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B978-3-437-43690-1.10014-2

10.1016/B978-3-437-43690-1.10014-2

978-3-437-43690-1

Replikationsfehler.

a) Das Imino-Tautomer von Adenin kann mit Cytosin statt Thymin eine Basenpaarung eingehen.

b) Durch die Fehlpaarung von Imino-A (A*) mit C kommt es bei fehlender Korrektur zur Fixierung der Mutation in der nächsten Zellgeneration.

c) Durch Verschiebung der repetitiven Einheiten, hier eines (CA)15-Repeats, während der Replikation kann der Repeat um eine oder mehrere CA-Einheiten verlängert werden.

Intrinsische Schwachstellen der DNA, durch die Mutationen entstehen können. Eingezeichnet sind Ziele für Hydrolyse (blau), Oxidation (rot) und nichtenzymatische Methylierung durch S-Adenosyl-Methionin (grün). Die Größe der Pfeile spiegelt die Häufigkeit der Veränderungen wider.

Ames-Test. Schematische Darstellung des Testverfahrens und Ergebnis einer mutagenen Substanz (rechts oben) im Vergleich zur Kontrolle (rechts unten).

Arten der chemischen Mutagenese.

a) Oxidative Desaminierung von Cytosin oder Adenin durch salpetrige Säure führt zu fehlpaarenden Basenderivaten.

b) O6-Methylierung von Guanin erlaubt eine Basenpaarung mit Thymin.

c) Nitrosamine sind in zweifacher Hinsicht mutagen. Die beim Zerfall entstehende salpetrige Säure kann desaminierend wirken, während reaktive Alkylgruppen (farbig unterlegt) alkylieren können. Verwandte Stoffe wie Sulfonsäurederivate und N-Lost wirken allein durch Alkylierung.

Mutagene zyklische Kohlenwasserstoffe.

a) Interkalierende Farbstoffe wie Acridinorange oder Ethidiumbromid lagern sich flach zwischen die Basen ein, vergrößern deren Abstand und verzerren die DNA-Raumstruktur.

b) Inertes Benzpyren kann im Körper zu einem reaktiven Diol-Epoxid umgewandelt werden.

c) Bei Bindung an Guanin (Guanin-Benzpyren-Addukt) wird Cytosin auf dem Gegenstrang der DNA verdrängt.

d) Raumstruktur eines Benzpyrenaddukts an DNA.

Fluoreszenzfärbung von DNA.

a) DNA-Agarosegel in UV-Licht, gefärbt mit Ethidiumbromid.

b) Neuronale Stammzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop nach Anfärbung der DNA mit Hoechst 33258 (blau) und der Intermediärfilamente (GFAP, grün).

Cisplatin.

a) Struktur des planaren Platinkomplexes.

b) Struktur der häufig entstehenden Quervernetzung zweier Guaninbasen innerhalb eines Strangs (Pfeil) durch Cisplatin mit verzerrter DNA-Helix (Platin: rot; NH3: blau/weiß).

UV-Licht und Pyrimidindimere.

a) UV-Licht kann den Pyrimidinring aktivieren und zur Ausbildung eines Cyclobutanrings zwischen direkt benachbarten Pyrimidinen führen. Hier dargestellt als Thymidindimer auf einem der beiden DNA-Stränge.

b) Raumstruktur der verzerrten DNA-Helix mit zwei schräg stehenden Thyminbasen.

Auswirkungen von Mutationen auf die Translation von Proteinen.

a) Punktmutationen können in der kodierenden Sequenz zum stummen Austausch, zum Aminosäureaustausch, zu einem Stoppcodon oder zum Überlesen eines Stoppcodons führen (von links nach rechts gezeigt).

b) Insertionen und Deletionen führen zu einer Verschiebung des Leserasters mit völlig anderer Aminosäuresequenz, wenn der Längenunterschied nicht einem Vielfachen der Zahl 3 entspricht.

