewöhnlichen Gebrauchsgegenständen, und häufig steht sie dafür sogar nachts auf. Obwohl sie es gegenüber ihrem Arzt und ihren Angehörigen nicht zugeben will, hat sie große Schwierigkeiten, einfache Alltagsverrichtungen zu bewältigen. Ihre zeitliche und räumliche Orientierung ist stark eingeschränkt, und ihr Erleben und Empfinden ist phasenweise stark vergangenheitsverhaftet. Auffällig ist auch, dass sie vertraute Personen, wie ihre Schwiegertochter und ihre Enkel, immer öfter nicht erkennt. Trotz erheblichen Widerwillens der Patientin weist der Hausarzt Frau K. in die gerontopsychiatrische Abteilung des städtischen Krankenhauses ein, um den erkennbaren Demenzzustand diagnostisch zu klären. Die Kernspin- und Computertomographien ergeben keine Auffälligkeiten. Neuropsychologische Tests bestätigen, dass Frau K. einen schweren Verlust von Gehirn- und Gedächtnisleistungen hat, der typischerweise bei Morbus Alzheimer auftritt. Diese Krankheit ist durch massive Ablagerungen des von einem Vorläuferprotein abgespaltenen Amyloid--Peptids im Extrazellularraum des Hirns gekennzeichnet. Parallel zur Einleitung sozialtherapeutischer Maßnahmen erhält Frau K. eine medikamentöse Behandlung mit Acetylcholinesterasehemmern, wodurch die Krankheit zwar nicht geheilt, ihr Fortschreiten aber verlangsamt wird.
Zur Orientierung
Proteine stellen die vielseitigste und wichtigste Klasse von Biomolekülen dar. Ihr kaum vorstellbarer Variantenreichtum kommt durch ein sehr einfaches Bauprinzip zustande, das auf der Verknüpfung von nur 20 Aminosäuren basiert und die Faltung in zahlreiche Raumstrukturen ermöglicht. Proteine bestimmen maßgeblich die äußere und innere Gestalt sowie die Funktionen von Organismen, Organen, Zellen und subzellulären Organisationsformen – im gesunden wie im krankhaften Zustand. Um grundlegende Prozesse und Zusammenhänge des Lebens zu begreifen, muss man letztlich auf molekularer Ebene die Proteine verstehen, die direkt oder indirekt an normalen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Hier liegt der Schlüssel zur Entwicklung von Strategien, um Krankheiten wirksam bekämpfen zu können.
Das Gesamtinventar der Proteine einer Zelle ist in der DNA kodiert. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms sowie die bisher erfolgte Auswertung und Interpretation des genomischen Informationsgehalts verdeutlichen die immense Vielfalt. Biochemiker und Mediziner haben das ehrgeizige Ziel, Strukturen und molekulare Mechanismen möglichst aller Proteine zu entschlüsseln; allerdings wird das noch viele Jahre dauern.
2.1
Aminosäuren und Peptide
2.1.1
Struktur der Aminosäuren
Aufbau
Stereochemie
Schon gewusst
D-Aminosäuren wurden als Bestandteile in einigen mikrobiellen Antibiotika (z.B. dem Ionophor Valinomycin (D-Valin, Abb. 2.3), aber auch als Bausteine von bakteriellen Zellwänden (D-Alanin und D-Glutaminsäure) identifiziert.
MERKE
Das gemeinsame Merkmal der -Aminosäuren sind die am C gelegene Carboxyl- und Aminogruppe. Das C-Atom in biogenen Aminosäuren liegt überwiegend in der stereochemischen L-Konfiguration vor.
Struktur und Klassifikation proteinogener Aminosäuren
2.1.2
Allgemeine Eigenschaften von Aminosäuren
Chemische Eigenschaften
MERKE
Die biologisch relevanten 20 proteinogenen L--Aminosäuren sind strukturell nach einem einheitlichen Grundprinzip aufgebaut. Ihre chemischen Eigenschaften werden von den funktionellen Gruppen der individuellen Reste R bestimmt.
Blick ins Labor
Aromatische Aminosäuren absorbieren Licht im für den Menschen unsichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Sie verleihen diese Eigenschaft auch an die von ihnen aufgebauten Proteine. Für die Ultraviolettabsorption der meisten Proteine bei etwa 280 nm sind die intensiven Absorptionsmaxima von Tryptophan und Tyrosin bei dieser Wellenlänge verantwortlich (Abb. 2.4). Die Spektralphotometrie macht sich dieses Prinzip zur qualitativen und quantitativen Stoffanalyse zunutze. Ein Maß für die Eigenschaft einer Probe, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren, ist die Extinktion (in der englischsprachigen Literatur auch Absorption). Diese Eigenschaft wird als Extinktionsspektrum, oder Absorptionsspektrum, graphisch dargestellt, indem die Extinktion über der Absorptionswellenlänge aufgetragen wird (Abb. 2.4). Der Name Extinktion bezieht sich auf die (teilweise) Auslöschung des eingestrahlten Anregungslichts nach Passage der Probe. Man misst das Verhältnis (I0/I) der Intensitäten des eingestrahlten (I0) und des austretenden Lichts (I). Der Logarithmus dieses Intensitätsverhältnisses log (I0/I) ist die Extinktion (E), für die das Lambert-Beer-Gesetz gilt:
log I0/I E c d
Die Extinktion ist proportional zur molaren Konzentration des gelösten Stoffs c (in mol L1 oder M) und zur Schichtdicke d der Probe (in cm, der Dicke von Probenküvetten). Die Proportionalitätskonstante wird als Extinktionskoeffizient bezeichnet und ist eine stoffspezifische Konstante. Da die Extinktion eine dimensionslose Größe ist, muss der Extinktionskoeffizient die Einheit mol1 Lcm1 besitzen. Neben den Aminosäuren absorbieren viele biologische Moleküle Licht im ultravioletten und ggf. auch im sichtbaren Wellenlängenbereich; aus der Lage der Extinktionsmaxima kann man diese Stoffe qualitativ nachweisen. Voraussetzung zur quantitativen Bestimmung mithilfe der Extinktion ist die Kenntnis der substanzspezifischen Extinktionskoeffizienten. Nichtaromatische Aminosäuren haben praktisch keine Absorption im Wellenlängenbereich von 240 bis 300 nm.
Neben der Absorption zeigen die aromatischen Aminosäuren auch Fluoreszenz. Dieses physikalische Phänomen beruht in der Wiederaussendung eines absorbierten Lichtquants mit verminderter Energie. Mit geeigneten Detektoren erlaubt die Fluoreszenz Nachweise von Aminosäuren und Proteinen mit erheblich höherer Empfindlichkeit.
Säure-Base-Eigenschaften von Aminosäuren
MERKE
Aminosäuren verhalten sich ampholytisch, d.h., sie können Protonen aufnehmen oder abgeben. Demnach sind sie sowohl Basen als auch Säuren.
