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B978-3-437-43690-1.10013-0

10.1016/B978-3-437-43690-1.10013-0

978-3-437-43690-1

Der genetische Code.

Struktur der tRNA. Sekundärstruktur der tRNAPhe aus Hefe (linke Seite); durch Ausbildung von Basenpaarungen kommt es zu einer Kleeblattstruktur. Tertiärstruktur der tRNAPhe aus Hefe (rechte Seite); aufgrund der allen tRNA-Molekülen gemeinsamen typischen Form wird die Tertiärstruktur auch als L-Form bezeichnet.

Aminoacylierung. Die Aktivierung einer Aminosäure durch Bildung eines Aminoacyladenylats und die Übertragung des Aminoacylrests auf das 3'-Ende der tRNA sind dargestellt.

Struktur des 70S-Ribosoms.

a) Kristallstruktur des Ribosoms aus dem thermophilen Bakterium Thermus thermophilus (tRNA in der A-Stelle: gelb; tRNA in der P-Stelle: rot).

b) Cryo-EM-Struktur des Ribosoms aus E. coli: tRNA in der A-Stelle (blau), tRNA in der P-Stelle (grün). Die Polypeptidkette, die durch einen Tunnel in der 50S-Untereinheit austritt, ist modelliert, ebenso die mRNA.

Polysomen (Elektronenmikroskop). Die dunklen, runden Partikel sind Ribosomen; links im Bild ist das 5'-Ende (Translationsbeginn), rechts im Bild das 3'-Ende erkennbar. Die Größenzunahme der wachsenden Polypeptidketten mit fortschreitender Translation ist deutlich zu sehen.

Schema der Initiation der Translation in Eukaryonten. Nicht gezeigt ist die Stimulierung der Initiation durch das Poly(A)-bindende Protein Pab1p, das an das Poly(A)-Ende und an eIF4G bindet und damit die Bindung von eIF4G begünstigt.

Met-tRNA Methionyl-tRNA, An Poly(A)-Ende der mRNA

Schema der Elongation der prokaryontischen Translation. Die entsprechenden eukaryontischen Faktoren sind eEF1 (Aminoacyl-tRNA-Bindung) und eEF2 (Translokation).

Schematischer Mechanismus der Peptidverknüpfung am Ribosom. Der nucleophile Angriff der freien Aminogruppe der Aminoacyl-tRNA (A-Stelle) auf die Esterbindung der Peptidyl-tRNA (P-Stelle) führt zur Bildung der Peptidbindung.

Termination der Proteinsynthese bei Prokaryonten. Die entsprechenden Faktoren in Eukaryonten sind eRF1, eRF3 und eIF3.

Hemmung der eukaryontischen Initiation durch Phosphorylierung von eIF2.

Stimulierung der Translation durch Wachstumsfaktoren und Insulin. Die Bindung von Wachstumsfaktor (GF) oder Insulin an spezifische Rezeptoren führt zur Stimulierung intrazellulärer Signalwege. Die Stimulierung von Ras aktiviert die Kaskade der MAP-Kinasen (MAPK), die durch Phosphorylierung von eIF4E zur Stimulierung der Cap-abhängigen Initiation führen. Die Stimulierung der Phosphatidylinosit-3-Kinase (PI3K) (Gegenspieler ist das Tumorsuppressorprotein PTEN) führt zur Bildung von PI(3,4,5)P3 (Phosphatidylinosit-tris-Phosphat) aus PI(4,5)P2. Die PI(3,4,5)P3-abhängige Kinase PDK aktiviert die Protein-Kinase B (PKB oder Akt). Durch Aktivierung der S6-Kinase (S6K) und der Kinase mTOR und die Hemmung der Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3) kommt es zur vermehrten (eIF4E, eIF4B) bzw. verminderten (eIF4E-BP, eIF2B, eIF2) Phosphorylierung von Initiationsfaktoren, die zu einer Stimulierung der Initiation führt.

Funktionelle und regulatorische Elemente eukaryontischer mRNA. Bindungsstelle für Regulatorproteine kann z.B. IRE (iron response element) sein. Repressorproteine binden an bestimmte Strukturelemente und blockieren die Translation. AU-reiche Elemente im 3'-UTR sind Bindungsstellen für Proteine, die den nucleolytischen Abbau der mRNA vermitteln. MicroRNA-Moleküle binden ebenfalls im 3'-UTR.

Regulation der Translation von Ferritin-mRNA durch Fe2+. Bei hoher Fe2+-Konzentration sind die IRE (iron response elements) frei und können durch die Helicase eIF4A aufgelöst werden, sodass die Initiation der Translation nicht behindert wird. Bei niedriger Fe2+-Konzentration wird die Bindung von IRP (iron response element-binding protein) an das IRE stimuliert und das IRE gegenüber der Helicase eIF4A stabilisiert. Die IRE/IRP-Struktur inhibiert die Bindung des 43S-Komplexes an den Cap-Bindungskomplex und damit die Translation der Ferritin-mRNA.

P-bodies in einer Tumorzelle. Die P-bodies sind als rote Punkte im Zytosol neben dem Zellkern (blau) zu erkennen.

Aufbau von Ribosomen

Tab. 13.1
ganze Ribosomen kleine Untereinheit große Untereinheit
Eukaryonten
Größe 80S (4,2 MDa) 40S (1,4 MDa) 60S (2,8 MDa)
rRNA 18S (1 874 Nucleotide) 28S (4718 Nucleotide)
5,8S (160 Nucleotide)
5S (120 Nucleotide)
Proteine 33 49
Prokaryonten
Größe 70S (2,5 MDa) 30S (0,9 MDa) 50S (1,6 MDa)
rRNA 16S (1 542 Nucleotide) 23S (2904 Nucleotide)
5S (120 Nucleotide)
Proteine 21 34

Elongationsfaktoren

Tab. 13.2
Prokaryonten Eukaryonten Funktion
EF-Tu eEF1 Aminoacyl-tRNA-Bindung
EF-Ts eEF1, GDP-GTP-Austausch
EF-G eEF2 Translokation

Hemmung der prokaryontischen Translation durch Antibiotika

Tab. 13.3
Antibiotikum Bindungsstelle betroffene Teilreaktion
Tetracyclin 16S-rRNA Aminoacyl-tRNA-Bindung
Neomycin 16S-rRNA Codon-Erkennung
Streptomycin 16S-rRNA Codon-Erkennung
Chloramphenicol 23S-rRNA Peptidyltransfer
Thiostrepton 23S-rRNA Translokation
Fusidinsäure EF-G Translokation

Translation

W. Wintermeyer

  • 13.1

    Der genetische Code 402

  • 13.1.1

    Prinzip des genetischen Codes402

  • 13.1.2

    Folgen von Mutationen402

  • 13.2

    Transfer-RNA 403

  • 13.2.1

    Struktur und Funktion von tRNA403

  • 13.2.2

    Wobble-Basenpaare in der dritten Codon-Position403

  • 13.2.3

    Aminoacyl-tRNA-Synthetasen404

  • 13.3

    Ribosomen 405

  • 13.3.1

    Aufbau der Ribosomen405

  • 13.3.2

    Biogenese der Ribosomen406

  • 13.4

    Proteinbiosynthese 406

  • 13.4.1

    Orte der Proteinsynthese406

  • 13.4.2

    Phasen der Proteinsynthese407

  • 13.4.3

    Initiation der Translation bei Prokaryonten407

  • 13.4.4

    Initiation der Translation bei Eukaryonten408

  • 13.4.5

    Elongation409

  • 13.4.6

    Termination410

  • 13.5

    Regulation der Translation bei Eukaryonten 411

  • 13.5.1

    Hemmung der Initiation durch eIF2-Kinasen411

  • 13.5.2

    Stimulierung der Initiation durch Protein-Kinasen412

  • 13.5.3

    Regulation durch mRNA-bindende Proteine oder MicroRNA412

  • 13.6

    Hemmstoffe der Translation 414

  • 13.6.1

    Antibiotika414

  • 13.6.2

    Exotoxine414

Praxisfall

Ein 40-jähriger Patient leidet an epileptischen Anfällen, verbunden mit Muskelschwäche, fortschreitender Demenz und Schwerhörigkeit. Seine Mutter und Großmutter mütterlicherseits zeigten dieselben Symptome. Sie entnehmen eine Biopsie aus dem Muskel und isolieren die mitochondriale DNA. Beim Vergleich der DNA-Sequenz des Patienten mit einer Kontrollsequenz fällt auf, dass an Position 8 344 in einem Gen für die tRNALys ein A gegen ein G ausgetauscht ist. Die RNA-Analyse zeigt, dass im Gewebe des Patienten diese tRNALys nur zu 65% ihrer normalen Menge vorhanden ist. Die Proteinsynthese in den Mitochondrien des Patienten ist stark vermindert, und Untereinheiten der Cytochromoxidase und Cytochrom b werden unvollständig synthetisiert.