DNA-Schäden und Reparatur. Die DNA kann durch eine Reihe endogener und exogener Ursachen in unterschiedlicher Form geschädigt werden. Je nach Veränderung kommen verschiedene Reparatur- oder Kompensationsmechanismen zum Einsatz.

Basenexzisionsreparatur (BER). Desaminierung von Cytosin führt zu Uracil, einer erkennbar falschen Base, die entfernt und ersetzt wird.

Nucleotidexzisionsreparatur (NER). Kurze einzelsträngige Segmente der veränderten DNA werden komplett ersetzt.

Mismatch-Reparatur bei Eukaryonten am Beispiel des MutS /MutL -Komplexes.

Das Holliday-Modell der homologen Rekombination. Nach einem Einzelstrangbruch kommt es zur recA/RAD51-vermittelten Invasion des Einzelstrangs in den homologen Doppelstrang. Der dort verdrängte Strang bindet an den verbliebenen zweiten Einzelstrang und bricht ebenfalls. Die so überkreuzten Einzelstränge werden wieder ligiert (kovalent verknüpft), und die Überkreuzungsstelle kann nun seitwärts verschoben werden.

Die kreuzförmige Darstellung der Holliday-Struktur veranschaulicht die Entstehung der potenziellen Endergebnisse einer nachfolgenden Trennung. Werden die Stränge an den mit 1 gekennzeichneten Stellen getrennt, so kommt es zu einem lokalisierten Einzelstrangaustausch. Bei einer Trennung der anderen Stränge (2) kommt es zusätzlich zu einem kompletten Austausch der Doppelhelices auf einer Seite.

Integration des Bakteriophagen Lambda in das E.-coli-Genom, katalysiert von einer sequenzspezifischen Integrase. Je nach Sequenz werden verschiedene Anheftungsstellen (att von Attachment) unterschieden.

Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch homologe Rekombination. Bei der Reparatur durch homologe Rekombination entstehen zwei Holliday-Strukturen. Besitzen die Ausgangsstränge geringe Sequenzunterschiede, so kann entweder ein lokal begrenzter Austausch der Allele erfolgen, oder es entstehen Heteroduplexbereiche, die je nach Reparatur ebenfalls einen Allelaustausch bewirken können (Genkonversion). Die flankierenden Bereiche werden nicht verändert, können aber komplett ausgetauscht sein.

Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch nichthomologe Endverknüpfung. Die nichthomologe Endverknüpfung benutzt einen sequenziell aufgebauten Multiproteinkomplex, der im Prinzip beliebige freie Enden verknüpfen kann und so eine rasche, aber manchmal fehlerhafte Beseitigung der freien DNA-Enden ermöglicht.