Isoelektrischer Punkt (IEP)
MERKE
Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Nettoladung von Aminosäuren gleich null.
Pufferwirkung
MERKE
Im Vergleich zu den anorganischen Säure-Base-Paaren ist bei physiologischem pH-Wert der Beitrag von Aminosäureseitenketten zur Gesamtpufferwirkung im Blut geringfügig.
Blick ins Labor
Der qualitative und quantitative Nachweis von Aminosäuren wird mit chromatographischen Methoden durchgeführt. Es handelt sich hierbei um ein Trennverfahren, bei dem sich die Komponenten eines zu trennenden komplexen Gemischs in verschiedene Phasen aufteilen. Unter Phasen versteht man nicht miteinander mischbare Stoffe mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. Bei der sog. Verteilungschromatographie besteht eine der Phasen aus festem Material, meist ein Pulver oder Gel mit bindenden Oberflächeneigenschaften. Man nennt sie deshalb feste oder auch stationäre Phase. Die andere, flüssige oder mobile Phase wird von einer Flüssigkeit gebildet. Mobile und stationäre Phase unterscheiden sich in ihren chemischen Eigenschaften, z.B. der Hydrophobie. Die chromatographische Trennung erfolgt, weil die zu trennenden Stoffe unterschiedliche Affinitäten zu den Phasen haben, je nachdem, ob sie selbst stärker oder schwächer hydrophob sind (Tab. 2.1). Bei der Entwicklung des Chromatogramms, im Fall der Säulenchromatographie auch Elution genannt, reichern sich die aufzutrennenden Stoffe aus dem Gemisch in einer der beiden Phasen an. Sie verteilen sich also auf die Phasen, bis sie völlig voneinander separiert sind. Früher hat man fast ausschließlich über Dünnschichtchromatographie getrennt, mit einem lösungsmittelbenetzten Kieselgelpartikel als stationäre Phase und einer mobilen Phase aus Lösungsmittelgemisch. Der Nachweis erfolgte über Sprühreagenzien, die eine kovalente Bindung mit den Aminosäuren eingehen. Ein Beispiel hierfür ist die Ninhydrinreaktion. Das Verfahren hat allerdings eine relativ geringe Reproduzierbarkeit und lässt sich schlecht automatisieren, sodass heutzutage zur Aminosäuretrennung überwiegend die sog. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt wird (HPLC von high performance liquid chromatography, Abb. 2.7a).
HPLC-Technik. Bei diesem säulenchromatographischen Verfahren (Abb. 2.7a) dienen mit Kohlenwasserstoff-(Octadecyl-)Gruppen kovalent modifizierte Kieselgele als stationäre Phase (reversed phase). Das an sich polare Kieselgel ist durch Kohlenwasserstoffbindung stark hydrophobisiert, deshalb binden sich die Aminosäuren zunächst daran. Die Elution erfolgt mit der mobilen Phase, einem hydrophoben Lösungsmittelgemisch, das durch die Trennsäule über die stationäre Phase geleitet wird. Je größer die Hydrophobie einer Aminosäure, umso höher ist ihr Bindungsvermögen an das Säulenmaterial, und ein umso größeres Eluentenvolumen muss die Säule durchströmen, damit sich die Aminosäure von der stationären Phase ablöst. Bei gegebener Flussrate dient die Retentionszeit als Kenngröße zur Identifikation einer Komponente. Abb. 2.7b zeigt ein typisches Chromatogramm einer Aminosäuretrennung. Die einzelnen Komponenten werden durch eine chemische Derivatisierungsreaktion für den Detektor sichtbar gemacht, da nur wenige Aminosäuren charakteristische Absorptions- oder Fluoreszenzeigenschaften besitzen.
Aminosäuren als Stoffwechselintermediate und Botenstoffe
Essenzielle Aminosäuren
Schon gewusst
Künstlich hergestellte Aminosäuren sind medizinisch wichtig, weil sie für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Patienten, die künstlich (parenteral) ernährt werden müssen, z.B. aufgrund von Darmerkrankungen, bekommen sie als Infusionslösungen. Wenn Aminosäuren für diese Zwecke synthetisch hergestellt werden, fallen dabei allerdings meist Gemische von gleichen Anteilen der D- und L-Isomere an. Die chemische Produktion bzw. Isolation von stereoisomeren Aminosäuren ist aufwändig und ziemlich kostspielig, sodass man, um stereochemisch reine Stoffe zu produzieren, auf die Fähigkeiten von hoch spezialisierten Mikroorganismen zurückgreift. Dieses biotechnologische Herstellungsverfahren hat auch deshalb große wirtschaftliche Bedeutung, weil die Lebensmittelindustrie die Produkte in großem Umfang als Nahrungsmittelzusätze verwendet.
MERKE
Einige der proteinogenen Aminosäuren müssen mit der Nahrung zugeführt werden.
2.1.3
Peptidbindung
Kovalente Verknüpfung von Aminosäuren

MERKE
Aminosäuren werden durch Kondensation von Amino- und Carboxylgruppen zu Peptiden verknüpft.
Schon gewusst
Stabilität von Peptidbindungen
Planare Struktur der Peptidbindung
MERKE
Aufgrund des partiellen Doppelbindungscharakters ist die Peptidbindung planar und starr.
Konformation
Klinik
Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase: ein Faltungshelfer mit Doppeljob. Neben seiner Funktion bei der Isomerisierung der Peptidbindung ist das Protein ein Moonlighter (engl. für eine Person mit mehren Arbeitsstellen) mit hoher medizinischer Relevanz: Das Molekül verfügt überraschenderweise auch über die biologische Funktion eines Cyclophilins. Es besitzt eine Bindungsstelle für Ciclosporine, das sind zyklische Oligopeptide, die aus Pilzen gewonnen werden. Im ciclosporingebundenen Zustand ist es an der Hemmung von T-Zell-vermittelten Immunantworten beteiligt (Kap. 26.8). Damit ist das Protein in seiner Rolle als Cyclophilin für die immunsuppressive Wirkung von Ciclosporin verantwortlich und spielt eine wesentliche Rolle in der Transplantationsmedizin.
MERKE
Die der Peptidbindung benachbarten Bindungen sind theoretisch frei drehbar, nehmen aber bestimmte Vorzugswinkel ein.
2.2
Aufbau von Proteinen
MERKE
Die Strukturhierarchie bei Proteinen gliedert sich in die Strukturebenen der Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur.
