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B978-3-437-43690-1.10012-9

10.1016/B978-3-437-43690-1.10012-9

978-3-437-43690-1

Transkriptionsinitiation und RNA-Ketten-Verlängerung.

a) Die Transkription findet in der sog. Transkriptionsblase statt. Superspiralisierte DNA wird vor der Transkriptionsblase entwunden, aufgeschmolzen und von der RNA-Polymerase transkribiert. Nachdem eine DNA-Region abgelesen wurde, findet eine erneute Verdrillung der DNA statt.

b) Bei der RNA-Ketten-Verlängerung reagiert die 3'-Hydroxyl-Gruppe des zuletzt eingebauten Nucleotids mit der -Phosphat-Gruppe des nächsten Nucleosidtriphosphats und bildet eine Esterbindung. R 5'-Ende des RNA-Strangs.

Die Untereinheiten von RNA-Polymerasen. Links sind die Untereinheiten der RNA-Polymerase von E. coli gezeigt. Zusätzlich zu den -, -, '- und -ähnlichen Untereinheiten (Core-Enzym) enthalten die drei eukaryontischen RNA-Polymerasen (RNAP I, RNAP II und RNAP III) noch eine Reihe weiterer, z.T. untereinander identischer Untereinheiten.

Promotorerkennung durch die E.-coli-RNA-Polymerase. Die Sigma-Untereinheit (70) erkennt die konservierten –10- und –35-Elemente und ist dadurch für die Anlagerung des RNA-Polymerase-Holoenzyms an den Promotor verantwortlich.

Aufbau und Regulation des lac-Operons von E. coli.

a) Schematische Darstellung des lac-Operons. Die drei Gene des lac-Operons (-Galaktosidase, Lactose-Permease und Transacetylase) werden von einem gemeinsamen Promotor abgelesen. Zwischen Promotor und -Galaktosidase-Gen liegt der Operator, der als Bindungsstelle für den lac-Repressor dient. Die Bindung von Lactose an den lac-Repressor führt zu einer Konformationsänderung des Repressorproteins und dessen Ablösung vom Operator.

b) Drei Aktivitätsstufen des lac-Operons. Das gebundene lac-Repressorprotein verhindert die Transkription (1). Nach Ablösen des Repressors durch den Induktor kann die RNA-Polymerase die Gene des lac-Operons ablesen (2). Die Effizienz der Promotorerkennung wird durch das cAMP-CAP-Protein noch deutlich erhöht (3).

Poly- und monocistronische mRNA. Bei polycistronischer mRNA liegen die kodierenden Bereiche für mehrere Proteine hintereinander auf einem langen mRNA-Molekül. Ribosomen können unterschiedliche Startstellen vor jedem proteinkodierenden Bereich erkennen und somit die Proteine getrennt ablesen. Polycistronische mRNA findet man häufig bei Bakterien. Monocistronische mRNA enthält nur die Information für ein einziges Protein und ist typisch für Eukaryonten.

Promotoren, die von der RNA-Polymerase II erkannt werden.

a) Die drei häufigsten basalen Promotortypen eukaryontischer Gene. Häufig findet man sowohl die TATA-Box (1) als auch das Initiatorelement (INR, 2) im gleichen Promotor. Die Pfeile zeigen Startstellen der Transkription. Unterschiedlich hohe Pfeile (3) deuten an, dass unterschiedliche Startstellen mit unterschiedlicher Effizienz genutzt werden.

b) Schematische Struktur eines genspezifischen Promotors. Kurze Konsensusmotive (Module) liegen in unmittelbarer Nachbarschaft des basalen Promotors. Die exemplarisch dargestellten Module stellen Bindungsstellen für Oktamer-Transkriptionsfaktoren, CCAT-Box-Transkriptionsfaktoren sowie Sp1 dar (von links nach rechts). Unterschiedliche genspezifische Promotoren enthalten in Anzahl und Sequenz verschiedene derartige Module.

Schematischer Aufbau und Funktionsweise von Enhancer-Elementen.

a) Enhancer enthalten ebenfalls Konsensussequenzen, die denen in den genspezifischen Promotoren entsprechen (Abb. 12.6). Diese Module sind als farbige Symbole in der Abbildung angedeutet. Enhancer können orientierungsunabhängig (Pfeile) stromaufwärts des Promotors (1), stromabwärts des Promotors (2) oder auch in einem Intron in der transkribierten Region (3) lokalisiert sein.

b) Mechanismus der Enhancer-Wirkung. Durch Interaktion der an den Enhancer gebundenen Transkriptionsfaktoren (nicht gezeigt) mit an den Promotor gebundenen Transkriptionsfaktoren kommen beide Elemente in unmittelbare räumliche Nachbarschaft. Die dazwischen liegenden DNA-Bereiche werden als Schleife ausgestülpt.

Schematische Darstellung des Initiationskomplexes am basalen Promotor. Die Promotor-DNA ist als Helix gezeichnet, die durch die Bindung von TFIID abgeknickt wird. Die Startstelle der Transkription ist als Pfeil markiert. Die weiteren Komponenten – TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, RNA-Polymerase – können entweder sukzessive an den Promotor angelagert werden oder in einem einzigen Schritt an den Promotor binden.

Domänenstruktur von Transkriptionsfaktoren. Transkriptionsfaktoren enthalten neben einer DNA-bindenden Domäne (DBD) noch mindestens eine weitere Domäne, die transkriptionsregulierende Domäne (entweder Transaktivierungsdomäne [TAD] oder Transrepressordomäne [TRD]), die für die Regulation der Transkription entscheidend ist.

Helix-Turn-Helix Motiv und Homöodomne.

a) Schematische Darstellung der DNA-Erkennung durch ein Helix-Turn-Helix-(HTH-)Motiv. Die N-terminale Helix (rot) positioniert die C-terminale Erkennungshelix (blau) und stabilisiert somit die Gesamtstruktur. Die Erkennungshelix liegt in der großen Furche der DNA. Der Turn ist ebenfalls rot dargestellt.

b) Schematische Darstellung einer Homöodomäne. Vor dem HTH-Motiv (N-terminal) liegt eine weitere -Helix (orange). Die Erkennungshelix wird hier durch die beiden anderen -helikalen Bereiche stabilisiert.

c) Struktur der an die große Furche der DNA gebundenen Homöodomäne des Antennapedia-Transkriptionsfaktors, eines wichtigen Regulators der Embryonalentwicklung von Drosophila.

Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne vom C2H2-Typ.

a) Zweidimensionale Struktur der Zinkfingerdomäne. Das Zinkatom wird von den beiden Cysteinresten (C) und den beiden Histidinresten (H) gebunden. Weitere konservierte Aminosäuren sind im Einbuchstabencode gezeigt.

b) Dreidimensionale Darstellung einer Zinkfingerdomäne und deren Interaktion mit der großen Furche der DNA.

c) Zwei- bzw. dreidimensionale Darstellung eines Ausschnitts eines Zinkfingerproteins mit drei Tandem-Zinkfingerdomänen. Wie der rechte Teil der Abbildung zeigt, interagieren die -helikalen Bereiche der drei Zinkfingerdomänen mit aufeinanderfolgenden Abschnitten der DNA jeweils in der großen Furche.

Konservierte Struktur der nucleären Rezeptoren.

a) Die Grundstruktur der nucleären Rezeptoren ist hochkonserviert. Am aminoterminalen Ende findet sich meist eine Transaktivierungsdomäne (TAD1) unterschiedlicher Länge. Die DNA-Bindungsdomäne (DBD) enthält jeweils zwei aufeinanderfolgende Zinkfinger vom C4-Typ. In der carboxyterminalen Domäne befinden sich die Ligandenbindungsdomäne sowie eine weitere Transaktivierungsdomäne (TAD2).

b) Die nucleären Rezeptoren lassen sich in unterschiedliche Klassen einteilen. Die Steroidhormonrezeptoren binden alle als Homodimere an DNA, während die anderen Rezeptoren jeweils als Heterodimer binden. Der häufigste Dimerisierungspartner ist der Retinsäure-X-Rezeptor (RXR). Ob Eicosanoide die wirklichen hochaffinen und spezifischen Liganden der PPAR-Familie darstellen, ist nicht klar. Besondere Bedeutung haben diese Rezeptoren (v.a. der im Fettgewebe exprimierte PPAR), weil er durch synthetische Substanzen (Glitazone) aktiviert wird, die beim Typ-2-Diabetes eingesetzt werden. COUP-TF wurde zwar zunächst beim Hühnchen gefunden, er ist aber auch beim Menschen wichtig.

DNA-Bindung von Steroidhormonrezeptoren.

a) Die zweidimensionale Struktur der beiden Zinkfinger vom C4-Typ ist schematisch gezeigt. Die vier Cysteinreste binden jeweils ein Zn-Ion. Obwohl die prinzipielle Struktur der beiden Finger gleich ist, besitzen die beiden Zinkfinger unterschiedliche Funktionen (DNA-Bindung/Dimerisierung).

b) Bindungsstellen für nucleäre Rezeptoren sind häufig als Palindrom, als invertierte Wiederholung (wie gezeigt) oder als direkte Wiederholung angeordnet. Sowohl die Sequenz als auch der Abstand der jeweiligen Bindungshalbstellen unterscheiden sich bei den verschiedenen Hormonrezeptoren (X beliebige Nucleotide).

Struktur der Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktoren.

a) Schematische Darstellung der Interaktion einer dimeren bLZip-Domäne mit der DNA.

b) Schematische Darstellung des AP-1-Transkriptionsfaktors, der aus den parallel angeordneten c-Fos- und c-Jun-Proteinen besteht. Auch hier ist die Leucin-Zipper-Domäne hervorgehoben, die an der Dimerisierung beteiligten Leucinreste (L) sind dargestellt. Die Transaktivierungsdomänen findet man im N-terminalen Bereich dieser Proteine. Bei dieser Ansicht schaut man direkt auf die DNA-Doppelhelix, die deshalb als Kreis dargestellt ist.

c) Interaktion der DNA-Bindungsdomäne eines Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktors mit der DNA. Nur der -helikale Bereich der Leucin-Zipper-Proteine ist dargestellt.

Struktur der Helix-Loop-Helix-Faktoren. Die Wechselwirkung der bHLH-Domäne mit der DNA ist schematisch gezeigt. Die Loop-Region, die die beiden -Helices verbindet, ist gekennzeichnet.

Prinzip der kombinatorischen Regulation. Viele Transkriptionsfaktoren sind Dimere, die nicht nur als Homodimere an den entsprechenden Bindungsstellen binden (obere Reihe), sondern als Heterodimere die entsprechenden Kombinationen von Bindungshalbstellen erkennen können (untere Reihe). Es wird unmittelbar deutlich, dass sich bei Hinzunahme weiterer Dimerisierungspartner die Komplexität fast beliebig erweitern lässt. Die DNA-Motive sind durch kleine Buchstaben (a, b, c), die entsprechenden DNA-bindenden Proteine durch Großbuchstaben (A, B, C) gekennzeichnet.

Der ribosomale RNA-Genlocus.

a) Viele Kopien der rRNA-kodierenden Gene sind als Tandem hintereinander angeordnet, und sie werden durch intergenische Sequenzen (IGS) getrennt. In diesen intergenischen Sequenzen befinden sich die regulatorischen Elemente für die Transkription. Im unteren Bereich der Abbildung sind die Kontrollregionen für die Transkription der rDNA dargestellt.

b) Elektronenmikroskopische Darstellung der ribosomalen RNA-Synthese an den repetitiven (wiederholten) rRNA-Genen. Die transkribierte Region ist durch die christbaumähnliche Erscheinung gekennzeichnet. Die Transkriptionsrichtung der RNA-Polymerase I erkennt man an den länger werdenden, zur Seite abstehenden Zweigen des Baums.

Regulatorische Elemente bei der Transkription durch RNA-Polymerase III.

Serumabhängige Regulation des c-Fos-Gens. Die beiden Transkriptionsfaktoren SRF (serum response factor) und p62TCF (p62/TCF) sind auch im unstimulierten Zustand an ein Kontrollelement (SRE, serum response element) am c-fos-Promotor gebunden. Nach Serumstimulation wird p62TCF phosphoryliert und dadurch aktiviert.

Aktivierung cAMP-abhängiger Gene durch Phosphorylierung von CREB. Die Bindung des Liganden (1) führt zum Austausch von GDP gegen GTP an der s-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins (2). Daraufhin dissoziieren die Gs- und die G-Untereinheiten. Die Gs-Untereinheit aktiviert die Adenylatcyclase (3), die wiederum die Umwandlung von ATP in cAMP katalysiert (4). Das so entstandene cAMP bewirkt die Aktivierung der Protein-Kinase A (5), die schließlich den Transkriptionsfaktor CREB phosphoryliert (6). Das phosphorylierte CREB bindet als Dimer an das cAMP responsive element (CRE) in den Promotor- und Enhancer-Regionen der Zielgene und aktiviert somit deren Transkription (7).

Genaktivierung über den JAK/STAT-Signaltransduktionsweg. Die Bindung des Zytokinliganden an den Rezeptor (1) induziert die Phosphorylierung des Rezeptors durch die JAK-Kinase (2). Der phosphorylierte Rezeptor bildet eine Andockstelle für die STAT-Transkriptionsfaktoren, die nach der Bindung ebenfalls phosphoryliert werden (3). Die phosphorylierten STAT-Proteine können dimerisieren (4), in den Kern wandern und dort die Expression ihrer Zielgene starten (5).

Genaktivierung durch den TGF-/Smad-Signaltransduktionsweg. Die Bindung von TGF- induziert die Interaktion der Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren (1). Dadurch ist der Typ-II-Rezeptor in der Lage, den Typ-I-Rezeptor zu phosphorylieren und damit zu aktivieren (2). Der aktivierte Typ-I-Rezeptor phosphoryliert ein rezeptorreguliertes Smad (3), das anschließend mit Smad4 heterodimerisiert (4), als Dimer in den Kern wandert und dort die Transkription der Zielgene aktiviert (5).

Aktivierung von NFAT. Durch Stimulation der T-Zellen kommt es zum Anstieg der intrazellulären Ca-Konzentration durch Ca-Einstrom aus dem endoplasmatischen Retikulum und aus dem Extrazellularraum. Die Immunsuppressiva Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus (FK506) entfalten ihre immunmodulatorische Wirkung durch Inhibition von Calcineurin und damit Blockade der NFAT-Aktivierung.

Genaktivierung durch Glucocorticoidhormone. Im inaktiven Zustand liegt der Glucocorticoidrezeptor (GR) als Monomer im Zytoplasma vor, das mit dem Hsp90-Komplex assoziiert ist (1). Das Steroidhormon gelangt durch die Plasmamembran (2) und bindet an den Rezeptor (3). Dadurch wird der Hsp90-Komplex abgelöst (4), und der Rezeptor wird in den Kern transportiert. Nach Dimerisierung bindet der Glucocorticoidrezeptor an ein spezifisches DNA-Element in der Promotor- bzw. Enhancer-DNA, das glucocorticoid responsive element (GRE, Abb. 12.13b), und schaltet die Expression seiner Zielgene an (5).

Genregulation durch Retinsäure. Das Heterodimer des Retinsäurerezeptors (RXR/RAR) ist bereits im inaktiven Zustand an die DNA gebunden. Es ist jedoch mit Corepressoren (NCoR) und Histon-Deacetylasen (HDAC) assoziiert, die eine Genaktivierung verhindern. Die Bindung der Retinsäure an den Rezeptor bewirkt den Austausch des Corepressors (NCoR) gegen einen Coaktivator (NCoA) und der Histon-Deacetylase gegen eine Histon-Acetyltransferase (z.B. CBP/p300, Kap. 12.7.1).

Aktivierung des NF-B-Transkriptionsfaktors. Unterschiedliche Induktoren bewirken die Aktivierung des IB-Kinase-Komplexes. Als Konsequenz wird das IB-Protein (IB) phosphoryliert, nachfolgend ubiquitinyliert und schließlich durch das Proteasom abgebaut. Das freigesetzte NF-B-Dimer (aus p50 und ReIA) kann in den Kern wandern und dort an seine Erkennungssequenz (B-Motiv) in den Promotoren bzw. Enhancer-Elementen der Zielgene binden und diese Gene aktivieren.

Regulation von MyoD. Hemmung der muskelspezifischen Genexpression durch Assoziation von MyoD und E2A mit Id. In proliferierenden Zellen liegen sowohl MyoD als auch E2A im Komplex mit dem Id-Protein vor und sind dadurch transkriptionell inaktiv, weil das Heterodimer nicht an die DNA binden kann (1). Wird die Differenzierung initiiert, dissoziiert Id von seinen Dimerisierungspartnern, die nun Heterodimere bilden können (2), die transkriptionell aktiv sind (3). Das freie Id-Protein wird proteolytisch abgebaut.

Regulation der Myc-Funktion. Aktivierung und Hemmung von Myc-abhängigen Zielgenen durch Assoziation von Max mit unterschiedlichen Dimerisierungspartnern. Während Myc/Max-Heterodimere die Transkription aktivieren (1), wirken Mad/Max-Heterodimere hemmend auf diese (2).

Aktivierung von Notch durch partielle Proteolyse. Durch zwei proteolytische Prozessierungsschritte (S2 und S3; ein erster Schritt S1 wurde bereits bei der Synthese von Notch gesetzt) wird die intrazelluläre Domäne freigesetzt. Nach Bindung der intrazellulären Notch-Domäne an das DNA-gebundene RBP-J-Protein wird ein Corepressorkomplex (Co-R) gegen einen Coaktivatorkomplex (Co-A) ausgetauscht.

Enhancosom am -Interferon-Gen. Die Bindung einer Reihe von Transkriptionsfaktoren (NF-B, IRF, AP-1) wird durch HMG1 ermöglicht. Diese Transkriptionsfaktoren können dann gemeinsam den CPB/p300-Coaktivator rekrutieren.

DNA-Methylierung.

a) Struktur von Cytidin, 5-Methylcytidin und Thymidin.

b) An CpG-Dinucleotiden sind die Cytosinreste der beiden komplementären Stränge methyliert. Nach der Replikation (1) werden die hemimethylierten Stellen durch eine Hemimethylase (DNMT1) wieder vollständig methyliert (2).

c) Im nichtmethylierten Zustand ist der Promotor des INK4-Gens aktiv. Methylierung der CpG-Dinucleotide (durch m gekennzeichnet) führt zur Inaktivierung. Auch für andere Tumorsuppressorgene wie E-Cadherin und BRCA1 wurde ein entsprechender Mechanismus nachgewiesen.

Locus-Kontrollregionen und Isolatorelemente.

a) Der menschliche -Globin-Genlocus. Der dargestellte DNA-Bereich umfasst etwa 80.000 bp und enthält vor den Strukturgenen die Locus-Kontrollregion (LCR), die für die Expression der -Globin-Gene essenziell ist.

b) Funktion von Isolatorelementen. Isolatorelemente (I) verhindern, dass Enhancer-Regionen eines Gens die Expression eines benachbarten Gens beeinflussen.

Die Cap-Struktur am 5'-Ende von mRNA-Molekülen. Die 5'-Cap-Struktur enthält das ungewöhnliche Nucleotid 7-Methylguanylat (blau), das über eine 5'-5'-Triphosphatbrücke mit dem ersten transkribierten Nucleotid der mRNA verbunden ist. Darüber hinaus ist die 2-Hydroxyl-Gruppe der Ribose des ersten und z.T. auch des zweiten Nucleotids methyliert (rot).

Polyadenylierung von mRNA-Molekülen. Der neu entstandene mRNA-Strang wird ungefähr zehn bis 30 Nucleotide hinter dem Polyadenylierungssignal (AAUAAA) häufig an einem CA-Dinucleotid endonucleolytisch geschnitten. Anschließend synthetisiert die Poly(A)-Polymerase den Adenylatschwanz.

RNA-Spleißen im Überblick. Nach der Transkription des Gens entsteht ein primäres, intronhaltiges hnRNA-Transkript. Es besteht aus acht Exons (blau) und sieben Introns (gelb). Durch Anheften des 5'-Caps und die Polyadenylierung des 3'-Endes wird dieses primäre Transkript modifiziert. Beim Spleißen werden die Introns aus der hnRNA entfernt.

Spleißsequenzen. Am Ende der Exonsequenzen findet man häufig das AG-Dinucleotid. Beginn und Ende der Intronsequenz sind extrem gut konserviert (GUAG). Außerdem gibt es weitere konservierte Nucleotide sowie den Adenosinrest (A) an der Verzweigungsstelle und eine etwa 15 Nucleotide lange Pyrimidinsequenz. 5'SD Spleißdonorsequenz (Exon-Intron-Übergang), 3'SA Spleißakzeptorsequenz (Intron-Exon-Übergang).

Die Spleißreaktion.

a) Teilreaktionen des Spleißens. Über zwei Umesterungen, die eine lassoähnliche Struktur generieren, wird das Intron aus der hnRNA entfernt. Die konservierten Sequenzmotive der Introns sind dargestellt.

b) Biochemischer Mechanismus des Spleißens. Die 2'-Hydroxyl-Gruppe des Adenylylrests an der Verzweigungsstelle greift die 5'-Phosphatgruppe an der Spleißdonorstelle an. Dadurch entsteht eine äußerst ungewöhnliche 2'-5'-Phosphodiesterbindung (1. Umesterung). Nun greift die frei gewordene 3'-OH-Gruppe am Spleißdonor den Phosphatrest am Spleißakzeptor an. Dadurch werden die beiden Exons verknüpft (2. Umesterung) und das Intron als lassoähnliche Struktur aus dem Transkript entfernt.

Der Aufbau des Spleißosoms. Die relevanten konservierten Sequenzen sind an den Exon-Intron-Übergängen sowie im Intron nochmals gezeigt. Die Verzweigungsstelle (A) im Intron ist nach unten versetzt dargestellt. Die U1-Untereinheit des Spleißosoms bindet an die Spleißdonorstelle, wobei die Erkennung und Positionierung durch Basenkomplementarität der U1-snRNA gewährleistet werden. U2AF und die U2-Untereinheit binden an die Spleißakzeptorstelle bzw. den Verzweigungspunkt im Intron. Es besteht eine Basenkomplementarität der U2-snRNA zur Verzweigungsstelle. Anschließend binden U4, U5 und U6 an das zu spleißende Transkript. Dadurch wird die lassoähnliche Struktur des Introns stabilisiert, die für den Spleißvorgang unerlässlich ist.

Mechanismen des Selbstspleißens bei RNA-Molekülen. Während bei Gruppe-I-Introns ein nicht zum RNA-Molekül gehörendes Nucleotid (GTP) als Verzweigungsstelle dient, ist die Verzweigungsstelle bei Gruppe-II-Introns Bestandteil der RNA-Sequenz. Gruppe-II-Introns werden als lassoähnliche Strukturen entfernt.

Prinzipielle Mechanismen des alternativen Spleißens. Fünf unterschiedliche Varianten von alternativem Spleißen sind dargestellt. Exons bzw. Teile von Exons, die konditional in der reifen mRNA enthalten sind, sind hellblau hervorgehoben. P1 und P2 markieren zwei unterschiedliche Promotoren mit jeweils einem ersten Exon. PA1 und PA2 stehen für zwei unterschiedliche Polyadenylierungsstellen am Ende eines jeweils letzten Exons einer mRNA.

Zelltypspezifisches alternatives Spleißen am Beispiel des Calcitonin-Gens. Während in der Nebenschilddrüse das Polyadenylierungssignal 1 [Poly(A)-Signal 1] das Ende der mRNA darstellt, wird in Neuronen die Polyadenylierungsstelle 2 [Poly(A)-Signal 2] benutzt. Dies resultiert in unterschiedlichen Transkripten: In der Nebenschilddrüse entsteht ein primäres Transkript, das vier Exons enthält, während in Neuronen eine hnRNA gebildet wird, die sechs Exons beinhaltet.

Mechanismen der RNA-Editierung.

a) Desaminierung von Cytosin. RNA-Editierung in Darmzellen führt zur Veränderung des CAA-Tripletts in UAA. Dadurch wird aus einem Codon für die Aminosäure Glutamin ein Stoppcodon. Die Umwandlung des Cytosinrests in einen Uracilrest erfolgt durch Desaminierung. Das eigentliche Translationsstoppcodon ist durch einen Pfeil und T gekennzeichnet.

b) Desaminierung von Adenosin. Nach Basenpaarung des zu editierenden Bereichs im Exon mit einer komplementären Region im Intron wird die Stelle durch eine Doppelstrang-RNA-spezifische Adenosin-Desaminase (ADAR) modifiziert. Das entstehende Inosin wird bei der Translation als Guanosin gelesen.

Der INK4-Genlocus. Die beiden Gene ARF (oberhalb der Linie) und INK4 (unterhalb der Linie) besitzen unterschiedliche Promotoren (Startstellen der Transkription jeweils durch Pfeile gekennzeichnet) und damit unterschiedliche erste Exons. Am Exon 2 werden unterschiedliche Spleißakzeptoren verwendet. Exon 3 ist identisch für beide Gene. Aufgrund der unterschiedlichen Spleißakzeptoren in Exon 2 wird dieses Exon ebenso wie Exon 3 im Fall des ARF- bzw. INK4-Gens in unterschiedlichen Leserastern abgelesen. Proteinkodierende Bereiche für ARF sind rot, die für INK4 grün dargestellt.

Rolle der CTD. An die C-terminale Domäne (CTD) der großen Untereinheit der RNA-Polymerase II (RNAP) binden unterschiedliche Enzyme, die für den Transkriptionsprozess bzw. die RNA-Prozessierung eine wichtige Rolle spielen.

Struktur des in das Wirtsgenom integrierten HIV-Provirus. Die Kontrollelemente für die Regulation der Transkription liegen an den Enden des Provirus (LTR, long terminal repeats). Das Rev-Response-Element (RRE) befindet sich auf der nicht gespleißten bzw. der partiell gespleißten RNA.

Prozessierung der Vorläufer für rRNA.

a) Prozessierung der 45S-prä-rRNA. Durch Prozessierung entstehen drei verschiedene rRNA-Moleküle. Während bei der Transkription von proteinkodierenden Genen je ein Transkript zu einer mRNA gespleißt wird, entstehen die 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA aus einem einzigen Primärtranskript.

b) Die Synthese der Ribosomen. Ribosomale und nucleäre Proteine binden an die prä-rRNA. Nach deren Prozessierung assoziiert die 5S-rRNA mit dem größeren der beiden dabei entstehenden Ribonucleoproteinkomplexe. Die Prä-Ribosomen werden dann aus dem Nucleolus in das Zytoplasma exportiert.