Veränderung der genetischen Information

M. Gessler

  • 14.1

    Mutation und Rekombination 417

  • 14.1.1

    Mutationsarten418

  • 14.1.2

    Rekombination418

  • 14.1.3

    Somatische und Keimbahnmutationen418

  • 14.2

    Ursachen und Folgen von Mutationen 419

  • 14.2.1

    Replikationsfehler419

  • 14.2.2

    Baseninstabilität und endogene Noxen420

  • 14.2.3

    Chemische Mutagenese421

  • 14.2.4

    Physikalische Mutagenese424

  • 14.2.5

    Auswirkungen von Mutationen426

  • 14.3

    DNA-Reparaturmechanismen 427

  • 14.3.1

    Direkte Reparatur427

  • 14.3.2

    Basenexzisionsreparatur (BER)428

  • 14.3.3

    Nucleotidexzisionsreparatur (NER)428

  • 14.3.4

    Mismatch-Reparatur (MMR)429

  • 14.3.5

    Toleranzreparatursysteme430

  • 14.4

    DNA-Rekombination und Rekombinationsreparatur 430

  • 14.4.1

    Homologe Rekombination430

  • 14.4.2

    Sequenzspezifische Rekombination431

  • 14.4.3

    Reparatur von Doppelstrangbrüchen432

  • 14.5

    DNA-Methylierung und Imprinting 434

  • 14.5.1

    DNA-Methylierung434

  • 14.5.2

    Genomisches Imprinting435

Praxisfall

Die Bezeichnung Mondscheinkinder suggeriert vielleicht Romantisches oder Verträumtes, doch die Nacht ist für diese Kinder die einzige Tageszeit, zu der sie ungeschützt ins Freie dürfen. Tagsüber müssen sie sich durch teils extreme Maßnahmen vor Sonnenlicht, v.a. der schädlichen ultravioletten Strahlung, schützen. Nur mit Schutzanzügen sollten sie ins Freie, und selbst im Haus brauchen sie spezielle Fensterscheiben oder Filterfolien. Ungeschützt würden sie Gefahr laufen, in kurzer Zeit multiple Hauttumoren zu entwickeln

Die Mondscheinkrankheit hat den medizinischen Namen Xeroderma pigmentosum. Sie ist eine sehr seltene genetische Erkrankung (1: 250.000) und kann durch verschiedene Defekte der Nucleotidexzisionsreparatur verursacht werden (Kap. 14.3.3). Betroffen ist dabei v.a. die Reparatur von UV-Schäden in der Haut, weshalb es zu einer dramatischen Anhäufung von DNA-Veränderungen in Hautzellen und damit zu einem sehr hohen Risiko der Tumorbildung kommt.

(www.mondscheinkinder.de, www.xps.org, www.moonchildren.com)

Zur Orientierung

Die möglichst fehlerfreie Weitergabe der genetischen Information an Tochterzellen bzw. Nachkommen ist Grundvoraussetzung für den Erhalt eines Organismus. Sowohl intrinsische Instabilität der DNA (z.B. bei oxidativem Stress) und fehlerhafte Replikation (z.B. Tautomerie) als auch externe Einflüsse physikalischer und chemischer Natur (z.B. UV-Licht oder Nitrosamine) führen permanent zu Veränderungen des Erbguts. Eine Reihe paralleler enzymatischer Systeme korrigiert den größten Teil dieser Veränderungen, die anderenfalls als Mutationen im Erbgut zu Funktionsstörungen führen können. Treten DNA-Schäden in großer Zahl auf, reagiert eine Zelle nicht nur mit der Reparatur, sondern mit einem Stopp des Zellzyklus und im Extremfall auch mit Apoptose. In gewissen Grenzen werden Veränderungen der DNA jedoch auch gezielt eingesetzt, z.B. bei der meiotischen Rekombination, der Rekombination in B- und T-Zellen oder dem genomischen Imprinting. Letzteres beruht auf der unterschiedlichen Methylierung einzelner Gene, je nachdem ob sie vom Vater oder der Mutter stammen.

Mutation und Rekombination

Die meisten Bestandteile des menschlichen Körpers wie RNA, Proteine, Lipide unterliegen einem permanenten Umsatz. Fehlerhafte Produkte werden daher rasch wieder eliminiert. Die DNA-Sequenz dagegen muss auf Dauer unverändert erhalten werden, um die Integrität des Individuums und die langfristige Erhaltung der Spezies zu gewährleisten. Dennoch kommt es durch Replikationsfehler oder Schädigung der DNA ständig zu Veränderungen der DNA-Sequenz. Diese werden aber in der Regel korrigiert. Erfolgt die Reparatur jedoch nicht rechtzeitig vor einer Zellteilung, kann die Veränderung an die Tochterzellen weitergegeben und damit irreversibel fixiert werden. Man bezeichnet sowohl den Prozess, der zur Veränderung der DNA führt, als auch die veränderte Struktur selbst als Mutation.
Da weniger als 2% des menschlichen Genoms für Proteine kodieren und nicht jede Veränderung der Nucleinsäuresequenz die Funktion eines Proteins verändert (Kap. 12.1), zeigen die meisten Mutationen keine Auswirkungen. Solche Mutationen werden als stumme oder neutrale Mutationen bezeichnet (je nachdem, ob die identische oder eine funktionell gleichwertige Aminosäure kodiert wird). Mutationen, die zu einer veränderten Funktion führen, heißen effektive Mutationen.
Die spontane Mutationsrate liegt beim Menschen in einer Größenordnung von 10–4 bis 4 10–6 pro Gen und Generation. Sie hängt jedoch von der Größe des Gens, der chromosomalen Position, dem Geschlecht und vielen anderen Faktoren ab.