2.2.1
Primärstruktur
Blick ins Labor
Um die rapide anwachsenden Nucleinsäure- und Proteindatenbanken über spezifische Moleküle abfragen zu können, ist ein Computer mit Internetanschluss aus dem Labor nicht mehr fortzudenken. Zahlreiche Dienstleister im World Wide Web stellen Wissenschaftlern Unmengen von Datenmaterial über Sequenzen, Strukturen, Funktionen und Interaktionen von Biomolekülen zur Verfügung. Viele dieser Dienste sind für Studenten und akademische Forscher kostenfrei. Die moderne Disziplin der Bioinformatik sorgt dafür, dass Datenbanken und die hierfür erforderlichen Computerprogramme, mit denen man relevante Informationen zeitsparend extrahieren kann, ständig aktualisiert und weiterentwickelt werden. Jedes biochemische Projekt wird heutzutage zuerst virtuell oder auch in silico vorbereitet, bevor es in das reale Labor geht, in dem die in-vitro-Experimente durchgeführt werden. Neben vielen anderen Web-Services bietet das NCBI (National Center for Biotechnology Information) ein umfassendes Portal, das besonders für Einsteiger extrem nützlich ist (Literatur). Neben der sinnvollen Durchführung von Literaturrecherchen lassen sich DNA-, Proteinsequenzdatenbanken und Strukturdatenbanken effizient abfragen. Besonders hilfreich für Forschung und Klinik sind die Datenbanken, in denen alle wichtigen Aspekte von humanen genetischen Erkrankungen deponiert sind. Hier ist v.a. die Datenbank OMIM (Online Mendelian Inheritance of Man) erwähnenswert (Literatur). Neben den Sequenzdaten normaler und krankheitsauslösender Gene bzw. Proteine im Zusammenhang mit Erbkrankheiten findet man dort pathologische, diagnostische und therapeutische Informationen und umfangreiche Bibliographien.
Vergleich von Aminosäuresequenzen
Schon gewusst
Der Verwandtschaftsgrad zweier Aminosäuresequenzen in Prozent identischer Aminosäurepositionen lässt sich leicht angeben, sobald man die Sequenzen optimal aligniert hat. Hier verbirgt sich jedoch ein Problem: Es gibt Einfügungen bzw. Auslassungen von Aminosäuren in Sequenzen, die einen positionsgenauen binären Vergleich unmöglich machen. Nahtloses Alignieren wird erst möglich, indem man durch Einführung von Lücken Insertionen/Deletionen ausgleicht. Mit der ausschließlichen Beschränkung auf die invarianten Regionen zweier Sequenzen unterschätzt man den tatsächlichen Ähnlichkeitsgrad, weil konservierte Substitutionen die dreidimensionale Struktur und Funktionalität von Modulen praktisch kaum beeinflussen. Den Konservierungsgrad von Aminosäureaustauschen kann man mithilfe sog. Substitutionsmatrizen quantifizieren. Sie liefern ein genaueres Maß für die Sequenzverwandtschaft von Proteinen.
MERKE
Aminosäuresequenzvergleiche, also der Vergleich der Primärstrukturen von Proteinen, liefern wichtige Informationen über ihre Verwandtschaft und funktionelle Motive.
2.2.2
Stabilisierende Wechselwirkungen
Disulfidbrücken

Schon gewusst
Man kann Disulfidbrücken auch künstlich in Proteine einfügen. Im praktischen Leben macht man sich das bei der Fixierung von Dauerwellen zunutze: Hier werden die S–S-Brücken, die die Polypeptidstränge der Keratinproteine in den Haaren quervernetzen, durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel gespalten, sodass die freien Thiolgruppen der Cysteine entstehen. In diesem Zustand modelliert man die Haare in die gewünschte Frisur und leitet durch Zugabe eines Oxidationsmittels die erneute Disulfidbrückenbildung ein. Die Polypeptidketten werden vernetzt und in der neuen Orientierung stabilisiert. Es sind also kovalente Bindungen, die die Locken in Form halten.
Nichtkovalente Bindungen
Ionische Wechselwirkungen
Wasserstoffbrücken
Hydrophobe Wechselwirkungen
MERKE
Die dreidimensionale Struktur von Polypeptidketten wird durch kovalente sowie durch nichtkovalente Bindungen unterschiedlicher Stärke ausgeprägt.
2.2.3
Sekundärstrukturen
-Helix
-Strang und -Faltblatt
Schon gewusst
Es gibt Strukturproteine, die vorwiegend aus -Faltblättern aufgebaut sind. Ein Beispiel hierfür ist das Seidenfibroin des Seidenspinners (Bombyx mori), das das Hauptprotein der Seide darstellt. Abb. 2.17b zeigt den typischen Aufbau der antiparallelen Aminosäureseitenketten, die ein Faltblatt bilden. Die Faltblätter lagern sich schichtweise aneinander, wobei die Aminosäureseitenketten in den Ebenen eng aneinanderrücken (Abb. 2.17c). Der Abstand zwischen den C-Atomen in verschiedenen Ebenen beträgt 0,35–0,57 nm. Es bleibt kein Platz für große Aminosäurereste, sodass bevorzugt Wechselwirkungen kleiner, repetitiver Seitenketten auftreten. Der besondere Vorteil dieser atomaren Anordnung besteht in der geradezu unglaublichen mechanischen Stabilität, Zugfestigkeit und Elastizität dieses Gebildes: Würde man ein hinreichend ausgedehntes Netz aus Spinnenseidenfäden, die ebenfalls aus Seidenfibroin bestehen, von der Dicke eines Bleistifts ausbringen, so könnte man einen Jumbojet aus vollem Flug einfangen.
MERKE
Die häufigsten Sekundärstrukturelemente in Proteinen sind die -Helix und der die -Faltblätter ausbildende -Strang.
Sekundärstrukturelemente in spezialisierten Proteinen
Kollagenhelix
Keratinhelix
Schon gewusst
Neben den bisher genannten Polypeptidkonformationen gibt es noch weitere Strukturelemente (Tab. 2.5). Hierzu gehören helikale Formen wie die 310-Helix, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Rest n und n + 3 gekennzeichnet ist. Die Bezeichnung stammt von den drei Aminosäureresten pro Windung und zehn kovalenten Bindungen, die zwischen Wasserstoffbrückendonor und -akzeptor gelegen sind. Die 310-Helix ist somit etwas gestreckter als die klassische -Helix, die nach dieser Nomenklatur 3,613-Helix heißen müsste. Eine andere Variante ist die sog. -Helix, die etwas loser gewunden ist, da in ihr Wasserstoffbrücken zwischen den Aminosäuren n und n+5 bestehen. Diese Sekundärstrukturformen kommen in Proteinen nur selten vor.