Prozessierung der tRNA-Moleküle. Nach dem Schneiden primärer tRNA-Transkripte durch RNaseP und RNaseD (1) wird von der tRNA-Nucleotidyl-Transferase am 3'-Ende die für tRNA typische CCA-Sequenz angefügt (2).

Die häufigsten modifizierten Basen in tRNA-Molekülen.

Funktionen der RNA-Polymerasen

Tab. 12.1
RNA-Polymerase Funktionen
RNA-Polymerase I Synthese von rRNA (28S-rRNA, 18S-rRNA, 5,8S-rRNA)
RNA-Polymerase II Synthese von mRNA, snRNA (U1-, U2-, U4-, U5-snRNA; Kap. 12.9.3) sowie von Vorläufern der miRNA (Kap.13.5.3)
RNA-Polymerase III tRNA (alle), 5S-rRNA, snRNA (z.B. U6- oder 7S-RNA)

Transkription

T. Wirth

  • 12.1

    Ablauf der Transkription 354

  • 12.1.1

    Initiation der Transkription am Promotor354

  • 12.1.2

    Elongation der Transkription355

  • 12.1.3

    Struktur der RNA-Polymerasen355

  • 12.1.4

    Termination der Transkription357

  • 12.2

    Transkriptionskontrolle bei Prokaryonten 357

  • 12.2.1

    Das Operon: Ein Promotor reguliert mehrere Gene357

  • 12.2.2

    Genaktivierung358

  • 12.3

    Transkriptionskontrolle bei Eukaryonten 358

  • 12.3.1

    Promotoren, Enhancer und Silencer360

  • 12.3.2

    Modularer Aufbau der regulatorischen Elemente360

  • 12.3.3

    Bildung des Initiationskomplexes am basalen Promotor362

  • 12.4

    Transkriptionsfaktoren 364

  • 12.4.1

    Domänenstruktur von Transkriptionsfaktoren364

  • 12.4.2

    DNA-Bindungsdomänen von Transkriptionsfaktoren364

  • 12.4.3

    Transkriptionsregulierende Domänen von Transkriptionsfaktoren370

  • 12.5

    Regulation der Transkription durch die RNA-Polymerasen I und III 370

  • 12.5.1

    Transkription der ribosomalen RNA-Gene durch RNA-Polymerase I370

  • 12.5.2

    Regulation der RNA-Polymerase-I- Transkription371

  • 12.5.3

    Promotoren der RNA-Polymerase III372

  • 12.6

    Regulation der Funktion und Aktivität von Transkriptionsfaktoren 373

  • 12.6.1

    Kontrolle der Synthese und des Abbaus373

  • 12.6.2

    Kovalente Modifikation374

  • 12.6.3

    Ligandenbindung377

  • 12.6.4

    Interaktion mit Inhibitorproteinen378

  • 12.6.5

    Dimerisierung380

  • 12.6.6

    Partielle Proteolyse381

  • 12.7

    Kontrolle der Genexpression durch Coaktivatoren und Corepressoren 382

  • 12.7.1

    Kovalente Modifikation der Histone durch Coaktivatoren382

  • 12.7.2

    Änderung der DNA-Struktur durch Coaktivatoren383

  • 12.7.3

    Chromatin-Remodelling383

  • 12.7.4

    Corepressoren383

  • 12.8

    Kontrolle der Transkription durch DNA-Methylierung und Locus-Kontrollregionen 384

  • 12.8.1

    DNA-Methylierung384

  • 12.8.2

    Locus-Kontrollregionen385

  • 12.8.3

    Isolatorelemente385

  • 12.9

    Posttranskriptionelle RNA- Modifikationen 386

  • 12.9.1

    Capping der mRNA am 5'-Ende386

  • 12.9.2

    Polyadenylierung der mRNA am 3'-Ende387

  • 12.9.3

    Spleißen der mRNA-Vorläufer388

  • 12.9.4

    RNA-Editierung393

  • 12.9.5

    Ein Gen – zwei Proteine394

  • 12.9.6

    Interaktion RNA-modifizierender Enzyme mit der RNA-Polymerase II394

  • 12.10

    Transport der mRNA in das Zytosol und mRNA-Abbau 395

  • 12.10.1

    Transport der reifen mRNA in das Zytoplasma395

  • 12.10.2

    Regulation des mRNA-Abbaus im Zytoplasma396

  • 12.11

    Prozessierung von prä-rRNA und prä-tRNA 397

  • 12.11.1

    Prozessierung der prä-rRNA397

  • 12.11.2

    Prozessierung der prä-tRNA398

Praxisfall

Ein 30-jähriger, blass aussehender Patient kommt in die Praxis und klagt über körperliche Abgeschlagenheit sowie gehäuftes Auftreten von blauen Flecken. Außerdem könne er im Gegensatz zu früher jetzt kaum mehr die Treppe zu seiner Wohnung im dritten Stockwerk steigen, ohne unter massiver Atemnot zu leiden. Das Blutbild bestätigt den Verdacht auf eine Anämie. Gleichzeitig ergibt sich auch eine Verringerung der weißen Blutzellen (Leukozyten) sowie der Blutplättchen (Thrombozyten). Im Blutausstrich finden sich in geringer Zahl unreife weiße Blutkörperchen. Eine Knochenmarkpunktion ergibt eine massive Zunahme von Vorläuferzellen der weißen Blutzellen mit fast vollständiger Verdrängung der normalen Blutbildung. Die Mehrzahl dieser unreifen Zellen enthalten Granula sowie stäbchenförmige Strukturen (sog. Auer-Stäbchen).

Der Patient leidet an einer akuten promyelozytären Leukämie (APL). Auslöser für diese Erkrankung ist eine Chromosomenmutation (Translokation), die einen Transkriptionsfaktor, den nucleären Retinsäurerezeptor, betrifft. Der durch die Translokation mutierte Rezeptor unterdrückt die Expression einer Reihe von Genen, die für die Differenzierung von myeloischen Vorläuferzellen zu reifen Granulozyten nötig sind. Gleichzeitig bewirkt er das ungehemmte Wachstum dieser Vorläuferzellen. Zur Therapie der APL wird neben der Verabreichung von Chemotherapeutika auch eine spezifische Therapie mit all-trans-Retinsäure durchgeführt. Dadurch wird die reprimierende Funktion des mutierten Retinsäurerezeptors aufgehoben und der Differenzierungsblock der Zellen beseitigt. Dies zeigt einerseits, wie eine Veränderung der spezifischen Gentranskription einer Zelle zur Entartung führen kann, andererseits macht dieses Beispiel klar, wie die genaue Kenntnis der molekularen Grundlagen einer Erkrankung zum Auffinden einer spezifischen Therapie beiträgt.

Zur Orientierung

Die unterschiedlichen Zellen des Körpers erfüllen unterschiedliche Aufgaben und sind entsprechend spezialisiert. Die genetische Information, die in der chromosomalen DNA kodiert wird, ist allerdings (von wenigen besonderen Ausnahmen abgesehen) in allen Körperzellen identisch. Die Expression der genetischen Information wird abhängig von den spezifischen Erfordernissen der Zelle genau reguliert.

Diese Regulation findet auf unterschiedlichen Ebenen statt. Neben der Synthese der RNA (Transkription) können auch viele nachgeordnete Schritte reguliert werden. Das sind z.B.:

  • Reifung/Modifikation der mRNA

  • Transport der RNA in das Zytoplasma

  • Abbau der RNA

  • Effizienz der Translation

  • Modifikation/Funktion eines Proteins

  • Abbau eines Proteins

Die entscheidende Regulationsebene ist die der RNA-Transkription, d.h. das Überschreiben der DNA-Matrize in eine RNA-Kopie. In diesem Kapitel werden zunächst die Grundlagen des Transkriptionsprozesses beschrieben, danach folgen die Regulationsmechanismen der Transkription. Schließlich werden die Prozesse der RNA-Reifung einschließlich der damit verbundenen Regulationsstrategien diskutiert.

Ablauf der Transkription

Transkription nennt man den Prozess, bei dem die DNA-Vorlage eines Gens in RNA überschrieben wird. Dies wird von spezialisierten Enzymen, den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen, vorgenommen. Genau wie die DNA-Synthese benötigt auch die RNA-Synthese eine Matrize, die kopiert werden kann. Die Matrize ist einer der beiden Stränge der DNA (Abb. 12.1). Anders als bei der DNA-Synthese/Replikation bleibt der kopierte RNA-Strang allerdings nicht mit der Matrizen-DNA gepaart, sondern wird als Einzelstrang abgelöst. Von der gleichen DNA-Matrize können Hunderte und Tausende von RNA-Kopien angefertigt werden.
Der Transkriptionsprozess kann in drei Stadien untergliedert werden:
  • Initiation: Start der Transkription

  • Elongation: Verlängerung der RNA-Kette

  • Termination: Ende der Transkription, Freisetzung des RNA-Transkripts.

Initiation der Transkription am Promotor

Die Expression der Mehrzahl der Gene wird hauptsächlich auf der Ebene der Transkriptionsinitiation reguliert. Für die Initiation ist ein sog. Promotor essenziell. Promotoren sind Sequenzabschnitte auf der DNA, die der RNA-Polymerase die Startstelle der Transkription anzeigen. Die Interaktion der RNA-Polymerase mit dem Promotor und der Start der Transkription verlaufen dabei über mehrere Zwischenschritte. Zunächst bindet die RNA-Polymerase durch Mechanismen, die noch detailliert besprochen werden, an die Promotor-DNA. Danach wird der DNA-Doppelstrang im Bereich der Startstelle der Transkription aufgeschmolzen. Dies erlaubt der RNA-Polymerase die Initiation und Synthese eines kurzen Stücks der RNA (etwa zehn Nucleotide). Im letzten Schritt des Initiationsprozesses verlässt die RNA-Polymerase den Promotor und geht in die Elongationsphase über.
Die RNA-Synthese findet an entwundener und aufgeschmolzener DNA statt, in der sog. Transkriptionsblase (Abb. 12.1a). Die Entspiralisierung vor der Transkriptionsblase und die Neuverdrillung hinter der RNA-Polymerase werden von spezifischen Enzymen, den DNA-Topoisomerasen, durchgeführt (Kap. 11.1.4).
Im Prinzip können beide Stränge des Doppelstrangs, die zueinander komplementär, aber eben nicht identisch sind, in RNA überschrieben werden. Im Regelfall dient aber nur ein Strang als Matrize (Matrizenstrang). Der andere Strang entspricht dann in seiner Basenabfolge der synthetisierten RNA und wird deshalb auch als kodierender Strang oder Sense-Strang bezeichnet, da er den gleichen Sinn ergibt wie die RNA. Der Matrizenstrang entspricht dem Antisense-Strang.

Elongation der Transkription

Die Bausteine der RNA-Synthese sind die Ribonucleosidtriphosphate ATP, GTP, CTP und UTP. Die Basenpaarung erfolgt dabei wie bei der DNA-Synthese (Kap. 11), außer dass Thymin durch Uracil bzw. Thymidin durch Uridin ersetzt ist.
RNA-Polymerasen sind Nucleotidyl-Transferasen. Die RNA-Synthese (wie auch die der DNA) erfolgt in 5'3'-Richtung, d.h., der Matrizenstrang wird in 3'5'-Richtung abgelesen. Die 3'-OH-Gruppe des zuletzt eingebauten Nucleotids reagiert mit der 5'--Phosphat-Gruppe (nucleophiler Angriff) des nächsten Nucleosidtriphosphats unter Bildung einer Phosphodiesterbindung und Freisetzung von Pyrophosphat (PPi; Abb. 12.1b). PPi wird durch die Pyrophosphatase zu zwei Molekülen anorganischem Phosphat (Pi) gespalten, wodurch das Reaktionsgleichgewicht auf die Seite der RNA-Synthese verschoben wird. Dies entspricht weitgehend den Vorgängen bei der DNA-Synthese (Kap. 11.1.1).
Im Gegensatz zur DNA-Synthese wird für die RNA-Synthese kein Primer benötigt. Das bedeutet, dass das Primärtranskript zunächst mit einem 5'-Triphosphat beginnt. Wir werden aber später sehen, dass die 5'-Enden vieler RNA-Moleküle posttranskriptionell noch modifiziert werden.
Die Fehlerrate der Transkription ist deutlich höher als die der Replikation. Während bei der Replikation nur etwa ein Fehler bei 109–1010 Basenpaaren auftritt, liegt die Fehlerrate der Transkription bei etwa einem Fehler pro 104–105 eingebaute Nucleotide. Obwohl auch die RNA-Polymerase über eine 3'5'-Nuclease-Aktivität verfügt, ist das Korrekturlesen deutlich weniger effizient.

Struktur der RNA-Polymerasen

Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische RNA-Polymerasen sind komplexe Enzyme. Während es bei Prokaryonten nur eine Form der RNA-Polymerase gibt, verfügen Eukaryonten über drei verschiedene RNA-Polymerasen (Abb. 12.2).
RNA-Polymerasen bei Prokaryonten
Das bakterielle RNA-Polymerase-Holoenzym (griech. holos ganz) besteht aus der Core-RNA-Polymerase und dem sog. Sigma-Faktor. Bei der Core-Polymerase handelt es sich um ein Pentamer aus einer - und einer '-Untereinheit, zwei -Untereinheiten sowie der kleinen (Omega)-Untereinheit (2'). Das Core-Enzym ist für den eigentlichen, oben beschriebenen RNA-Syntheseprozess zuständig. Die Rolle des Sigma-Faktors besteht darin, die Startstelle für den Transkriptionsprozess, den Promotor, zu erkennen. Die beiden großen Untereinheiten (' und ) binden die Ribonucleosidtriphosphate und verknüpfen sie entsprechend der Basenfolge auf dem Matrizenstrang. Die Funktion der beiden -Untereinheiten und der -Untereinheit liegt im Aufbau des Core-Enzyms sowie der Wechselwirkung mit regulatorischen Proteinen und der DNA.
RNA-Polymerasen bei Eurkaryonten
Als man Anfang der 70er Jahre des 20. Jahrhunderts eukaryontische RNA-Polymerasen aus Gewebeextrakten aufreinigte, erlebte man zwei Überraschungen: Zum einen ließen sich chromatographisch drei Fraktionen mit RNA-Polymerase-Aktivität nachweisen, die RNA-Polymerasen I, II und III genannt wurden. Zum anderen zeigte sich, dass keine der drei RNA-Polymerasen in der Lage ist, spezifische Startstellen der Transkription auf der DNA zu finden. Ebenso wie die RNA-Polymerase der Prokaryonten benötigen auch die drei eukaryontischen RNA-Polymerasen für die Erkennung der zu transkribierenden DNA und die Transkriptionsinitiation Signale auf der DNA. Wie wir noch sehen werden, ist das Erkennen des richtigen Startpunkts für eukaryontische RNA-Polymerasen ein komplexer Mechanismus, der eine Reihe zusätzlicher Faktoren erfordert.
Die Strukturanalyse der eukaryontischen RNA-Polymerasen ergab, dass sie ebenfalls aus zwei -ähnlichen Untereinheiten sowie je einer - und '-ähnlichen Untereinheit aufgebaut sind, die auch funktionell weitgehend konserviert sind (funktionell konserviert bedeutet, dass die Untereinheiten die gleiche Funktion beim Transkriptionsprozess besitzen). Die -ähnlichen Untereinheiten der RNA-Polymerasen I und III sind identisch, die '- und -Untereinheiten der drei RNA-Polymerasen sind untereinander ähnlich, stellen aber doch unterschiedliche Polypeptide dar. Zusätzlich besitzen alle drei RNA-Polymerasen noch etwa zehn zusätzliche Untereinheiten, von denen fünf bei allen drei Polymerasen identisch sind (Abb. 12.2). RNA-Polymerasen sind also komplexe Enzyme aus vielen Untereinheiten mit einem Gesamtmolekulargewicht von mehr als 600 kDa.

Klinik

Der Knollenblätterpilz Amanita phalloides produziert ein Gift (-Amanitin), das eukaryontische RNA-Polymerasen inhibiert. Schon bei geringen Konzentrationen (1 g mL1) kann es die RNA-Polymerase II komplett blockieren, während eine zehnfach höhere Konzentration die RNA-Polymerase III inhibiert. Im Gegensatz zu diesen beiden RNA-Polymerasen ist die RNA-Polymerase I auch gegen hohe -Amanitin-Konzentrationen resistent. Der Verzehr des grünen Knollenblätterpilzes ist häufig tödlich, wobei die letale Dosis für das Gift Amanitin bei Menschen bei 0,1 mg pro kg Körpergewicht liegt. Meist kommt es 8–12 h nach Verzehr des Pilzes zu Brechdurchfall und in der Folge zu einer massiven Leberschädigung durch Inhibition der Transkription v.a. in der Leber. Zu diesem Zeitpunkt ist eine Therapie bei schweren Vergiftungen kaum mehr möglich.

Eine Besonderheit der größten Untereinheit der RNA-Polymerase II (entspricht ') ist das Vorhandensein einer C-terminalen Domäne (CTD) mit etwa 50 mehr oder weniger perfekten Wiederholungen eines Heptapeptids mit der Konsensussequenz Tyr–Ser–Pro–Thr–Ser–Pro–Ser. Diese CTD ist essenziell für die Funktion der RNA-Polymerase II. Bestimmte Serinreste der CTD sind bei der aktiv transkribierenden RNA-Polymerase phosphoryliert und dienen als Bindungsstelle für eine Reihe von Enzymen, die für die Prozessierung und Reifung der RNA-Polymerase-II-Transkripte benötigt werden. Diese Funktion wird in Kap. 12.9.6 genauer beschrieben.
Funktionen der verschiedenen RNA-Polymerasen
Die drei eukaryontischen RNA-Polymerasen sind für die Transkription unterschiedlicher Gene zuständig (Tab. 12.1).
Daneben gibt es in Säugerzellen noch eine mitochondriale RNA-Polymerase. Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen RNA-Polymerasen besitzt das mitochondriale Enzym nur eine einzige katalytisch aktive Polypeptidkette.
In einer schnell wachsenden Zelle findet man hauptsächlich rRNA (80% der gesamten RNA-Menge) und tRNA (15%). Demgegenüber ist der Anteil an mRNA – also der für Proteine kodierenden RNA – kleiner als 5%. Trotzdem konzentriert sich die Regulation der Genexpression überwiegend auf diese proteinkodierenden Gene. Unterschiedliche Zelltypen exprimieren die gleichen rRNA- und tRNA-Moleküle. Sie unterscheiden sich aber im mRNA-Muster.
Struktur der eukaryontischen RNA-Polymerase II
Die Struktur der eukaryontischen RNA-Polymerase II der Hefe wurde mit allen Untereinheiten in atomarer Auflösung bestimmt. Zwischen den beiden großen Untereinheiten (' und bzw. RBP1 und RBP2) befindet sich eine große Spalte. Durch diese Spalte gelangt die doppelsträngige DNA in das Innere des komplexen Enzyms und wird dabei in die beiden komplementären Einzelstränge aufgeschmolzen. Am aktiven Zentrum findet die katalytische Reaktion statt, wobei die über eine Art Kanal eindringenden Ribonucleosidtriphosphate zur RNA polymerisiert werden. Ein beweglicher Arm der RNA-Polymerase wirkt als eine Klammer und hält DNA und entstehende RNA zunächst zusammen. Am Austrittskanal verlassen die wieder doppelsträngige DNA sowie die entstehende RNA den Polymerasekomplex.

MERKE

Beim Transkriptionsprozess wird eine DNA-Matrize von RNA-Polymerasen in eine komplementäre RNA-Kopie überschrieben. Während Prokaryonten wie E. coli nur einen Typ von RNA-Polymerasen enthalten, besitzen alle höheren Eukaryonten drei RNA-Polymerasen, die unterschiedliche Gene transkribieren. Promotoren sind Elemente auf der DNA, die für die Initiation der Transkription wichtig sind und die Startstelle der Transkription festlegen. Für die RNA-Synthese wird kein Primer benötigt.

Termination der Transkription

Die drei eukaryontischen RNA-Polymerasen zeigen völlig unterschiedliche Mechanismen zur Termination der Transkription. Im Fall der RNA-Polymerase I wird ein spezifischer Terminationsfaktor benötigt, der an ein Sequenzmotiv (Terminator) auf der DNA bindet.
Die Termination der RNA-Polymerase III benötigt kein zusätzliches Protein. Nachdem die RNA-Polymerase III eine Reihe von Uridylylresten anpolymerisiert hat, terminiert sie die Transkription. Diese Uridylylreste sind auf der DNA kodiert.
Am wenigsten klar ist der Mechanismus der Termination durch RNA-Polymerase II. Viele unreife Vorläufer mRNAs, sog. Prä-mRNA-Moleküle, sind an ihrem 3'-Ende noch etwa 1000–2000 Nucleotide länger als die reifen mRNA-Moleküle. Einige der Faktoren, die an der Prozessierung des 3'-Endes der mRNA durch Anheften eines Poly(A)-Schwanzes beteiligt sind (Kap. 12.9.2), scheinen auch für den Terminationsprozess verantwortlich zu sein.

Transkriptionskontrolle bei Prokaryonten

Bei der Analyse der Promotorsequenzen einer Reihe von prokaryontischen Genen fiel auf, dass kurze Sequenzbereiche bei unterschiedlichen Promotoren konserviert sind. Solche konservierten Sequenzen – d.h., in verschiedenen Promotoren findet man in den entsprechenden Positionen eine identische oder sehr ähnliche Sequenz – nennt man Konsensussequenzen. Diese findet man in den –10- und –35-Regionen von Promotoren (Abb. 12.3). Die Startstelle der Transkription wird nach Übereinkunft als +1 bezeichnet (das erste in RNA überschriebene Nucleotid). Die davor liegenden, nichttranskribierten Sequenzen werden mit negativen Vorzeichen versehen. Die Region –10 liegt also 10 Basenpaare (bp) vor der Startstelle, die Region –35 liegt entsprechend 35 bp davor. Die konservierten Sequenzen bei –35 und –10 werden vom Sigma-Faktor (-Faktor) erkannt, der durch die sequenzspezifische Interaktion mit diesen Stellen die RNA-Polymerase an den Promotor rekrutiert. Schon kurz nach Beginn des Transkriptionsprozesses wird die Sigma-Untereinheit freigesetzt, und die restliche Transkription wird von der Core-RNA-Polymerase allein bewerkstelligt.
Die beschriebenen –10- und –35-Konsensussequenzen findet man bei einer Vielzahl von E.-coli-Genen. Allerdings besitzt E. coli unterschiedliche Sigma-Faktoren, die z.B. für die Expression von Genen nach Hitzeschock oder unter bestimmten Umweltbedingungen benötigt werden. Diese alternativen Sigma-Faktoren binden an andere Konsensussequenzen.
Die Termination der Transkription findet an bestimmten Terminatoren statt, an denen die RNA-Polymerase freigesetzt wird. Es handelt sich hierbei entweder um spezifische Sekundärstrukturen (invertierte Sequenzwiederholungen, die in der transkribierten RNA Haarnadelstrukturen bilden können) oder um Sequenzelemente, die von spezifischen Terminationsproteinen erkannt werden.

Das Operon: Ein Promotor reguliert mehrere Gene

Das Operonmodell, das 1960 von Franois Jacob und Jacques Monod formuliert wurde, beschreibt wesentliche Grundlagen der prokaryontischen Genexpressionskontrolle. Das Modell wurde auf der Grundlage der Lactosenutzung durch das Bakterium E. coli formuliert.
Wenn E. coli auf Nährmedien mit Lactose als Kohlenstoffquelle wächst, werden zwei wichtige Proteine induziert: -Galaktosidase, die das Disaccharid Lactose in Glucose und Galaktose spaltet, und Lactose-Permease, die für die Aufnahme von Lactose in die Bakterienzelle wichtig ist. Beide Gene sowie ein drittes Gen, das für die Thiogalaktosid-Transacetylase kodiert, liegen direkt nebeneinander auf dem Bakterienchromosom. Die Transkription für alle drei Gene wird an einem Promotor initiiert. Die kodierenden Bereiche für alle drei Gene werden in ein einziges großes RNA-Molekül transkribiert (Abb. 12.4a). Eine solche Einheit bezeichnet man als Operon.
Wächst E. coli auf Nährmedien mit Glucose als Kohlenstoffquelle, werden die gerade beschriebenen Gene nicht benötigt und deshalb nicht transkribiert. Dafür ist einerseits eine DNA-Region zwischen dem Promotor und den Genen des lac-Operons (-Galaktosidase, Lactose-Permease, Thiogalaktosid-Transacetylase) wichtig, die man Operator nennt. Außerdem ist ein Regulatorprotein beteiligt, ein sog. Repressor, der an den Operator bindet und die RNA-Polymerase blockiert. Der lac-Repressor wird von einem Gen kodiert, das bei E. coli in der Nachbarschaft des lac-Operons liegt. Diese Nähe ist jedoch nicht Voraussetzung für die Funktion.

MERKE

Regulatorproteine, wie wir sie bei Eukaryonten noch vielfältig kennenlernen werden, wirken in trans, d.h. unabhängig vom Ort, an dem sie auf dem Chromosom kodiert sind. Demgegenüber wirken cis-Elemente, wie Promotor und Operator bzw. bei Eukaryonten Promotor, Enhancer und Silencer, nur jeweils auf das unmittelbar benachbarte Gen.

Zurück zum lac-Operon. Wenn die Bakterien auf Glucosemedium wachsen, bindet der lac-Repressor an den Operator und blockiert die Expression des lac-Operons. Um die Expression bei Wachstum auf lactosehaltigem Medium zu induzieren, wird ein spezifischer Induktor benötigt. Als solcher fungiert physiologischerweise Lactose. Der Induktor bindet an den Repressor und löst ihn aufgrund einer Konformationsänderung von der DNA ab. Dies bewirkt, dass nun die RNA-Polymerase an den Promotor binden und die Gene des Operons transkribieren kann.

Blick ins Labor

Auch synthetische, nicht verwertbare Analoga wie Isopropyl--D-Thiogalaktosid (IPTG) können als Induktor dienen und den Repressor ablösen. IPTG wird heute in der molekularbiologischen Forschung häufig verwendet, um rekombinante Proteine (Kap. 15.4.1) zu induzieren, die in E. coli unter der Kontrolle des lac-Operators exprimiert werden. Auf diese Weise werden heute eine ganze Reihe klinisch relevanter Proteine hergestellt, z.B. Insulin, bestimmte Blutgerinnungsfaktoren, aber auch Proteine, die als Impfstoffe verwendet werden.