Mutationsarten

Klassischerweise unterscheidet man Genom-, Chromosomen- und Genmutationen. Bei Genommutationen ist die Anzahl der Chromosomen verändert, wie z.B. bei der Trisomie 21 (Down-Syndrom). Chromosomenmutationen betreffen die Struktur einzelner Chromosomen und können beispielsweise als Deletion/Insertion (Verlust/Zugewinn von einzelnen größeren DNA-Abschnitten) oder als Translokation (Verlagerung bzw. Austausch mit einem anderen Chromosom) vorliegen. Als Genmutationen bezeichnet man typischerweise lokale Veränderungen der DNA-Sequenz eines einzelnen Gens. Dabei entstehen Punktmutationen durch Austausch einzelner Basen, während bei Insertionen und Deletionen wiederum Nucleotide zusätzlich eingefügt werden bzw. verloren gehen. Bei Punktmutationen unterscheidet man Transitionen (Purin gegen Purin oder Pyrimidin gegen Pyrimidin, A G, T C) und Transversionen (Purin gegen Pyrimidin und umgekehrt, z.B. A T, G C).

Rekombination

Sie führt zu einer Neustrukturierung der genetischen Information durch Austausch zwischen zwei DNA-Strängen oder Neuverknüpfung innerhalb eines DNA-Moleküls. Damit ist ein Austausch von Allelen zwischen Chromosomen möglich, der z.B. im Rahmen der Meiose (Crossing-over) die genetische Vielfalt erhöht. Rekombination führt nicht nur zur Veränderung der genetischen Information, wie z.B. bei Translokationen, sondern kann auch der DNA-Reparatur dienen (Kap. 14.4.3).
Transposition
Die von Barbara McClintock (1902–1992) im Mais beschriebenen springenden Gene sind wohl die bekanntesten Beispiele mobiler genetischer Elemente (Kap. 11.4.3). Aber auch das menschliche Genom besteht fast zur Hälfte aus DNA-Sequenzen, die bis zu hunderttausendfach vorkommen (z.B. Alu- und Line-Repeats) und ihren Ursprung in mobilen oder retroviralen Elementen haben (Kap. 11.4). Im Laufe der Evolution wurden diese Sequenzen nahezu komplett stillgelegt, und ihre Rolle im menschlichen Genom ist umstritten. Es gibt aber immer wieder seltene Beispiele, wo Neumutationen genetischer Erkrankungen auf dem Springen, also der Aktivierung und Reinsertion solcher Sequenzen in Genloci, beruhen, die dadurch verändert werden.

Somatische und Keimbahnmutationen

Während Keimbahnmutationen mit den Keimzellen auf die Nachkommen übertragen werden und somit die Veränderung in der Population fortbestehen lassen, sind somatische Mutationen auf einen Teil der übrigen Körperzellen beschränkt und betreffen nur das Individuum. Bedeutsam sind hier v.a. Veränderungen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen, die zur Krebsentstehung führen können (Kap. 22 und 23Kap. 22Kap. 23).

Klinik

Sehr viele Erkrankungen des Menschen (z.B. kardiovaskuläre oder degenerative Erkrankungen) werden durch sog. prädisponierende Mutationen in einer Vielzahl verschiedener Gene zwar wahrscheinlich nicht unmittelbar hervorgerufen, aber doch mit bestimmt. Oft sind dies Punktmutationen, die als allelische Varianten (z.B. als SNP, single nucleotide polymorphism) in der Bevölkerung vorkommen und deren Vorhandensein mit einem leicht veränderten Risiko für eine bestimmte Erkrankung assoziiert ist. Für sich genommen besitzen diese Veränderungen noch keinen Krankheitswert, sie stellen nur einen Risikofaktor dar. So besitzen Träger der 4-Variante des Apolipoprotein-E-Gens, die bei etwa 15% der Bevölkerung vorkommt, ein ca. 1,5- und 3fach höheres Risiko für Herzinfarkt bzw. die Alzheimer-Krankheit. Ein Screening hierfür wäre jedoch höchst fragwürdig, da nur ein kleiner Teil der Träger auch erkranken wird.