2.2.4
Supersekundärstrukturen
-helikale Proteine
Spezielle helikale Motive
Coiled-coil-Strukturen – Leucin-Zipper
-Faltblatt-Proteine
--Proteine
Blick ins Labor
Oft ist es wünschenswert, bereits aus der Primärstruktur eines Polypeptids Aussagen über die höheren Strukturhierarchien ableiten zu können. Auf Strukturebene liefern computergestützte Rechenverfahren recht zuverlässige Ergebnisse. Es gibt verschiedene Strukturvorhersagemethoden, die auf der unterschiedlichen Neigung der Aminosäuren basieren, bestimmte Sekundärstrukturen einzunehmen. Bei diesen Verfahren wird also auf Erfahrungswerte zurückgegriffen, die u.a. auf einer riesigen Datenbasis aus bereits aufgeklärten dreidimensionalen Strukturen beruhen. Bei neueren (neuronalen Netzwerk-)Methoden werden unbekannte Polypeptide durch Sequenzvergleich (Abb. 2.22) möglichst eng verwandten Proteinen gegenübergestellt. Durch Minimierung des Fehlers wird dann die wahrscheinlichste Abfolge von Sekundärstrukturelementen bestimmt.
Spezielle Strukturmotive
Zinkfingermotiv
EF-Hand
MERKE
Die Sekundärstrukturelemente von Polypeptiden ordnen sich zu charakteristischen Strukturmotiven, die besondere Funktionalitäten ausbilden.
2.2.5
Tertiärstruktur
Moleküldarstellungen mit dem Computer
Blick ins Labor
Die große praktische Bedeutung der Molekülvisualisierungsverfahren kann man sich am Beispiel der Tertiärstruktur des Insulinmoleküls verdeutlichen. In Abb. 2.25 sind verschiedene graphische Darstellungsformen gezeigt, womit man völlig unterschiedliche Aspekte des Moleküls veranschaulichen kann: Die sog. topologische Darstellung zeigt den Verlauf der Polypeptidketten und liefert einen Überblick über die Tertiärstruktur. In ihr erkennt man die durch die Helix-, Faltblatt- und Schleifenregionen der Polypeptidketten repräsentierten Sekundärstrukturelemente (Abb. 2.25a). Detailliertere Informationen ergeben sich aus der Lage der Aminosäureseitenketten, die in der Strichdarstellung gezeichnet sind (Abb. 2.25b). Häufig ist aber gerade dieser Gehalt an Einzelheiten nicht erwünscht, weil er massiv auf Kosten der Übersichtlichkeit geht. Einen realistischen Eindruck von der Verteilung und dem wirklichen Platzbedarf der einzelnen Atome vermittelt das Kalottenmodell, bei dem die Größe der Kugeln den Van-der-Waals-Radien der Atome entspricht (Abb. 2.25c). Abb. 2.25d zeigt dagegen die Gestalt des Proteins aus der Sicht eines niedermolekularen Liganden, der mit dem Makromolekül wechselwirkt, also z.B. eine Bindung oder eine katalytische Umwandlungsreaktion eingeht. Dieses Bild lässt sich am einfachsten erstellen, indem man mithilfe von Computerprogrammen die Oberfläche des Zielproteins von einem Lösungsmittelmolekül (im biologischen System Wasser) als Oberflächensonde ertasten lässt. Verschiedene Farben machen die elektrostatische Ladungsverteilung auf der Proteinoberfläche sichtbar. Man nimmt hierbei an, dass die in das Lösungsmittel hineinragenden Aminosäureseitenketten dieselben pKa-Werte haben wie isolierte Aminosäuren in freier Lösung.
Schon gewusst
Neben dem Sequenzvergleich ist auch der Vergleich ihrer 3-D-Strukturen für ein tieferes Verständnis von Proteinen äußerst hilfreich. Strukturvergleiche sind insofern nützlich, weil strukturelle Verwandtschaftsverhältnisse auch noch nachweisbar sind, wenn die Proteine praktisch keine Sequenzähnlichkeit aufweisen. Eine systematische Einteilung der Proteine aufgrund ihrer Strukturverwandtschaft, z.B. bei Vorliegen bestimmter Strukturmotive, resultiert in sog. hierarchischen Klassifikationsschemata. Es handelt sich hierbei um Datenbanken, in denen Proteine nach ihren Verwandtschaftsgraden gruppiert, beschrieben und graphisch dargestellt werden. Natürlich sind diese Datenbanken im Internet abfragbar, die bekanntesten sind CATH (Class-Architecture-Topology-Homologous superfamily), PDB (engl. Protein Data Base) und SCOP (Structural Classification Of Proteins).
MERKE
Mit Computervisualisierungsmethoden kann man Modelle der dreidimensionalen Proteinstrukturen darstellen.
Proteindomänen
Faltungseinheiten von Polypeptiden
MERKE
Proteindomänen sind Polypeptideinheiten, die sich unabhängig von benachbarten Sequenzabschnitten in ihre Tertiärstruktur falten können.
Schon gewusst
Monofunktionelle und bifunktionelle Proteine. Verschiedene Domänen innerhalb einer singulären Polypeptidkette haben unterschiedliche Funktionen. Die Aufgabenverteilung einzelner Abschnitte geht so weit, dass selbst unterschiedliche chemische Reaktionen durch Faltungseinheiten von ein und derselben Polypeptidkette katalysiert werden können. Ein Beispiel für bifunktionelle Enzyme ist die Phosphofructo-Kinase-2/Fructose-2,6-Bisphosphatase-2 (PFK2/FBPase2), die zwei verschiedene Enzymaktivitäten auf den Domänen desselben Polypeptids beherbergt. Beide Reaktionen dienen zur Steuerung des zellulären Spiegels von Fructose-2,6-bisphosphat, einem Regulator der gegenläufigen Stoffwechselprozesse Glykolyse und Gluconeogenese (Kap. 5.2.2 und 5.2.4Kap. 5.2.2Kap. 5.2.4).
Modularer Aufbau
MERKE
Modulare Proteine bilden funktionelle Einheiten, die identische oder unterschiedliche Domänen in verschiedenen Kombinationen enthalten.
2.2.6
Quartärstruktur
Klinik
Ein medizinisch relevantes Enzym ist die Kreatinkinase (CK), die als Dimer aus den Isoformen Typ M (für muscle) und B (für brain) besteht. Die drei Isoenzyme CK-MM, CK-MB und CK-BB haben gleiche enzymatische Aktivität, unterscheiden sich aber durch ihre Hemmbarkeit mit Antikörpern, die gegen die M-Untereinheit gerichtet sind. Die Isoformenzusammensetzung von Enzymen ist diagnostisch wichtig, weil bei Gewebsdefekten Proteine in Körperflüssigkeiten übertreten. Ein wichtiges Beispiel ist der Myokardinfarkt, bei dem aus zugrunde gegangenen Herzmuskelzellen CK in das Blut freigesetzt werden. Hier ist die Quantifizierung der herzspezifischen Isoform CK-MB von großer Bedeutung. Der zeitliche Verlauf des Serumspiegels dieses Enzyms gibt wichtige Aufschlüsse über den Zeitpunkt des Infarkteintritts. Die Enzymaktivitäten können sogar schon gemessen werden, bevor Änderungen im Elektrokardiogramm sichtbar werden.