Mitochondrien besitzen ein eigenes kleines Genom, das einige wichtige mitochondriale Enzyme und die Komponenten der Replikation, Transkription und Translation kodiert. Die Erkrankung des Patienten ist auf eine erbliche Störung der mitochondrialen Proteinsynthese zurückzuführen, die durch die Verminderung der Aktivität einer mitochondrialen tRNALys infolge einer Punktmutation verursacht wird. Die Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion durch Störung der Translation führt zu einem Krankheitsbild, das als myoklone Epilepsie bezeichnet wird. Erbliche Störungen der Translation als Ursache für Erkrankungen sind selten, da sie wegen der zentralen Bedeutung der Translation für die Zelle kaum toleriert werden und entsprechende Mutationen die Entwicklung lebensfähiger Feten meist nicht zulassen.

Zur Orientierung

Bei der Translation wird die genetische Information, die in der Basenabfolge der DNA gespeichert ist, in die Abfolge von Aminosäuren in Proteinen übersetzt. Alle Organismen verwenden den gleichen genetischen Code, und auch der Translationsapparat besteht aus grundsätzlich ähnlichen Komponenten. Gleichwohl gibt es zwischen Bakterien und höheren Zellen deutliche Unterschiede in Aufbau und Funktion des Translationsapparats, die z.B. bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen mit Antibiotika ausgenutzt werden. Als Grundlage für das Verständnis der Translation wird in diesem Kapitel zunächst der genetische Code erklärt. Den Zusammenhang zwischen Codon und Aminosäure stellt die Transfer-RNA her. Ort der Proteinbiosynthese sind die Ribosomen. Die Proteinbiosynthese verläuft in drei Phasen: Initiation, Elongation und Termination. Insbesondere die Initiation wird gehemmt oder stimuliert, wofür physiologisch meist Kinasen zuständig sind, aber auch externe Stoffe, wie Antibiotika oder Exotoxine infrage kommen.

Der genetische Code

Die Information für die Aminosäuresequenz der Proteine ist in der Nucleotidsequenz der Gene in der DNA gespeichert. Zur Übersetzung der genetischen Information (Genexpression) werden in der Transkription RNA-Kopien der Gensequenzen hergestellt (mRNA), die dann in der Translation den Aufbau der Proteine bestimmen. Die Information für die Abfolge der Aminosäuren ist in der Basensequenz der Nucleinsäuren, im sog. genetischen Code, verschlüsselt.

Prinzip des genetischen Codes

Der genetische Code ist so aufgebaut, dass von den vier Nucleinsäurebasen der mRNA (G, A, C, U) jeweils drei gleiche oder verschiedene ein Codewort (Codon) bilden (Abb. 13.1). Von den 64 (43) möglichen Codons stehen 61 für eine der 20 zu kodierenden Aminosäuren; die restlichen drei Codons sind Endsignale einer Polypeptidkette. Die Zahl der kodierenden Codons ist also wesentlich größer als die Zahl der zu kodierenden Aminosäuren (degenerierter Code), sodass es für die meisten Aminosäuren (außer für Methionin und Tryptophan) zwei oder mehr Codons gibt. Der genetische Code wird in allen Organismen in gleicher Weise benutzt, er ist universell. Geringe Abweichungen in der Zuordnung einzelner Codons wurden bisher nur in Mitochondrien und in Ziliaten (Wimperntierchen) gefunden. Die Codons der mRNA werden von den Anticodons der tRNA-Moleküle durch Ausbildung komplementärer Basenpaare erkannt.
Das Codon AUG steht für die Aminosäure Methionin; in einem bestimmten strukturellen Kontext der mRNA steht es für den Start der Proteinsynthese. Für die Dekodierung des AUG-Startcodons ist eine bestimmte tRNAMet zuständig (Initiator-tRNAMet), die sich von der Elongator-tRNAMet unterscheidet, die Methionin während der Elongation in interne Positionen der mRNA an AUG-Codons der kodierenden Sequenz einbaut. Die drei Terminationscodons UAA, UAG und UGA stehen für Stopp; sie werden nicht von der tRNA, sondern von Proteinen, den Terminationsfaktoren, erkannt.

Schon gewusst

In den letzten Jahren ist zu den 20 Standardaminosäuren, die am Ribosom in Proteine eingebaut werden, als 21. Aminosäure das Selenocystein dazugekommen. Es findet sich im aktiven Zentrum einiger Oxidoreduktasen (z.B. Glutathion-Peroxidase; Thyroxin- und Triiodthyronin-Deiodase) und wird am Ribosom direkt bei der Proteinbiosynthese eingebaut. Selenocystein wird aus Serin durch enzymatische Umwandlung einer mit Serin beladenen tRNASec mit ungewöhnlicher Struktur gebildet. Die so entstandene Sec-tRNASec bindet unter Beteiligung spezieller Faktoren an das Ribosom und erkennt ein UGA-Codon, das normalerweise in der betreffenden mRNA für Stopp steht, wenn sich in der Nähe des UGA-Codons eine bestimmte Haarnadelstruktur befindet (selenocysteine insertion sequence, SECIS). In eukaryontischer mRNA treten SECIS-Elemente im 3'-nichttranslatierten Bereich auf (3'-UTR).

In einigen methanogenen Archaebakterien findet sich Pyrrolysin, das mithilfe einer Pyrrolysyl-tRNA an UAG-Codons am Ribosom in ein Protein (die Methylaminotransferase) eingebaut wird. Die Erkennung des UAG-Codons wird wahrscheinlich durch ähnliche Strukturelemente der mRNA vermittelt wie bei Selenocystein. Pyrrolysin ist demnach die 22. Aminosäure, die am Ribosom in Proteine eingebaut wird.

Folgen von Mutationen

Missense-Mutationen
Veränderungen der DNA-Sequenz (Mutationen; Kap. 14) durch Basenaustausch bleiben häufig stumm, da meist mehrere Codons für eine Aminosäure stehen. Sie können aber auch zum Einbau anderer Aminosäuren führen (Missense). Da die Codon-Tripletts in der DNA/mRNA unmittelbar aufeinanderfolgen, führen Mutationen, bei denen eine oder mehrere Basen verloren gehen (Deletion) oder zusätzlich auftreten (Insertion), in der Regel zu einer vollständig veränderten Aminosäuresequenz des synthetisierten Proteins (außer bei Veränderungen um drei Basen oder Vielfache von drei).
Nonsense-Mutationen
Besonders problematisch sind Punktmutationen, durch die ein für eine Aminosäure kodierendes Codon zu einem Stoppcodon mutiert (Nonsense), z.B. UGG (Tryptophan) zu UGA (Stopp). An diesen Stellen wird die Synthese des Proteins vorzeitig abgebrochen, und es entsteht ein verkürztes, funktionsunfähiges Protein, das zu Störungen der Zellfunktion führen kann. Es gibt Kontrollmechanismen, die zu einem gezielten raschen Abbau von mRNA-Molekülen führen, die solche Nonsense-Mutationen innerhalb der kodierenden Sequenz enthalten (nonsense-mediated decay, NMD).
Nonsense-mediated decay
Das reguläre Terminationscodon befindet sich in der Regel im letzten Exon der prä-mRNA. Beim Spleißen der prä-mRNA werden an den Exon-Exon-Übergängen Proteinkomplexe hinterlassen (exon junction complex, EJC), die beim Export der reifen mRNA vom Zellkern in das Zytosol gebunden bleiben und erst durch das erste translatierende Ribosom entfernt werden. Führen Mutationen oder Transkriptionsfehler zu einem irregulären Terminationscodon in einem Exon vor dem letzten Exon-Exon-Übergang der prä-mRNA und damit zu einem vorzeitigen Stopp der Translation, bleiben die EJC im noch nicht translatierten Bereich erhalten. Dies ist das Signal für den gezielten Abbau dieser mRNA durch spezifische Nucleasen.

Schon gewusst

Es gibt seltene Fälle, bei denen eine Verschiebung des Leserasters während der Translation (häufig in +1-Richtung, seltener in –1-Richtung) Voraussetzung für die Entstehung eines bestimmten Translationsprodukts ist. Die regulierende Einwirkung auf die Rasterverschiebung dient in diesen Fällen zur Regulation der Synthese des entsprechenden Proteins. Im Genom von manchen Retroviren (z.B. HIV) überlappen die Gene für das Kapsidprotein (gag) und die reverse Transkriptase (pol). Bei der Translation der viralen RNA wird im normalen Leseraster gag translatiert und an einem Stoppcodon terminiert. Mit geringer Frequenz findet am Ende von gag eine –1-Verschiebung des Leserasters statt, sodass ein Gag-Pol-Fusionsprotein (oder größere Fusionsproteine) entsteht, das durch eine virale Protease in die Bestandteile zerlegt wird. Dieser Mechanismus stellt sicher, dass viel Kapsidprotein und wenig reverse Transkriptase entstehen.