Genaktivierung

Repression ist ein wichtiger Regulationsmechanismus bei Prokaryonten, man findet aber auch transkriptionelle Aktivatoren. Am lac-Operon beobachtet man nicht nur Repression, die über den Operator vermittelt wird, sondern auch positive Kontrolle durch die Bindung eines Aktivatorproteins an den Promotor. Für diese Regulation ist das Katabolitaktivatorprotein (CAP) verantwortlich. Wenn die Glucosekonzentration im Nährmedium sehr gering ist, steigt die intrazelluläre Konzentration von cAMP (zyklisches Adenosin-3',5'-monophosphat) stark an. Dieses cAMP bindet dann an das CAP. Der cAMP-CAP-Komplex wiederum interagiert mit dem lac-Promotor und bewirkt eine effizientere Rekrutierung der RNA-Polymerase (Abb. 12.4b).
Durch diese Mechanismen lassen sich drei Regulationszustände des lac-Operons einstellen (Abb. 12.4b):
  • Glucosekonzentration hoch (kein cAMP-CAP), keine Lactose (lac-Repressor aktiv) lac-Operon ist reprimiert (1)

  • Glucosekonzentration hoch (kein cAMP-CAP), Lactose vorhanden (lac-Repressor inaktiv) lac-Operon ist partiell aktiv (2)

  • Glucosekonzentration niedrig (cAMP-CAP vorhanden), Lactose vorhanden (lac-Repressor inaktiv) lac-Operon wird stark transkribiert (3).

Diese Regulationsstrategie stellt sicher, dass Glucose als Hauptenergiequelle genutzt wird, solange sie im Nährmedium vorhanden ist. Neben diesen knapp geschilderten Regulationsmöglichkeiten haben Bakterien noch eine ganze Reihe weiterer Strategien entwickelt, auf die hier allerdings nicht detailliert eingegangen werden soll.
Eine Besonderheit prokaryontischer Genorganisation und Genexpression liegt im Auftreten polycistronischer RNA (Abb. 12.5). Wie beim lac-Operon werden mehrere Strukturgene (drei beim lac-Operon) von einem Promotor aus in eine lange einzelne mRNA-Kette transkribiert. Ribosomen der Prokaryonten können dann mit spezifischen Erkennungssignalen vor der kodierenden Region der Gene interagieren und diese Gene somit gleichzeitig getrennt in Proteine translatieren. Bislang sind bei Eukaryonten und insbesondere bei Säugern nur ganz wenige Beispiele für polycistronische mRNA bekannt. Die überwältigende Mehrheit aller Säugergene wird als monocistronische RNA transkribiert und translatiert, d.h., ein mRNA-Molekül trägt die Information für ein Protein.

MERKE

Bei Prokaryonten werden spezifische Konsensussequenzen im Promotor von der Sigma-Untereinheit der RNA-Polymerase erkannt. Durch Bindung von Repressor- bzw. Aktivatorproteinen an regulatorische Stellen der Promotor-DNA kann die Effizienz der Transkriptionsinitiation beeinflusst werden.

Transkriptionskontrolle bei Eukaryonten

Auch bei Eukaryonten stellt die Transkriptionsinitiation die wichtigste Kontrollebene der Genexpression dar. Die RNA-Polymerase arbeitet meist mit maximaler Aktivität. Deshalb sind stark exprimierte Gene solche, von denen die RNA-Polymerase durch häufige Initiation viele RNA-Transkripte synthetisiert. Ähnlich wie bei Prokaryonten sind auch bei Eukaryonten cis- und trans-Elemente für die Regulation verantwortlich:
  • cis-regulatorische DNA-Elemente (Promotoren, Enhancer und Silencer, Kap. 12.3.1)

  • trans-wirkende Proteine (Transkriptionsfaktoren, Kap. 12.4).

Die größte Komplexität findet man bei den Genen, die für Proteine kodieren und die alle durch die RNA-Polymerase II transkribiert werden. Diese Gene werden zunächst besprochen, später werden wir auch die Regulation der durch die RNA-Polymerasen I und III transkribierten Gene betrachten (Kap. 12.5).

Promotoren, Enhancer und Silencer

Spezifische DNA-Bereiche von Genen, die mit regulatorischen Proteinen interagieren, werden als cis-wirkende Sequenzelemente bezeichnet. Man unterscheidet zwei grundsätzliche Klassen cis-regulatorischer DNA-Elemente:
  • basaler Promotor

  • genspezifische Regulationselemente (genspezifische Promotoren, Enhancer und Silencer).

Der basale Promotor ist für die Festlegung des Transkriptionsstartpunkts und somit für die Initiation der Transkription notwendig. Demgegenüber bestimmen die genspezifischen Regulationselemente den Ort (d.h. in welchen Zellen des Körpers ein Gen transkribiert wird), den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Transkription am basalen Promotor. Die zeitliche und räumliche Kontrolle der Genexpression wird also durch die genspezifischen Regulationselemente festgelegt. Starke RNA-Expression bedeutet, dass durch häufige Initiation der RNA-Polymerase am Promotor eines Gens viele RNA-Moleküle produziert werden.
Bei der Analyse einer Vielzahl von Genen zeigte sich, dass sich in unmittelbarer Nachbarschaft des Transkriptionsstartpunkts häufig gut konservierte Sequenzmotive finden, die für die Funktion des basalen Promotors wichtig sind. Viele Gene besitzen ca. 25 bp stromaufwärts von der Startstelle der Transkription eine sog. TATA-Box (Abb. 12.6a). Sie legt den Startpunkt der Transkriptionsinitiation fest. Ein zweites Element, das den Startpunkt der Transkription bestimmt, ist das sog. Initiatorelement (INR). Dieses Element findet man sowohl in Kombination mit der TATA-Box als auch allein. Bei TATA-losen Promotoren findet man zusätzlich zum INR-Element häufig noch weitere stromabwärts (Downstream) gelegene konservierte Elemente (DPE downstream promoter elements). Ein Initiatorelement erlaubt die spezifische Transkriptionsinitiation an genau der INR-Sequenz (Abb. 12.6a, b).
Nicht alle Gene zeigen allerdings diesen punktgenauen Transkriptionsstart. Bei einer Reihe sog. Haushaltsgene (engl. housekeeping genes) – das sind Gene, die in allen Zellen für fundamentale Prozesse der Zellphysiologie benötigt werden – beobachtet man, dass die RNA-Transkripte in einer Region beginnen, die bis zu 200 bp umfassen kann. Es existieren also verschiedene Startstellen für das gleiche Gen. Bei diesen Haushaltsgenen findet man keine TATA-Box und meist auch kein Initiatorelement. Die basalen Promotoren dieser Gene enthalten stromaufwärts der Startregion ca. 20–50 bp lange CG-reiche Sequenzen, d.h. Sequenzen, in denen die Nucleotide C und G vorherrschen (Abb. 12.6). Das Sp1-Protein, ein Transkriptionsfaktor der Zinkfingerfamilie (Kap. 12.4), bindet an diese CG-Sequenzen und ist für die Rekrutierung der RNA-Polymerase II an diese Promotoren wichtig. Die Mehrzahl aller RNA-Transkripte beginnt mit A oder G (50% bzw. 25%).

Modularer Aufbau der regulatorischen Elemente

Der basale Promotor fungiert nur dann als Startstelle der Transkription, wenn zusätzliche genspezifische Regulationselemente vorhanden sind.
Genspezifischer Promotor
In unmittelbarer Nachbarschaft in 5'-Richtung (stromaufwärts) findet man den sog. genspezifischen Promotor. Es gibt keine festen Regeln für dessen Größe. Typischerweise umfasst er etwa 100–200 bp vor dem basalen Promotor. Für die Funktion sind allerdings nicht alle Sequenzen dieses Promotorbereichs wichtig, sondern nur jeweils kurze konservierte Sequenzmodule, die in diesen Promotorbereich eingebettet sind (Abb. 12.6b). Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Konsensussequenzen, z.B. der TATA-Box, ist die relative Position der einzelnen Sequenzmodule zueinander und zur Startstelle der Transkription nicht streng festgelegt. Diese Sequenzmodule von typischerweise 6–10 bp Länge sind Bindungsstellen für die genspezifischen Transkriptionsfaktoren. Die dazwischen liegenden DNA-Sequenzen haben keine Bedeutung für die Promotorfunktion.
Enhancer
Die Funktion des genspezifischen Promotors wird häufig durch sog. Enhancer-Elemente verstärkt. Enhancer-Elemente können sich in großer Entfernung (viele Tausend Basenpaare) vom Transkriptionsstart befinden, stromaufwärts oder stromabwärts des Gens und sogar innerhalb der transkribierten Region (in Introns, sowie in beliebiger Orientierung relativ zum Promotor angeordnet sein (Abb. 12.7a). Enhancer-Elemente sind für die Kontrolle der gewebespezifischen und zeitlich regulierten Genexpression essenziell. Wie die genspezifischen Promotorelemente besitzen auch Enhancer eine modulare Struktur, d.h., sie enthalten eine spezifische Anordnung von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren. Die Art der Bindungsstellen und deren Kombination legen die Stärke sowie die Spezifität der Funktion des Enhancers fest (Zellspezifität, Induzierbarkeit etc.; Kap. 12.6). Enhancer besitzen eine hohe Dichte solcher Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Wenn Enhancer-Elemente in unmittelbarer Nachbarschaft von Promotoren lokalisiert sind, ist eine strenge Trennung von Promotor und Enhancer oft nicht möglich. Sowohl genspezifische Promotoren als auch Enhancer können gewebespezifisch reguliert werden.
Wie können Enhancer-Elemente, die in großer Distanz vom Promotor lokalisiert sind, die Transkriptionsrate am Promotor regulieren? Man geht heute davon aus, dass Promotoren und Enhancer zwar durch große DNA-Sequenzbereiche voneinander getrennt sind, dass sie allerdings im Zellkern in unmittelbarer Nachbarschaft vorliegen. Dies wird durch Zurückfalten der DNA ermöglicht, wobei Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen durch Protein-Protein-Interaktionen der gebundenen Transkriptionsfaktoren einen wichtigen Beitrag leisten (Abb. 12.7b). Dadurch werden die Bindung von generellen Transkriptionsfaktoren (unten) einschließlich der RNA-Polymerase an den basalen Promotor und damit die Transkription stimuliert.
Silencer
Man findet nicht nur positiv auf die Transkription wirkende Enhancer-Elemente, sondern auch negativ wirkende DNA-Abschnitte, die oft als Silencer bezeichnet werden. Silencer wirken, genau wie Enhancer, unabhängig vom Abstand, von der Lage oder Orientierung relativ zum Transkriptionsstart. Auch sie sind modular aufgebaut; sie üben ihre Funktion durch die Bindung transkriptionsreprimierender Proteine aus.

Bildung des Initiationskomplexes am basalen Promotor

Vor dem Start der Transkription muss die RNA-Polymerase II zunächst an den basalen Promotor rekrutiert werden. Wie bereits zu Beginn des Kapitels erwähnt wurde, sind die eukaryontischen RNA-Polymerasen selbst nicht in der Lage, Promotoren zu erkennen. Sie benötigen hierfür die Hilfe einer Reihe von Transkriptionsfaktoren, die gemeinsam mit der RNA-Polymerase den sog. Initiationskomplex (IC) aufbauen. Für die durch die RNA-Polymerase II transkribierten Gene sind diese Transkriptionsfaktoren, die am basalen Promotor binden, jeweils die gleichen. Sie werden deshalb auch als generelle Transkriptionsfaktoren (GTF) bezeichnet. Zu ihnen zählt – neben der RNA-Polymerase II selbst – noch eine Reihe von Faktoren. Alle Faktoren, die für basale Transkription durch RNA-Polymerase II wichtig sind, werden als TFII bezeichnet, z.B. TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH. Bei TFIIC handelt es sich um die RNA-Polymerase selbst, die Rolle der anderen Faktoren wird nachfolgend beschrieben.
Bindung der generellen Transkriptionsfaktoren am Promotor
Wie bereits oben beschrieben wurde, enthalten viele basale Promotoren eine sog. TATA-Box. Diese TATA-Box dient als Erkennungsstelle für den TFIID-Komplex, einen Multiproteinkomplex (ca. 750 kDa). TFIID besteht aus dem TATA-Box-Bindungsprotein (TBP) sowie sog. TBP-assoziierten Faktoren (TAF). Die Anlagerung von TFIID an die TATA-Box wird durch TBP ermöglicht. TBP besitzt eine in der Evolution hochkonservierte C-terminale Domäne, die die DNA-Bindung des Proteins an die TATA-Box vermittelt. Die Aufklärung der Struktur von DNA-gebundenem TBP zeigte, dass die C-terminale Domäne wie ein Sattel auf der DNA sitzt (Abb. 12.8). Die spezifische Bindung von TBP an die DNA wird durch Wechselwirkungen von Aminosäureseitenketten mit den Basen der DNA (TATA-Sequenz) in der kleinen Furche der DNA-Doppelhelix vermittelt. Dabei wird die DNA auf beiden Seiten der TATA-Box stark abgeknickt. Der direkt an TBP gebundene DNA-Abschnitt von 6–8 Basenpaaren ist dabei teilweise entwunden. Die nach außen gerichtete Oberfläche des DNA-gebundenen TBP kann mit den TBP-assoziierten Faktoren und anderen regulatorischen Proteinen interagieren.
TFIID ist auch für die Bindung an Initiatorelemente (INR) durch TAF-Proteine verantwortlich und wird selbst bei TATA- und initiatorlosen Promotoren an die Startstelle rekrutiert, in diesem Fall durch Wechselwirkung mit dem an die CG-Sequenzen gebundenen Sp1-Protein.
Nachdem TFIID an die DNA gebunden hat, werden nacheinander die anderen generellen Transkriptionsfaktoren hinzugefügt (Abb. 12.8). TFIIA stabilisiert die Bindung von TFIID an den Promotor; TFIIB bindet nicht nur an TFIID, sondern kann auch noch selbst direkt an die Promotor-DNA unmittelbar 5' der TATA-Box binden. Auch die RNA-Polymerase II muss in der Region um den Transkriptionsstart an die DNA binden. Dies wird durch TFIIB und TFIIA ermöglicht, die durch ihre Anlagerung an TFIID eine Plattform für die RNA-Polymerase II schaffen. Gemeinsam mit der RNA-Polymerase bindet TFIIF an den Komplex, danach assoziiert TFIIE, der für die Rekrutierung und Regulation von TFIIH verantwortlich ist.
TFIIH, ebenfalls ein Multiproteinkomplex aus neun Untereinheiten, nimmt eine besondere Stellung unter den generellen Transkriptionsfaktoren ein. TFIIH enthält zwei Untereinheiten mit Helicaseaktivität, die den DNA-Doppelstrang zu Beginn der Transkription unter ATP-Verbrauch trennen und somit die Voraussetzung für die Transkriptionsinitiation schaffen. Darüber hinaus enthält TFIIH eine Protein-Kinase, die die C-terminale Domäne (CTD) der größten RNA-Polymerase-II-Untereinheit (Kap. 12.1) phosphoryliert (es gibt allerdings noch weitere CTD-Kinasen). Erst der RNA-Polymerase-Komplex mit phosphorylierter CTD verlässt den Promotor und kann mit der RNA-Synthese beginnen.

Klinik

Der TFIIH-Komplex ist nicht nur für die Initiation der Transkription wichtig, sondern er enthält auch Untereinheiten, die eine entscheidende Rolle bei der sog. Nucleotidexzisionsreparatur (NER) spielen (Kap. 14.3.3). Dieses Reparatursystem ist für die Entfernung von Schäden verantwortlich, die nur einen Strang der DNA betreffen, z.B. durch UV-Strahlung gebildete Pyrimidindimere in der DNA von Hautzellen. Patienten mit der seltenen Erkrankung Xeroderma pigmentosum zeigen Defekte in der NER. Bei einem Teil dieser Patienten konnten als Ursache Mutationen der Helicaseuntereinheiten von TFIIH gefunden werden. Man weiß heute, dass die beiden Helicasen XPB und XPD (xeroderma pigmentosum complementation group B and D) für die Entwindung der DNA-Stränge zu der Reparatur notwendig sind. Warum ist der NER-Prozess mit einem generellen Transkriptionsfaktor assoziiert? Eine plausible Erklärung liegt darin, dass aktive RNA-Polymerase-Moleküle einen signifikanten Teil der genomischen DNA jeder Zelle transkribieren. Wenn die RNA-Polymerase auf eine Hürde trifft, z.B. eine durch Mutation veränderte Base, arretiert sie. TFIIH kann dann mit der pausierenden RNA-Polymerase interagieren und die Reparatur des Schadens einleiten.

Wenn die RNA-Polymerase nach der Initiation zum Elongationsprozess übergeht, dissoziieren die meisten der generellen Transkriptionsfaktoren von der Polymerase. Nur TFIIF spielt auch noch während der Elongationsphase eine Rolle. Daneben gibt es eine Reihe weiterer Elongationsfaktoren, deren Hauptfunktion darin besteht, ein Pausieren der RNA-Polymerase zu verhindern und somit die Prozessivität der RNA-Polymerase, d.h. ihre Effektivität beim Verlängern eines begonnenen RNA-Transkripts, zu erhöhen. Der am besten charakterisierte Elongationsfaktor ist das TFIIS, ein einzelnes Protein mit einem Molekulargewicht von 38 kDa, das die Prozessivität der RNA-Polymerase bei der Elongation stimuliert.
Obwohl es im Reagenzglas gelingt, den Initiationskomplex (IC) durch eine geordnete Zugabe der generellen Transkriptionsfaktoren (zunächst TFIID, dann TFIIB und TFIIA, dann RNA-Polymerase etc.) aufzubauen, ist es denkbar, dass der gesamte Komplex aus RNA-Polymerase II, assoziierten Proteinen und generellen Transkriptionsfaktoren bereits im Nucleoplasma unabhängig von einer DNA-Bindung assoziieren kann. Demzufolge werden heute zwei Modelle zur Bildung des Initiationskomplexes beschrieben: Während das erste Modell von einer schrittweisen Bildung des Komplexes ausgeht (Abb. 12.8), fordert das zweite einen großen vorgeformten Komplex im Nucleoplasma, ein sog. RNA-Polymerase-II-Holoenzym aus mehr als 50 Untereinheiten, das in einem Schritt am Promotor rekrutiert wird.
Genspezifische Transkriptionsfaktoren
Ohne zusätzliche genspezifische Regulationselemente kann sich kein Initiationskomplex an einem basalen Promotor bilden. Dies liegt daran, dass die spezifischen Wechselwirkungen am basalen Promotor (TBP-TATA-Box-Interaktion) nicht stabil genug sind, um die Komplexbildung zu ermöglichen. Gleichzeitig gibt es sehr viele AT-reiche Sequenzen in der genomischen DNA, die der TATA-Box ähneln, und die Menge der generellen Transkriptionsfaktoren würde nicht ausreichen, um alle Sequenzen zu binden. Aktiv transkribierte Gene müssen deshalb noch zusätzliche Signale besitzen, die für die Bildung eines Initiationskomplexes benötigt werden. Dies sind die genspezifischen Promotor- und Enhancer-Elemente und die daran bindenden Transkriptionsfaktoren. Wir wissen heute, dass bestimmte Bereiche dieser Transkriptionsfaktoren (sog. Transaktivierungsdomänen) mit verschiedenen generellen Transkriptionsfaktoren direkt interagieren können und so die Bildung des Initiationskomplexes am basalen Promotor begünstigen. Wechselwirkungen zwischen Transaktivierungsdomänen der Transkriptionsfaktoren (Kap. 12.4) und unterschiedlichen TAF-Proteinen (TBP-assoziierten Faktoren) des TFIID-Komplexes scheinen eine besondere Bedeutung zu besitzen. Wir werden aber später noch weitere Mechanismen kennenlernen, die für die Bildung des Initiationskomplexes und die Regulation der Transkriptionseffizienz entscheidend sind.

Klinik

Pharmakologische Inhibition der Transkription

Der Transkriptionsprozess ist auch Ausgangspunkt für therapeutische Interventionen, einerseits um Bakterien bei Infektionen zu eliminieren, andererseits um schnell wachsende Tumorzellen zu inhibieren. Daneben werden Modulatoren der Transkription als Immunmodulatoren und auch bei der Behandlung des Diabetes mellitus (Typ-2-Diabetes) eingesetzt.
Die bakterielle Transkription wird selektiv durch die Rifamycine blockiert, die z.B. von Streptomyces mediterraneus produziert werden. Halbsynthetische Derivate (v.a. Rifampicin) werden v.a. zur Bekämpfung von Mycobacterium tuberculosis (also als Antituberkulotikum) eingesetzt. Rifamycin bindet an die -Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase und inaktiviert dadurch das Enzym. Dadurch werden die Bakterien abgetötet. Ein Hemmstoff der eukaryontischen Transkription (der auch auf Prokaryonten wirkt) ist das ebenfalls von Streptomyceten produzierte Actinomycin D. Actinomycin D bindet gut an doppelsträngige DNA, indem es bevorzugt zwischen GC-Basenpaare interkaliert. Bei niedrigen Actinomycin-D-Konzentrationen wird selektiv der Transkriptionsprozess blockiert. Hohe Actinomycin-D-Konzentrationen hemmen auch die DNA-Replikation. Aufgrund dieser Effekte wird Actinomycin D als Zytostatikum in der Tumorchemotherapie sowie als Immunsuppressivum eingesetzt.
Eine besondere Bedeutung haben aktivierende und inhibierende Liganden der nucleären Hormonrezeptoren (Kap. 12.4.2), Transkriptionsfaktoren, die wir später noch detailliert besprechen werden. Synthetische Glucocorticoide sind ausgesprochen wichtige entzündungshemmende Medikamente, die mit der Funktion von Transkriptionsfaktoren interferieren. Daneben werden agonistische und antagonistische steroide Sexualhormone/synthetische Derivate sowohl in der Tumortherapie (Brustkrebs, Prostatakrebs) als auch z.B. bei der Schwangerschaftsverhütung eingesetzt. Aktivatoren eines weiteren Typs von nucleären Hormonrezeptoren, nämlich von PPAR (Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor) werden eingesetzt, um die Insulinresistenz beim Typ-2-Diabetes zu durchbrechen.

MERKE

Für die Regulation der Transkription durch RNA-Polymerase II sind cis-Elemente auf der DNA essenziell. Genspezifische Promotoren werden in ihrer Funktion von Enhancer- und/oder Silencer-Elementen beeinflusst. Ein häufiges konserviertes Element in den basalen Promotoren vieler Gene ist die TATA-Box, die einen Kristallisationspunkt für den Aufbau des Initiationskomplexes der Transkription darstellt. Inhibitoren des Transkriptionsprozesses werden in der Infektions- und Tumortherapie angewendet.

Transkriptionsfaktoren

Domänenstruktur von Transkriptionsfaktoren

Ein Transkriptionsfaktor muss mindestens zwei Aufgaben erfüllen: Er muss in Promotoren, Enhancern und anderen regulatorischen Elementen spezifische DNA-Zielsequenzen erkennen und daran binden. Außerdem muss er die Fähigkeit besitzen, mit der RNA-Polymerase II oder anderen Faktoren in Wechselwirkung zu treten, um die Transkriptionsrate beeinflussen zu können.
Diesen Aufgaben können Transkriptionsfaktoren dadurch nachkommen, dass sie im Regelfall aus mindestens zwei funktionellen Domänen bestehen (Abb. 12.9):
  • einer DNA-Bindungsdomäne und

  • einer transkriptionsregulierenden Domäne (entweder Transaktivierungsdomäne, TAD, oder Transrepressordomäne, TRD).

Zusätzlich enthalten viele Transkriptionsfaktoren regulatorische Domänen, mit denen die DNA-Bindung und/oder die Transaktivierungsfunktion moduliert werden können.
Die DNA-Bindungsdomänen sind für die Bindung an spezifische DNA-Sequenzmodule verantwortlich. Die Strukturen der DNA-Bindungsdomänen von Transkriptionsfaktoren sind vielfältig. Trotzdem haben sich einige häufig auftretende Motive herauskristallisiert, von denen einige im Folgenden beschrieben werden: Diese Domänen wurden im Verlauf der Evolution immer wieder für die DNA-Bindung eingesetzt, wobei spezifische Unterschiede in der Aminosäuresequenz der
jeweiligen Motive dafür verantwortlich sind, dass unterschiedliche Transkriptionsfaktoren an verschiedene Zielsequenzen binden. Die DNA-Bindung durch Transkriptionsfaktoren erfolgt ausschließlich über schwache Wechselwirkungen, nämlich Wasserstoffbrücken, ionische sowie hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte. Die Spezifität der Bindung kommt durch die Interaktion von Aminosäureseitenketten mit ganz bestimmten Basen zustande.