MERKE
Kombinationen mehrerer Untereinheiten oder verschiedener Proteine ermöglichen die funktionelle Bewältigung komplexer katalytischer Aktivitäten.
2.3
Posttranslationale Zustandsänderungen
2.3.1
Proteinmodifikationen
Translationale Modifikationen
Posttranslationale Modifikationen
Aminosäuremodifikationen
Lipidanker
Schon gewusst
Die Komplexität posttranslationaler Lipidmodifikationen sei am Beispiel des Signaltransduktionsproteins Ras beschrieben: Durch eine Farnesyl-Transferase wird zuerst der Farnesylrest mit seinen 15 Kohlenstoffatomen auf einen Cysteinrest übertragen. Letzterer stellt bei Ras die viertletzte Aminosäure des C-terminalen Endes dar (Abb. 2.12b). Als Donor dient Farnesyldiphosphat. Danach werden die drei C-terminalen Aminosäuren proteolytisch abgespalten, und eine Carboxymethyl-Transferase überträgt einen Methylrest auf die COOH-Gruppe (Abb. 2.29e), wobei als Substrat S-Adenosylmethionin verwendet wird. Beim sogenannten H-Ras wird in einer weiteren Reaktion Palmitinsäure auf zwei weitere, C-terminal gelegene Cysteinreste übertragen. Erst mit dieser letzten Modifikation kann Ras fest in der äußeren Membran verankert werden und seine intrazelluläre Signalfunktion übernehmen.
Acetylierungen
Phosphorylierungen
Klinik
Tyrosinreste können auch sulfatiert werden. Hierbei wird das aktivierte Sulfat aus Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat (PAPS) durch das im trans-Golgi-Apparat lokalisierte integrale Membranprotein Tyrosylproteinsulfo-Transferase übertragen. Diese Vorgänge spielen eine Rolle bei Protein-Protein-Wechselwirkungen beim intrazytoplasmatischen Transport oder bei Sekretionsprozessen. Es ist möglich, dass die Sulfatierung des Chemokincorezeptors CCR5 die Infektion einer Zelle durch das humane Immunschwächevirus (HIV) erleichtert.
Kohlenhydratmodifikationen
Klinik
Transferrin ist ein Glykoprotein, das für den Eisentransport zuständig ist. Bei chronischem Alkoholkonsum wird die für die Übertragung von Sialinsäureresten verantwortliche Glykosyltransferase gehemmt, sodass im Vergleich zur Hauptkomponente Tetrasialo-Transferrin nur noch CDT (carbodefizientes Transferrin) gebildet wird, bestehend aus Disialo-, Monosialo- und Asialo-Transferrin. CDT kann durch einen Immunoassay oder durch HPLC quantifiziert werden. Sein Anteil im Blut beträgt im Normalfall weniger als 3% des Gesamttransferrins. Männer mit einem täglichen Alkoholkonsum von mehr als 60 g über drei Wochen hinweg erreichen einen CDT-Anteil von bis zu 18%. Die Halbwertszeit für die CDT-Erhöhung liegt bei zwei Wochen, sodass der Wert nach plötzlicher Abstinenz nicht sofort absinkt.
Blick ins Labor
Neben den enzymatisch katalysierten Proteinmodifikationen gibt es auch solche, die durch spontane Reaktion mit Reaktanden entstehen, z.B. die Bindung von Glucose an Hämoglobin A (HbA 22). Die Anlagerung erfolgt über eine Zweistufenreaktion, bei der die Glucose zuerst mit der NH2-Gruppe des N-terminalen Valins der -Kette ein Aldimin ausbildet, das nachfolgend in ein Ketoamin umgelagert wird (Amadori-Umlagerung). Das Produkt, HbA1c, lässt sich durch IEF, durch Kationenaustauscherchromatographie oder mittels Immunoassay bestimmen. Der relative Anteil des glykierten Hämoglobins ist ein Maß für die im Zeitdurchschnitt im Blut vorliegende Glucosekonzentration. Der HbA1c-Wert ist quasi als Blutzuckergedächtnis anzusehen, das die mittlere Glucosekonzentration der vergangenen vier bis sechs Wochen wiedergibt, weil das unmodifizierte Hämoglobin aufgrund der Erythrozytenlebensdauer ständig regeneriert wird. Insofern ist die Messung von HbA1c ein wertvoller Parameter für die Beurteilung der Blutzuckerlage bei der Langzeitbeobachtung von Patienten mit Diabetes mellitus.
Klinik
Eine wichtige Folge der nichtenzymatischen Glykierung ist die Vernetzung von Kollagenmolekülen in den subendothelialen Schichten von Blutgefäßen bei chronischer Hyperglykämie. Die hierdurch erheblich verminderte Elastizität der Gefäßwände ist eine der maßgeblichen Ursachen von diabetischen Mikro- und Makroangiopathien.
MERKE
Durch kovalente Modifikationen an proteingebundenen Aminosäuren werden zusätzliche Funktionalitäten der Proteine erzeugt. Hierdurch erweitert sich die Proteinvielfalt erheblich über das im Genom vorhandene Potenzial hinaus.
2.3.2
Faltung von Proteinen
Blick ins Labor
In vitro lassen sich Proteine am besten ausgehend vom vollständig denaturierten Zustand studieren. Völlige Entfaltung erreicht man durch Behandlung mit Denaturierungsmitteln wie 8 mol L–1 Harnstoff oder 6 mol L–1 Guanidiniumhydrochlorid. Damit kann man Polypeptide in eine Zufallsknäuelstruktur überführen und sie dabei trotzdem in Lösung halten. Wird das denaturierende Agens unter oxidierenden Bedingungen durch Verdünnung oder Dialyse abgetrennt, bildet sich die native Struktur zurück. Mit diesen Rückfaltungsexperimenten konnte demonstriert werden, dass allein die Aminosäuresequenz die dreidimensionale Struktur von Proteinen festlegt.
Energetische Aspekte der Faltung
Schon gewusst
Stellt man sich vor, dass ein Modellprotein aus nur 100 Aminosäuren besteht und jeder Rest nur zwei verschiedene Positionen einnehmen kann, so gibt es für die Polypeptidkette 2100 bzw. 1030 verschiedene Konformationen (der wirkliche Wert wird noch viel höher liegen!). Bei einer Verweildauer von nur 1 ps (1 Pikosekunde 10–12 s) pro Konformationszustand bräuchte das Protein 1030 10–12 s (1018 s 32 Mrd. Jahre), wenn es alle zur Verfügung stehenden Möglichkeiten austesten würde. Ein solcher Zeitraum übersteigt sogar das Alter des Universums. Diese Rechnung spiegelt das sog. Levinthal-Paradox wider, benannt nach dem amerikanischen Biologen Cyrus Levinthal. Es beinhaltet, dass die Natur offenbar wesentlich schnellere Wege der Proteinfaltung gefunden hat.