MERKE

Der genetische Code ist ein Triplettcode, bei dem drei aufeinanderfolgende Basen der DNA (oder mRNA) ein Codon bilden, das jeweils für eine Aminosäure des kodierten Proteins steht. Der genetische Code enthält 64 Codons, von denen 61 die 20 Standardaminosäuren kodieren. Ein bestimmtes Codon (AUG, Methionin) steht für den Beginn des kodierten Proteins, drei Codons (UAA, UAG, UGA) bilden das Signal für das Ende. Der genetische Code ist grundsätzlich für alle Organismen gleich (Universalität); geringfügige Abweichungen, d.h. Codons mit anderer Bedeutung, wurden bisher nur in Mitochondrien und in Ziliaten gefunden.

Transfer-RNA

Struktur und Funktion von tRNA

Transfer-Ribonucleinsäuren (tRNA) sind kleine RNA-Moleküle (meist 75–85 Nucleotide) mit sehr ähnlicher Sekundär- und Tertiärstruktur (Abb. 13.2), die eine große Zahl modifizierter Nucleoside aufweisen. Die tRNA stellt die Beziehung zwischen dem mRNA-Codon und der jeweils kodierten Aminosäure her (Adapterfunktion). Die hierfür notwendigen funktionellen Zentren sind das Anticodon und das 3'-terminale Akzeptorende, auf das die Aminosäure in einer durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase katalysierten Reaktion (Kap. 13.2.3) übertragen wird.

MERKE

Transfer-RNA-Moleküle (tRNA) stellen die Beziehung zwischen mRNA-Codon und Aminosäure her (Adapterfunktion).

Die Dekodierung der mRNA am Ribosom erfolgt durch die Ausbildung von drei Basenpaaren zwischen den drei Basen des Codons und den drei Basen des komplementären Anticodons der tRNA. Die meisten Aminosäuren werden von mehr als einem Codon, in einigen Fällen von bis zu sechs Codons kodiert. Demnach gibt es für Aminosäuren mit mehreren Codons mehrere tRNA-Moleküle, die mit derselben Aminosäure beladen werden. Sie werden als Isoakzeptoren bezeichnet und unterscheiden sich v.a. im Anticodon, aber auch sonst in der Sequenz.

Wobble-Basenpaare in der dritten Codon-Position

Während die Basenpaarung zwischen Codon und Anticodon in der ersten und zweiten Position des Codons streng nach Watson-Crick erfolgt (AU; UA; GC; CG), sind zwischen der dritten Base des Codons und der ersten Base des Anticodons auch andere Basenpaare möglich (Wobble-Paare, z.B. GU; IU/C/A), sodass sich in einigen Fällen das Anticodon einer tRNA mit zwei oder mehr Codons paaren kann, die sich in der dritten Position unterscheiden. So enthalten Zellen etwa 40–50 verschiedene tRNA-Molekülen, mit denen die 61 für Aminosäuren kodierenden Codons abgelesen werden können. In den Mitochondrien von Säugerzellen, die einen leicht abgewandelten genetischen Code benutzen, reichen dafür sogar nur 22 verschiedene tRNA-Moleküle aus.

Blick ins Labor

Die Häufigkeit, mit der bestimmte Codons für eine Aminosäure benutzt werden, ist von Spezies zu Spezies verschieden. Bei der Expression von fremden Genen, die in der Biotechnologie oder Gentherapie in Wirtsorganismen eingeführt werden (Kap. 15), kann dies Schwierigkeiten verursachen, da die Häufigkeitsverteilung der isoakzeptierenden tRNA-Moleküle der Codon-Häufigkeit angepasst ist. In solchen Fällen ist es zweckmäßig, die Codons des fremden Gens der Codon-Häufigkeit des Wirtsorganismus anzupassen.

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

Aminoacylierung
Die Übertragung der Aminosäure auf das 3'-Ende der tRNA (Aminoacylierung) wird durch eine Gruppe von Ligasen, die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, katalysiert, die für die jeweilige Aminosäure und die zugehörige tRNA (oder Gruppe von isoakzeptierenden tRNA-Molekülen) spezifisch sind. Demnach gibt es 20 verschiedene Aminoacyl-tRNA-Synthetasen für die 20 Standardaminosäuren. Die Aminoacylierung erfolgt in zwei Schritten, die von demselben Enzym katalysiert werden (Abb. 13.3):
1. Aminosäure + ATP Aminoacyl~AMP + PPi
Im ersten Schritt erfolgt die Aktivierung der Aminosäure durch Bildung einer energiereichen Anhydridbindung zwischen der Carboxylgruppe der Aminosäure und der Phosphorylgruppe des AMP. Wie bei anderen Aktivierungsreaktionen, die unter Bildung eines Adenylats und Abspaltung von Pyrophosphat (PPi) verlaufen (z.B. der Fettsäureaktivierung), wird das Gleichgewicht der Reaktion durch Spaltung des PPi mittels Pyrophosphatase zugunsten des Adenylats verschoben.
2. Aminoacyl~AMP + tRNA Aminoacyl~tRNA + AMP
Im zweiten Schritt wird der Aminoacylrest vom Aminoacyl-AMP auf eine Hydroxylgruppe der Ribose des endständigen Adenosinrests der tRNA unter Bildung von Aminoacyl-tRNA übertragen. Der Aminoacylrest behält bei dieser Umesterung seine energiereiche Esterbindung.
Die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen lassen sich in zwei Klassen einteilen. Sie unterscheiden sich in der Struktur des aktiven Zentrums sowie in der Art der tRNA-Bindung und übertragen den Aminoacylrest entweder auf die 2'- oder die 3'-HydroxylGruppe der tRNA. Durch spontane Wanderung des Aminoacylrests entsteht die 3'-Aminoacyl-Verbindung, die das Substrat für die weiteren Schritte der Translation ist.

MERKE

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen aktivieren Aminosäuren in einer ATP-abhängigen Reaktion unter Bildung eines Aminoacyladenylats und übertragen den Aminoacylrest auf das 3'-Ende der tRNA unter Bildung einer energiereichen Esterbindung (Aminoacylierung). Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sind spezifisch für jeweils eine Aminosäure und die zugehörige tRNA oder Gruppe von isoakzeptierenden tRNA-Molekülen. Es gibt 20 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen für die 20 Standardaminosäuren.

Substraterkennung und Fehlerkorrektur
Die selektive Erkennung der tRNA erfolgt durch Ausbildung spezifischer Wechselwirkungen der Synthetase mit in der Regel mehreren Erkennungselementen in verschiedenen Regionen des tRNA-Moleküls. Bei vielen tRNA-Molekülen sind dies Anticodon-Basen sowie die Sequenzen im Akzeptorstamm. Isoakzeptierende tRNA-Moleküle weisen das gleiche Muster von Erkennungselementen auf.
Die Aminoacylierung erfolgt mit hoher Genauigkeit. Die Fehlerrate liegt bei etwa einem Fehleinbau pro 1000 Aminosäuren. Mit dieser Genauigkeit muss demnach die Aminoacyl-tRNA-Synthetase ihre Substrate, die jeweils zugehörige Aminosäure und tRNA, erkennen und von anderen unterscheiden. Die genaue Erkennung der Aminosäuren ist in den meisten Fällen unproblematisch, da sie hinsichtlich ihrer Molekülgröße und ihrer chemischen Eigenschaften hinreichend verschieden sind. In den wenigen Fällen, wo diese Kriterien für eine genaue Diskriminierung nicht ausreichen, wird die erforderliche Genauigkeit durch einen Korrekturmechanismus (sog. Editing) erreicht, indem die betreffenden Aminoacyl-tRNA-Synthetasen die inkorrekt gebildete Aminoacyl-tRNA hydrolysieren. Hierfür besitzen diese Enzyme eine Hydrolaseaktivität, die in einem zweiten katalytischen Zentrum lokalisiert ist.