DNA-Bindungsdomänen von Transkriptionsfaktoren

Das Helix-Turn-Helix-Motiv
Als erstes DNA-bindendes Motiv wurde das Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH-Motiv) beschrieben (Abb. 12.10a). Es besteht aus zwei -Helices, die durch einen kurzen nichthelikalen Abschnitt, der den Turn (engl. turn: Umkehr, Kehre) bildet, miteinander verbunden sind. Dieser Turn wird von einer kurzen Sequenz aus drei oder vier Aminosäuren gebildet. Die beiden -Helices kommen dadurch übereinander zu liegen und werden v.a. durch Wechselwirkungen zwischen ihnen in einem festen Winkel zueinander gehalten. Die C-terminale Helix wird als Erkennungshelix bezeichnet, da sie an die große Furche der DNA-Doppelhelix bindet. Die Aminosäureseitenketten der Erkennungshelix gehen Wechselwirkungen mit den Basen bzw. auch dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA-Sequenz ein. Die N-terminale Helix nennt man Positionierungshelix, da sie die exakte Ausrichtung der Erkennungshelix ermöglicht. Die HTH-DNA-Bindungsproteine weisen starke Variationen außerhalb des HTH-Motivs auf und können zusätzlich -Helices (wie lac-Repressor) oder -Faltblattstruktur-Abschnitte (wie CAP, Kap. 12.2) besitzen.
Die Homöodomäne
Proteine mit Homöodomänen stellen eine spezielle Klasse von HTH-Proteinen dar. Homöodomänen wurden zunächst in einer bestimmten Genklasse bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, den homöotischen Genen, beschrieben. Diese homöotischen Gene sind für die Kontrolle der Entwicklung der Fliege (Festlegung der Segmentidentität) und – wie sich später herausstellte – auch für die Entwicklung höherer Organismen einschließlich des Menschen von grundlegender Bedeutung. Diese Gene kodieren für Proteine, die alle eine sehr ähnliche Sequenz von 60 Aminosäuren, die sog. Homöodomäne, enthalten. In der Homöodomäne sind neben dem HTH-Motiv weitere Bereiche sehr gut konserviert (Abb. 12.10b). Vor dem HTH-Motiv (N-terminal) liegt eine weitere -Helix, sodass die Gesamtstruktur aus drei aufeinanderfolgenden -Helices besteht. Dabei bilden Helix 2 und Helix 3 das HTH-Motiv. Helix 1 und Helix 2 liegen in antiparalleler Anordnung zueinander, während die Helix 3 (Erkennungshelix, C-terminal) in etwa rechtwinklig unter diesen beiden Helices liegt. Auch diese Struktur wird entscheidend durch Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten zwischen den einzelnen helikalen Bereichen stabilisiert.
Transkriptionsfaktoren mit Zinkfingerdomänen
Während das HTH-Motiv nur aus Aminosäuren besteht, benutzen verschiedene Gruppen von DNA-Bindungsproteinen Zinkionen, um die DNA-bindende Tertiärstruktur zu stabilisieren. Die metallionbindenden Proteinabschnitte werden als Zinkfinger bezeichnet. Das Zn2+-Ion, ein vierzähniger Ligand, wird dabei durch Histidin- und Cysteinreste komplexiert. Zinkfinger wurden erstmals für den Transkriptionsfaktor TFIIIA beschrieben, der neun solcher Finger besitzt. Finger des Typs Cys2-His2 (C2H2) bestehen aus je einem Cystein- und Histidinpaar, die in die Aminosäurekonsensussequenz Phe/Tyr–X–Cys–X2–4–Cys–X3–Phe/Tyr–X5–Leu–X2–His–X3–4–His (X beliebige Aminosäure) eingebettet sind. Der Name Zinkfinger rührt daher, dass die zweidimensionale Abbildung dieser Struktur an einen Finger erinnert (Abb. 12.11a). Die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur ergab allerdings, dass das Zinkatom die Wechselwirkung zwischen einem -Faltblatt und einer -Helix stabilisiert. Dabei bildet der linke Teil des Zinkfingers (der N-terminale Bereich) ein -Faltblatt, während der rechte, C-terminale Bereich -helikal vorliegt. Die -Helix ist für die spezifische DNA-Erkennung durch Wechselwirkung mit der großen Furche der DNA verantwortlich (Abb. 12.11b). Zu dieser Gruppe von Transkriptionsfaktoren zählt z.B. Sp1 (Kap. 12.3), das drei Zinkfinger in seinem C-Terminus enthält.
Insgesamt findet man im Säugergenom mehrere hundert Gene, die für solche C2H2-Zinkfinger-Proteine kodieren. Fast allen ist gemeinsam, dass sie mehrere Zinkfingerstrukturen besitzen, die hintereinander angeordnet sind. Dabei interagieren die -Helices aufeinanderfolgender Zinkfinger jeweils mit der großen Furche der DNA, wodurch ein nahezu kontinuierliches Teilstück der DNA von diesen Proteinen umwunden wird. Auf diese Weise werden eine starke Protein-DNA-Bindung und hohe Sequenzspezifität gewährleistet (Abb. 12.11c).
Nucleäre Hormonrezeptoren
Einen zweiten Typ von Zinkfingern, die sog. C2C2- bzw. C4-Zinkfinger, findet man bei einer ebenfalls großen Familie von Transkriptionsfaktoren, den sog. nucleären Rezeptoren. Als erste Vertreter dieser Klasse wurden die Steroidhormonrezeptoren entdeckt und charakterisiert. Allerdings zählt diese Familie von Proteinen noch viele weitere, insgesamt etwa 100 Mitglieder, die eine Reihe lipophiler Hormone binden, zu denen neben den Steroidhormonen u.a. auch Vitamin D, die Schilddrüsenhormone und die Retinoide (Vitamin-A-Derivate) gehören. Die Liganden unterscheiden sich zwar in ihrer Funktion und Struktur, weisen jedoch in ihrer Wirkungsweise Gemeinsamkeiten auf. Aufgrund ihrer geringen Molekülgröße und ihrer hydrophoben Eigenschaften durchdringen sie die Zellmembran und gelangen so in das Innere der Zielzelle. Dort binden sie an ihre jeweiligen Rezeptorproteine, wodurch diese aktiviert werden und direkt die Expression von Zielgenen regulieren (Kap. 12.6). Aufgrund dieser funktionellen Gemeinsamkeit nennt man diese Klasse der Hormonrezeptoren auch nucleäre Rezeptoren, weil sie im Unterschied zu den membranständigen Rezeptoren (Kap. 22) ihre Wirkung unmittelbar im Zellkern entfalten.
Struktur der nucleären Hormonrezeptoren
Der grundsätzliche Aufbau der nucleären Rezeptoren ist in Abb. 12.12 gezeigt. Am aminoterminalen Ende besitzen diese Proteine eine Transaktivierungsdomäne (TAD1), auf die eine DNA-Bindungsdomäne (DBD, Zinkfingerdomäne) und die Ligandenbindungsdomäne folgen. Die Ligandenbindungsdomäne ist zusätzlich mit einer weiteren Transaktivierungsdomäne (TAD2) assoziiert. Aufgrund des konservierten Aufbaus zählt man zu den nucleären Rezeptoren – zusätzlich zu den bereits erwähnten Transkriptionsfaktoren, die lipophile Liganden binden – ebenfalls eine Reihe von Proteinen, für die man bis heute keine Liganden identifiziert hat. Diese Transkriptionsfaktoren nennt man Orphan-Rezeptoren (engl. orphan Waisen; Abb. 12.12).
Unterschiede zwischen C2H2- und C4-Typ
Es gibt einige charakteristische Unterschiede zwischen DNA-Bindungsdomänen des C2H2-Typs und denen des C4-Typs. Während die Mitglieder der C2H2-Zinkfingerfamilie charakteristischerweise mehr als drei Finger enthalten, besitzen die C4-Transkriptionsfaktoren immer zwei Zinkfinger. Dabei kommen den beiden Zinkfingern unterschiedliche Funktionen zu. Der N-terminale Finger bindet mittels seiner -Helix spezifisch an die DNA, der C-terminale Finger dagegen stabilisiert diese Struktur und ist gleichzeitig an der Dimerisierung beteiligt (Abb. 12.13a).
Die C4-Proteine binden als Dimer an die DNA, entweder als Homodimer (beide Proteine sind identisch, z.B. Steroidhormonrezeptoren) oder als Heterodimer (Dimerisierung von zwei verschiedenen Proteinen, z.B. Rezeptoren für andere lipophile Hormone/Retinsäure). Der Dimerisierungspartner bei der Bildung der Heterodimere ist meist der Retinsäure-X-Rezeptor (RXR). Obwohl auch der RXR durch einen eigenen Liganden aktiviert werden kann (9-cis-Retinol), werden die Heterodimere durch Bindung des Liganden an den Dimerisierungspartner aktiviert (z.B. Vitamin D, Schilddrüsenhormone etc.). Die Tatsache, dass nucleäre Rezeptoren als Dimere an die DNA binden, spiegelt sich auch in der DNA-Sequenz der Bindungsstellen wider. Diese Bindungsstellen sind aus zwei kurzen Motiven zusammengesetzt, an die je ein Monomer binden kann. Die als Homodimer bindenden Steroidhormone erkennen spezifische Sequenzmotive, die als invertierte Wiederholung angeordnet sind (Abb. 12.13b). Bei den als Heterodimer bindenden Rezeptoren können sich die beiden Sequenzmotive unterscheiden, und es sind auch andere Anordnungen (Palindrom, direkte Wiederholungen) möglich.
Weitere Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren
Neben diesen beiden weitverbreiteten Zinkfingerstrukturen existieren noch andere Klassen, z.B. die Gruppe der GATA-Proteine (binden an die DNA-Basensequenz GATA), die für die Entwicklung der Erythrozyten (GATA1), eines Subtyps von Helfer-T-Lymphozyten (GATA3) oder des Herzmuskels (GATA4) wichtig sind. Auch die GATA-Proteine enthalten zwei C4-Zinkfinger. Bei ihnen ist der erste Zinkfinger für Wechselwirkungen mit weiteren Proteinen verantwortlich, der zweite Zinkfinger vermittelt die Interaktion mit der DNA.
Die basische Leucin-Zipper-Domäne
Leucin-Zipper ist eine Proteindomäne, die bei einer Reihe von Transkriptionsfaktoren gefunden wurde; das erste Mitglied dieser Familie war das c-Jun-Protein. Diesen Proteinen ist eine lange -helikale Region gemeinsam, an deren N-terminalem Ende basische Aminosäuren auffallen. Namensgebend war, dass bei diesen -Helices auf die kurze basische Sequenz eine längere Sequenz (ca. 40 Aminosäuren) folgt, in der jeder siebte Aminosäurerest Leucin ist. Da eine Windung der -Helix 3,6 Aminosäurereste umfasst, liegen die Leucinreste in jeder zweiten Windung übereinander und zeigen alle auf die gleiche Seite der Helix, wodurch eine hydrophobe Interaktionsfläche gebildet wird. Die leucinhaltige -Helix kann mit einer gleichartigen leucinhaltigen -Helix eines zweiten Proteins reißverschlussartig interagieren (daher der Name Leucin-Zipper; engl. zipper: Reißverschluss). Durch die Aneinanderlagerung der Leucinreste bei der Dimerisierung zeigen die hydrophoben Reste der beiden Helices im Komplex nach innen, während nach außen hin hydrophile Bereiche vorherrschen. Die Helices werden durch Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Seitenketten der Leucinreste sowie durch weitere komplementäre Wechselwirkungen zwischen Aminosäureresten der Dimerisierungsflächen zusammengehalten (z.B. elektrostatische Wechselwirkungen zwischen komplementär angeordneten basischen und sauren Aminosäuren). Die eigentliche DNA-Bindungsdomäne befindet sich in der vorgelagerten basischen Region im N-terminalen Bereich (deshalb bLZip für basischer Leucin-Zipper). Direkt unterhalb der Dimerisierungsfläche trennen sich die beiden -Helices und bilden eine Y-ähnliche Struktur. Diese ermöglicht es den basischen Seitenketten der N-terminalen Region der Leucin-Zipper-Struktur, mit der DNA in der großen Furche in Wechselwirkung zu treten (Abb. 12.14a).
Man findet auch Leucin-Zipper-Strukturen ohne basische Domäne. Diese LZip-Strukturen sind dann ausschließlich für Protein-Protein-Wechselwirkungen der entsprechenden Proteine verantwortlich.
Proteine mit Leucin-Zipper-Struktur können Homodimere oder Heterodimere bilden. Allerdings können nicht alle Leucin-Zipper-Proteine miteinander dimerisieren. Dies hängt entscheidend davon ab, wie gut die hydrophoben Oberflächen zweier Leucin-Zipper--Helices zueinander passen. Zu der Gruppe von Proteinen mit einem Leucin-Zipper gehört eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, z.B. CREB/ATF und die Jun/Fos-Proteine, deren heterodimerer Komplex als AP-1 bezeichnet wird (Abb. 12.14b und Kap. 12.6).
Das basische Helix-Loop-Helix-Motiv
Das basische Helix-Loop-Helix-Motiv (bHLH-Motiv) ist mit dem Leucin-Zipper verwandt und hat ebenfalls zwei Funktionen: DNA-Bindung und Proteindimerisierung. Das bHLH-Motiv besteht aus einer kurzen, meist basischen -Helix (enthält zu Beginn basische Aminosäuren), die durch eine Schleife (Loop) mit einer zweiten, längeren -Helix verbunden ist. Die Länge der verbindenden Schleife ist bei den HLH-Proteinen variabel, und sie besteht je nach Protein aus zwölf bis 28 Aminosäuren. Die Flexibilität dieser Schleife erlaubt es einer Helix, sich zurückzufalten und gegen die erste Helix zu legen. Der basische Anteil der ersten Helix stellt spezifische Kontakte mit den Basen der DNA in der großen Furche her. Die doppelte Helixstruktur bindet aber nicht nur DNA, sondern auch ein HLH-Motiv eines zweiten Proteins (Abb. 12.15), wobei sich – ähnlich wie beim Leucin-Zipper – Homo- oder Heterodimere bilden können.
Zu dieser Klasse von Transkriptionsfaktoren gehören eine Reihe wichtiger Regulatoren der zellulären Entwicklung und Differenzierung, wie MyoD oder die E2A-Proteine. MyoD ist ein Hauptregulator der Muskeldifferenzierung, während die E2A-Proteine für die Entwicklung der B-Lymphozyten essenziell sind. Weitere Beispiele für diese Gruppe von Transkriptionsfaktoren sind die Myc-, Mad- und Max-Proteine, die zusätzlich zum bHLH-Motiv noch eine Leucin-Zipper-Struktur enthalten, die dort allerdings nur für die Dimerisierung und nicht für die DNA-Bindung verantwortlich ist (oben).
Kombinatorische Kontrolle durch Dimerisierung
Die Tatsache, dass Transkriptionsfaktoren als Homo- oder Heterodimere an die DNA binden, ist weit verbreitet und eröffnet vielfältige Möglichkeiten. Jedes Monomer eines dimeren Faktors bindet nur die Hälfte der Konsensussequenz des regulatorischen Moduls. Dieser Mechanismus kann von der Zelle genutzt werden, um durch Kombination unterschiedlicher Monomere mit verschiedenen Modulen zu interagieren. Dieser Vorgang ist ökonomisch, da durch die Kombination von drei Proteinen sechs verwandte, aber doch unterschiedliche Bindungsstellen reguliert werden können (Abb. 12.16). Außerdem hat ein Wechsel der Dimerisierungspartner unterschiedliche funktionelle Konsequenzen am gleichen Promotor/Enhancer-Modul. Der bereits erwähnte Transkriptionsfaktor AP-1 ist ein Beispiel für ein variables heterodimeres Protein. Er besteht aus je einer Fos- und einer Jun-Untereinheit, wobei vier verschiedene Fos-Proteine (c-Fos, FosB, Fra1, Fra2) und drei Jun-Proteine (c-Jun, JunB, JunD) heterodimerisieren können. Insgesamt ergeben sich also zwölf Kombinationsmöglichkeiten. In Wirklichkeit gibt es noch mehr Möglichkeiten, da einige der Proteine auch noch Homodimere und Heterodimere mit Mitgliedern der CREB/ATF-Familie bilden können.

Transkriptionsregulierende Domänen von Transkriptionsfaktoren

Wie bereits erwähnt, besitzen Transkriptionsfaktoren neben den DNA-Bindungsdomänen noch eine weitere funktionelle Domäne, nämlich entweder eine Transaktivierungsdomäne (TAD) oder eine Transrepressordomäne (TRD).
Transaktivierungsdomänen
Im Gegensatz zu den DNA-Bindungsdomänen findet man bei den Transaktivierungsdomänen allerdings keine eindeutigen strukturellen Ähnlichkeiten zwischen unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren.
Der Vergleich einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren führte allerdings dazu, dass man Klassen von Aktivierungsdomänen unterscheiden konnte, die jeweils einen hohen Anteil bestimmter Aminosäuren enthalten. So beschreibt man saure Aktivierungsdomänen, in denen Aminosäuren wie Glutamat und Aspartat vorherrschen, und glutamin- oder prolinreiche Aktivierungsdomänen. Biophysikalische Studien haben gezeigt, dass diese Domänen in Lösung häufig unstrukturiert sind. Einige von ihnen können jedoch unter bestimmten Umständen nach Aktivierung (z.B. Ligandenbindung, Phosphorylierung) -Helices und -Stränge bilden.
Funktionell gibt es drei wichtige Aufgaben für Transaktivierungsdomänen:
  • die direkte Interaktion mit generellen Transkriptionsfaktoren, um die Bildung des Initiationskomplexes (IC) zu ermöglichen bzw. zu beschleunigen

  • die Wechselwirkung mit transkriptionellen Coaktivatoren, die neben der effektiven IC-Bildung auch die Chromatinstruktur beeinflussen können (Kap. 12.7)

  • die Rekrutierung von Faktoren an die RNA-Polymerase II, die deren Transkriptionsrate modulieren können.

Verschiedene Transaktivierungsdomänen interagieren direkt mit generellen Transkriptionsfaktoren, u.a. mit TFIIB, TFIID und TFIIF. Diese Interaktionen führen zur Bildung oder Stabilisierung des Initiationskomplexes bzw. im Fall von TFIIF auch zur Modifizierung der RNA-Polymerase-Aktivität. Die Wechselwirkung mit transkriptionellen Coaktivatoren stellt ebenfalls eine wichtige Funktion der Transaktivierungsdomänen dar (Kap. 12.7). Daneben ist es in den vergangenen Jahren gelungen, einen hochmolekularen Multiproteinkomplex aus etwa 30 Proteinen aufzureinigen, der Mediator genannt wird. Die wichtigste Funktion des Mediatorkomplexes besteht darin, die Funktion von Transaktivierungsdomänen zu vermitteln (daher der Name), indem er diese entweder mit der RNA-Polymerase II oder den generellen Transkriptionsfaktoren durch Protein-Protein-Wechselwirkungen verbindet.
Transrepressordomänen
Für die Funktion der Repressordomänen gibt es zwei hauptsächliche Möglichkeiten. Repressordomänen können die Wirkung von Aktivierungsdomänen anderer Transkriptionsfaktoren (die z.B. in der Nähe der Repressoren an die DNA binden) ausschalten, indem sie deren Interaktion mit Coaktivatoren blockieren. Alternativ können Repressordomänen mit Corepressoren interagieren, die dann die Transkription unterdrücken (Kap. 12.7).

MERKE

Transkriptionsfaktoren sind aus funktionellen Domänen aufgebaut. Außer den DNA-Bindungsdomänen, die Wechselwirkungen mit der DNA erlauben, besitzen sie im Regelfall noch transkriptionsregulierende Domänen. Die Strukturen einer Reihe von DNA-Bindungsdomänen wurden aufgeklärt. Die hochspezifische Interaktion mit der DNA wird durch eine Reihe von schwachen Wechselwirkungen erzielt. Durch Homo- bzw. Heterodimerisierung von Transkriptionsfaktoren kann das Spektrum der regulierten Gene erweitert werden.

Regulation der Transkription durch die RNA-Polymerasen I und III

Während die RNA-Polymerase II für die Expression einer großen Zahl unterschiedlicher Gene verantwortlich ist (ca. 20 000), transkribieren die eukaryontischen RNA-Polymerasen I und III nur eine geringe Anzahl von Genen. Dafür sind diese RNA-Polymerasen ausgesprochen aktive Enzyme, die mehr als 95% der gesamten RNA in proliferierenden Zellen erzeugen.

Transkription der ribosomalen RNA-Gene durch RNA-Polymerase I

Der höchste Grad der Spezialisierung ist bei der RNA-Polymerase I erreicht, die nur eine einzige Transkriptionseinheit abliest, nämlich die der ribosomalen RNA-Gene. Diese sog. rDNA (DNA, die für ribosomale RNA kodiert) ist in vielen Kopien im Genom enthalten – beim Menschen sind es etwa 250 seriell hintereinander angeordnete Gene. Wie später noch im Detail beschrieben wird (Kap. 12.10), werden aus dem durch die RNA-Polymerase I erzeugten Primärtranskript (der 45S-rRNA) die ribosomalen 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA-Moleküle durch Prozessierung herausgespalten. Nur die 5S-rRNA wird getrennt durch die RNA-Polymerase III transkribiert. Die 5S-rRNA-Gene sind lediglich 120 Nucleotide lang und liegen ebenfalls in vielen Kopien im Genom vor.
Die RNA-Polymerase I ist in einer bestimmten, abgegrenzten Struktur des Zellkerns, dem Nucleolus, lokalisiert. Die Nucleoli können als ribosomale Fabriken betrachtet werden, in denen die rRNA durch RNA-Polymerase I in den fibrillären Zentren synthetisiert wird und später in den umgebenden granulären Regionen zu funktionellen Ribosomen reift (Abb. 12.46).

Schon gewusst

Die nucleäre Kompartimentierung wurde lange Zeit als eine Besonderheit der RNA-Polymerase I betrachtet. Inzwischen weiß man, dass auch die RNA-Polymerasen II und III bestimmte Orte für die Transkription bevorzugen. Es wurden ungefähr 2000 Stellen im Nucleoplasma identifiziert, an denen RNA-Polymerase-III-Transkription stattfindet. An diesen Stellen wurde keine RNA-Polymerase-II-Aktivität festgestellt. Diese wiederum wurde an ungefähr 8000 separaten Stellen geortet.

Regulation der RNA-Polymerase- I-Transkription

Viele Kopien der rRNA-Gene sind als sich wiederholende Strukturen, meist head to tail" (Kopf an Schwanz; bedeutet direkte Sequenzwiederholung), hintereinander angeordnet. Wie Abb. 12.17 zeigt, findet man dann zwischen den transkribierten Einheiten, auf denen die Information für die rRNA enthalten ist, sog. Intergenic spacers (IGS). In diesen Spacer-Bereichen befinden sich wichtige regulatorische Elemente für die Transkription durch die RNA-Polymerase I. Unmittelbar vor dem Transkriptionsstart findet man den sog. Core-Promotor. Dieser enthält den konservierten ribosomalen Initiator (rInr), eine AT-reiche Sequenz, die sich um die Position +1 befindet. Etwa 50–100 bp stromaufwärts der Startstelle findet man ein weiteres Kontrollelement, das man UCE (upstream control element) nennt.
Weitere Enhancer-ähnliche Elemente finden sich noch weiter stromaufwärts im Spacer-Bereich. Im Spacer-Bereich gibt es auch Startstellen für die RNA-Polymerase, die dort allerdings keine funktionellen RNAs produziert. Vielmehr geht man davon aus, dass dies dazu dient, die RNA-Polymerase-I-Moleküle jeweils zum eigentlichen Promotor hin zu dirigieren. Direkt vor dem UCE befindet sich ein Terminationselement für diese RNA-Polymerasen, der proximale Terminator (PT). Er schützt einerseits den eigentlichen Promotor vor den RNA-Polymerase-I-Molekülen, die im Spacer-Bereich RNA-Synthese initiiert haben; andererseits bewirkt er durch gebundene Faktoren gleichzeitig Chromatin-Remodellierung (Kap. 12.7.3) am Promotor, die dessen Effizienz zur eigentlichen Transkription erhöht.
Die Bildung des Initiationskomplexes am RNA-Polymerase-I-Promotor benötigt weniger Faktoren als an den RNA-Polymerase-II-Promotoren. Am UCE und an den Enhancer-Elementen im Spacer bindet ein einziger Transkriptionsfaktor, der sog. UBF (upstream binding factor), der für die Rekrutierung der basalen Faktoren wichtig ist.

Schon gewusst

Interessanterweise zeigt der Promotor für die RNA-Polymerase I im Gegensatz zu den meisten RNA-Polymerase-II- und -III-Promotoren eine ausgeprägte Speziesspezifität. Die Speziesspezifität wird durch SL1 (Selektivitätsfaktor) vermittelt, einen basalen Transkriptionsfaktor für die RNA-Polymerase I, der sich in verschiedenen Organismen unterscheidet. SL1 enthält insgesamt vier Polypeptide, nämlich TBP (TATA-bindendes Protein), das wir schon bei TFIID kennengelernt haben, und drei weitere Proteine. TBP hat hier allerdings nicht die Funktion, an eine TATA-Sequenz zu binden, sondern seine Aufgabe besteht v.a. in der Bildung des SL1-Komplexes selbst. Nachdem SL1 am Core-Promotor rekrutiert ist, kann die RNA-Polymerase I binden und die Transkription initiieren.

In Gentransferexperimenten konnte gezeigt werden, dass der menschliche Promotor zwar in menschlichen Zellen, aber nicht in Mauszellen aktiv ist. Umgekehrt ist der Mauspromotor nur in der Maus, aber nicht in menschlichen Zellen aktiv. In dieser Hinsicht unterscheiden sich die ribosomalen Gene von einer Vielzahl anderer Gene (vornehmlich durch RNA-Polymerase-II-transkribierte Gene), die in entsprechenden Experimenten untersucht wurden und die diese Speziesspezifität nicht zeigen.

Promotoren der RNA-Polymerase III

Die RNA-Polymerase III ist für die Transkription einer Reihe von kleinen RNA-Molekülen, insbesondere der tRNA sowie der ribosomalen 5S-RNA, verantwortlich. Die auffälligste und ungewöhnlichste Eigenschaft vieler RNA-Polymerase-III-Promotoren ist, dass sich die erforderlichen Sequenzelemente im transkribierten Bereich selbst, also stromabwärts von +1, befinden. Diese internen cis-regulatorischen Elemente sind nach der Transkription Bestandteil der funktionellen RNA.
Der häufigste Promotortyp für die RNA-Polymerase III wird in den tRNA-Genen gefunden. Beim Menschen gibt es aufgrund von Genduplikationen etwa 1000 tRNA-Gene und folglich ebenso viele Promotoren. Diese tRNA-Gen-Promotoren bestehen aus zwei konservierten Sequenzblöcken, der A-Box und der B-Box, in der transkribierten Region (Abb. 12.18). An diese beiden Sequenzblöcke bindet der Transkriptionsfaktor TFIIIC, der dann die Rekrutierung eines weiteren Faktors, TFIIIB, im Bereich der Startstelle der Transkription ermöglicht. Die Bindung von TFIIIB ist Voraussetzung dafür, dass die RNA-Polymerase III in den Präinitiationskomplex eintritt und die Gene transkribiert. TFIIIB enthält ebenso wie TFIID (RNA-Polymerase II) und SL1 (RNA-Polymerase I) das TATA-bindende Protein TBP.
Eine Modifikation dieses Promotortyps findet man bei den amplifizierten Genen für die 5S-rRNA. Diese 5S-rRNA-Gene enthalten eine andere interne Kontrollsequenz, die man C-Box nennt (Abb. 12.18). An diese C-Box bindet ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, das TFIIIA-Protein, das zur Klasse der Zinkfingerproteine gehört. TFIIIA rekrutiert dann den TFIIIC-Faktor, der wiederum Voraussetzung für die Bindung von TFIIIB und RNA-Polymerase III ist.