Schon gewusst

Mutation, Rekombination und Evolution

Mutation und Rekombination sind in ihrer Wirkung nicht nur negativ und als Gefahr für den Organismus zu sehen. Vom biologischen Standpunkt aus vergrößert jede Veränderung des Genoms, die vererbt wird und nicht letal ist, die genetische Vielfalt innerhalb der Spezies. Damit wird ein großes Reservoir genetischer Variationen geschaffen, also die Grundvoraussetzung für die Selektion im Rahmen der Evolution.

MERKE

Man unterscheidet Genom- und Chromsosomenmutationen sowie Genmutationen (Transition/Transversion bzw. Deletion/Insertion). Durch Rekombination und Transposition wird die Abfolge des genetischen Materials verändert. Je nach Zelltyp unterscheidet man somatische und Keimbahnmutationen. Die Mehrzahl der Mutationen ist stumm, jedoch bilden alle Veränderungen das Ausgangsmaterial für die evolutionäre Selektion.

Ursachen und Folgen von Mutationen

Replikationsfehler

Die Replikation der DNA erfolgt mit extrem hoher Genauigkeit. Dies beruht u.a. auch auf der Exonuclease-Korrekturfunktion der an der Replikation beteiligten Polymerasen, die fehlgepaarte Nucleotide wieder entfernt (Kap. 11.2.2). Die dabei übersehenen Fehlpaarungen können von der nachfolgend stattfindenden Mismatch-Reparatur (Kap. 14.3.4) beseitigt werden. Trotzdem kommt es zu etwa einem Replikationsfehler pro 109 replizierter Basen. Daher sind bei jeder Zellteilung statistisch mehrere Mutationen pro Zelle zu erwarten, da das haploide menschliche Genom 3 109 Basenpaare besitzt.
Tautomerie
Replikationsfehler entstehen nicht nur durch Einbau eines falschen Nucleotids durch die Polymerase. Die selten vorkommende Tautomere der Basen (< 0,1%) können Fehlpaarungen erlauben und damit den korrekten Einbau einer falschen Base ermöglichen. Unter Tautomerie versteht man das Vorkommen von untereinander im Gleichgewicht stehenden isomeren Strukturen, die sich nur durch die Stellung eines Protons und die Lage einer Doppelbindung unterscheiden (z.B. Keto-Enol-Tautomerie). So erlaubt die Enol- statt der Ketoform von Thymin eine Paarung mit G statt A. Die Enolform von Guanin paart mit T, und Imino-Adenin paart mit C statt T (Abb. 14.1a). Die tautomere Base wird nach der Replikation zwar wieder in den bevorzugten Grundzustand zurückkehren, aber die Mutation wird auf dem neu synthetisierten Strang bei fehlender oder falscher Reparatur an die Tochterzelle weitergegeben (Abb. 14.1b).
Repeat-Polymorphismen und -Expansionen
Sie stellen eine Sonderform der Insertions- bzw. Deletionsmutationen dar. Insbesondere bei monoton wiederholten Abfolgen einzelner oder mehrerer Nucleotide (DNA-Repeats) kann es zu einer Verschiebung der Stränge bei der Replikation kommen (Polymerase-Slippage), was zu einer Verlängerung (Abb. 14.1c) oder Verkürzung der repetitiven Sequenz führt. Dies ist auch der Grund, weshalb die häufig vorkommenden (CA)n-Sequenzen in der Regel in mehreren verschieden langen Allelen in der Bevölkerung vorkommen – eine Variation, die man zur genetischen und forensischen Diagnostik nutzt. Aber auch Mono-, Tri- und Tetranucleotid-Repeats, z.B. (A)n, (TTA)n, (GATA)n, können hierzu verwendet werden (Kap. 15.2.3). Da sich solche Repeats in der Regel in nichtkodierenden Bereichen des Genoms befinden, bleiben diese Mutationen ohne Auswirkungen. Liegen die Repeats aber in Genen, so kann die Veränderung ihrer Länge pathologische Konsequenzen haben.