Ribosomen

Aufbau der Ribosomen

Die Proteinsynthese findet an den Ribosomen im Zytosol der Zelle statt. Ribosomen sind makromolekulare Ribonucleoproteinpartikel mit Durchmessern von etwa 20 nm, die aus zwei verschieden großen Untereinheiten aufgebaut sind. Sie enthalten mehrere RNA-Moleküle (rRNA) und zahlreiche, überwiegend kleine (10–15 kDa) basische Proteine (Tab. 13.1). Der Aufbau der Ribosomen in Pro- und Eukaryonten ist ähnlich, wobei die eukaryontischen Ribosomen größere RNA-Moleküle und eine größere Zahl von Proteinen und damit eine größere Masse besitzen. Mitochondriale Ribosomen ähneln den prokaryontischen Ribosomen, besitzen jedoch deutlich kleinere rRNA-Moleküle und erheblich mehr Proteine.
Die Sedimentationskonstante S (Svedberg) gibt an, wie schnell ein Molekül oder ein Partikel im Schwerefeld einer Ultrazentrifuge sedimentiert. S-Werte hängen von Größe, Dichte und Gestalt des Moleküls ab und sind deshalb nicht genau additiv.
Die räumliche Struktur von Ribosomen aus prokaryontischen Zellen wurde durch Kristallstrukturanalyse aufgeklärt (Abb. 13.4). Der Kern der kleinen und großen Untereinheit wird von der räumlich gefalteten Struktur der rRNA-Moleküle gebildet; außen sind die ribosomalen Proteine an die rRNA gebunden. Die funktionellen Zentren des Ribosoms, das Dekodierungszentrum auf der kleinen Untereinheit und das Peptidyltransferasezentrum auf der großen Untereinheit, bestehen aus rRNA und sind in den Ribosomen aller Organismen konserviert. Ribosomen weisen Bindungsstellen für Aminoacyl-tRNA (A-Stelle) und Peptidyl-tRNA (P-Stelle) auf. Daneben gibt es noch die Austrittsstelle für tRNA (E-Stelle, für Exit), an welche die tRNA vor der Dissoziation vom Ribosom bindet.

Biogenese der Ribosomen

Ribosomen werden im Zellkern hergestellt, und zwar im Nucleolus, einer elektronenmikroskopisch erkennbaren Substruktur des Zellkerns. Im Nucleolus werden die zahlreichen Gene für die ribosomale RNA durch die RNA-Polymerase I in eine prä-rRNA transkribiert, die 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA-Moleküle enthält. Die Gene für die 5S-rRNA werden dagegen durch die RNA-Polymerase III im Nucleoplasma transkribiert. Die Maturation der prä-rRNA zur reifen rRNA durch spezifische nucleolytische Spaltungen findet in prä-ribosomalen Partikeln statt. Diese entstehen durch Anlagerung ribosomaler Proteine, die aus dem Zytosol importiert werden, sowie zahlreicher (> 100) Proteine, die für die Reifung erforderlich sind. Der letzte Reifungsschritt, bei dem die fertigen 40S- und 60S-Untereinheiten entstehen, findet im Nucleoplasma statt. Die ribosomalen Untereinheiten werden dann durch die Kernporen in das Zytoplasma geschleust, wo sie in die Translation eintreten.

MERKE

Ribosomen sind makromolekulare Ribonucleoproteinpartikel, die aus mehreren rRNA-Molekülen und zahlreichen Proteinen bestehen. Sie sind aus zwei Untereinheiten aufgebaut, auf denen die funktionellen Zentren für die Codon-Anticodon-Wechselwirkung (kleine Untereinheit) und die Peptidverknüpfung (große Untereinheit) lokalisiert sind. Die funktionellen Zentren werden aus konservierten Regionen der rRNA-Moleküle gebildet. Der Aufbau der Ribosomen von Pro- und Eukaryonten ist ähnlich, jedoch gibt es erhebliche Unterschiede in der Größe der rRNA-Moleküle und in der Zahl der Proteine.

Proteinbiosynthese

Der Ablauf der ribosomalen Proteinsynthese ist bei Pro- und Eukaryonten grundsätzlich ähnlich. Die folgende Darstellung beschränkt sich auf die Grundzüge der Translation, wobei Teilschritte, die bei Pro- und Eukaryonten gleich ablaufen, gemeinsam abgehandelt werden. Getrennt beschrieben werden die Initiation und die damit eng verbundene Regulation der eukaryontischen Translation, da hier wesentliche Unterschiede bestehen.

Orte der Proteinsythese

Bei Prokaryonten ist die Translation räumlich und funktionell eng an die Transkription gekoppelt, sodass eine mRNA noch während der Transkription in die Translation eintreten kann. In eukaryontischen Zellen findet die Proteinsynthese im Zytosol statt, d.h., die mRNA muss nach der Transkription und Maturation aus dem Kern in das Zytosol transportiert werden. Proteine, die nach ihrer Synthese in der Zelle verbleiben, werden an Ribosomen gebildet, die frei im Zytoplasma vorkommen. Membranproteine und Proteine, die von der Zelle sezerniert werden, entstehen an Ribosomen, die an die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) gebunden sind (raues ER, Kap. 16.3.1). Das Protein tritt während der Synthese in das Lumen des ER über und wird dort sowie während der nachfolgenden Passage durch den Golgi-Apparat v.a. durch Glykosylierung modifiziert (posttranslationale Modifizierung, Kap. 2.2.9). Zellen, die einen großen Anteil der synthetisierten Proteine exportieren (z.B. Leber, Pankreas), enthalten besonders viele Ribosomen, von denen ein großer Teil am ER gebunden ist.

MERKE

In eukaryontischen Zellen sind Transkription und Translation räumlich getrennt. Die Transkription und Reifung der mRNA findet im Zellkern statt, die Translation im Zytosol. Zytosolische Proteine werden an freien Ribosomen synthetisiert, Exportproteine und Proteine der Plasmamembran an Ribosomen, die an das endoplasmatische Retikulum gebunden sind.

Phasen der Proteinsynthese

Während der Initiation findet das Ribosom den Anfang der zu translatierenden mRNA-Sequenz. Dabei wird die Initiator-tRNA an das AUG-Startcodon in der P-Stelle des Ribosoms gebunden.
Die Elongation ist ein zyklischer Vorgang. Im ersten Schritt wird eine Aminoacyl-tRNA mit dem komplementären Anticodon an die A-Stelle des Ribosoms gebunden und reagiert mit der Peptidyl-tRNA in der P-Stelle unter Bildung einer Peptidbindung. Es resultieren eine deacylierte tRNA in der P-Stelle und eine um die neu eingetretene Aminosäure verlängerte Peptidyl-tRNA in der A-Stelle. Mit der Translokation dieser Peptidyl-tRNA in die P-Stelle wird ein Zyklus der Elongation abgeschlossen. Dabei wird die mRNA um ein Codon-Triplett verschoben, und die deacylierte tRNA dissoziiert von der P-Stelle. Der Zyklus wiederholt sich, bis die zu translatierende mRNA-Sequenz vollständig translatiert ist und bei der Translokation der Peptidyl-tRNA und der mRNA ein Terminationscodon im Dekodierungszentrum erscheint. Dies ist das Signal für die Termination, bei der das fertige Protein hydrolytisch von der Peptidyl-tRNA abgespalten und freigesetzt wird. Anschließend können die Ribosomen erneut in die Initiation eintreten.
Sobald der Initiationsbereich der mRNA wieder zugänglich ist, kann ein weiteres Ribosom mit der Translation beginnen. So kann dieselbe mRNA gleichzeitig von mehreren Ribosomen translatiert werden, wobei der Abstand zwischen zwei Ribosomen etwa 80 Nucleotide beträgt. Diese Strukturen sind im Elektronenmikroskop als Polysomen erkennbar (Abb. 13.5).

Initiation der Translation bei Prokaryonten

Bei Prokaryonten läuft die Initiation in zwei Phasen ab. In der ersten Phase wird ein 30S-Initiationskomplex gebildet, indem die 30S-Untereinheit die mRNA sowie die Initiator-tRNA, (N-Formylmethionyl-tRNAfMet, fMet-tRNAfMet) bindet. In vielen bakteriellen mRNA-Molekülen finden sich etwa zehn Nucleotide stromaufwärts vor dem Startcodon AUG untereinander ähnliche purinreiche Sequenzen (Shine-Dalgarno-Sequenz). Diese sind zu einer Sequenz nahe dem 3'-Ende der 16S-rRNA der 30S-Untereinheit komplementär und erleichtern durch Ausbildung der entsprechenden Basenpaare die Positionierung der 30S-Untereinheit am Startcodon. Die Erkennung des AUG-Codons im 30S-Initiationskomplex geschieht durch das Anticodon der Initiator-tRNA in der P-Stelle der 30S-Untereinheit.
An der ersten Phase der Initiation sind die drei Initiationsfaktoren IF1, IF2 und IF3 beteiligt. IF1 stimuliert die Funktionen von IF2 und IF3. IF2, eine GTPase, hat die entscheidende Funktion, da er für die Bindung der Initiator-tRNA notwendig ist. IF3 stabilisiert die freien Untereinheiten der Ribosomen durch Bindung an die freie 30S-Untereinheit, stimuliert die Bildung des 30S-Initiationskomplexes und spielt bei der Selektion der Initiator-tRNA eine Rolle.
In der zweiten Phase wird durch Assoziation der 50S-Untereinheit ein 70S-Initiationskomplex gebildet. Dieser Vorgang führt zu einer Stimulierung der intrinsischen GTPase-Aktivität von IF2 zur GTP-Hydrolyse und damit zu einer Inaktivierung von IF2. Dies hat zur Folge, dass die drei Initiationsfaktoren vom Ribosom dissoziieren. Der 70S-Initiationskomplex enthält danach nur noch die Initiator-tRNA, die in der P-Stelle an das AUG-Startcodon der mRNA gebunden ist. In der nicht besetzten A-Stelle befindet sich das dem AUG folgende Codon. Mit der Bindung der entsprechenden Aminoacyl-tRNA wird die erste Runde der Elongation eingeleitet.