Schon gewusst

Interessanterweise gibt es aber auch eine kleine Anzahl von RNA-Polymerase-III-Promotoren, deren Kontrollelemente stromaufwärts des Transkriptionsstarts liegen. Ein gut untersuchtes Beispiel ist der Promotor für das U6-snRNA-Gen von Maus und Mensch (Abb. 12.18). Wir werden die Rolle der U6-RNA bei der mRNA-Prozessierung später noch kennenlernen (Kap. 12.10). Dieser Promotor enthält eine TATA-Box 25 bp vor dem Transkriptionsstart sowie zwei weitere regulatorische Elemente, die man als proximales und distales Sequenzelement (PSE und DSE) bezeichnet. Hier binden Faktoren an die PSE- und DSE-Motive, wodurch TFIIIB und die RNA-Polymerase III an die Startstelle der Transkription rekrutiert werden. Obwohl diese Promotoren eine TATA-Box enthalten und obwohl der an das DSE-Motiv bindende Transkriptionsfaktor auch regulatorische Elemente für die RNA-Polymerase II bindet (den Oct1-Transkriptionsfaktor, ein Mitglied der Homöodomänenproteine, das ebenfalls direkt an das DSE-Motiv bindet), wird das U6-Gen ausschließlich durch die RNA-Polymerase III transkribiert.

MERKE

Die Transkription nucleärer Gene wird durch drei RNA-Polymerasen gewährleistet, RNA-Polymerase I, II und III, wobei jede dieser RNA-Polymerasen nur bestimmte Gene transkribiert. Während RNA-Polymerase I und III (im Gegensatz zu Pol II) nur eine sehr geringe Anzahl an Genen transkribieren, sind diese doch hochaktive Moleküle, die ca. 95% der Gesamt-RNA in proliferierenden Zellen synthetisieren. Die Prinzipien der Regulation der Transkription sind bei allen drei RNA-Polymerasen konserviert. Spezifische Transkriptionsfaktoren binden an konservierte Promotor- und Enhancer-Elemente und regulieren die Initiationsrate der entsprechenden RNA-Polymerasen an den jeweiligen Genen.

Regulation der Funktion und Aktivität von Transkriptionsfaktoren

Die Kontrolle der Transkriptionsrate stellt eine entscheidende Regulationsebene von außerordentlicher Bedeutung dar. Sie erfolgt wesentlich durch die Regulation der Funktion und Aktivität von genspezifischen Transkriptionsfaktoren. Diese Kontrolle ist von besonderer Relevanz, da die Deregulation einer ganzen Reihe der nachfolgend beschriebenen Transkriptionsfaktoren für die neoplastische Transformation von Zellen beider Tumorentstehung verantwortlich ist. Daher muss die Aktivität der Transkriptionsfaktoren streng kontrolliert werden.
Die Zelle hat verschiedene Möglichkeiten entwickelt, um die Aktivität eines Transkriptionsfaktors zu regulieren. Dazu gehören u.a. die koordinierte Synthese, die Regulation der Proteinstabilität, die kovalente Modifikation, die Ligandenbindung, die subzelluläre Lokalisation, die Assoziation mit inhibitorischen Proteinen, die partielle Proteolyse und der Austausch von Dimerisierungspartnern. Im Folgenden werden Beispiele für diese grundsätzlichen Regulationsmöglichkeiten etwas ausführlicher beschrieben. Bei den meisten Beispielen kommen jedoch gleichzeitig mehrere Regelmechanismen zum Tragen. Außerdem sei an dieser Stelle daran erinnert, dass die regulatorischen Elemente aller proteinkodierenden Gene Bindungsstellen für eine Reihe von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die kombinierte Aktion verschiedener, nachfolgend beschriebener Mechanismen ermöglicht eine hochspezifische Feinregulation der Genexpression.

Kontrolle der Synthese und des Abbaus

Von einer Reihe von Transkriptionsfaktoren ist bekannt, dass sie spezifisch nur in einem oder wenigen Zelltypen exprimiert werden. Diese Faktoren spielen häufig eine wichtige Rolle bei der Etablierung der zellulären Identität bzw. der Manifestierung des differenzierten Zellphänotyps, indem sie die Expression von Zielgenen kontrollieren, die für die jeweilige Zelle typisch sind. Beispiele hierfür sind die Homöodomänenproteine, die wichtige Entscheidungen in der Embryonalentwicklung kontrollieren, sowie die basischen Helix-Loop-Helix-(bHLH-)Proteine der MyoD-Familie, die für die Muskelentwicklung essenziell sind.
Die kontrollierte Neusynthese von Transkriptionsfaktoren wird auch genutzt, wenn Zellen auf ein externes Signal reagieren. Als Beispiel wird hier der Transkriptionsfaktor AP-1 (Aktivator-Protein-1) beschrieben.
Aktivator-Protein-1 (AP-1)
AP-1 ist ein dimerer Transkriptionsfaktor, der aus Leucin-Zipper-Proteinen der Jun-, Fos- und ATF-Familien (ATF von activating transcription factor) besteht (Kap. 12.4). Er spielt sowohl bei Entwicklungsprozessen als auch bei der schnellen Antwort einer Zelle auf wachstumsinduzierende und stressverursachende Stimuli eine Rolle.
Einer der Mechanismen, durch den die Aktivität von AP-1 kontrolliert wird, ist die koordinierte Synthese der Untereinheiten c-Fos und c-Jun. Die entsprechenden Gene werden nach Stimulation der Zelle durch ein Wachstumssignal sehr rasch verstärkt exprimiert und nach kurzer Zeit (gewöhnlich weniger als 1 h) bereits wieder abgeschaltet. Daher werden sie auch als Immediate early response genes bezeichnet.
Expression des c-Fos-Gens
Der Prototyp des AP-1-Transkriptionsfaktors ist ein Heterodimer aus c-Fos und c-Jun. Die Expression des c-Fos-Gens wird massiv verstärkt, wenn in vitro kultivierte Zellen durch Zugabe von Serum (einem Gemisch aus Wachstumsfaktoren) oder von einzelnen Wachstumsfaktoren stimuliert werden. Ein Sequenzmodul im Promotor des c-Fos-Gens ist entscheidend für diese Induktion der Transkription verantwortlich, nämlich das sog. SRE (serum response element). Dieses Element wird von einem SRF-Dimer (SRF von serum response factor), einem Transkriptionsfaktor, gebunden. Nach Bindung von SRF wird ein weiterer Transkriptionsfaktor namens Elk/p62TCF rekrutiert. Dadurch bildet sich ein ternärer Komplex aus drei Komponenten: DNA, SRF und p62TCF. Dieser Komplex liegt schon in ruhenden Zellen vor, ist aber inaktiv. Nach Serumstimulation wird über eine Kette von Phosphorylierungsreaktionen durch MAP-Kinase-Kaskaden (Kap. 22.4.2) letztendlich eine Protein-Kinase aktiviert, die p62TCF an drei C-terminalen Aminosäuren phosphorylieren kann und dadurch die Transaktivierung durch den ternären Komplex bewirkt (Abb. 12.19).
Expression des c-Jun-Gens
Ein ähnlicher Regulationsmechanismus liegt auch beim c-Jun-Gen vor. Im unstimulierten Zustand findet man in der Zelle nur geringe Mengen an c-Jun-Protein. c-Jun ist allerdings bereits als Heterodimer mit ATF2 am Promotor des eigenen Gens (dem c-Jun-Promotor) gebunden. Nach Stimulation wird dieses in geringer Menge vorkommende c-Jun ebenso wie ATF2 stark aktiviert, indem die Transaktivierungsdomänen ebenfalls durch MAP-Kinasen (JNK von c-Jun-N-terminale Kinase) phosphoryliert werden. Dies führt zur verstärkten Expression und damit zur Neusynthese von zusätzlichem c-Jun-Protein.
Kontrollierter Abbau der c-Jun- und c-Fos-Proteine
Sowohl das c-Jun- als auch das c-Fos-Gen fördern die Zellteilung. In der Zelle müssen die Mengen dieser beiden Proteine also streng kontrolliert werden, da es sonst zur Tumorbildung kommen kann. Für beide Gene ist tatsächlich eine Beteiligung an Zelltransformationsprozessen vielfach nachgewiesen worden (sie werden deshalb auch als Protoonkogene bezeichnet). Ein zusätzlicher Mechanismus liegt nun darin, nicht nur die Synthese, sondern auch den Abbau der beiden Proteine zu kontrollieren. Das c-Jun-Protein besitzt eine sehr kurze Halbwertszeit, die durch die bereits zuvor erwähnte Phosphorylierung der Transaktivierungsdomäne deutlich verlängert wird. Nichtphosphoryliertes c-Jun-Protein wird rasch ubiquitinyliert und durch das Proteasom abgebaut. Dabei wird auch der Heterodimerisierungspartner c-Fos mit abgebaut.
Hypoxieinduzierter Faktor (HIF-1)
Auch die Aktivität des hypoxieinduzierten Faktors (HIF-1) wird durch kontrollierten Abbau reguliert. HIF-1 besteht aus zwei Untereinheiten, HIF-1 und HIF-1. Beide Untereinheiten werden konstitutiv synthetisiert. Bei normalem Sauerstoffpartialdruck wird HIF-1 durch eine Prolylhydroxylase an einem Prolinrest hydroxyliert (Mechanismus entspricht der Vitamin-C-abhängigen Prolinhydroxylierung von Kollagenen, Kap. 20.2.1); dies dient als Signal für die Ubiquitinylierung und den proteasomvermittelten Abbau. Bei Sauerstoffmangel (Hypoxie) ist dieser sauerstoffverbrauchende Oxidationsschritt beeinträchtigt und der HIF-1-Abbauweg somit blockiert, sodass sich das Protein anreichert. HIF-1 wird aktiv und reguliert die Expression von Genen, die die Sauerstoffversorgung des Gewebes verbessern, z.B. Expression von Erythropoetin (EPO) oder von Wachstumsfaktoren für die Bildung von Blutgefäßen (Angiogenese).

Kovalente Modifikation

Aktivierung durch Phosphorylierung
Ein wichtiger Mechanismus, der bei der Regulation vieler zellulärer Prozesse eingesetzt wird, ist die Proteinphosphorylierung. Wie wir bereits bei der Regulation der c-Fos- und c-Jun-Gene gesehen haben, wird diese Modifikation genutzt, um die Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren zu modulieren. Dies soll nun am Beispiel von CREB, dem JAK/STAT- und dem TGF-/Smad-Signaltransduktionsweg eingehender besprochen werden.
PKA/CREB-Signaltransduktionsweg
Eine Reihe von Hormonen (Adrenalin, Noradrenalin, Glucagon u.a.) vermittelt ihre spezifischen Effekte durch Bindung an Transmembranrezeptoren, die auf der zytoplasmatischen Seite mit heterotrimeren G-Proteinen interagieren (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren; Kap. 22.2). Die aus drei Untereinheiten (-, - und -Untereinheit) bestehenden G-Proteine existieren in einer GDP-gebundenen (inaktiv) und einer GTP-gebundenen Form (aktiv). Eine Bindung des Hormons an den Rezeptor führt zum Austausch von GDP gegen GTP und somit zur Aktivierung und Dissoziation des G-Proteins. Bestimmte aktive G-Proteine können die Adenylatcyclase stimulieren und somit die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen. Dies führt zur Induktion einer Reihe von Genen, deren Promotor eine bestimmte Sequenz enthält, nämlich ein sog. cAMP responsive element (CRE). Dieses Promotorelement wird von einer Familie von Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktoren gebunden, die als CREB (CRE-binding protein) bezeichnet werden und sich als Dimere an die DNA anlagern. Die durch cAMP aktivierte Protein-Kinase A (PKA) kann in den Kern translozieren und einen spezifischen Serinrest der CREB-Proteine phosphorylieren. Dadurch wird deren Transaktivierungspotenzial gesteigert (Abb. 12.20). CREB spielt beispielsweise im Nervensystem als Schutz gegen neurotoxische Stimuli und bei der Ausbildung des Langzeitgedächtnisses eine wichtige Rolle.
Wir hatten auch schon bei Prokaryonten die Rolle von cAMP bei der Regulation der Genexpression kennengelernt. Während dort aber cAMP direkt mit dem Transkriptionsfaktor interagiert (CAP), verläuft die Aktivierung bei Eukaryonten indirekt, nämlich über die Protein-Kinase A.
Mittlerweile konnte auch gezeigt werden, dass neben dem klassischen CREB-Aktivierungsweg über cAMP und PKA auch Signaltransduktionswege über mitogenaktivierte Protein-Kinasen sowie Ca2+- und calmodulinabhängige Protein-Kinasen zur CREB-Phosphorylierung führen können.
JAK/STAT-Signaltransduktionsweg
Auch die Transkriptionsfaktoren der STAT-Familie (signal transducers and activators of transcription) werden durch Phosphorylierung reguliert. Man kennt heute sieben Mitglieder der STAT-Familie, die durch Interferone, Zytokine (Hormone, die Wachstums- und Differenzierungsprozesse in unterschiedlichen Zelltypen steuern) und Wachstumsfaktoren aktiviert werden. STAT-Proteine sind u.a. für interferonabhängige antivirale Antworten sowie die Entwicklung verschiedener Zellpopulationen (z.B. des hämatopoetischen Systems) nötig.
Im Gegensatz zum vorher beschriebenen CREB-Aktivierungsweg, bei dem der aktivierte Rezeptor über den zweiten Botenstoff cAMP und die Protein-Kinase A wirkte, stellt in diesem Fall der Transkriptionsfaktor selbst die Verbindung zwischen aktiviertem Rezeptor und Zellkern her (Abb. 12.21).
Die entsprechenden membranständigen Rezeptoren verfügen zwar selbst nicht über eine katalytische Domäne, sie sind aber auf der zytoplasmatischen Seite mit einer Klasse von Tyrosin-Kinasen assoziiert, die man JAK nennt (Janus-Kinasen, in Anspielung auf das Vorhandensein von zwei Kinasedomänen, von denen jedoch nur eine funktionell ist; Kap. 22.6.1). Nach der Bindung des Liganden an den Rezeptor kann dieser dimerisieren, was zur Phosphorylierung von Tyrosinresten am Rezeptor durch JAK-Kinasen führt. Diese Phosphotyrosinreste stellen Andockstellen für die STAT-Proteine dar. Nachdem die STAT-Proteine an den Rezeptor gebunden haben, werden sie durch die rezeptorgebundenen JAK-Kinasen ebenfalls an Tyrosinresten phosphoryliert. Dies führt zur Dissoziation der STAT-Proteine vom Rezeptor und zur Dimerisierung. Die Dimere translozieren dann in den Zellkern und aktivieren die Transkription ihrer Zielgene.
TGF-/Smad-Signaltransduktionsweg
Die Smad-Proteine (Sma- and Mad-homologues, zunächst bei Drosophila und Caenorhabditis elegans entdeckt) werden durch Bindung von Wachstumsfaktoren der TGF--Superfamilie (TGF von transforming growth factor) an ihre Rezeptoren aktiviert (Kap. 22.5.1). Diese sind von Drosophila bis zum Menschen konserviert und spielen eine wichtige Rolle bei zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Mitglieder dieser Familie sind aber auch an der Regulation von Entwicklungsprozessen wie der embryonalen Musterbildung und Knochenmorphogenese beteiligt.
Für Mitglieder der TGF--Superfamilie existieren zwei Typen von Rezeptoren, die jeweils Serin- und Threonin-Kinase-Aktivität besitzen. Typ-II-Rezeptoren binden den Liganden, dimerisieren mit Typ-I-Rezeptoren und können diese durch Phosphorylierung aktivieren. Die aktivierten Typ-I-Rezeptoren sind nun in der Lage, Smad-Proteine (sog. Rezeptor-Smad bzw. R-Smad) an spezifischen Serinresten zu phosphorylieren. Diese Modifikation hebt inhibitorische Wechselwirkungen innerhalb der Smad-Proteine auf und erlaubt es ihnen, mit sog. Co-Smad-Proteinen (Smad4) zu assoziieren. Smad4 bindet nicht selbst an den Rezeptor, kann aber mit den rezeptorregulierten Smad-Proteinen transkriptionell aktive Heterodimere bilden. Diese Heterodimere können in den Kern wandern und dort die Transkription ihrer Zielgene aktivieren (Abb. 12.22).
Aktivierung durch Dephosphorylierung
Neben der Aktivierung durch Phosphorylierung kann ein Transkriptionsfaktor auch durch Dephosphorylierung aktiviert werden. So liegen die Mitglieder der NFAT-Familie (NFAT von nuclear factor of activated T-cells), die für Entwicklung und Aktivierung von T-Lymphozyten wichtig sind, im unstimulierten Zustand phosphoryliert im Zytoplasma vor. Nach Zellaktivierung kommt es zunächst zu einem Anstieg der intrazellulären Ca-Ionen-Konzentration. Ca-Ionen binden an das Protein Calmodulin, und das Ca-Calmodulin aktiviert daraufhin die Protein-Phosphatase Calcineurin. Calcineurin ist nun in der Lage, die NFAT-Proteine an spezifischen Serinresten zu dephosphorylieren, wodurch sie in den Zellkern translozieren können, um die Transkription zu stimulieren. Durch erneute Phosphorylierung der nucleären NFAT-Proteine wird der Export aus dem Kern induziert (Abb. 12.23).

Klinik

Immunsuppression durch Cyclosporin A und Tacrolimus

Immunsuppression ist von entscheidender medizinischer Bedeutung, z.B. nach Organtransplantationen. Zwei wichtige Immunsuppressiva sind Cyclosporin A (CsA, auch Ciclosporin), ein zyklisches, elf Aminosäuren langes Peptid aus Schlauchpilzen, und Tacrolimus (FK506), ein Makrolid aus Schimmelpilzen. Der Wirkmechanismus dieser beiden Substanzen ist sehr ähnlich. Sie binden intrazellulär an Rezeptoren (Cyclophiline für CsA bzw. FK-bindende Proteine für FK506) und können in dieser proteinkomplexierten Form das Calcineurin inhibieren (Abb. 12.23). Die wichtigsten Zielmoleküle von Calcineurin in T-Zellen stellen die NFAT-Transkriptionsfaktoren dar, die für die Aktivierung der T-Zellen verantwortlich sind.
Weitere kovalente Modifikationen
Heute weiß man, dass nicht nur die reversible Phosphorylierung einen wichtigen Regulationsmechanismus darstellt, sondern dass auch andere kovalente Modifikationen wie die Acetylierung, die Glykosylierung oder die Kopplung mit kleinen Polypeptiden bei der Ubiquitinylierung oder Sumoylierung die Aktivität von Transkriptionsfaktoren beeinflussen können.

Ligandenbindung

Einen noch direkteren Weg vom Liganden zur Transkriptionsaktivierung stellen die nucleären Rezeptoren dar, zu denen u.a. die Steroidhormon-, Retinsäure-, Vitamin-D- und Schilddrüsenhormonrezeptoren gehören (Kap. 24.1.2). Diese Rezeptoren entfalten ihre Aktivität unmittelbar im Zellkern. In allen diesen Fällen ist der Ligand (z.B. ein Hormon) lipophil und kann deshalb die Plasmamembran durchdringen. In der Zelle bindet das Hormon an seinen Rezeptor, einen Transkriptionsfaktor der C4-Zinkfinger-Familie, und bewirkt dessen Aktivierung. Im Gegensatz zu den hauptsächlich phosphorylierungsabhängigen Aktivierungswegen findet hier keine intrazelluläre Signaltransduktion statt, sondern das extrazelluläre Signal selbst trägt zur Genregulation bei. Nucleäre Rezeptoren sind für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig, z.B. die Entwicklung der Sexualorgane, aber auch für die Kontrolle des Elektrolyt- und Wasserhaushalts und von Stoffwechselprozessen wie Gluconeogenese und Cholesterinhomöostase.
Im Fall der Glucocorticoidhormone bindet der Ligand im Zytoplasma an seinen Rezeptor. Dies bewirkt zunächst, dass ein inhibitorischer Proteinkomplex abdissoziiert, der aus dem Hitzeschockprotein Hsp90 und anderen Proteinen besteht. Danach können die Rezeptoren dimerisieren, als Homodimer in den Kern wandern und die Transkription ihrer Zielgene aktivieren (Abb. 12.24).
Dagegen sind die Rezeptoren für die Schilddrüsenhormone (thyroid receptor TR) und Retinsäure (retinoic acid receptor RAR) nicht mit Hitzeschockproteinen assoziiert und binden bereits in Abwesenheit ihres Liganden als Heterodimer mit RXR (Retinsäure-X-Rezeptor) an ihre Zielsequenz in der DNA. Die Bindung des Liganden bewirkt hier die Abdissoziation von Corepressoren und tauscht diese gegen Coaktivatoren aus (Abb. 12.25). Diese Hormonrezeptoren erfüllen also zwei Aufgaben: In Abwesenheit des aktivierenden Liganden binden sie an ihre Zielgene und unterdrücken deren Expression, nach Ligandenbindung kommt es zur spezifischen Genaktivierung.

Klinik

Durch Mutation veränderte Funktionen von nucleären Rezeptoren können nicht nur korrespondierende metabolische Störungen hervorrufen, sondern auch zur Tumorbildung führen. Ein Beispiel hierfür ist die akute promyelozytische Leukämie (APL). Diese Krankheit entsteht aufgrund von chromosomalen Translokationen, die alle eine Fusion des Retinsäurerezeptor--Gens mit einem anderen Gen zur Folge haben. Der häufigste Fusionspartner ist das PML-Gen (PML von promyelocytic leukemia), das normalerweise als Wachstumssuppressor fungiert. Das Fusionsprotein hat eine veränderte Funktion, die eine Akkumulation myeloider Vorläuferzellen im Knochenmark bewirkt. Patienten, die an diesen Tumoren leiden, können allerdings in der Regel erfolgreich mit Vitamin A (Vorläufer der Retinsäure) bzw. mit all-trans-Retinsäure behandelt werden, wodurch die veränderte Funktion des Fusionsproteins inhibiert wird.

Interaktion mit Inhibitorproteinen

NF-B wurde ursprünglich in B-Lymphozyten als ein konstitutiv aktiver Transkriptionsfaktor identifiziert, der die Expression der leichten -Kette der Immunglobuline reguliert. NF-B ist aber auch in den meisten anderen Zellen vorhanden, liegt dort jedoch in einer inaktiven Form im Zytoplasma vor. Kontrolliert wird die Aktivität von NF-B durch eine andere Familie von Proteinen, die IB-Inhibitorproteine, die mit den NF-B-Dimeren in nichtstimulierten Zellen einen Komplex bilden. Aufgrund dieser Wechselwirkung kann NF-B weder in den Kern wandern noch an die DNA binden. Wird die Zelle stimuliert, kommt es zur Aktivierung eines IB-Kinase-Komplexes, der in der Lage ist, die IB-Proteine zu phosphorylieren. Der IB-Kinase-Komplex besteht aus zwei katalytischen Untereinheiten (IKK1 oder IKK sowie IKK2 oder IKK) und einer regulatorischen Untereinheit, die für die Aktivierung des Komplexes entscheidend ist (NEMO oder IKK). Die Phosphorylierung des IB-Inhibitorproteins wird v.a. durch das Enzym IKK2/IKK katalysiert. Diese Phosphorylierung ist ein Signal für die Modifikation der IB-Proteine durch Ubiquitinylierung. Polyubiquitinylierte IB-Proteine werden durch das Proteasom abgebaut. Dadurch wird NF-B freigesetzt, kann in den Kern wandern und dort die Transkription seiner Zielgene starten (Abb. 12.26).
NF-B wirkt wie andere bereits besprochene Transkriptionsfaktoren als Dimer. Als Untereinheiten können fünf verschiedene Proteine dienen, p50, p52, RelA, RelB und c-Rel, die untereinander Homo- und Heterodimere bilden können.

Klinik

NF-B wird in Zellen als schnelle Antwort auf Stress- bzw. entzündliche Situationen aktiviert und spielt außerdem eine Rolle bei Wachstums- und Differenzierungsprozessen sowie der Regulation der Apoptose verschiedener Zellen. Die verantwortlichen Stimuli können völlig unterschiedlicher Natur sein, z.B. oxidativer Stress, proinflammatorische Zytokine wie TNF- oder IL-1 (Mediatoren der systemischen Entzündungsreaktion), bakterielle und virale Infektionen sowie eine Reihe von DNA-schädigenden Stoffen (z.B. Chemotherapeutika). Der Vielfalt der induzierenden Stimuli entsprechend aktiviert NF-B auch eine Vielfalt von Zielgenen, die für die oben beschriebenen physiologischen Zellantworten verantwortlich sind.

Die Hauptfunktion von NF-B liegt in der Steuerung der zellulären Antwort auf die genannten Stimuli. Deregulierte bzw. überschießende NF-B-Aktivität führt allerdings zu einer Reihe von Krankheitszuständen. Zum Beispiel bewirkt NF-B die transkriptionelle Aktivierung des HIV-Provirus und fördert dadurch die Verpackung in infektiöse Viren. Außerdem spielt NF-B sowohl bei akuten neurologischen Erkrankungen wie dem Schlaganfall als auch bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer eine Rolle. Aufgrund seiner Aktivierung durch proinflammatorische Stimuli und der Regulation von Genen, die mit Entzündungen assoziiert sind, ist NF-B an verschiedenen entzündlichen Krankheiten beteiligt, z.B. an der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis sowie der Atherosklerose. Schließlich findet man in einer Vielzahl unterschiedlicher Tumoren häufig eine NF-B-Deregulation. Auch verschiedene transformierende virale Proteine können zur Aktivierung von NF-B führen.

Eine wichtige Regulation der NF-B-Funktion kann durch Behandlung mit den als antiinflammatorischen Wirkstoffen eingesetzten Glucocorticoiden erzielt werden. Wir hatten bereits gesehen, dass Glucocorticoide in der Zelle an ihre Rezeptoren binden, die selbst Transkriptionsfaktorfunktion besitzen. Zusätzlich zur direkten Genregulation kann der aktivierte Glucocorticoidrezeptor allerdings auch mit aktiviertem NF-B interagieren. Dies führt zur Blockade der transkriptionellen Aktivität von NF-B und somit zur Hemmung der entsprechenden Zielgene. Durch einen ähnlichen Mechanismus kann der Glucocorticoidrezeptor auch die Aktivität des AP-1-Transkriptionsfaktors (Kap. 12.6.1) beeinflussen. Man weiß heute, dass diese Wirkung des Glucocorticoidrezeptors ganz entscheidend für die entzündungshemmenden Eigenschaften der Corticosteroide verantwortlich ist.