MERKE
Die Ausbildung der energetisch günstigsten Proteinkonformation (Proteinfaltung) erfolgt durch Bildung von Faltungsintermediaten mit schrittweise absinkendem Energiegehalt.
Faltungshelferproteine
MERKE
Faltungshelferproteine erleichtern die Faltung eines neu synthetisierten oder denaturierten Proteins und vermindern die zelluläre Konzentration von unvollständig gefalteten, falsch gefalteten oder ungefalteten Proteinen.
Proteinfehlfaltungskrankheiten
Klinik
Ein ganz anderer Fall von Fehlfaltung liegt bei der Sichelzellanämie vor. Bei dieser Erkrankung ist der tetramere Blutfarbstoff Hämoglobin betroffen (Abb. 2.10, Quartärstruktur des adulten Hämoglobins: 22). Hier führt eine Punktmutation auf Position 6 der -Untereinheit von Glutaminsäure nach Valin zu dramatischen Konsequenzen. Das Produkt wird als Sichelzellhämoglobin (HbS) bezeichnet. Die Punktmutation erzeugt einen hydrophoben Bereich auf der Oberfläche des Proteins. Die hierdurch entstehende Strukturvorwölbung passt genau in eine komplementäre hydrophobe Tasche an einer anderen Stelle des HbS, sofern das mutierte Hämoglobin in der desoxygenierten Form vorliegt. Es bilden sich langkettige Polymere von HbS aus, die man sogar elektronenmikroskopisch als Fibrillen erkennen kann. Bei homozygoten Genträgern entsteht die tödliche Sichelzellanämie, weil die langen Fasern des polymerisierten funktionell inaktiven HbS im desoxygenierten Zustand die Erythrozyten versteifen und ihnen so eine sichelförmige Morphologie aufzwingen. Bei heterozygoten Trägern liegt aber nur etwa die Hälfte der -Untereinheiten verändert vor, und die Sichelzellbildung ist weniger ausgeprägt. Interessanterweise sind die Träger resistent gegen die Infektion mit der Tropenkrankheit Malaria. Der Malariaparasit Plasmodium falciparum, der seinen Lebenszyklus teilweise im Erythrozyten verbringt, säuert das Zellinnere leicht an, was die Sichelzellumwandlung erleichtert. Sind aber erst einmal Sichelzellen gebildet, erhöht sich durch die Schädigung der Zytoplasmamembranen die Permeabilität für K+-Ionen, die vermehrt aus den Erythrozyten austreten. Dieser Verlust an intrazellulärem K+ ist dafür verantwortlich, dass die Parasiten absterben.
MERKE
Fehlgefaltete Proteine können leicht aggregieren und fatale Krankheitszustände auslösen.
2.3.3
Membranproteine
Struktur von Membranproteinen
Periphere Membranproteine
Integrale Membranproteine
Klinik
Membranproteine haben als potenzielle Angriffspunkte für Medikamente eine erhebliche Bedeutung in der Medizin. Großes Interesse an detaillierten Strukturen besteht bei der molekularen Erforschung von Krankheitsprozessen, aber auch bei der Target-Suche für die Entwicklung neuer Pharmaka, die an strukturell und funktionell wichtige Bindungsstellen andocken und dadurch die Zielproteine agonistisch oder antagonistisch beeinflussen können. Besondere Bedeutung als molekulare Zielstrukturen haben die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR von G protein-coupled receptors), die als integrale Membranproteine mit sieben mutmaßlich membrandurchspannenden Regionen eine dem Rhodopsin (Abb. 2.34) ähnelnde Architektur aufweisen und in zellulären Signaltransduktionsketten vorkommen. Rhodopsin ist der erste GPCR, dessen dreidimensionale Struktur mit hoher Auflösung erforscht worden ist. Diese wird als Leitstruktur für die Modellierung pharmakologisch relevanter GPCR genutzt, zumal mit dem Liganden Retinal eine mögliche Bindestelle für potenzielle Pharmaka modellierbar ist. Ein weiterer prominenter Vertreter dieser vielfältigen Gruppe von Molekülen ist beispielsweise der -adrenerge Rezeptor, der für die Bindung des Hormons Adrenalin und die molekulare Auslösung seiner Wirkungen verantwortlich ist.
Blick ins Labor
Um erste Informationen über die Struktur von Membranproteinen zu erhalten, kann man anhand der Aminosäuresequenz das Hydrophobieprofil berechnen und damit membrandurchspannende Regionen aufspüren. Dies ist in Abb. 2.35 für Rhodopsin gezeigt. Für jeweilige Fenster von 19 benachbarten Aminosäuren wird, zusammengefasst aus den Hydrophobiewerten der einzelnen Reste (Tab. 2.1), ein Hydropathieindex berechnet, der über die Sequenzposition aufgetragen wird. In grober Näherung ergeben sich aus dem gesamten Sequenzprofil Maxima des Hydropathieindex, aus dem man Hinweise auf mögliche Transmembranregionen erhalten kann. Das Vorkommen von mehreren Maxima im Hydropathiediagramm weist auf die Existenz von sieben transmembranären Regionen hin und wird durch die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur bestätigt. Streng genommen gilt diese Überlegung aber nur für -helikale Proteine, weil Proteine mit überwiegender -Faltblatt-Struktur im Hydropathiediagramm völlig unauffällig sind. Ein Beispiel hierfür ist das tief in die äußere Membran von E. coli eingebettete Porin. Es würde mit der Hydropathieanalyse allein nicht als Membranprotein zu erkennen sein.
MERKE
Membranproteine sind, bedingt durch ihre Verankerung in der Lipidphase, komplizierter aufgebaut als lösliche Proteine. Sie haben vielfältige Aufgaben, u.a. in der Signaltransduktion, im Stofftransport und in der Energiewandlung.
2.4
Biologischer Abbau von Proteinen
Proteasen des Verdauungstrakts
Schon gewusst
Ganz andere Funktionen als der Nahrungsmittelaufschluss hat der intra- und extrazelluläre Abbau von Proteinen. Es handeltsich hierbei um einen lebenswichtigen Prozess, der dazu dient, die Anpassung an wechselnde Situationen zu ermöglichen, indem überschüssige, nicht mehr benötigte und fehlgefaltete Proteine entsorgt werden. In den meisten Zellen sind dafür Lysosomen zuständig, die viele Proteasen enthalten. Diese sind mit dem Abbau bestimmter Proteinsubstrate befasst. Typische Vertreter lysosomaler Proteasen (oder Cathepsine) sind die Enzyme Elastase und Kollagenase, die Strukturproteine hydrolysieren. Die Alterung der Haut (Runzeln und Falten) ist mit einer erhöhten Aktivität der Kollagenasen verbunden. Diese werden durch Ultraviolettstrahlung aktiviert. Eine gesunde Hautbräunung führt also unaufhaltsam zu schnellerer Alterung der Haut.