Initiation der Translation bei Eukaryonten

Bei Eukaryonten ist an der Initiation der Translation eine große Zahl (> 12) von Initiationsfaktoren beteiligt, von denen hier nur die wichtigsten erwähnt werden. Eukaryontische Initiationsfaktoren werden eIF abgekürzt und nummeriert. Die meisten eukaryontischen mRNA-Moleküle haben einen komplexeren Aufbau als die prokaryontischen. Das 5'-Ende weist die sog. Cap-Struktur (m7GpppN) auf, die bei der Reifung der mRNA im Zellkern angeheftet wird (Kap. 12.9.1) und ein wichtiges Element für die Initiation der Translation bei Eukaryonten darstellt. Es folgt die 5'-nichttranslatierte Region (5'-UTR), die 100 Nucleotide oder mehr umfassen kann, bevor mit einem AUG-Startcodon die kodierende Region beginnt. Nach dem Terminationscodon folgt die 3'-nichttranslatierte Region (3'-UTR), die eine wichtige Rolle bei der Regulation der Translation spielt (unten). Am 3'-Ende der mRNA befindet sich meist eine Poly(A)-Sequenz, die ebenfalls nach der Transkription angeheftet wird. Ihre Länge variiert je nach Organismus und Alter der mRNA und kann bis zu einige hundert Adenylylreste umfassen.
Die drei Phasen der Initiation
Die Initiation umfasst mehrere Phasen (Abb. 13.6).
1. Cap-abhängige Initiation: In der ersten Phase wird am 5'-Cap der mRNA ein Komplex aus mehreren Initiationsfaktoren und der 40S-Untereinheit des Ribosoms aufgebaut (Cap-Bindungskomplex). Das Cap-bindende Protein eIF4E leitet diesen Vorgang ein und bindet – neben anderen Faktoren – das Protein eIF4G, einen zentralen Bestandteil des Initiationskomplexes. Die Wechselwirkung mit eIF3 (ein großer Komplex aus mindestens acht Untereinheiten) ermöglicht eIF4G die Anlagerung der 40S-Untereinheit, die vorher mit Initiator-tRNA (Met-tRNAMet, im Komplex mit eIF2-GTP) und eIF3 beladen wurde (43S-Komplex). eIF4G bindet auch an das Poly(A)-bindende Protein (Pab1p) und vermittelt so den Kontakt zwischen dem 5'- und 3'-Ende der mRNA (closed loop), der die Initiation begünstigt. Die progressive Verkürzung der Poly(A)-Kette durch nucleolytischen Abbau führt zum Verlust dieses Kontakts, damit zur Verminderung der Initiationseffizienz und schließlich zum Abbau der mRNA.
2. Scanning und AUG-Erkennung: Der Komplex aus der 40S-Untereinheit und einigen Initiationsfaktoren wandert entlang der 5'-UTR-Sequenz, bis er das AUG-Startcodon erreicht. Die gerichtete Bewegung kommt durch die Helicase eIF4A unter ATP-Hydrolyse zustande; auch eIF4B ist beteiligt. Das Absuchen des 5'-Endes der mRNA nach dem Startcodon wird als Scanning bezeichnet.
3. Bildung des 80S-Initiationskomplexes: Schließlich führt die Bindung der 60S-Untereinheit unter GTP-Hydrolyse durch eIF2 und Abdissoziation der Initiationsfaktoren zur Bildung des 80S-Initiationskomplexes, der anschließend in die Elongation eintritt. Im Unterschied zum bakteriellen IF2 benötigt eIF2 zur Regeneration (d.h. Austausch von GDP gegen GTP) einen Austauschfaktor (eIF2B). Wie in Kap. 13.5.1 beschrieben, ist die Hemmung des GDP-GTP-Austauschs durch Phosphorylierung des eIF2 ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der Initiation und damit der Translation.
Cap-unabhängige Initiation
Neben der Cap-abhängigen Initiation, die für die meisten zellulären mRNA-Moleküle gilt, gibt es auch eine Cap-unabhängige Initiation für die Translation von mRNA-Molekülen ohne 5'-Cap. Diese mRNA-Moleküle weisen im 5'-UTR unmittelbar vor der kodierenden Region eine besondere Struktur (internal ribosome entry site, IRES) auf, an der sich der Initiationskomplex unter Beteiligung einiger der o.g. Initiationsfaktoren sowie weiterer Proteinfaktoren der Zelle ohne vorausgehendes Scanning ausbilden kann. Dieser Mechanismus wird für die Translationsinitiation von mRNA-Molekülen einiger kleiner RNA-Viren (Picornaviren, z.B. Polio, Enzephalomyokarditis) benutzt, welche die 5'-Cap-abhängige Initiation der zellulären mRNA-Moleküle durch proteolytische Spaltung von eIF4G unterdrücken und damit die Translation der viralen mRNA, die kein 5'-Cap, dafür aber ein IRES-Element besitzen, begünstigen. Damit erreicht das Poliovirus, dass der zelluläre Translationsapparat vorzugsweise für die Synthese von Polioproteinen zur Verfügung steht. Es finden sich aber zunehmend auch zelluläre mRNA-Moleküle, die IRES-Elemente im 5'-UTR enthalten und Cap-unabhängig initiiert werden können. Dazu gehören z.B. Kinasen, die an der Regulation des Zellzyklus bzw. der Apoptose beteiligt sind. Die Steuerung der Aktivität der beteiligten Faktoren bietet zusätzliche Möglichkeiten zur Regulation der Translation.

Elongation

Die Verlängerung der Peptidkette verläuft in Pro- und Eukaryonten sehr ähnlich, sodass sie für beide Systeme gemeinsam beschrieben werden kann. Die einzelnen Schritte des Elongationszyklus werden von den Elongationsfaktoren katalysiert (Tab. 13.2).
Aminoacyl-tRNA-Bindung
EF-Tu (prokaryontisch) bzw. eEF1 (eukaryontisch) katalysieren die Bindung der Aminoacyl-tRNA an die A-Stelle des Ribosoms. Beide Faktoren sind GTPasen, die in der GTP-Form mit hoher Affinität einen Komplex mit Aminoacyl-tRNA bilden, der an das Ribosom bindet. Der Komplex aus Aminoacyl-tRNA und Elongationsfaktoren wird als Ternärkomplex bezeichnet. Die Konzentrationen von EF-Tu bzw. eEF1 in der Zelle sind sehr hoch, sodass praktisch die gesamte Aminoacyl-tRNA der Zelle im Komplex gebunden ist und unmittelbar für die Bindung an das Ribosom zur Verfügung steht.
Am besten ist der Mechanismus der EF-Tu-vermittelten Aminoacyl-tRNA-Bindung an das Ribosom verstanden; der Ablauf für eEF1 ist jedoch grundsätzlich der gleiche (Abb. 13.7). Zunächst bindet der Komplex EF-Tu-GTP-Aminoacyl-tRNA an das Ribosom, das Peptidyl-tRNA (oder Initiator-tRNA) in der P-Stelle trägt und in dessen A-Stelle sich das nächste zu translatierende mRNA-Codon befindet. Da nur einer der 40–50 verschiedenen Ternärkomplexe, die zufällig mit dem Ribosom in Wechselwirkung treten, die Aminoacyl-tRNA mit dem komplementären Anticodon enthält, kommt es nur mit diesem zur Codon-Erkennung; Ternärkomplexe mit nichtkomplementärem Anticodon dissoziieren dagegen wieder rasch vom Ribosom ab.
Die Codon-Erkennung und die damit einhergehende Bildung von Basenpaaren zwischen Codon und Anticodon führen dazu, dass die GTPase-Aktivität von EF-Tu, die an sich sehr niedrig ist, um mehrere Größenordnungen gesteigert wird. Die GTP-Hydrolyse bewirkt eine Umlagerung der Struktur des EF-Tu in die GDP-Form, die zur Loslösung von der Aminoacyl-tRNA führt. EF-Tu-GDP (eEF1-GDP bei Eukaryonten) dissoziiert anschließend vom Ribosom und wird durch Austausch des GDP durch GTP wieder in die aktive GTP-Form überführt. Der GDP-GTP-Austausch wird durch den Austauschfaktor EF-Ts (eEF1 bei Eukaryonten) katalysiert.
Verknüpfung der Peptidbindung
Nach der Freisetzung von EF-Tu bewegt sich das Aminoacyl-Ende der Aminoacyl-tRNA in das Peptidyltransferasezentrum auf der großen Ribosomenuntereinheit, woraufhin unmittelbar die Peptidverknüpfung stattfindet. Dabei reagiert die freie -Aminogruppe der Aminoacyl-tRNA als Nucleophil mit dem Carboxyl-C-Atom der Esterbindung der Peptidyl-tRNA (Abb. 13.8). Die Esterbindung ist energiereich, sodass die Peptidverknüpfung ohne weitere Energiezufuhr ablaufen kann (exergonische Reaktion). Das Ergebnis der Reaktion ist eine um eine Aminosäure verlängerte Peptidyl-tRNA in der A-Stelle und eine deacylierte tRNA in der P-Stelle. Die Anticodons beider tRNA-Moleküle sind auf der 30S-Untereinheit an die entsprechenden Codons der mRNA gebunden.
Das Peptidyltransferasezentrum ist in der Domäne V der 23S-rRNA lokalisiert. In diesem Bereich wurden die Bindungsstellen von Antibiotika (Kap. 13.6.1) sowie Bindungsstellen für die Peptidyl- und Aminoacyl-tRNA lokalisiert.
Die Beschleunigung der Peptidverknüpfung am Ribosom kommt v.a. durch die Wechselwirkungen der Aminoacyl-tRNA mit der 23S-rRNA im aktiven Zentrum zustande. Ribosomale Proteine sind an der Reaktion nicht beteiligt. Demnach ist das Ribosom ein Ribozym, das größte bisher charakterisierte und das bisher einzige natürliche Ribozym mit Polymeraseaktivität.
Vom Peptidyltransferasezentrum aus erstreckt sich ein etwa 10 nm langer Tunnel bis zur Rückseite der großen Untereinheit, durch den sich die wachsende Peptidkette bewegt. Im Tunnel befinden sich jeweils etwa 30–40 Aminosäuren.
Translokation
Der Elongationszyklus wird mit der Translokation abgeschlossen, bei der die beiden tRNA-Moleküle zusammen mit der mRNA am Ribosom verschoben werden. Dadurch gelangt die Peptidyl-tRNA von der A- in die P-Stelle, und das nächste zu translatierende Codon-Triplett der mRNA bindet an die A-Stelle. Nach der Verschiebung in die E-Stelle dissoziiert die deacylierte tRNA vom Ribosom ab, um erneut aminoacyliert zu werden (Abb. 13.7).
Die Translokation wird durch den Elongationsfaktor EF-G (eEF2 in Eukaryonten) katalysiert; es handelt sich wieder um eine GTPase, die im Verlauf der Reaktion GTP hydrolysiert. Die Bindung von EF-G an das Ribosom und die durch GTP-Hydrolyse hervorgerufene Konformationsänderung des Faktors induzieren eine Konformationsveränderung des Ribosoms, welche die Bewegung der tRNA-Moleküle zur Folge hat. Die GTP-Hydrolyse bewirkt eine starke Beschleunigung der Translokation.