E2F bezeichnet eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die für die zellzyklusabhängige Aktivierung von Genen – z.B. für DNA-Polymerase , Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) und Thymidin-Kinase – notwendig ist. Diese Enzyme steuern zum einen die DNA-Replikation, zum anderen stellen sie Nucleotide für die DNA-Synthese bereit. Aufgrund seiner wichtigen Funktion bei der Zellzykluskontrolle muss E2F streng kontrolliert werden. E2F-Proteine binden als Heterodimere mit einem weiteren Protein (DP) an ihre Zielsequenzen. Die funktionelle Kontrolle geschieht durch Wechselwirkungen mit einem weiteren Protein, dem Retinoblastomprotein.

Dimerisierung

Regulation von MyoD
MyoD gehört zur Familie der bHLH-Proteine und ist ein zentraler Regulator des Muskeldifferenzierungsprogramms. Dies geschieht durch Induktion weiterer myogener Transkriptionsfaktoren wie Myogenin, die ihrerseits die Expression der muskelspezifischen Gene (z.B. für die Actin- und Myosinbausteine des kontraktilen Apparats) anschalten. MyoD bindet v.a. als Heterodimer mit E2A-Proteinen an die Zielsequenz in der DNA (sog. E-Box). Da MyoD nur in ruhenden Zellen die Differenzierung veranlassen kann, muss es in proliferierenden Zellen einen Regelmechanismus geben, der den Transkriptionsfaktor hemmt. Eine Möglichkeit besteht in der Assoziation mit dem Protein Id (Inhibitor der Differenzierung), das die DNA-Bindung hemmt (Abb. 12.27). Id bildet sowohl mit MyoD als auch mit seinem Dimerisierungspartner (E2A) jeweils einen Komplex. Da aber Id keine DNA-Bindungsdomäne enthält, können diese Heterodimere nicht an die DNA binden und die Transaktivierung veranlassen. Kommt die Proliferation der Zellen zum Stillstand, wird das Id-Protein abgebaut, und die freigesetzten MyoD- und E2A-Proteine können transkriptionell aktive Dimere bilden.
Regulation von Myc
Myc gehört ebenso wie MyoD zur Klasse der bHLH-Proteine, es besitzt aber zusätzlich eine weitere Protein-Protein-Interaktionsdomäne, nämlich einen Leucin-Zipper (bHLH-LZip). Für die Bindung von Myc an seine Erkennungssequenz (E-Box) ist die Dimerisierung mit einem Partnerprotein namens Max (Myc-associated protein X) nötig. Auch bei Max handelt es sich um ein bHLH-LZip-Protein. Myc/Max-Heterodimere sind potente Aktivatoren der von ihnen regulierten Zielgene. Die Zielgene selbst sind an der Regulation des Zellzyklus (Zellteilung) sowie der Apoptose beteiligt. Es gibt allerdings in der Zelle noch einen zweiten Dimerisierungspartner von Max, nämlich das Mad-Protein (Mad von Max dimerization). Im Gegensatz zu den Myc/Max-Heterodimeren, die Zielgene aktivieren, handelt es sich bei den Mad/Max-Heterodimeren um transkriptionelle Repressoren (Abb. 12.28). Konsequenterweise vermitteln die Mad/Max-Heterodimere ein Ausbleiben der Zellteilung, und sie sind somit für die zelluläre Differenzierung wichtig.

Klinik

Das Myc-Protein ist bereits seit Langem als Onkoprotein bzw. Protoonkoprotein bekannt. So war das Myc-Gen eines der ersten Gene, dessen Fehlregulation unmittelbar mit Tumorerkrankungen des Menschen in Zusammenhang gebracht wurde. Bei Burkitt-B-Zell-Lymphomen findet man charakteristische Translokationen, die dazu führen, dass das c-Myc-Gen unter die transkriptionelle Kontrolle der starken Immunglobulin-Enhancer-Elemente gelangt. Auf diese Weise überexprimiertes Myc-Protein ist für die Transformation der B-Zellen verantwortlich. Heute weiß man, dass eine Deregulation von Myc auch an der Entstehung vieler anderer Tumoren beteiligt ist.

Wir erkennen an diesen Beispielen, wie durch wechselnde Partnerschaften an einem spezifischen cis-Element (z.B. dem E-Box-Motiv) entweder Genaktivierung oder Genrepression vermittelt werden kann. Die Mengen an Myc- oder Id-Protein können in der Zelle reguliert werden, um somit den jeweiligen Effekt auszulösen.
In den letzten Jahren hat das Myc-Protein aus vielen Gründen große Beachtung erfahren. Es reguliert vermutlich die Expression einer großen Zahl der RNA-Polymerase-II-transkribierten Gene (schätzungsweise 10% aller Gene werden von Myc reguliert). Zusätzlich zeigte sich, dass Myc auch im Nucleolus vorliegt und dort die Aktivität der RNA-Polymerase I reguliert.

Partielle Proteolyse

Ein besonderer Mechanismus zur Aktivierung eines Transkriptionsfaktors ist bei der Familie der Notch-Proteine realisiert. Notch-Proteine sind in der Evolution sehr gut konserviert, und sie regulieren in Invertebraten und Vertebraten wichtige zelluläre Differenzierungsvorgänge. In seiner inaktiven Form ist Notch ein transmembranäres Protein, bestehend aus einer extrazellulären ligandenbindenden Domäne und einer intrazellulären Signaldomäne. Nach Bindung der extrazellulären Domäne an ebenfalls membranständige Liganden, wie z.B. das Delta-like-1-Protein (Dll1), kommt es zu zwei definierten endoproteolytischen Schritten, die die intrazelluläre Domäne freisetzen.
Der erste Proteolyseschritt (S2), der in Vertebraten durch die Metalloprotease TACE vermittelt wird, setzt die extrazelluläre Domäne frei und führt gleichzeitig zur zweiten Proteolyse (S3). Erst durch diesen Proteolyseschritt, der durch die -Secretase erfolgt, kommt es zur Abtrennung der intrazellulären Notch-Domäne. Die freie intrazelluläre Notch-Domäne transloziert nun in den Zellkern und bindet dort an den DNA-gebundenden RBP-J-Komplex (Abb. 12.29). In Abwesenheit von Notch reprimiert RBP-J über assoziierte Corepressorproteine die Transkription. Nach Bindung von Notch kommt es zur Rekrutierung von Coaktivatoren, und die Transkription der Zielgene wird induziert. Einen ähnlichen Umschaltmechanismus hatten wir bei den Rezeptoren für Schilddrüsenhormone, Retinsäure und Vitamin D3 bereits kennengelernt (Abb. 12.25).
Auch weitere Transkriptionsfaktoren werden durch partielle Proteolyse reguliert, so z.B. der Transkriptionsfaktor SREBP, der für die Regulation der Expression von Enzymen der Cholesterinbiosynthese entscheidend ist (Kap. 18.3.1).

MERKE

Die Kontrolle der Aktivität von Transkriptionsfaktoren kann auf verschiedenen Ebenen stattfinden: durch Kontrolle der Synthese oder des Abbaus, durch kovalente Modifikationen (z.B. Phosphorylierung), durch Ligandenbindung, durch die Assoziation mit inhibitorischen Proteinen oder durch Wechsel der Bindungspartner. Bei vielen Transkriptionsfaktoren greifen mehrere dieser Kontrollmechanismen ineinander, sodass ein kompliziertes Netzwerk von Regulationsmöglichkeiten entsteht.

Kontrolle der Genexpression durch Coaktivatoren und Corepressoren

Die exakten Mechanismen, durch die Transkriptionsfaktoren den Transkriptionsprozess positiv oder negativ beeinflussen, sind zwar noch nicht im letzten Detail aufgeklärt, es gibt heute aber bereits gute Modelle, die diese Prozesse erklären. Ein zentraler Mechanismus besteht darin, den Präinitiationskomplex am Promotor eines Gens auszubilden. Dafür ist die effiziente Rekrutierung der basalen Komponenten einschließlich der RNA-Polymerase entscheidend. Dies wird zum einen erreicht, indem Transkriptionsfaktoren über ihre Transaktivierungsdomänen direkt mit den generellen Transkriptionsfaktoren wechselwirken, u.a. mit TFIIB und TFIID. Andererseits interagieren unterschiedliche Typen von Transaktivierungsdomänen mit unterschiedlichen TAF-Proteinen, also den TBP-assoziierten Proteinen in TFIID.

Kovalente Modifikation der Histone durch Coaktivatoren

Neben der direkten Interaktion von Transkriptionsfaktoren mit den basalen Faktoren sind auch transkriptionelle Coaktivatoren an der Vermittlung dieser Wechselwirkungen beteiligt. Diese Coaktivatoren können gleichzeitig einerseits mit mehreren genspezifischen Transkriptionsfaktoren sowie andererseits mit den generellen Transkriptionsfaktoren in Wechselwirkung treten. Auf diese Weise können sie helfen, die komplexen Interaktionen mehrerer Transkriptionsfaktoren an Genpromotoren zu koordinieren.
Wichtige Vertreter dieser Klasse von Coaktivatoren sind die beiden nahe verwandten Proteine CBP (CREB-binding protein; Kap. 12.6.2) und p300. Beide Coaktivatoren sind sehr große Proteine (ca. 300 kDa), die zusätzlich zu den bereits beschriebenen Fähigkeiten der Protein-Protein-Wechselwirkungen auch noch eine katalytische Aktivität besitzen. Es handelt sich um Histon-Acetyltransferasen. Diese Proteine können Histone an N-terminalen Lysinresten acetylieren und somit die Nucleosomenstruktur auflockern (Kap. 11.3.3). Gleichzeitig werden auch Transkriptionsfaktoren selbst acetyliert und dadurch in ihrer Funktion beeinflusst. CBP- und p300-Coaktivatoren können zusätzlich noch einen weiteren Histon-Acetyltransferase-Komplex, den PCAF/GCN5-Komplex (PCAF von p300/CBP-associated factor), an den Promotor rekrutieren, um diesen Vorgang zu verstärken.
Was bewirkt die Histon-Acetylierung? Die N-terminalen Abschnitte der Histone ragen aus dem fest gepackten Nucleosomenkern heraus. In diesen Histonbereichen findet man eine Reihe positiv geladener Aminosäuren, z.B. Lysinreste. Diese können nun elektrostatische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Phosphatresten des Zucker-Phosphat-Rückgrats der DNA eingehen und somit eine Kompaktierung der DNA-Struktur ermöglichen. Durch die Acetylierung der -Aminogruppen der Lysinreste werden diese positiven Ladungen eliminiert, und als Konsequenz findet man eine weniger kompakte Struktur der DNA, die für die Transkriptionsmaschine besser zugänglich ist.
Wichtige Mechanismen der Transaktivierung bestehen also in der Rekrutierung des Initiationskomplexes sowie der Auflockerung der Chromatinstruktur. Nicht nur Histon-Acetylierung, sondern auch die spezifische Methylierung von Histon-Lysinresten ist an der Kontrolle der Genexpression beteiligt. Abhängig davon, welcher Lysinrest methyliert wird, kann die Histon-Methylierung sowohl aktivierend als auch inaktivierend für die Genexpression wirken. Die Konsequenzen der verschiedenen Histon-Modifikationen für die Kontrolle der Genexpression werden als Histon-Code bezeichnet (Kap. 11.3.3).

Änderung der DNA-Struktur durch Coaktivatoren

Eine andere Klasse von transkriptionellen Coaktivatoren stellen die sog. HMG-Proteine dar. Unter diesem Überbegriff werden drei unterschiedliche Gruppen von Proteinen zusammengefasst, die sich bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese mit hoher Geschwindigkeit bewegen (daher der Name HMG von high mobility group). Es handelt sich dabei um die HMG1- und HMG2-Proteine (Gruppe 1), die HMG-I(Y)-Proteine (Gruppe 2) sowie die HMG14- und HMG17-Proteine (Gruppe 3). Heute weiß man, dass sie – trotz unterschiedlicher Strukturen in den einzelnen Gruppen – funktionelle Parallelen besitzen. Sie verändern die lokale Chromatinstruktur und erleichtern dadurch den Zugang von Transkriptionsfaktoren. So wurde sowohl für Steroidhormonrezeptoren als auch für Homöodomänenproteine gezeigt, dass sie in Anwesenheit von HMG-Proteinen erheblich effizienter an DNA binden können. Dabei besitzen diese HMG-Proteine selbst nur geringe spezifische DNA-Bindungsaktivität. Die Bindung mehrerer HMG-Proteine kann die DNA-Struktur so verändern, dass andere sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren effizienter an die jeweiligen Regulatorelemente binden können.
Ein gut untersuchtes Beispiel ist der Enhancer des -Interferon-Gens. Nach Virusinfektion einer Fibroblastenzelle wird die Expression von -Interferon massiv induziert. Dafür muss eine Reihe von Transkriptionsfaktoren binden, u.a. NF-B, interferon regulatory factors (IRF) sowie ein c-Jun/ATF2-Heterodimer. Die Bindung wird durch HMG-Proteine deutlich erleichtert, und man nennt den Gesamtkomplex, in dem auch transkriptionelle Coaktivatoren wie CBP/p300 enthalten sind, ein Enhancosom (Abb. 12.30).

Chromatin-Remodelling

Obwohl Nucleosomen für den Transkriptionsprozess selbst keine große Hürde darstellen, können sie die Bildung des zur Transkription kompetenten Initiationskomplexes stören. Aus dieser Sicht kann man die Histone als universelle Repressoren der Genexpression verstehen. Wir haben bereits gesehen, dass die Nucleosomenstruktur durch Histon-Acetylierung modifiziert werden kann. Die Bildung von Transkriptionsinitiationskomplexen ist mit einer lokalen Reorganisation der Nucleosomen verbunden. Dieser Vorgang, der auch als Chromatin-Remodelling bezeichnet wird, ist ein ATP-verbrauchender Prozess, bei dem Nucleosomen in der Nähe der Startstelle der Transkription entfernt oder verschoben werden. Es existieren verschiedene solcher ATP-abhängiger Chromatin-Remodellierungsmaschinen (z.B. der SWI/SNF-Komplex), die nicht nur für die Initiation der Transkription, sondern auch für die Transkriptionselongation essenziell sind (Kap. 11.3.3).

Corepressoren

Wir haben bereits Corepressoren kennengelernt, als wir die Funktion von Mitgliedern der C4-Zinkfinger-Familie besprochen haben (Kap. 12.4). Retinsäurerezeptoren und die Rezeptoren der Schilddrüsenhormone können – auch in Abwesenheit der induzierenden Hormone – als Heterodimere mit dem RXR-Rezeptor an die DNA ihrer Zielgene binden und deren Transkription reprimieren. Für diese Repression ist die Wechselwirkung mit sog. Corepressoren entscheidend. Verschiedene solcher Corepressoren wurden mittlerweile isoliert, z.B. NCoR (nuclear receptor corepressor). Diese Corepressoren rekrutieren Multiproteinkomplexe an die DNA-gebundenen Rezeptoren, in denen Histon-Deacetylasen (HDAC) enthalten sind. Histon-Deacetylasen haben eine den Histon-Acetyltransferasen entgegengesetzte Funktion. Sie deacetylieren Histone und bewirken so eine Kompaktierung des Chromatins und damit eine Inhibition der Genexpression. Auch andere Beispiele für Repression der Genexpression, z.B. durch Mad/Max oder das Retinoblastomprotein, beruhen auf einer Rekrutierung von HDAC-Komplexen. DNA-Methylierung (Kap. 12.8) führt ebenfalls zur Inhibition der Transkription. Auch diese durch DNA-Methylierung vermittelte Repression der Genexpression scheint über Histon-Deacetylierung zu funktionieren. Ein Protein, das spezifisch methylierte DNA erkennt (MeCP2), kann ebenfalls HDAC-Proteine rekrutieren und somit zur Kompaktierung des Chromatins und zur Repression der Transkription beitragen (Kap. 11.3.3).

MERKE

DNA-gebundene Transkriptionsfaktoren rekrutieren durch Protein-Protein-Wechselwirkungen sog. Coaktivatoren bzw. Corepressoren, die für die Transkriptionsregulation entscheidend sind. Diese Cofaktoren wirken z.B. dadurch, dass sie durch Acetylierung bzw. Deacetylierung der Histone die Chromatinstruktur verändern.

Kontrolle der Transkription durch DNA-Methylierung und Locus-Kontrollregionen

DNA-Methylierung

Bei Säugern werden nur Cytosinreste methyliert, auf die in einem sog. CpG-Dinucleotid Guanosin folgt. Wie Abb. 12.31 zeigt, findet die Methylierung in Position 5 der Base und auf beiden DNA-Strängen statt. Das Grundmuster der DNA-Methylierung wird bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. Dabei ist eine sog. Hemimethylase aktiv. Sie erkennt nach der semikonservativen Replikation den methylierten Ausgangsstrang und fügt die korrespondierende Methylierung am neuen Tochterstrang ein. Beim Menschen gibt es vier Gene, die für DNA-Methyltransferasen (DNMT) kodieren: DNMT1 kodiert für die bereits beschriebene Hemimethylase, die beiden Gene DNMT3a und DNMT3b für sog. De-novo-Methylasen, also Enzyme, die Methylgruppen in vormals nichtmethylierte DNA einführen. Die Rolle von DNMT2 ist derzeit nicht geklärt. Methylgruppendonor ist in allen Fällen das S-Adenosylmethionin (SAM, Kap. 9.2.2).

Klinik

Untersuchungen zur Expression methylierter Gene im Vergleich zu nichtmethylierten Genen zeigten, dass DNA-Methylierung die Expression inhibieren oder zumindest vermindern kann. So fand sich bei Frauen, in deren Körperzellen eines der X-Chromosomen spezifisch inaktiviert ist, dass dieses inaktive X-Chromosom erheblich stärker methyliert ist als das aktive Chromosom. Die Bedeutung der DNA-Methylierung für die Genexpression und die Zellphysiologie wird an einigen Beispielen der Tumorentstehung deutlich. In einer Reihe von Tumoren wird ein Tumorsuppressorgen, nämlich der negative Zellzyklusregulator INK4 (Abb. 12.31c und Kap. 12.9.5), nicht exprimiert. Als eine Ursache für die fehlende bzw. verminderte Expression konnte die Hypermethylierung (verstärkte Methylierung) des Promotors identifiziert werden.

Das globale DNA-Methylierungsmuster wird früh in der Embryonalentwicklung festgelegt. Gene aus differenzierten Zellen werden dabei zunächst methyliert, und der Methylierungszustand wird nach der Replikation durch die Hemimethylase erhalten. Erst wenn die Zellen in der Entwicklung das entsprechende Reifungsstadium erreichen, wird ein Teil der Methylgruppen in einem noch nicht völlig geklärten Prozess spezifisch entfernt.

MERKE

Durch Methylierung des Cytosinrests spezifischer CpG-Dinucleotide in Promotor- und Enhancer-Elementen von Genen kann deren Expression beeinflusst werden. In der Regel führt eine verstärkte Methylierung zu einer verminderten Expression der betroffenen Gene.

Locus-Kontrollregionen

Wir haben bereits cis-regulatorische Elemente wie Promotoren, Enhancer und Silencer kennengelernt. Manche Gene verfügen aber noch über weitere Regulationselemente, die nicht nur ein einziges Gen, sondern eine Gruppe beieinanderliegender Gene betreffen. Diese Elemente, die einen ganzen Genlocus regulieren, nennt man Locus-Kontrollregionen (LCR). Eine LCR wurde zunächst am -Globin-Genlocus beschrieben und ist dort auch am besten charakterisiert. Der -Globin-Genlocus enthält fünf Mitglieder der -Globin-Genfamilie: Das embryonale -Globin, die fetalen G- und A-Gene sowie die nach der Geburt und im Adultstadium exprimierten - und -Globin-Gene (98% -Globin, nur etwa 2% -Globin; Abb. 12.32a).

Klinik

Die Bedeutung der LCR des -Globin-Locus wurde durch Krankheiten offenkundig, bei denen die -Globin-Synthese gestört ist. Zu diesen Erkrankungen zählen die sog. Thalassämien. Thalassämien treten vorwiegend im Mittelmeerraum, Südostasien und Nordafrika auf. Patienten mit Thalassämie leiden an einer chronischen Anämie, die durch fehlende, fehlerhafte oder verminderte Synthese einer der Globinketten des Hämoglobins hervorgerufen wird. Durch den permanenten Mangel an normalem Hämoglobin und den damit verbundenen Sauerstoffmangel im Gewebe entstehen verschiedene Krankheitsbilder. Bei unterschiedlichen Formen der Thalassämie fehlen jeweils andere Globinproteine. Die -Thalassämien, bei denen die Expression des -Globins gestört ist, können durch verschiedene Mutationen hervorgerufen werden. Es wurden einige Fälle beschrieben, bei denen alle fünf Globin-Gene einschließlich ihrer unmittelbaren Kontrollsequenzen vorhanden waren, die LCR aber durch Deletion entfernt war. Diese Patienten zeigten keine Expression der -, - und -Globin-Gene.

LCR-Elemente wurden noch bei einer Reihe anderer Gene gefunden, der exakte Wirkmechanismus ist allerdings noch nicht aufgeklärt. Eine LCR scheint durch die folgenden Funktionen definiert zu werden:
  • Sie beeinflusst größere chromosomale Domänen, indem sie die Chromatinstruktur öffnet (für Transkriptionsfaktoren zugänglich macht).

  • Sie isoliert gegen Einflüsse benachbarter Chromatinbereiche.

  • Sie zeigt häufig ausgeprägte Zelltypspezifität.

Isolatorelemente

Wie wird nun gewährleistet, dass Elemente wie Enhancer, Silencer und LCR, die über große Distanzen auf der DNA wirken können, jeweils nur das richtige Gen bzw. die richtigen Gene regulieren, nicht aber das nächste oder übernächste Gen, das auf dem Chromosom folgt? Wie bereits erwähnt, besteht die Funktion einer LCR z.T. darin, gegen benachbarte Gene abzuschirmen. Zusätzlich findet man auf den Chromosomen sog. Isolatorelemente (engl. insulator), die solche weitreichenden Regulationseinflüsse auf umgrenzte Domänen beschränken (Abb. 12.32b). Ähnlich wie Enhancer-, Silencer- und LCR-Funktion wird auch die Isolatorfunktion durch Proteine vermittelt, die an die jeweiligen Elemente binden.

MERKE

Gene müssen in ihrer chromosomalen Umgebung unabhängig von benachbarten Genen reguliert werden können. Dies wird durch Locus-Kontrollelemente (LCR) und Isolatoren ermöglicht. Auch diese Elemente funktionieren durch Bindung regulatorischer Proteine.

Posttranskriptionelle RNA-Modifikationen

Die Primärtranskripte der eukaryontischen RNA-Polymerasen werden vor dem Export in das Zytoplasma zunächst noch einer Reihe von Modifikationen unterzogen, die für ihre jeweilige Funktion essenziell sind. Die Primärtranskripte proteinkodierender Gene werden auf dem Weg zur reifen mRNA sowohl am 5'- und am 3'-Ende als auch intern modifiziert. Diese Prozessierung ist nicht nur für die Funktion der mRNA wichtig, sondern bietet gleichzeitig weitere Möglichkeiten zur Regulation der Genexpression.

Capping der mRNA am 5'-Ende

Das erste Nucleotid eines neu entstehenden RNA-Transkripts ist in der Regel A oder G. Dieses wird in eukaryontischen Zellen modifiziert, noch während die Transkription durch die RNA-Polymerase II fortschreitet (Abb. 12.33). Es handelt sich also eigentlich um eine cotranskriptionelle Modifikation und nicht wirklich um eine posttranskriptionelle Modifikation. Dieser Vorgang, sog. Capping, wird durchgeführt, wenn die neu synthetisierte RNA-Kette etwa 20–30 Nucleotide lang ist. Die Modifikation lässt sich in drei Teilschritte unterteilen:
  • Zunächst wird durch die Triphosphataseaktivität des Capping-Enzyms die Phosphorsäureanhydridbindung zwischen der - und -Phosphat-Gruppe des ersten Nucleosidtriphosphats hydrolysiert. Dadurch entsteht am 5'-Ende der RNA ein Nucleosiddiphosphat.

  • Das so entstandene 5'-Diphosphat bildet anschließend mit der -Phosphat-Gruppe eines Guanosintriphosphats eine ungewöhnliche 5'-5'-Triphosphatbindung aus (Abb. 12.33). Diese Reaktion wird durch die Guanylyltransferaseaktivität des Capping-Enzyms katalysiert.

  • Schließlich wird der endständige Guanosinrest durch eine Methyltransferase in der Position N7 methyliert. Dieses modifizierte Ende wird als Cap bezeichnet. Diese Cap-Struktur wird außerdem an weiteren Sauerstoffatomen der Zuckerreste methyliert. Donor für alle Methylgruppen ist das S-Adenosylmethionin (SAM).

Diese Modifikation ist spezifisch für RNA, die durch die RNA-Polymerase II transkribiert werden. Die Capping-Enzyme sind mit der C-terminale Domäne (CTD, Kap. 12.1) der '-Untereinheit der RNA-Polymerase II assoziiert.
Die Cap-Struktur besitzt eine Reihe von Funktionen. Nach Bindung durch den Cap-Bindungskomplex werden die RNA-Moleküle aus dem Kern exportiert. Im Zytosol bindet dann der für die Translationsinitiation wichtige Faktor eIF4E an die Cap-Struktur. Diese Interaktion ist Voraussetzung für die Initiation der Translation. Eine weitere Funktion der Cap-Struktur besteht darin, die Stabilität und somit die Halbwertszeit von mRNA-Molekülen zu erhöhen, indem sie durch die 5'-5'-Triphosphatbindung das 5'-Ende der RNA vor dem Angriff von Nucleasen schützt.

Schon gewusst

Polioviren nutzen diesen Mechanismus, um die zelluläre Proteinbiosynthese zu hemmen. Das Virusgenom kodiert u.a. für eine Protease, die gezielt eine Untereinheit des Cap-Bindungskomplexes zerstört. Somit erreicht das Virus, dass sich die Proteinsynthesemaschinerie der infizierten Zelle auf die Translation viraler mRNA konzentriert, die kein 5'-Cap trägt. Bei der Translation der Poliovirus-mRNA bildet sich der Initiationskomplex direkt vor dem Startcodon.