Proteasomen
MERKE
Proteine werden durch proteolytische Enzyme aus der Zelle eliminiert. Das Proteasom ist eine makromolekulare Degradationsmaschine, die ubiquitinylierte Substratproteine abbaut.
2.5
Isolierung und Charakterisierung von Proteinen
Synthetische Herstellung von Proteinen
Klinik
Man setzt synthetische Peptide in der Forschung für die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften von Enzymen oder Signaltransduktionsproteinen ein, wobei sie z.B. als Substrate oder Inhibitoren dienen. Um Anti-Peptid-Antikörper herzustellen, koppelt man sie als künstliche Epitope an immunogene Makromoleküle. Darüber hinaus sind Peptide als pharmakologische Effektoren wichtig. So stimulieren Erythropoetin(EPO-)Derivate die Blutbildung. Nach erfolgter Chemotherapie oder nach Knochenmarktransplantationen unterstützen EPO, Wachstumsfaktoren und Interleukin-3 die Myelopoese. Das synthetische Peptid Interferon- hat antineoplastische und antivirale Wirkung und wird deswegen in der Behandlung der chronischen Hepatitis C genutzt.
Isolation subzellulärer Fragmente durch differenzielle Zentrifugation
Blick ins Labor
Man erzeugt Dichtegradienten, indem man zwei Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte in kontinuierlich verändertem Mischungsverhältnis in Zentrifugenröhrchen übereinanderschichtet, sodass die Flüssigkeitsdichte einen stetig verlaufenden Gradienten bekommt ( 1–1,4 g cm–3). Dazu verwendet man z.B. verschieden konzentrierte wässrige Lösungen von Saccharose, Glycerin oder geeigneten Makromolekülen. Die Probe wird als dünne Schicht oben aufgetragen. Im Zentrifugalfeld werden die Partikel beschleunigt und so lange transportiert, bis das Probenmaterial im Gradientenmedium eine Dichtezone erreicht hat, die der Partikeleigendichte entspricht (Schwebedichte). Es kommt so zur Auftrennung der verschiedenen subzellulären Fragmente entsprechend den unterschiedlichen Dichten. Durch vorsichtiges Anstechen des Gradientenröhrchens und Abpumpen der einzelnen Dichtefraktionen kann man die gereinigten subzellulären Partikel isolieren.
Chromatographische Trennverfahren
Gelfiltrationschromatographie
Ionenaustauschchromatographie
Blick ins Labor
Außer geladenen (hydrophilen) Gruppen haben Proteine auf ihren Oberflächen unterschiedliche Anordnungen von wasserabstoßenden Regionen. Auch diese stoffliche Eigenschaft kann zur Trennung herangezogen werden. Dabei werden Proteine je nach Grad ihrer Oberflächenhydrophobie an ein wasserabstoßendes Säulenmaterial mehr oder weniger stark gebunden und selektiv ausgewaschen. Man nennt dieses Verfahren hydrophobe Interaktionschromatographie. Die hiermit eng verwandte Umkehrphasenchromatographie (reversed phase) wird vornehmlich für die Trennung von Peptiden oder niedermolekularen Stoffgemischen verwendet (Kap. 2.1.2, Abb. 2.7).
Affinitätschromatographie
Schon gewusst
Falls die zu separierenden Proteine keine Affinität zu natürlichen oder leicht handhabbaren Liganden besitzen, kann man ihnen durch gentechnische Manipulation (Proteindesign) (Kap. 15) spezifische Bindungseigenschaften einfügen. Man heftet in der DNA-Sequenz sog. Tags an den N- oder C-Terminus des Proteins. Die zusätzliche DNA-Sequenz kodiert für eine Abfolge von Aminosäuren, die aufgrund ihrer Sequenz bestimmte Erkennungseigenschaften aufweisen. So bindet z.B. das aus zwölf Aminosäuren bestehende Strep-Tag an immobilisiertes Streptavidin (Kap. 4). Eine andere Form angehängter Erkennungssequenzen stellt das Oligohistidin-Tag dar: Kurze Ketten von sechs bis acht Histidinresten haben die Eigenschaft, Übergangsmetallionen zu komplexieren (Kap. 2.2) Wenn die Übergangsmetalle (Ni2+, Cu2+, Zn2+) an einem Säulenmaterial immobilisiert sind, kann eine chromatographische Trennung aufgrund der Bindungsaffinitäten erfolgen. So ist es möglich, die oligohistidinmarkierten Proteine aus komplexen Gemischen herauszufischen. Die Elution erfolgt in diesem Fall durch Auswaschen mit Lösungen der Aminosäure Histidin oder Imidazol (entspricht der Seitenkette von Histidin, Tab. 2.1).
Solubilisierung von Membranproteinen
Quantitativer Proteinnachweis
Proteintrennung im elektrischen Feld
Blick ins Labor
In der nativen Elektrophorese, bei der die unbehandelten Proteine in natürlicher, strukturell und funktionell intakter Form untersucht werden, separiert man die Proteine nach Ladung und Molekülmasse (entspricht in grober Näherung der Größe eines Proteins). Nach diesen Kriterien sollte im Idealfall jedes Protein an einer individuellen Position im Gel auftauchen. Beispielsweise gelingt es mit dieser Methode, Isoenzyme (z.B. der Lactat-Dehydrogenase, Abb. 2.28) aufgrund ihrer geringen Ladungsunterschiede nachzuweisen und ihre verschiedenen Anteile zu quantifizieren. Neben der Reinheitsabschätzung kann man mit diesem Verfahren nach abgeschlossener Trennung u.a. auch die enzymatische Aktivität der im Gel aufgetrennten Proteine testen. Zum spezifischen Enzymnachweis werden teilweise dieselben Methoden wie in der Histochemie angewendet. Man versucht also, enzymatisch aktive Proteinflecken zu lokalisieren. Dazu wird das Gel nach dem Lauf in einer Substratlösung inkubiert und der enzymatische Umsatz in situ durch Farb- oder Fällungsreaktionen sichtbar gemacht.