Schon gewusst

Die Elongation läuft mit einer Geschwindigkeit von etwa zehn Aminosäuren pro Sekunde. Demnach braucht ein Ribosom für die Synthese eines Proteins von 500 Aminosäuren fast 1 min. Dabei ist zu beachten, dass die für ein Protein kodierende mRNA in vielen Kopien vorliegt und dass ein mRNA-Molekül von mehreren Ribosomen gleichzeitig translatiert werden kann (Polysomen). Die Zahl der Ribosomen in Zellen, die aktiv Protein synthetisieren, beträgt einige tausend (Prokaryonten) bzw. bis zu einer Million (Leberzelle). Die Fehlerhäufigkeit bei der Elongation, d.h. die Häufigkeit, mit der eine falsche Aminosäure in die wachsende Peptidkette eingebaut wird, ist sehr gering (bei Prokaryonten 0,1–1 Promille, bei Eukaryonten etwas niedriger). Die hohe Genauigkeit wird durch ein zweistufiges Verfahren zur Prüfung der Codon-Anticodon-Wechselwirkung (initiale Selektion und nachfolgendes Proofreading) erreicht, an dem das Ribosom aktiv beteiligt ist.

Termination

Der Elongationszyklus wiederholt sich, bis ein Stoppcodon in der A-Stelle erscheint, für das es keine tRNA mit komplementärem Anticodon gibt. Dies stellt das Signal für die Termination der Proteinsynthese dar, bei der das fertig synthetisierte Protein hydrolytisch von der Peptidyl-tRNA abgelöst und vom Ribosom entlassen wird.
Die Termination wird von Terminationsfaktoren (release factors, RF) katalysiert. Bei Prokaryonten erkennt RF1 die Stoppcodons UAG und UAA, RF2 die Stoppcodons UGA und UAA. Bei Eukaryonten dagegen erkennt ein einziger Faktor, eRF1, alle drei Stoppcodons.
Den Ablauf der Termination zeigt Abb. 13.9. Die Bindung von RF1 oder RF2 (bzw. eRF1) an das Stoppcodon in der A-Stelle führt zur Hydrolyse der Peptidyl-tRNA. RF1 oder RF2 beeinflusst dabei das Peptidyltransferasezentrum auf der großen ribosomalen Untereinheit und ist möglicherweise an der Aktivierung des hydrolytischen Wassermoleküls beteiligt. Ein weiterer Faktor, RF3 (bzw. eRF3), eine GTPase, beschleunigt vermutlich die Dissoziation von RF1 oder RF2 nach der Hydrolyse der Peptidyl-tRNA.
Nach der Termination zerfällt der Ribosomenkomplex unter Freisetzung der deacylierten tRNA in die beiden Untereinheiten. Vermutlich wird dieser Vorgang durch Initiationsfaktoren (IF3 bzw. eIF3) unterstützt, die an die freigesetzte kleine ribosomale Untereinheit binden und sie dadurch stabilisieren. Bei Prokaryonten sind für diesen Schritt ein weiterer Faktor, der Ribosome recycling factor (RRF), sowie EF-G erforderlich. Im eukaryontischen System sind Initiations- und Elongationsfaktoren an der Dissoziation des Ribosoms in die Untereinheiten beteiligt.

MERKE

Die drei Phasen der ribosomalen Proteinsynthese sind Initiation, Elongation und Termination. Bei der Initiation wird das Ribosom mit der Initiator-tRNA am AUG-Startcodon der mRNA positioniert. Hierfür bilden mehrere Initiationsfaktoren am 5'-Ende der mRNA einen Komplex mit der kleinen ribosomalen Untereinheit, der dann entlang der mRNA bis zum Initiationscodon wandert. Dort vereinigt er sich mit der großen ribosomalen Untereinheit zum 80S-Initiationskomplex, der in die Elongation eintritt. Die Teilreaktionen der Elongation sind Aminoacyl-tRNA-Bindung, Peptidverknüpfung und Translokation, von denen die erste und die dritte Reaktion von Elongationsfaktoren katalysiert werden, die dabei GTP hydrolysieren. Die Peptidverknüpfung wird vom Ribosom katalysiert. Terminationsfaktoren erkennen Stoppcodons am Ribosom und bewirken die Freisetzung des fertig synthetisierten Proteins.

Regulation der Translation bei Eukaryonten

Neben der Transkription ist die Translation eine weitere Ebene der Regulation der Genexpression bei Eukaryonten, die es der Zelle erlaubt, auf ihren physiologischen Zustand und den des Organismus angemessen zu reagieren. In der Regel ist die Initiation der regulierende Schritt. Die Regulation kann inhibierend oder stimulierend wirken.

Hemmung der Initiation durch eIF2-Kinasen

Eine negative Regulation der Genexpression ist die Hemmung der Initiation durch Phosphorylierung von eIF2. Die Phosphorylierung erfolgt an der -Untereinheit von eIF2 und hat zur Folge, dass eIF2-GDP einen stabilen Komplex mit dem Nucleotidaustauschfaktor eIF2B bildet, sodass der GDP-GTP-Austausch nicht mehr stattfindet und eIF2-GTP nicht mehr regeneriert wird (Abb. 13.10). Damit ist die Initiation blockiert. eIF2 wird von einer Gruppe von Protein-Kinasen phosphoryliert, die jeweils durch verschiedene Signale reguliert werden.
  • Globin: Erythropoetische Zellen synthetisieren in großem Umfang Globin für die Herstellung von Hämoglobin. Dabei wird durch die Häm-regulierte eIF2-Kinase (heme regulated inhibitor of translation, HRI) die Translation der Globin-mRNA an die Menge des freien Häms angepasst. Ist kein freies Häm vorhanden, ist die Kinase aktiv, und die Synthese von Globin wird durch Phosphorylierung von eIF2 unterdrückt. Freies Häm hemmt dagegen die Kinase als allosterischer Inhibitor, sodass vermehrt Globin gebildet werden kann.