Eine weitere Besonderheit findet man bei Influenzaviren. Das Genom dieser Viren besteht aus fragmentierten RNA-Molekülen, die als Matrize für die Synthese von Influenza-mRNA-Molekülen durch die virale Polymerase dienen (Negativ- oder Minusstrang-RNA-Viren). Diese Polymerase besitzt eine intrinsische Endonucleaseaktivität, die kurze Fragmente vom 5'-Ende zellulärer mRNA-Moleküle, einschließlich der Cap-Struktur, abschneidet. Diese Fragmente werden dann von der viralen Polymerase als Primer verwendet, wodurch sie in der Lage ist, virale mRNA-Moleküle mit einer Cap-Struktur zu erzeugen. Diesen Mechanismus bezeichnet man als Cap-Snatching (Cap-Entreißen).

Polyadenylierung der mRNA am 3'-Ende

Ein weiterer Mechanismus der eukaryontischen mRNA-Prozessierung ist die Polyadenylierung ihres 3'-Endes. Darunter versteht man die Anheftung von ungefähr 200 Adenylylresten (beim Menschen) an das 3'-Ende von mRNA-Molekülen. Mit Ausnahme der für die Histonproteine kodierenden mRNA werden alle proteinkodierenden mRNA-Moleküle beim Menschen polyadenyliert. Die Polyadenylierung ist einerseits abhängig von spezifischen Sequenzmotiven auf der RNA, andererseits von mehreren multimeren Proteinkomplexen. Das wichtigste Signal für die Polyadenylierung ist die Konsensussequenz 5'-AAUAAA-3', die in unterschiedlichem Abstand stromabwärts der kodierenden ( translatierten) Region der mRNA im sog. 3'-untranslatierten Bereich (3'-UTR, 3' untranslated region) lokalisiert ist. Die Polyadenylierung findet zwischen diesem AAUAAA-Element und einem weiteren Sequenzmotiv, dem DSE (Downstream sequence element), einer U- bzw. GU-reichen Sequenz, statt. Direkt an der Polyadenylierungsstelle findet man häufig das Dinucleotid 5'-CA-3' (Abb. 12.34).
Die RNA-Polymerase II synthetisiert zunächst über das Polyadenylierungssignal hinaus ein Primärtranskript, das am 3'-Ende länger ist als die reife mRNA. Die 5'-AAUAAA-3'-Sequenz wird vom CPSF-Proteinkomplex erkannt (CPSF von cleavage and polyadenylation specificity factor), an das DSE bindet der CstF-Komplex (CstF von cleavage stimulatory factor). Weitere Faktoren (Cleavage-Faktoren CF I und CF II, Abb. 12.34) assoziieren mit diesen Komplexen, und es kommt zur Spaltung der RNA etwa zehn bis 30 Nucleotide hinter dem AAUAAA-Signal. An das 3'-OH-Ende der RNA polymerisiert eine Poly(A)-Sequenz, die RNA-Sequenz zwischen Polyadenylierungssignal und 3'-Ende wird entfernt. Die Polyadenylierung selbst geschieht matrizenunabhängig und wird von der Poly(A)-Polymerase (PAP), die ebenfalls im Komplex rekrutiert wird, katalysiert (Abb. 12.34).
Für die Festlegung der Länge des Poly(A)-Schwanzes ist das Poly(A)-bindende Protein II verantwortlich, das einerseits an die wachsende Poly(A)-Sequenz bindet und andererseits mit PAP interagiert. Nach dem Export in das Zytoplasma (Kap. 12.10.1) bindet ein anderes Poly(A)-bindendes Protein (PABP) an den Poly(A)-Schwanz. Dieses PABP interagiert mit dem eukaryontischen Initiationsfaktor eIF4G; diese Wechselwirkung ist für die effiziente Initiation der Translation wichtig (Kap. 13.4).
Die Länge des Poly(A)-Schwanzes am 3'-Ende der mRNA beeinflusst deren Translation. In reifenden Oozyten sind die meisten RNA-abbauenden Systeme ausgeschaltet. Deshalb können Oozyten einen großen Vorrat an mRNA aufbauen. Viele dieser mRNA-Moleküle besitzen nur kurze Poly(A)-Schwänze (zehn bis 30 Adenylylreste). In dieser Form werden sie jedoch nicht translatiert. Wenn nach der Befruchtung Proteine benötigt werden, für die diese mRNA-Moleküle kodieren, wird der Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende durch eine zytoplasmatische Poly(A)-Polymerase verlängert. Dies führt zu einer Stimulation der Translation. Der Poly(A)-Schwanz spielt also eine Rolle bei der Translation der mRNA.
Außerdem schützt der Poly(A)-Schwanz die mRNA vor enzymatischem Abbau durch Exonucleasen und beeinflusst somit maßgeblich die Stabilität bzw. Halbwertszeit der mRNA innerhalb der Zelle. Die Poly(A)-Schwänze der meisten mRNA-Moleküle werden nach ihrem Export aus dem Kern verkürzt; dies ist ein langsamer Vorgang, der sich z.T. über Tage erstrecken kann. Allerdings gibt es mRNA-Moleküle, deren Poly(A)-Schwänze in Stunden bzw. Minuten abgebaut werden. mRNA-Moleküle mit weniger als 30 Adenylylresten an ihrem 3'-Ende werden abgebaut (Kap. 12.10.2). Somit kann der Abbau von mRNA-Molekülen durch die Länge ihres Poly(A)-Schwanzes reguliert werden.

MERKE

Fast alle reifen mRNAs besitzen am 3'-Ende einen Poly(A)-Schwanz. Die für die Histonproteine kodierenden mRNA-Moleküle stellen eine seltene Ausnahme dar, da sie nicht polyadenyliert sind, dafür aber eine spezialisierte Sekundärstruktur am 3'-Ende tragen, die entsprechende Funktionen übernimmt.

Spleißen der mRNA-Vorläufer

Das klassische Modell eines Gens – Promotor, Startcodon, gefolgt von einer ununterbrochenen Kodierungssequenz, Stoppcodon – galt lange Zeit uneingeschränkt für alle Organismen. Im Jahre 1977 stellte sich jedoch heraus, dass viele Gene höherer Organismen wesentlich länger sind als die von ihnen erzeugte mRNA. Dies liegt daran, dass aus dem zunächst gebildeten Prmärtranskript noch im Zellkern bestimmte Abschnitte entfernt werden, die keine Information für die Herstellung des Proteins tragen. Man nennt solche Gene höherer Eukaryonten deshalb auch Mosaikgene.
Die Bereiche des Primärtranskripts, die in der reifen mRNA enthalten sind, nennt man Exons, die Sequenzen, die entfernt werden, Introns (Abb. 12.35). Den Vorgang der Entfernung der Introns und der Verknüpfung der Exons nennt man Spleißen. Mosaikgene bestehen häufig aus vielen Exons, wobei benachbarte Exons jeweils durch ein Intron getrennt sind. Werden solche Gene transkribiert, so entsteht zunächst ein primäres Transkript, das auch heterogene nucleäre RNA (hnRNA) oder prä-mRNA genannt wird. Im Gegensatz zur mRNA eines Gens enthält dessen hnRNA noch die Introns.
Spleißsequenzen
Die Analyse der DNA-Sequenzen an den Exon-Intron-Übergängen unterschiedlicher Gene ergab, dass an diesen Stellen konservierte Sequenzen vorkommen, die für den Mechanismus des Spleißens wichtig sind. So beginnen intronische Sequenzen in der Regel mit GU, während Exons und Introns mit AG enden. Auch die benachbarten Sequenzen sind charakteristischerweise noch sehr gut konserviert (Abb. 12.36). Folglich sieht eine 5`-Spleißstelle, die sog. Spleißdonorstelle, auf hnRNA-Ebene folgendermaßen aus: Exon-AG/GU-Intron (der Schrägstrich ist hier die Exon-Intron-Grenze). Ein weiteres Charakteristikum der als Spleißakzeptorstelle bezeichneten 3'-Spleißstelle ist der sog. Polypyrimidintrakt, eine etwa 15 bp lange pyrimidinbasenreiche Sequenz, die vor dem typischen AG des Intronendes liegt.
Neben diesen Konsensussequenzen für die 5'- und 3'-Spleißstellen gibt es eine weitere Sequenz in Introns, die für das korrekte Spleißen von hnRNA notwendig ist. Diese sog. Verzweigungsstelle (engl. branch point) liegt in der Regel 20–50 Nucleotide vom 3'-Ende des Introns entfernt. Innerhalb dieser Sequenz liegt ein Adenosin, das für die Bildung einer Phosphodiesterbindung mit dem Phosphat der 5'-Spleißstelle verantwortlich ist (Abb. 12.36).
Mechanismus der Spleißreaktion
Der Spleißvorgang kann in mehrere Teilreaktionen zerlegt werden. Es handelt sich dabei um Umesterungen. Darunter versteht man die Knüpfung einer neuen Esterbindung unter gleichzeitiger Lösung einer bestehenden Esterbindung. Durch eine Umesterung der 5'-Phosphat-Gruppe des Guanosins der Spleißdonorstelle mit der 2'-Hydroxyl-Gruppe des Adenosins innerhalb der Verzweigungsstelle im Intron wird das Zucker-Phosphat-Rückgrat der hnRNA an der Spleißdonorstelle durchtrennt (Abb. 12.37). Die dabei entstehende freie 3'-Hydroxyl-Gruppe am Exonende kann daraufhin eine Umesterung mit der 5'-Phosphat-Gruppe der Spleißakzeptorstelle durchführen. Bei diesem Prozess entstehen zwei verschiedene Produkte: intronfreie mRNA und eine lassoähnliche Struktur, die auf die intronische RNA-Sequenz zurückzuführen ist (Abb. 12.37).
Der Spleißosomkomplex
Die Teilreaktionen des Spleißens werden durch das Spleißosom, einen multikatalytischen Komplex, im Zellkern ausgeführt. Spleißosomkomplexe enthalten neben Proteinen auch kleine RNA-Moleküle. Diese RNA-Moleküle werden Small nuclear RNA (snRNA) genannt. Die Untereinheiten des Spleißosoms werden aufgrund ihrer Zusammensetzung aus snRNA und Proteinen auch als snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) bezeichnet. Im Spleißosom findet man fünf snRNP-Moleküle, die U1, U2, U4, U5 und U6 genannt werden. Die meisten snRNP-Moleküle bestehen aus mindestens einem snRNA-Molekül, das einen Komplex mit mehreren Proteinen bildet. Für die Funktion dieser snRNP-Moleküle ist entscheidend, dass die Sequenzen der snRNA-Moleküle zu den Sequenzen der Exon-Intron-Übergänge und der Verzweigungsstelle komplementär sind. Sie sind deshalb dafür verantwortlich, die für das Spleißen nötigen Proteine an die Stellen der hnRNA zu bringen, an denen ihre katalytische Funktion nötig ist.
Der Spleißprozess beginnt damit, dass die U1-snRNA die 5'-Konsensussequenz (Donorstelle) des Introns bindet (Abb. 12.38). Die Erkennung dieser Konsensussequenz übernimmt der snRNA-Anteil des Ribonucleoproteinkomplexes U1. Dieser ist zur Konsensussequenz der Donorstelle komplementär und hybridisiert mit ihr. Nun interagiert ein Protein, der U2-assoziierte Faktor (U2AF) an die Konsensussequenz im Intron nahe der 3'-Akzeptorstelle. Dies erlaubt der U2-snRNA, an den Verzweigungspunkt zu binden. U4 bindet nicht direkt an die prä-mRNA. Vielmehr besteht die Aufgabe von U4 darin, die U5- und U6-snRNP in das Spleißosom zu rekrutieren. Dadurch wird die dreidimensionale Struktur der zu spleißenden RNA so verändert, dass sich durch eine Umesterung der 2'-Hydroxyl-Gruppe des Adenosins in der Verzweigungsstelle mit einer Phosphatgruppe des RNA-Rückgrats an der Donorstelle die lassoähnliche Struktur ausbildet. Durch diese Umesterung entsteht am 3'-Ende von Exon 1 eine freie Hydroxylgruppe. Sobald dieser Vorgang beendet ist, verlässt U1-snRNP den Komplex. Die freie 3'-Hydroxyl-Gruppe von Exon 1 greift nun die Phosphatgruppe am Übergang des Introns zum Exon 2 an. Dadurch wird das lassoähnliche RNA-Molekül, das dem Intron entspricht, freigesetzt, und die beiden Exons werden verbunden (Abb. 12.37 und 12.38).

Klinik

Bei einer Autoimmunerkrankung, dem systemischen Lupus erythematodes (SLE), findet man Antikörper gegen das am Spleißprozess beteiligte U1-RNP, darüber hinaus aber häufig auch noch Antikörper gegen eine Reihe weiterer nucleärer Antigene.

Wir haben im Zusammenhang mit Locus-Kontrollregionen (LCR) bereits die Thalassämien kennengelernt. Interessanterweise wurden bei -Thalassämie-Patienten neben Mutationen des Promotors, der LCR sowie der kodierenden Sequenz auch Mutationen in Introns des -Globin-Gens gefunden. Bei diesen Mutationen handelt es sich um Veränderungen im Bereich der Exon-Intron-Übergänge bzw. der Verzweigungsstellen in Introns. Diese Mutationen sind dafür verantwortlich, dass sich nicht bzw. falsch gespleißte -Globin-mRNA bildet, die entweder im Zellkern zurückgehalten wird oder aber zur Bildung eines aberranten -Globin-Proteins führt. Spleißmutationen wurden auch bei der Phenylketonurie, die durch Mutationen im Phenylalanin-Hydroxylase-Gen entsteht, sowie vielen anderen Erbkrankheiten des Menschen gefunden.

Ribozyme und selbstspleißende Introns
Der oben beschriebene Mechanismus des Spleißens bei höheren Eukaryonten hat sich aller Wahrscheinlichkeit nach aus einem weitaus primitiveren Vorgang entwickelt: Bestimmte RNA-Moleküle aus niederen Eukaryonten (Ciliaten und Pilze) können ihre Introns ohne das Zutun von Proteinen entfernen. Weil diese RNA-Moleküle ihr eigenes Spleißen katalysieren, sind sie laut Definition Enzyme. Da sich die katalytische Wirkung dieser RNA-Moleküle ohne die Beteiligung von Proteinen entfaltet, nennt man sie Ribozyme.
Eine wichtige Aufgabe der am Spleißen beteiligten Proteine ist, das RNA-Molekül in die für die Reaktion notwendige dreidimensionale Struktur zu überführen. Beim Selbstspleißen wird die Sekundärstruktur der RNA, also ihre Faltung, durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Nucleotidsequenzen stabilisiert.
Man unterscheidet zwei verschiedene molekulare Mechanismen des Selbstspleißens, das Spleißen der Gruppe-I-Introns und der Gruppe-II-Introns.
  • Gruppe-I-Introns: Hier greift die 3'-Hydroxyl-Gruppe eines freien, über Wasserstoffbrücken an die RNA gebundenen Guanosins die Phosphatgruppe der 5'-Spleißstelle an. Dadurch wird das Zucker-Phosphat-Rückgrat an der Donorstelle unterbrochen und gleichzeitig eine Phosphodiesterbindung zu dem ehemals freien Guanosin gebildet (Abb. 12.39). Die so entstandene 3'-Hydroxyl-Gruppe am Ende des ersten Exons greift nun als Nucleophil die Phosphodiesterbindung an der 3'-Spleißstelle an, wodurch das Intron entfernt wird.

  • Gruppe-II-Introns: Der molekulare Mechanismus läuft im Prinzip wie das Spleißen im Spleißosom ab. Durch den nucleophilen Angriff der freien 2'-Hydroxyl-Gruppe eines Adenylylrests innerhalb des Introns auf die Phosphatgruppe an der 5'-Spleißstelle entsteht am Ende von Exon 1 eine freie 3'-Hydroxyl-Gruppe. Diese wiederum greift die Phosphatgruppe der Akzeptorstelle an, wodurch wie beim Spleißosom das Intron als lassoähnliche Struktur herausgeschnitten wird (Abb. 12.39).

Die drei Spleißarten bei Gruppe-I- und Gruppe-II-Introns sowie durch Spleißosomen sind höchstwahrscheinlich verschiedene Stufen der Evolution des Spleißens.

Blick ins Labor

Ribozyme stellen auch eine vielversprechende Strategie für gentherapeutische Ansätze dar. Obwohl die zuvor beschriebenen Ribozyme nur sich selbst spleißen, also in cis funktionieren, ist es gelungen, Ribozyme zu konstruieren, die diese ribonucleolytische Wirkung auch in trans, also auch für andere RNA-Moleküle, entfalten. Mithilfe solcher synthetischer Ribozyme wird versucht, in Zellen die mRNA-Moleküle von Proteinen zu zerstören, die z.B. an der Tumorgenese oder der Replikation des HIV (AIDS-Erreger) beteiligt sind.

Alternatives RNA-Spleißen
Im eukaryontischen Genom existieren zahlreiche Gene, deren RNA-Primärtranskript (hnRNA) nicht nach nur einem festgelegten Muster, sondern auf verschiedene Arten gespleißt werden kann. Diesen Vorgang nennt man alternatives Spleißen. Als Konsequenz können aus einem Primärtranskript verschiedene reife RNA-Moleküle entstehen. Diese alternativ gespleißten mRNA-Moleküle unterscheiden sich durch die Anwesenheit bzw. das Fehlen bestimmter Exons oder Exonbereiche. Sie entstehen dadurch, dass bestimmte Exon-Intron-Übergänge genutzt werden oder nicht.
Man unterscheidet fünf Varianten des alternativen Spleißens, die getrennt oder auch kombiniert an einem Primärtranskript zum Einsatz kommen können (Abb. 12.40).
  • Exons können beim Spleißen weggelassen werden, d.h., sie werden mit den beiden flankierenden Introns gemeinsam entfernt (Abb. 12.40, 1).

  • Exons können zwei alternative Spleißdonor- (Abb. 12.40, 2) oder Spleißakzeptorstellen (Abb. 12.40, 3) besitzen. Dies bedeutet, dass abhängig davon, welche der beiden Stellen genutzt wird, unterschiedlich große Bereiche als Exon in der reifen RNA enthalten sind. Wir erkennen an diesen Beispielen auch, dass Introns nicht nur nutzlose RNA sind, sondern dass auch kodierende Bereiche in den Intronsequenzen enthalten sein können.

  • Durch alternatives Spleißen wird es darüber hinaus möglich, dass ein Gen unterschiedliche Promotoren für seine Expression (Abb. 12.40, 4) oder verschiedene Polyadenylierungssequenzen benutzt (Abb. 12.40, 5).

Ein Beispiel für ein Gen, aus dessen Primärtranskript durch alternatives Spleißen unterschiedliche Exons in alternativen mRNA-Molekülen verknüpft werden, ist das Calcitonin-CGRP-Gen. Dieses Gen enthält sechs Exons im Primärtranskript, die in zwei verschiedenen Zelltypen unterschiedlich kombiniert werden. Das in den C-Zellen der Schilddrüse synthetisierte und gespleißte Transkript dieses Gens kodiert für das Peptidhormon Calcitonin (Thyreocalcitonin), während in Nervenzellen und dem Hypothalamus Transkription und Spleißen zu der längeren, für CGRP (calcitonin gene- related protein) kodierenden mRNA führen. Die mRNA des Calcitonins besteht aus den Exons 1–4 des Gens, während die mRNA des CGRP aus den Exons 1, 2, 3, 5 und 6 zusammengesetzt ist. Das heißt, in Nervenzellen geht beim Spleißen das vierte Exon verloren (Abb. 12.41).
Die beiden Proteine üben völlig unterschiedliche physiologische Funktionen aus. Calcitonin (32 Aminosäuren lang) ist an der Regulation des Blutcalciumspiegels beteiligt, den es durch Hemmung der Calciumfreisetzung aus den Knochen senkt. Demgegenüber scheint CGRP (37 Aminosäuren lang) v.a. vasoaktive Wirkungen (Vasodilatation) zu besitzen und ist an der Kontrolle des Gefäßwiderstands beteiligt.
Ein weiteres sehr gut untersuchtes Beispiel für eine wichtige physiologische Funktion des alternativen Spleißens werden wir bei der Synthese der Immunglobuline kennenlernen (Kap. 26). Durch alternatives Spleißen können B-Lymphozyten von der Produktion membranständiger Immunglobuline auf sezernierte Immunglobuline umschalten. Darüber hinaus können durch alternatives Spleißen andere Proteinfunktionen reguliert werden, z.B.:
  • Die subzelluläre Lokalisation von Proteinisoformen (z.B. Kern-Zytoplasma, Plasmamembran-Zytosol etc.) kann durch Einbau/Weglassen von Lokalisationssignalen im Protein verändert werden.

  • Transkriptionsfaktoren können mit der gleichen DNA-Bindungsdomäne, aber unterschiedlichen regulatorischen Domänen generiert werden (Aktivatoren-Repressoren).

  • Die Bindungsdomäne eines allosterischen Regulators eines Enzyms kann eingebaut oder weggelassen werden.

  • Erkennungsstellen für posttranslationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) können variiert werden.

Alternatives Spleißen ermöglicht es eukaryontischen Organismen, funktionell unterschiedliche Proteine von einem Gen zu synthetisieren. Die Funktionen der durch alternatives Spleißen entstehenden Proteine können sich erheblich unterscheiden. Dieser Mechanismus trägt deshalb zur Vielfalt der im Körper synthetisierten Proteine bei.
Der Vorgang des alternativen Spleißens wird in den Zellen reguliert. Das Primärtranskript enthält entweder in den Exon- oder den Intronbereichen cis-regulatorische Elemente, die von spezifischen RNA-bindenden Proteinen erkannt werden. Diese Proteine können dann den Spleißvorgang regulieren. Sie werden entweder zelltypspezifisch exprimiert, oder sie können selbst durch Signale in der Zelle funktionell kontrolliert werden.

RNA-Editierung

Unter dem Phänomen der RNA-Editierung versteht man die posttranskriptionelle Veränderung der Basenabfolge der mRNA. Dabei wird die Sequenz des Transkripts durch Insertion (Einfügen) bzw. Deletion (Entfernen) von Basen oder aber durch Umwandlung einer Base in eine andere Base verändert.
Der Prozess wurde ursprünglich bei Trypanosomen, den Erregern der Schlafkrankheit, entdeckt, bei denen das posttranskriptionelle Einfügen von Basen vorherrscht. Bei Säugern wurde ein anderer Mechanismus der RNA-Editierung gefunden: Nach der Transkription wird eine Base des Transkripts in eine andere umgewandelt. Diese gezielte Umwandlung von Basen wird nachfolgend an Beispielen näher erläutert.
Desaminierung von Cytosin
Vom Apolipoprotein B, das für den Aufbau einiger Lipoproteine und somit für den Transport von Lipiden im Blut essenziell ist (Kap. 18.2), werden zwei Formen exprimiert. ApoB-100 wird in der Leber synthetisiert und besitzt eine Molekülmasse von etwa 520 kDa. Demgegenüber wird im Dünndarm ApoB-48 mit einer Molekülmasse von ca. 250 kDa exprimiert. ApoB-48 ist wichtigstes Strukturprotein der Chylomikronen, die in den Mukosazellen des Darms gebildet werden. Demgegenüber wird ApoB-100 v.a. für die Bildung von VLDL-Partikeln (Very-low-density-Lipoprotein) in der Leber und dessen Stoffwechselprodukt LDL benötigt. Es enthält, verglichen mit ApoB-48, eine zusätzliche Domäne, die für die Bindung an den LDL-Rezeptor auf der Zellmembran und damit für die Aufnahme des LDL in die Zelle notwendig ist. Beide Proteine werden von einem Gen kodiert und nur als eine mRNA synthetisiert. Allerdings wird die mRNA im Darm durch RNA-Editierung modifiziert. Durch enzymatische Desaminierung wird ein Cytosin- in einen Uracilrest umgewandelt. Diese Umwandlung verändert ein CAA-Codon, das für die Aminosäure Glutamin kodiert, in ein UAA-Stoppcodon. So entstehen gewebespezifisch unterschiedlich lange Formen des Apolipoproteins B (Abb. 12.42a).
Desaminierung von Adenosin
Eine weitere Form der RNA-Editierung, die selektive Desaminierung von Adenosinresten, findet man bevorzugt im Gehirn. Ein wichtiges Beispiel für eine auf diese Weise modifizierte RNA ist die mRNA einer Untereinheit des Glutamatrezeptors (GluR-B). Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die durch Liganden (Glutamat) geöffnet werden. Das Primärtranskript enthält an der editierten Stelle die Sequenz CAG und kodiert für die Aminosäure Glutamin. Die Desaminierung durch eine Adenosin-Desaminase wandelt Adenosin in Inosin um, und das Codon bewirkt den Einbau von Arginin in die Polypeptidkette (das entstehende CIG-Codon wird bei der Translation als CGG-Codon gelesen). Die entsprechende Aminosäure befindet sich in der Transmembrandomäne des Glutamatrezeptors und beeinflusst dessen Ionenpermeabilität. Wenn sich an dieser Stelle des Proteins nach der Editierung Arginin befindet, ist der entsprechende Ionenkanal für Ca2+-Ionen undurchlässig. Durch Editierung der mRNA des Glutamatrezeptors wird also dessen Permeabilität für Ca2+-Ionen verändert.
Dieser Editierungsprozess setzt voraus, dass die zu editierende Region im Exon mit einer stromabwärts liegenden Region im Intron eine Basenpaarung eingeht (Abb. 12.42b). Aus o.g. Mechanismus kann man ableiten, dass diese Form der Editierung vor dem Spleißen der prä-mRNA stattfinden muss. Mehrere Gene für RNA-modifizierende Adenosin-Desaminasen wurden mittlerweile identifiziert und werden ADAR (Adenosin-Desaminasen für RNA) genannt (zur Unterscheidung von Enzymen, die DNA als Substrat desaminieren).

Ein Gen – zwei Proteine

Die bislang beschriebenen Beispiele für alternatives Spleißen führen zu unterschiedlichen Proteinen, die sich sehr ähneln und bei denen mehr oder weniger große Proteinbereiche identisch sind. Bei Viren hatte man schon lange beobachtet, dass durch unterschiedliches Spleißen auch völlig unterschiedliche Proteine aus einer genomischen Sequenz erzeugt werden können, indem alternative Leseraster für die Translation genutzt werden. Wie wir heute wissen, existiert dieser Mechanismus auch bei Säugern. Wir haben bereits das INK4-Gen kennengelernt, ein Tumorsuppressorgen, das in einer Reihe von Tumoren mutiert ist bzw. durch Methylierung des Promotors nicht exprimiert wird (Kap. 11). Der INK4-Genlocus auf Chromosom 9 kodiert in der Tat für zwei Proteine, zum einen INK4 und zum anderen ARF (alternate reading frame alternatives Leseraster). Es existieren zwei Promotoren und folglich zwei unterschiedliche erste Exons für die beiden Transkripte, die Exons 2 und 3 sind jeweils identisch (Abb. 12.43). Allerdings wird das zweite Exon in unterschiedlichen Leserastern gelesen. Beide Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellteilung: INK4 über seine Funktion als negativer Regulator der Zellzyklusprogression, ARF als Regulator des MDM2-p53-Systems. Das ARF-Protein bewirkt eine Stabilisierung von p53 und trägt somit ebenfalls zum Zellzyklusarrest bei (Kap. 12.6).