Blick ins Labor
Eine andere Methode der elektrophoretischen Proteintrennung beruht auf den unterschiedlichen isoelektrischen Punkten der Proteine. Der IEP von Proteinen ( Polyaminosäuren) ist analog zu dem der Aminosäuren definiert. Allerdings kann man diese Größe nicht einfach aus der Aminosäurezusammensetzung berechnen, da sich im gefalteten Protein elektrische Ladungen von Seitenketten gegenseitig beeinflussen. Bei der isoelektrischen Fokussierung (IEF) wandern die Proteine entweder im nativen oder durch 8 mol L–1 Harnstoff entfalteten Zustand in einem durch das Gel stabilisierten pH-Gradienten, bis sie am isoelektrischen Punkt (Nettoladung 0) liegen bleiben. Aufgrund geringer Unterschiede des IEP von verschiedenen Hämoglobinvarianten (unterschiedliche Isoformen sowie mutierte Versionen) kann man mithilfe der IEF Polymorphismen des Blutfarbstoffs anhand des spezifischen Bandenmusters diagnostizieren. Außerdem kann man glykiertes Hämoglobin nachweisen, das in erhöhter Konzentration im Blut von Diabetikern vorkommt (Kap. 2.3.1). Durch Kombination von IEF mit denaturierender Elektrophorese (zweidimensionale Gelelektrophorese, Abb. 2.41d) erzielt man hochaufgelöste Trennungen komplexer Gemische. Dies ist bei der Analyse von zellulären Proteinexpressionsmustern wichtig.
Spezifische Proteinnachweise
Blick ins Labor
Von großer Bedeutung für die moderne Analytik ist die Massenspektrometrie. Durch die MALDI-Massenspektrometrie (matrix-assisted laser desorption ionization, Abb. 2.43) werden Molekülmassen von Ionen anhand ihrer Flugdauer im Hochvakuum bestimmt. Dabei werden die in eine Matrix eingebetteten Proteine durch Laserbestrahlung schonend ionisiert, in die Gasphase befördert und im Hochspannungsfeld beschleunigt. Die Flugzeit bis zum Erreichen des Detektors ist ein Maß für das Masse-Ladungs-Verhältnis des fraglichen Proteins. Ebenfalls auf sanfter Ionisation beruht die ESI-Massenspektrometrie (Elektrosprayionisation), mit der man sogar massenspektrometrische Peptidsequenzierungen vornehmen kann.
Analyse des Proteoms
Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen
Strukturaufklärung von 2-D- und 3-D-Kristallen
Blick ins Labor
Dampfdiffusion In der geschlossenen und abgedichteten Probenkammer (Abb. 2.44a) stehen das proteinhaltige Probentröpfchen (oben) und das Reservoir (unten) über die Gasphase in Verbindung miteinander. Das Reservoir enthält eine hochkonzentrierte Fällungsmittellösung, die aufgrund ihres chemischen Potenzials Wasser aus der oberhalb des Reservoirs befindlichen Gasphase aufnimmt. Das Probentröpfchen hat eine niedriger konzentrierte Fällungsmittellösung, die ständig Wasser in die Gasphase abgibt. Es folgt eine stetige Volumenabnahme des Probentröpfchens, und das hierin gelöste Protein wird langsam aufkonzentriert, bis sich geordnete dreidimensionale Kristalle ausbilden.
Strukturaufklärung Dreidimensionale Strukturinformation auf atomarer Ebene erhält man durch Röntgenanalyse der Kristalle unter Einsatz des in Abb. 2.44c schematisch dargestellten Aufbaus. Die Röntgenstrahlen wechselwirken mit den Elektronenhüllen der regelmäßig angeordneten Probenatome. Die Überlagerung der an den Atomen gestreuten Strahlen ergibt je nach Raumrichtung eine Verstärkung oder Auslöschung des Signals. Die resultierenden Beugungsmuster (Abb. 2.44d) werden mit Detektoren aufgefangen. In den Intensitäten der abgebildeten Reflexe ist bereits die Strukturinformation enthalten. Diese Strukturfaktoren werden unter Einbeziehung sog. Phaseninformation computergestützt in eine Elektronendichtekarte umgerechnet, in die man iterativ ein Modell der zu bestimmenden Struktur einpasst.
Kernresonanzspektroskopie
Blick ins Labor
Es wäre wünschenswert, wenn man aus der Primärstruktur direkt die Raumstruktur des Makromoleküls ablesen könnte. Die Raumstrukturen von sequenzähnlichen Proteinen sind je nach Verwandtschaftsgrad weitgehend identisch, sodass man aus dem Aminosäuresequenzvergleich auch viel über Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen sowie über die Funktionen unbekannter Proteine lernen kann. Gegenwärtige Computerverfahren zur Strukturberechnung bauen auf der bekannten dreidimensionalen Struktur (Tertiärstrukturvorhersage) eines engen Verwandten des fraglichen Proteins auf (Homology-Modelling). Bei ausreichend hoher Sequenzähnlichkeit kann die dreidimensionale Struktur des Zielproteins aus den Raumkoordinaten der Atome berechnet werden.
MERKE
Die Herstellung, Reinigung und Analytik von Proteinen sind für die Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie von immenser Bedeutung.
Zusammenfassung
Aminosäuren
Peptidbindung
Proteinstruktur
Faltung
Abbau
Isolation und Charakterisierung
Fragen
1.
Wieso gehört Glycin nicht zu den optisch aktiven Aminosäuren?
2.
Unter welchen Bedingungen klassifiziert man Aminosäuren in sauer bzw. basisch? Welche Aminosäuren dieser Art kennen Sie?
3.
Warum ist die Peptidbindung so stabil?
4.
Die Aminosäureabfolge von Proteinen kann man durch Edman-Abbau bestimmen. Gibt es alternative Verfahren, Proteinsequenzen zu ermitteln?
5.
Warum werden die -Helix als kondensierte und der -Strang als ausgedehnte Sekundärstruktur angesehen?
6.
Wodurch ist die Stabilität von Proteinen begründet?
7.
Worin besteht der Vorteil der modularen Zusammensetzung von Multidomänenproteinen? [Domänen. Kopienzahl. Proteinfunktionen]
8.
Sie sollen einen diagnostischen Test entwickeln, mit dem Sie HbS von HbA trennen können. Welche instrumentellen Techniken bieten sich hierfür an? Begründen Sie Ihre Entscheidung. Denken Sie an Interaktion mit chromatographischen Trennmaterialien und das Verhalten von Proteinen im elektrischen Feld.
9.
Wie können Sie Proteinbanden voneinander trennen, die auf einem SDS-Elektrophoresegel comigrieren?
10.
Wie kann man bestimmen, ob ein Protein Disulfidbrücken hat?
11.
Woran liegt es, dass Proteine, die aus einem extrem hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren bestehen, trotzdem wasserlöslich sind?
12.
Was besagt das Vorkommen invarianter Regionen in Proteinen?
13.
Durch welche Faktoren ist die Hydrophobie von Membranproteinen bedingt?
14.
Was sind konservative Substitutionen in Proteinen? Benennen Sie Beispiele hierfür.
15.
Sie sollen einen Proteinmarker finden, der sich für die Diagnose einer neu entdeckten Stoffwechselkrankheit eignet. Wie gehen Sie experimentell vor?
16.
Fehlgefaltete Proteine werden in der Zelle normalerweise rückgefaltet oder proteolytisch abgebaut. Warum greifen diese Strategien nicht beim Prionprotein?