  • Interferon: Auch bei der Wirkung von Interferon spielt die Phosphorylierung von eIF2 eine Rolle. Interferon induziert eine andere eIF2-Kinase (RNA-abhängige Protein-Kinase, PKR): Sie wird durch doppelsträngige RNA, die z.B. bei der Replikation von Viren entsteht, aktiviert; eine Phosphorylierung von eIF2 dagegen hemmt die Translation und damit die Vermehrung des Virus. Andere eIF2-Kinasen werden durch Stressbedingungen wie Aminosäuremangel oder das Auftreten aberrant gefalteter Proteine im endoplasmatischen Retikulum (unfolded protein response, Kap. 16.3.1) aktiviert.

Durch die Phosphorylierung von eIF2 wird natürlich auch die Translation aller anderen mRNA-Moleküle gehemmt. Daher ist diese Art von Regulation nur für solche Fälle geeignet, bei denen in der Zelle ein Protein dominant translatiert wird, z.B. die oben erwähnte Synthese von Globin in erythropoetischen Zellen.

Stimulierung der Initiation durch Protein-Kinasen

Andere Kinasen führen zu einer Stimulierung der Initiation. Wie oben beschrieben, wird die Cap-abhängige Initiation durch die Bindung des Initiationsfaktors eIF4E an die 5'-Cap-Struktur der mRNA eingeleitet. Darauf folgt die Anlagerung von eIF4G, die für die Rekrutierung der 40S-Untereinheit mit eIF3, eIF2 und Initiator-tRNA erforderlich ist. Die Ausbildung des Präinitiationskomplexes am 5'-Cap wird durch die Phosphorylierung von Initiationsfaktoren (eIF4E, eIF4G) bzw. durch ein eIF4E-bindendes Protein (eIF4E-BP) begünstigt. Die Phosphorylierung erfolgt durch Protein-Kinasen, die über MAP-Kinasen (mitogen-activated protein kinases) oder PI3-Kinasen (Phosphatidylinosit-3-Kinasen) an mitogene Stimuli (Wachstumsfaktoren) oder Stressfaktoren (z.B. Aminosäuremangel) gekoppelt sind (Abb. 13.11).
Auch die stimulierende Wirkung von Insulin auf die Proteinsynthese kommt über eine Aktivierung der PI3-Kinase zustande. Eine zentrale Rolle spielt die Kinase mTOR (mammalian target of rapamycin), die durch mitogene Stimuli aktiviert und deren Hemmung durch Rapamycin (Sirolimus), z.B. zur Immunsuppression nach Organtransplantationen, ausgenutzt wird. Die durch PI3-Kinase vermittelte Stimulierung der PDK wirkt über die S6-Kinase auch auf die Elongation. Die Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 steigert zum einen die Aktivität der Ribosomen, zum anderen vermindert die durch Phosphorylierung ausgelöste Hemmung der eEF2-Kinase den Phosphorylierungsgrad von eEF2 und steigert damit dessen Aktivität (Abb. 13.11).

MERKE

Die Initiation der Translation wird durch Protein-Kinasen reguliert, die entweder inhibierend (Phosphorylierung von eIF2) oder stimulierend (Phosphorylierung von Faktoren des Cap-Bindungskomplexes) wirken können.

Regulation durch mRNA-bindende Proteine oder MicroRNA

Andere Mechanismen der Translationsregulation machen Gebrauch von Strukturelementen der mRNA, die sich in den nichttranslatierten 5'- bzw. 3'-Regionen (5'-UTR, 3'-UTR) der mRNA befinden (Abb. 13.12). Durch Bindung regulatorischer Proteine an diese Elemente kann die Initiation sowohl positiv als auch negativ beeinflusst werden.
IRE-bindende Proteine
Ein gut untersuchtes Beispiel ist die Regulation der Translation einiger mRNA-Moleküle im Zusammenhang mit dem Eisenstoffwechsel der Zelle. Freies Eisen (Fe2+) wird in der Zelle in Ferritinkomplexen gespeichert. Die Translation der mRNA für Ferritin wird stimuliert, wenn die Konzentration von freien Fe2+-Ionen in der Zelle hoch ist, und reprimiert, wenn sie niedrig ist, sodass Fe2+-Speicher aufgelöst werden. Durch die Bindung eines Proteins (iron response element-binding protein, IRP) an eine Haarnadelstruktur der mRNA (iron response element, IRE) im 5'-UTR in der Nähe des 5'-Cap wird die Ausbildung des Initiationskomplexes verhindert und damit die Translation gehemmt (Abb. 13.13).
Die Affinität des IRP für die mRNA wird durch die Fe2+-Konzentration in der Zelle reguliert. Eine niedrige Fe2+-Konzentration verursacht eine Konformationsveränderung des IRP, indem aus einem an IRP gebundenen Eisen-Schwefel-Komplex (Fe4S4) ein Fe2+-Ion abgegeben wird. Dies hat eine erhöhte Affinität des IRP zur mRNA zur Folge. Bei hoher Fe2+-Konzentration dagegen liegt der Komplex in der Fe4S4-Form vor. In dieser Konformation hat IRP keine Affinität zur mRNA, und Ferritin kann gebildet werden.
Die Menge der Zellmembranrezeptoren für das Fe3+-Transportprotein Transferrin (Transferrinrezeptoren) kontrolliert die Aufnahme von Fe3+-Ionen in die Zelle. Die Translation der mRNA des Transferrinrezeptors wird ebenfalls durch IRP reguliert – diesmal durch Bindung an mehrere IRE-Strukturen im 3'-UTR, die eine Stabilisierung der mRNA gegenüber nucleolytischem Abbau sowie eine Begünstigung der Initiation bewirkt.
3'-UTR-bindende Proteine
In den 3'-UTR-Bereichen vieler mRNA-Moleküle finden sich Bindungsstellen für Translationsrepressoren. Dies sind Proteine, deren Bindung die Translation der mRNA blockiert. Dieser Mechanismus der Translationsregulation findet sich z.B. bei mRNA-Molekülen, die nur in bestimmten Phasen der Embryogenese translatiert werden. Des Weiteren gibt es im 3'-UTR Sequenzelemente (z.B. AU-reiche Elemente), die durch die Bindung bestimmter Proteine die Stabilität der mRNA gegenüber nucleolytischem Abbau beeinflussen.
MicroRNA
Auch MicroRNA (miRNA) bindet im 3'-UTR der mRNA. Es handelt sich um kleine RNA-Moleküle von ca. 22 Nucleotiden Länge, die teilweise komplementär (Antisense-Sequenz!) zu bestimmten Sequenzen im 3'-UTR sind. miRNA-Moleküle werden durch nucleolytische Prozessierung größerer Transkripte gebildet. Ihre Bindung an mRNA führt zur Repression der Translation, in einigen Fällen auch zum Abbau der mRNA, ähnlich dem durch siRNA (small interfering RNA) induzierten mRNA-Abbau (Kap. 12.10.2). Die mRNA-miRNA-Komplexe bilden zusammen mit Proteinen sog. P-bodies (auch als GW-bodies bekannt) im Zytosol, in denen mRNA entweder bis zu einer späteren Translation stillgelegt oder abgebaut wird (Abb. 13.14). Die Bedeutung der Translationsregulation durch miRNA ist erheblich, insbesondere bei der Kontrolle der Embryonalentwicklung und des Zellzyklus. Im Humangenom finden sich mehrere hundert Gene für miRNA-Moleküle, die offenbar die Expression einiger tausend Gene regulieren.

Klinik

Angesichts der wichtigen funktionellen Rolle der 3'-UTR vieler mRNA-Moleküle ist es nicht verwunderlich, dass auch Erkrankungen im Zusammenhang mit Veränderungen in dieser Region beschrieben wurden. So findet sich bei der myotonen Dystrophie eine Erhöhung der Zahl von CTG-Tripletts im 3'-UTR-Bereich des Gens für eine cAMP-abhängige Protein-Kinase (von normal fünf bis 30 Wiederholungen auf bis zu 1000 oder mehr). Weiter scheint das Fehlen von AU-reichen Elementen in verkürzten mRNA-Molekülen, das die Lebensdauer dieser mRNA-Moleküle und damit die Translation erhöht, ein Faktor für das vermehrte Zellwachstum bei bestimmten Krebsformen zu sein.

MERKE

Die Regulation der Translation ist ein wichtiges Element bei der Regulation der Genexpression. In vielen Fällen sind Protein-Kinasen beteiligt, welche die Initiation durch Phosphorylierung von Initiationsfaktoren regulieren. Die Initiation der Translation kann auch durch die Bindung von Proteinen oder Antisense-RNA (MicroRNA) an nichttranslatierte Regionen (5'-UTR, 3'-UTR) der mRNA reguliert werden. Die Stabilität der mRNA gegenüber nucleolytischem Abbau wird durch mRNA-bindende Proteine beeinflusst.