Interaktion RNA-modifizierender Enzyme mit der RNA-Polymerase II

Wir hatten zu Beginn des Kapitels gelernt, dass die größte Untereinheit der RNA-Polymerase II eine repetitive Aminosäuresequenz am C-Terminus besitzt, die C-terminale Domäne (CTD) genannt wird. Die Konsensussequenz dieser aus sieben Aminosäuren bestehenden Wiederholungen lautet Tyr–Ser–Pro–Thr–Ser–Pro–Ser (Y–S–P–T–S–P–S im Einbuchstabencode). Die RNA-Polymerase II der Hefe besitzt 26 solcher Wiederholungen, beim Menschen sind es 52 Wiederholungen. Durch gezielte Mutationen in der Hefe wurde gezeigt, dass mindestens acht Wiederholungen benötigt werden, damit die Hefen überleben können. Die Röntgenstrukturanalyse der eukaryontischen RNA-Polymerase II ergab, dass diese CTD direkt am Austrittskanal der RNA aus der RNA-Polymerase lokalisiert ist und eine extendierte Struktur besitzt. Die CTD ist eine variable Andockstelle für viele Enzyme, die für den Transkriptionsprozess sowie für die Prozessierung der RNA verantwortlich sind. Durch spezifische Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung der CTD wird ermöglicht, dass unterschiedliche Enzymaktivitäten mit der CTD in Wechselwirkung treten. Die Phosphorylierungen finden bevorzugt an den Serinresten 2 und 5 in den konservierten Wiederholungen statt. Zunächst ist die CTD wichtig für Interaktionen mit dem Mediatorkomplex und damit für eine effiziente Rekrutierung der RNA-Polymerase bzw. Initiation der Transkription. Der Mediatorkomplex bindet an die unphosphorylierte CTD. Beim Initiationsprozess wird die CTD durch den generellen Transkriptionsfaktor TFIIH sowie durch Protein-Kinasen im Mediatorkomplex phosphoryliert. Danach assoziiert das Capping-Enzym mit der CTD. Enzyme für das Spleißen der RNA-Vorläufer und schließlich die Polyadenylierung interagieren ebenfalls mit der CTD. Außerdem binden chromatinmodifizierende Enzyme an die CTD (Abb. 12.44). Wie bereits erwähnt, wird der Phosphorylierungszustand der CTD im Verlauf dieses Prozesses durch Protein-Phosphatasen und Protein-Kinasen selektiv variiert, um diese spezifischen Interaktionen zu ermöglichen.

MERKE

Die Primärtranskripte, aus denen die mRNA entsteht, werden sowohl am 5'-Ende durch das Anheften einer Cap-Struktur als auch am 3'-Ende durch Synthese eines Poly(A)-Schwanzes modifiziert. Diese Modifikationen beeinflussen die mRNA-Stabilität sowie die Effizienz der Translation. Darüber hinaus werden aus dem Primärtranskript Intronsequenzen durch Spleißen entfernt. Das Entfernen der Introns durch die Spleißosomen geschieht durch zwei Umesterungsschritte, durch die zwei Exons an ihren Spleißdonor- bzw. Spleißakzeptorstellen verknüpft werden. Als Nebenprodukt entsteht ein lassoähnliches Molekül, das die intronischen Sequenzen enthält. Durch alternatives Spleißen können aus einem Primärtranskript mehrere unterschiedliche mRNA-Moleküle hergestellt werden, die wiederum in verschiedene Proteine translatiert werden. Die für die Prozessierung verantwortlichen Enzyme werden an der differenziell phosphorylierten CTD der RNA-Polymerase II rekrutiert. Auch durch RNA-Editierung kann die Sequenz der mRNA verändert werden.

Transport der mRNA in das Zytosol und mRNA-Abbau

Während die Enzyme der hnRNA-Synthese und -Prozessierung im Kern lokalisiert sind, finden sich die Ribosomen, die für die Translation der reifen mRNA-Transkripte verantwortlich sind, im Zytoplasma. Der mRNA-Export aus dem Kern ist ein weiterer Angriffspunkt für spezifische Regulation. Im Zytoplasma zeigen mRNA-Moleküle eine definierte Halbwertszeit, die für die jeweiligen mRNA-Moleküle spezifisch ist und durch exogene Faktoren reguliert werden kann.

Transport der reifen mRNA in das Zytoplasma

Die Kompartimentierung der Genexpression sorgt dafür, dass nur korrekt gespleißte mRNA translatiert wird, da hnRNA oder nicht vollständig gespleißte RNA den Kern nicht verlassen kann. Über den Mechanismus, der ungespleißte RNAs im Kern zurückhält, ist wenig bekannt. Der Export der komplett gespleißten RNA findet in Form von Ribonucleoproteinkomplexen (mRNP), die aktiv durch die Kernporen in das Zytoplasma transportiert werden, statt.
Bislang sind nur wenige Beispiele für regulierten Kernexport spezifischer RNA-Moleküle bei Eukaryonten bekannt. Das am besten verstandene System ist der Export von RNA-Molekülen des HIV (human immunodeficiency virus). Ausgehend von in das menschliche Genom integrierten HIV-Proviren werden drei virale RNA-Moleküle exportiert, eine genomische 9 kb lange RNA, eine einmal gespleißte 4-kb-RNA und eine mehrfach gespleißte 2-kb-RNA (Abb. 12.45). Bei der 9-kb-RNA und der 4-kb-RNA handelt es sich also um ungespleißte bzw. partiell gespleißte RNA-Moleküle, die den Kern eigentlich nicht verlassen dürften. Tatsächlich werden diese RNA-Moleküle nur exportiert, wenn zuvor ein von der kurzen 2-kb-mRNA kodiertes retrovirales Protein namens Rev translatiert wird. Außerdem ist auf den langen RNA-Molekülen ein sog. Rev-Response-Element (RRE) vorhanden, an das das Rev-Protein bindet. Der Mechanismus des Transports in den Kern und des Kernexports wird in Kap. 17.2 (Abb. 17.3) detailliert besprochen. Das Rev-Protein trägt ein Kernexportsignal (NES, nuclear export signal), das von einem spezifischen Exportprotein (Exportin-1) erkannt wird. Der Exportin-Rev-RNA-Komplex wird dann unter Mitwirkung einer GTPase (RanGTP) aus dem Kern transportiert.

Regulation des mRNA-Abbaus im Zytoplasma

Einmal in das Zytoplasma transportierte mRNA-Moleküle können vielfach als Matrize für die Proteinbiosynthese an Ribosomen dienen. So kann z.B. ein Actin-mRNA-Molekül bis zu 1000-mal abgelesen werden. Allerdings sind mRNA-Moleküle nicht ewig haltbar, sondern sie unterliegen einem geregelten Abbau. Dieser Abbaumechanismus beginnt bei vielen mRNA-Molekülen zunächst mit der Deadenylierung durch eine 3'-5'-Deadenylase. Wenn der Poly(A)-Schwanz stark verkürzt (zehn bis 30 A-Reste) oder komplett entfernt ist, kann durch ein Decapping-Enzym die Cap-Struktur als 7m-GDP abgespalten werden. Daraufhin wird die entblößte mRNA durch eine 5'3'-Exonuclease abgebaut. Alternativ kann der Abbau der deadenylierten RNA auch durch 3'5'-Exonucleasen (unabhängig von der An- oder Abwesenheit der Cap-Struktur) erfolgen.
Die Halbwertszeiten verschiedener mRNA-Moleküle der Säuger sind allerdings sehr unterschiedlich. Während einige mRNA-Moleküle, z.B. Actin-mRNA in Muskelzellen oder die mRNA für -Globin in Retikulozyten, sehr langlebig sind (> 20 h), haben andere eine kurze Halbwertszeit von nur wenigen Minuten bis zu 1 h. Solche kurzlebigen mRNA-Moleküle sind charakteristisch für Gene, die für regulatorische Proteine kodieren wie Wachstumsfaktoren oder induzierbare Transkriptionsfaktoren (c-Fos oder c-Myc). Im Fall von c-Fos als Bestandteil des AP-1-Komplexes haben wir schon gesehen, dass das Protein aufgrund der Interaktion mit dem kurzlebigen c-Jun-Protein ebenfalls schnell abgebaut wird. Damit die Expression dieser wichtigen Proteine wirklich exakt reguliert wird, muss allerdings auch gewährleistet sein, dass die mRNA schnell wieder eliminiert werden kann. Vielen kurzlebigen mRNA-Molekülen ist gemeinsam, dass sie in ihren 3'-nichttranslatierten Regionen sog. AU-reiche Sequenzelemente (ARE) tragen. Diese etwa 50 bp langen ARE enthalten mehrere Kopien der Konsensussequenz 5'-AUUUA-3' und werden von spezifischen Proteinen erkannt. ARE bewirken, dass die Deadenylierung und damit der Abbau der jeweiligen mRNA beschleunigt werden. Ein anderes gut untersuchtes Beispiel für die Regulation der Stabilität einer spezifischen mRNA wird in Kap. 2 beschrieben: Die Stabilität der mRNA, die für das Transferrinrezeptorprotein kodiert, wird durch die Konzentration an intrazellulären Fe2+-Ionen reguliert.
Die mRNA-Degradation kann auch durch kleine RNA-Moleküle (siRNA und miRNA, Kap. 15.5.1 und 13.5.3Kap. 15.5.1Kap. 13.5.3) induziert werden. Bei perfekter Basenkomplementarität vermitteln diese RNA-Moleküle das direkte Schneiden der Ziel- mRNA durch eine assoziierte Endonuclease. Bei nicht perfekter Komplementarität induzieren miRNA-Moleküle die Deadenylierung und damit ebenfalls den Abbau der mRNA.

MERKE

Die mRNA-Moleküle müssen aus dem Zellkern aktiv in das Zytoplasma transportiert werden, damit dort die Translation erfolgen kann. Dieser Transport wird für bestimmte mRNA-Moleküle reguliert. Auch im Zytoplasma unterliegen die mRNA-Moleküle einem regulierten Abbaumechanismus. Der nucleolytische Degradationsprozess ist von der Länge des Poly(A)-Schwanzes, dem Vorhandensein des 5'-Caps sowie von weiteren regulatorischen Proteinen abhängig.

Prozessierung von prä-rRNA und prä-tRNA

Prozessierung der prä-rRNA

Prozessierung der rRNA
Ribosomale RNA (rRNA) ist essenzieller Bestandteil von Ribosomen. Ebenso wie snRNP bestehen Ribosomen aus einem Komplex von Proteinuntereinheiten und RNA-Molekülen. In höheren Eukaryonten enthalten die Ribosomen vier verschiedene rRNA-Moleküle, die sich in ihrer Größe und Sequenz unterscheiden: 28S-rRNA (ca. 5000 Nucleotide), 18S-rRNA (ca. 2000 Nucleotide), 5,8S-rRNA (ca. 160 Nucleotide) und 5S-rRNA (ca. 120 Nucleotide).
Diese vier rRNA-Moleküle werden durch die Transkription von nur zwei verschiedenen Genen hergestellt: Die 5S-rRNA wird von einem Gen kodiert, das von der RNA-Polymerase III transkribiert wird. Demgegenüber entstammen die 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA einem einzigen gemeinsamen Vorläufermolekül, der 45S-prä-rRNA. Den Vorgang, bei dem diese rRNA-Moleküle aus der 45S-prä-rRNA gebildet werden, nennt man rRNA-Prozessierung (Abb. 12.46). Bemerkenswerterweise werden in diesem Fall drei verschiedene RNA-Moleküle durch die Transkription nur eines Gens gebildet.
Das 45S-rRNA-Primärtranskript besitzt eine Länge von 13.700 Nucleotiden, von denen nur etwa die Hälfte in den reifen rRNA-Molekülen auftaucht (28S-, 18S- und 5,8S-rRNA haben zusammen eine Länge von ca. 7.200 Nucleotiden). Der Rest der prä-RNA wird abgebaut. An der Prozessierung der prä-RNA ist wiederum eine Vielzahl kleiner nucleolärer RNA-Moleküle beteiligt, die man snoRNA (small nucleolar RNA) nennt. Ähnlich wie die snRNA, die wir beim Spleißprozess kennengelernt haben, ist auch die snoRNA gemeinsam mit Proteinen in snoRNP (small nucleolar ribonucleoprotein) organisiert. Durch spezifische Basenpaarung zwischen snoRNA- und prä-rRNA-Molekülen werden die Schnittstellen für die rRNA-Prozessierung bestimmt. Außer dieser besonderen Form der Synthese aus einer prä-rRNA findet man bei rRNA-Molekülen eine weitere Auffälligkeit. Häufig sind die Ribosereste der rRNA-Nucleotide am 2'-OH methyliert. Auch an diesem Prozess sind snoRNA-Moleküle beteiligt.
Amplifikation der rRNA-Gene
Die rRNA-Gene, die für die 45S-prä-rRNA kodieren, liegen im Nucleolus in amplifizierter Form vor, d.h., es existieren viele Kopien dieses Gens. Nach der Transkription und der Prozessierung bilden die rRNA-Moleküle zusammen mit aus dem Zytoplasma importierten ribosomalen Proteinen Ribonucleoproteinkomplexe, die in das Zytoplasma exportiert werden (Abb. 12.46b). Die große ribosomale Untereinheit (60S) besteht aus der 28S-rRNA, der 5,8S-rRNA, der 5S-rRNA sowie 49 Proteinen. Demgegenüber enthält die kleine ribosomale Untereinheit (40S) die 18S-rRNA und 33 Proteine (Kap. 13.3).
Innerhalb einer Zelle befinden sich etwa fünf bis zehn Millionen Ribosomen. Bei der Zellteilung werden diese Ribosomen auf die Tochterzellen verteilt (nicht gleichmäßig) und müssen durch Neusynthese wieder auf die Ausgangszahl gebracht werden. Anders als bei der Proteinsynthese, bei der ein mRNA-Molekül vielfach translatiert werden und somit die Erzeugung vieler Proteinmoleküle steuern kann, sind die rRNA-Moleküle bereits das Endprodukt, d.h., es müssen pro Zellzyklus wiederum mehr als eine Million rRNA-Moleküle transkribiert werden. Dies wird einerseits durch die Amplifikation der rRNA-Gene erreicht, andererseits dadurch, dass die rRNA-Gene in dichter Abfolge von vielen RNA-Polymerase-I-Molekülen abgelesen werden (Kap. 12.5).

Prozessierung der prä-tRNA

In eukaryontischen Zellen existieren etwa 50 unterschiedliche tRNA-Moleküle. Diese entstehen aus längeren Transkripten (prä-tRNA), die durch Endonucleasen prozessiert werden. Die Ribonuclease P (RNaseP), ein Ribonucleoprotein, entfernt einen Teil des 5'-Bereichs der tRNA-Vorläufermoleküle. Bei Bakterien besitzt der RNA-Anteil der RNaseP selbst als Ribozym die katalytische Funktion, die vom Polypeptidanteil nur verstärkt wird. Die Ribonuclease D (RNaseD) ist für die Prozessierung am 3'-Bereich zuständig (Abb. 12.47). Nachdem die überzähligen Nucleotide am 3'-Ende entfernt worden sind, katalysiert die tRNA-Nucleotidyl-Transferase an dieser Stelle die Anheftung der für alle tRNA-Moleküle charakteristischen CCA-Sequenz. Außerdem muss zur Synthese einiger tRNA-Moleküle noch ein Intron durch Spleißen entfernt werden. Der Spleißmechanismus dieser RNA-Moleküle unterscheidet sich vom zuvor beschriebenen für mRNA. Während bei der mRNA-Reifung die Entfernung der Introns durch zwei Umesterungen erfolgt, werden die Introns der prä-tRNA durch Endonucleasen ausgeschnitten und die freien Enden ligiert. Das Spleißosom ist an der Prä-tRNA-Prozessierung nicht beteiligt.
tRNA-Moleküle weisen noch eine weitere Besonderheit auf. Viele ihrer Basen (etwa 10%) werden posttranskriptionell modifiziert. Da diese modifizierten Basen in Bezug auf die Gesamtmenge aller Basen in DNA und RNA relativ selten sind, werden sie auch als seltene Basen bezeichnet. Neben der Methylierung der 2'-OH-Gruppe der Ribose, der Änderung von Uridin zu Dihydrouridin, Pseudouridin oder Ribothymidin treten Modifikationen von Purinbasen (durch Methylierung oder Isopentenylierung) auf. Diese Basenmodifikationen haben einen positiven Einfluss auf die Effizienz und Genauigkeit der Proteinbiosynthese. In Abb. 12.48 sind die häufigsten modifizierten tRNA-Basen dargestellt.
tRNA-Moleküle sind nicht linear; sie besitzen wie Proteine eine dreidimensionale Struktur. Diese Struktur wird durch zahlreiche Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Bereichen der tRNA-Sequenz gebildet. Die tRNA ist deshalb über weite Strecken doppelsträngig. Vergleicht man die Struktur verschiedener tRNA-Moleküle, so erkennt man mehrere Gemeinsamkeiten (Abb. 12.47):
  • 5'- und 3'-Ende sind über einen sieben Basenpaare langen antiparallelen Stamm miteinander verbunden.

  • Das ungepaarte 3'-Ende trägt die charakteristische CCA-Sequenz.

  • Der D-Arm enthält häufig die modifizierte Base Dihydrouridin.

  • Das Anticodon, das für die Erkennung des Codons auf der mRNA verantwortlich ist (Basenkomplementarität; Kap. 15.1), liegt im Zentrum einer sieben Basen langen Schleife.

  • Im T-Arm kommt die modifizierte Base Pseudouridin vor.

  • Zwischen dem Anticodon-Arm und dem T-Arm liegt eine Schleife, die man aufgrund ihrer variablen Größe bei verschiedenen tRNA-Molekülen V-Schleife nennt.

Alle tRNA-Moleküle haben dadurch eine ähnliche zweidimensionale Struktur, die wegen ihrer Form als Kleeblattstruktur bezeichnet wird. Dieses Kleeblatt nimmt bei der dreidimensionalen Faltung im Raum eine Form an, die dem Großbuchstaben L ähnelt; man nennt diese Struktur deshalb auch L-Form (Abb. 13.2).

MERKE

Auch die Transkripte der RNA-Polymerasen I und III werden posttranskriptionell verändert. Im Fall der durch die RNA-Polymerase I transkribierten ribosomalen Gene werden aus einem langen Vorläufertranskript die drei reifen rRNA-Moleküle (die 28S-, die 18S- und die 5,8S-rRNA) herausgeschnitten. Im Fall der tRNA-Moleküle, die durch die RNA-Polymerase III synthetisiert werden, werden sowohl das 5'-Ende als auch das 3'-Ende der Primärtranskripte durch RNAsen modifiziert bzw. am 3'-Ende auch die Adaptersequenz CCA angefügt. Daneben werden viele Basen in den tRNA-Molekülen verändert, sodass tRNA-Moleküle eine Vielzahl von modifizierten Basen enthalten.

Zusammenfassung

Die Regulation der Genexpression ist ein hochkomplexer Prozess, der die Grundlage der Entwicklung, Differenzierung und Funktion unterschiedlicher Zelltypen eines Organismus ist. Ausgehend von einem einheitlichen Genom werden unterschiedliche zelltyp- und zellstadienspezifische Genexpressionsmuster realisiert. Die entscheidende Regulationsebene ist die der RNA-Transkription, das Überschreiben der DNA-Matrize in eine RNA-Kopie.

RNA-Polymerase

In Prokaryonten ist eine einzige RNA-Polymerase für das Ablesen des gesamten Genoms verantwortlich, bei Eukaryonten existieren drei unterschiedliche nucleäre RNA-Polymerasen, die für die Synthese unterschiedlicher RNA-Moleküle verantwortlich sind. Alle eukaryontischen Polymerasen sind komplexe Enzyme, die aus vielen Untereinheiten bestehen. Von besonderer Bedeutung ist das Verständnis der Funktion der RNA-Polymerase II, da diese Polymerase alle proteinkodierenden Gene transkribiert und daneben noch eine Reihe von regulatorischen RNA-Molekülen synthetisiert.

Regulation der Transkription

Alle Gene besitzen auf ihrer DNA konservierte Signale, die für die Transkription generell sowie für die Regulation der Transkription essenziell sind. Für die Festlegung des Startpunkts der Transkription ist der Promotor verantwortlich. Eine Reihe von generellen Transkriptionsfaktoren bindet am basalen Promotor und ermöglicht der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription. Die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation wird durch zusätzliche genspezifische Promotor-, Enhancer- und/oder Silencer-Elemente positiv bzw. negativ reguliert Promotoren, Enhancer und Silencer enthalten kurze DNA-Sequenzmotive, die als Erkennungsstellen für DNA-bindende Transkriptionsfaktoren fungieren. In der Evolution haben sich einige Proteindomänen (Zn-Finger, HLH-Motiv) durchgesetzt, die als DNA-Bindungsdomänen bei Transkriptionsfaktoren genutzt werden. Die Synthese und Aktivität der Transkriptionsfaktoren selbst können durch eine Vielzahl von Mechanismen moduliert werden. Ähnlich wie bei der Regulation der Enzymaktivität spielt auch bei der Regulation der Transkriptionsfaktoraktivität die kovalente Modifikation eine besondere Rolle. Viele Signaltransduktionsprozesse, die durch Hormone. und Wachstumsfaktoren ausgelöst werden, führen zu einer veränderten Funktion von Transkriptionsfaktoren. Die kombinatorischen Aktivitäten verschiedener Transkriptionsfaktoren, die an die regulatorischen Elemente eines Gens binden, sind für die exakte Regulation der Expression dieses Gens verantwortlich. Auf diese Weise wird eine räumlich (zelltypspezifische) und zeitlich genau kontrollierte Expression der Gene im menschlichen Körper ermöglicht.

Co- und posttranskriptionelle Modifikation der mRNA

In nahezu allen Fällen werden die durch RNA-Polymerasen synthetisierten Primärtranskripte noch co- oder posttranskriptionell verändert bzw. prozessiert. Auch hier findet man die meiste Vielfalt und das höchste Maß an Regulation bei den proteinkodierenden mRNA-Molekülen. Am 5'-Ende wird die Cap-Struktur, ein modifizierter Guanosinrest, in 5'-5'-Bindung angeheftet. Nichtkodierende Bereiche aus dem Inneren der Transkripte, die Introns, werden durch Spleißen entfernt, und nur die verbleibenden Exons tauchen in der reifen mRNA auf. Bei vielen Genen des Menschen können durch alternatives Spleißen unterschiedliche mRNA-Moleküle und damit am Ende unterschiedliche Proteine von einem Gen gebildet werden. Der Spleißprozess selbst wird durch das Spleißosom katalysiert, einem Komplex aus snRNA und Proteinen. Das Spleißosom erkennt konservierte RNA-Sequenzmotive im Primärtranskript (Spleißdonorstelle, Verzweigungspunkt im Intron, Spleißakzeptorstelle) und bewirkt zwei Umesterungsreaktionen, wodurch das Intron als lassoartige Struktur freigesetzt wird und die Exons an definierten Stellen miteinander verbunden werden. Am 3'-Ende schließlich erhalten die mRNA-Moleküle einen Poly(A)-Schwanz, der gemeinsam mit der Cap-Struktur die Stabilität und die Effizienz der Translation der mRNA reguliert.

Prozessierung der tRNA und rRNA

Auch die von der RNA-Polymerase I synthetisierte Vorstufe der ribosomalen RNA sowie die Polymerase-III-transkribierten Vorläufer-tRNAwerden posttranskriptionell prozessiert. Transkription und Prozessierung der ribosomalen RNA findet dabei in spezialisierten nucleären Kompartimenten, den Nucleoli, statt. Bei der Prozessierung der tRNA werden nicht nur Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden entfernt und/oder angehängt, es werden auch viele Nucleotide intern verändert, sodass am Ende ein hoher Anteil an modifizierten Basen vorliegt.

Fragen

  • 1.

    Beschreiben Sie den wesentlichen Unterschied zwischen Promotorerkennung durch die prokaryontische RNA-Polymerase und die RNA-Polymerase II bei Eukaryonten.

  • 2.

    Skizzieren Sie wesentliche Unterschiede zwischen Replikation/DNA-Synthese und Transkription/RNA-Synthese. Berücksichtigen Sie dabei neben den beteiligten Faktoren auch Grundsätzliches wie Direktionalität, Matrize(n), Bausteine, Initiator, Korrekturlesen.

  • 3.

    Beschreiben Sie mögliche Gründe für die Spezialisierung der eukaryontischen RNA-Polymerasen. Denken Sie dabei an Endprodukte der Syntheseprozesse bzw. deren Mengen in der eukaryontischen Zelle.

  • 4.

    Erklären Sie das Grundprinzip des Aufbaus von cis-regulatorischen Elementen (Promotor, Enhancer, Silencer).

  • 5.

    Beschreiben Sie mindestens fünf Mechanismen, durch die die Aktivität von Transkriptionsfaktoren reguliert werden kann. Nennen Sie dazu jeweils Beispiele.

  • 6.

    Viele Transkriptionsfaktoren binden als Heterodimer an die DNA. Erläutern Sie, welche möglichen Vorteile dieser Mechanismus beinhaltet.

  • 7.

    Wie kann die Chromatinstruktur bzw. wie können Chromatinmodifikationen die Effizienz der Transkription beeinflussen?

  • 8.

    Sowohl das 5'-Ende als auch das 3'-Ende der RNA-Polymerase-II-Transkripte werden post-/cotranskriptionell modifiziert. Beschreiben Sie diese Modifikationen und nennen Sie wichtige Funktionen.

  • 9.

    Bei der Bildung der mRNA werden häufig Sequenzen, die in der DNA-Matrize vorhanden sind, entfernt. Erläutern Sie diesen Prozess und beschreiben Sie daraus abgeleitete Mechanismen, durch die von einem Gen unterschiedliche reife mRNA-Moleküle gebildet werden.

  • 10.

    Welche Veränderungen erfahren die Primärtranskripte der RNA-Polymerase I und III?

016 IMPP-Fragen

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