Hemmstoffe der Translation

Antibiotika

Viele Antibiotika wirken als Inhibitoren der Translation, sodass sie für die antibakterielle Therapie verwendet werden können (Tab. 13.3). Allerdings ist inzwischen die Anwendung einiger Substanzen wegen des Auftretens von Resistenzen nur noch eingeschränkt möglich. Die Suche nach neuen Verbindungen, mit denen Teilschritte der Translation in Bakterien gehemmt werden können, wird weltweit aktiv betrieben.
Die meisten dieser Antibiotika beeinträchtigen die Funktion des Ribosoms, indem sie an die ribosomale RNA binden. So lagern sich etwa die Aminoglykoside (z.B. Neomycin, Paromomycin, Gentamicin) an die 16S-rRNA der kleinen ribosomalen Untereinheit unmittelbar im Dekodierungszentrum und erhöhen dadurch die Häufigkeit von Fehlern bei der Codon-Erkennung. Streptomycin, aus einer anderen Gruppe von Aminoglykosiden, hat dieselbe Wirkung, bindet jedoch an einer anderen Stelle der 16S-rRNA.
Hemmstoffe der Peptidyltransferase binden im Peptidyltransferasezentrum der 23S-rRNA der großen ribosomalen Untereinheit. Thiostrepton besetzt die Faktorbindungsstelle der 23S-rRNA und hemmt die Translokation durch die Blockierung bestimmter Konformationsänderungen des Ribosoms. Dagegen bindet Fusidinsäure an EF-G, hemmt dessen Dissoziation vom Ribosom und blockiert damit die weitere Elongation.

MERKE

Viele Antibiotika hemmen die Translation durch Bindung an funktionell wichtige Bereiche der ribosomalen RNA. Die therapeutische Anwendung dieser Antibiotika bei Infektionen mit pathogenen Bakterien geht wegen der zunehmenden Verbreitung resistenter Stämme zurück.

Exotoxine

Einige pathogene Bakterien scheiden Exotoxine aus, die durch Endozytose in die Zelle gelangen. Ihre pathogene Wirkung beruht auf einer Hemmung der Proteinsynthese in der Wirtszelle. Die Translokation ist z.B. der Angriffspunkt des Diphtherietoxins von Corynebacterium diphtheriae. Die A-Untereinheit des Toxins inaktiviert eEF2 durch ADP-Ribosylierung (Cofaktor ist NAD+) eines bestimmten, posttranslational modifizierten Histidinrests (Diphthamid), der für die Funktion des eEF2 in der Translokation essenziell ist. Die enzymatische Aktivität des Toxins ist hoch: Ein einziges Molekül reicht aus, um die Zelle abzutöten. Nach dem gleichen Mechanismus wirkt das Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa, das ein breites Spektrum von Erkrankungen verursachen kann (u.a. Lungenentzündung, Harnwegsinfektionen, Hautinfektionen).
Das Shiga-Toxin (auch Verotoxin genannt) wird von Enterobacteriaceae wie Shigella dysenteriae oder darmpathogenen Stämmen von E. coli (enterohämorrhagische E. coli, EHEC) produziert. Die N-Glykosidase-Aktivität der A-Untereinheit des Toxins inaktiviert das Ribosom, indem es einen bestimmten Adeninrest der 28S-rRNA abspaltet. Zu den durch EHEC verursachten Erkrankungen gehören die hämorrhagische Kolitis und das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS).

MERKE

Einige pathogene Bakterien wirken durch Hemmung der Translation mittels Exotoxinen, die Komponenten des Translationsapparats (eEF2, Ribosomen) enzymatisch modifizieren und dadurch inaktivieren.

Schon gewusst

Zahlreiche Pflanzen produzieren toxische Proteine, deren Toxizität durch Inaktivierung der Ribosomen zustande kommt. Diese Proteine (ribosome inactivating proteins, RIP) spalten einen bestimmten Adeninrest der 28S-rRNA ab und inaktivieren dadurch die Ribosomen. Beispiele sind das Ricin aus den Samen der Rizinuspflanze oder das Viscumin aus der Mistel, bei denen die B-Untereinheit (ein Lektin) den Eintritt der A-Untereinheit (N-Glykosidase-Aktivität) in die Zelle vermittelt. Ähnlich wirkt das Pilztoxin -Sarcin, eine spezifische Endonuclease, die 28S-rRNA an einer bestimmten Phosphodiesterbindung spaltet und damit die Ribosomen inaktiviert. Ricin ist ein wirksames Gift; 1 mg oral zugeführt oder eingeatmet, ist tödlich. Schon nach 4–8 h setzt hohes Fieber ein; dann kommt es zu Blutungen in der Lunge. Das Gift führt innerhalb von 36–70 h zum Tod. Die Sorge, dass Ricin als Biowaffe für terroristische Anschläge verwendet werden könnte, ist wegen der im Vergleich zu hochwirksamen Giften relativ hohen Dosis eher unbegründet.

Zusammenfassung

Translation

Die Translation oder Proteinsynthese ist der letzte Schritt der Genexpression. Die Nucleotidsequenz der mRNA wird in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt. Der für alle Organismen universelle genetische Code ist so aufgebaut, dass jeweils drei der vier Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Uracil ein Codon bilden, das für eine bestimmte Aminosäure kodiert. Die Verbindung zwischen mRNA-Codon und Aminosäure wird von der tRNA hergestellt. Die Aminosäuren werden durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen auf die entsprechenden tRNA-Moleküle unter ATP-Verbrauch geladen.
Die Verknüpfung der Aminosäuren zum Protein findet an Ribosomen statt. Ribosomen sind makromolekulare Ribonucleoproteinpartikel, die sich im Zytosol der Zelle finden. Ribosomen sind in allen Organismen ähnlich aufgebaut, wobei es Unterschiede in der Größe der rRNA-Moleküle und der Zahl der Proteine gibt. Die funktionellen Zentren des Ribosoms (Dekodierungszentrum, Peptidyltransferasezentrum) werden aus konservierten Sequenzen der rRNA gebildet.
An allen Phasen der Proteinsynthese (Initiation, Elongation, Termination) sind Translationsfaktoren beteiligt, die bestimmte Teilschritte katalysieren, z.T. unter GTP-Hydrolyse. Die enzymatische Reaktion des Ribosoms, die Herstellung der Peptidbindung, wird ohne Mitwirkung von Faktoren durch die rRNA katalysiert; das Ribosom ist demnach ein Ribozym.

Regulation der Translation

Die Regulation der Translation ist ein wesentliches Element der Regulation der Genexpression. Sie erfolgt in der Regel bei der Initiation, die durch Phosphorylierung von Initiationsfaktoren stimuliert oder gehemmt werden kann. Damit wird die Translation an intrazelluläre Signalwege und mitogene Stimuli angekoppelt, die zahlreiche andere Vorgänge in der Zelle steuern. Auch die Bindung von regulierenden Proteinen oder Antisense-RNA an die mRNA kann die Translation beeinflussen.

Hemmstoffe der Translation

Es gibt zahlreiche Hemmstoffe, die Teilschritte der Translation hemmen. Eine Reihe von Antibiotika binden an Ribosomen oder Translationsfaktoren und hemmen bestimmte Teilreaktionen am Ribosom. Der therapeutische Nutzen dieser Antibiotika nimmt ab, da sich resistente Bakterienstämme immer weiter ausbreiten. Einige pathogene Bakterien verursachen Erkrankungen durch Toxine, die Komponenten des Proteinsynthesesystems der Zelle (Ribosomen, Faktoren) inaktivieren und damit die Translation unterbinden.

Fragen

  • 1.

    Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sind die eigentlichen Übersetzer des genetischen Codes in der Genexpression. Warum?

  • 2.

    Warum wird zur Dekodierung der 61 für Aminosäuren kodierenden Codons des genetischen Codes eine geringere Zahl von tRNA-Molekülen benötigt?

  • 3.

    Geben Sie den wesentlichen Unterschied zwischen pro- und eukaryontischen Ribosomen bei der Erkennung des Anfangs der kodierenden Sequenz auf der mRNA an.

  • 4.

    Wie viele Moleküle ATP und GTP werden für den Einbau einer Aminosäure bei der Proteinsynthese hydrolysiert? (Nehmen Sie die Hydrolyse von PPi als äquivalent der Hydrolyse von ATP an.)

  • 5.

    Wie ist es zu erklären, dass die Regulation der Translation durch Protein-Kinasen sowohl stimulierend als auch inhibierend sein kann?

  • 6.

    Geben Sie eine Möglichkeit an, die Translation einer bestimmten mRNA in der Zelle zu blockieren, ohne die Translation anderer mRNA-Moleküle zu beeinträchtigen.

  • 7.

    Wie kommt die Hemmung der Translation durch MicroRNA zustande?

  • 8.

    Nennen Sie ein Toxin, das Ribosomen durch Spaltung einer einzigen kovalenten Bindung inaktiviert.

017 IMPP-Fragen

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