Klinik

Triplett-Expansionen sind die Ursache der Chorea Huntington (Veitstanz) und verschiedener anderer neurologischer oder neuromuskulärer Erbkrankheiten. Hierbei kommt es zu einer massiven Verlängerung jeweils einer repetitiven Trinucleotidsequenz, z.B. (CAG)36–120 statt (CAG)10–35 bei der Chorea Huntington. Weil CAG für die Aminosäure Glutamin kodiert, führt dies zu abnormen Proteinsequenzen mit Polyglutaminabschnitten, die zur Aggregation neigen und so eine Reihe anderer zellulärer Prozesse beeinträchtigen. Bei anderen Erkrankungen kommt es durch die repetitiven DNA-Abschnitte auch zu Störungen in der DNA-Struktur (Fragiles-X-Syndrom) und Genexpression (myotone Dystrophie).

MERKE

Replikationsfehler entstehen durch inkorrekte Polymerasefunktion oder temporäre Basenveränderung durch Tautomerie. Repetitive Sequenzen können durch Verschieben des Matrizenstrangs verlängert oder verkürzt werden.

Baseninstabilität und endogene Noxen

Depurinierung und Desaminierung
Allein durch Wärme werden in jeder Zelle täglich bis zu 10.000 Purine durch Hydrolyse der labilen N-glykosidischen Verknüpfung mit der Desoxyribose abgespalten (thermische Depurinierung). Die spontane Desaminierung, die ebenfalls durch Hydrolyse erfolgt, betrifft v.a. Cytosin, das dadurch zu Uracil wird, einer erkennbar falschen DNA-Base. Die Fehler, die durch thermische Depurinierung und spontane Desaminierung entstehen, werden meist effektiv erkannt und repariert. Problematisch ist jedoch die Desaminierung von 5-Methyl-C zu T, da hier eine formell korrekte Base entsteht (Kap. 14.5.1). Die Desaminierung von Purinen tritt selten auf.
Die Desaminierung von Basen, insbesondere der RNA, kann auch gezielt enzymatisch erfolgen, z.B. CU-Editing der Apolipoprotein-B-mRNA durch das APOBEC-Enzym (Kap. 12.9.4) oder Hypermutation und Klassenwechsel der Immunglobulin-Gene durch die AID-Enzyme (Kap. 26.4).
Oxidativer Stress
Oxidativer Stress in der Zelle, der durch Stoffwechselprozesse oder durch schädliche Umwelteinflüsse ausgelöst werden kann, hat die Bildung von Sauerstoff- und Hydroxylradikalen zur Folge (z.B. O2, H2O2 und OH∙; Kap. 6.5). Insbesondere Hydroxylradikale sind extrem reaktiv und können die Basen in einer Oxidationsreaktion an verschiedenen Positionen verändern. Relevant ist hierbei v.a. 8-Hydroxyguanin, das mit A statt C paart und somit Transversionsmutationen verursacht. Eine Oxidation der Desoxyribose kann zu Einzelstrangbrüchen führen.
Daneben gibt es jedoch noch weitere Schwachstellen in der DNA. Die Möglichkeiten der endogenen DNA-Schädigung durch Hydrolyse, Oxidation und die nichtenzymatische Methylierung durch reaktives S-Adenosyl-Methionin sind in Abb. 14.2 dargestellt.

MERKE

Auch ohne exogene Noxen wird DNA durch spontane Depurinierung, Desaminierung, Oxidation und Methylierung geschädigt.

Chemische Mutagenese

Nicht nur die intrinsische Instabilität der Basen, sondern auch Modifikationen durch verschiedene chemische oder physikalische Noxen können zu DNA-Veränderungen führen. Je nach Art der Veränderung können diese folgenlos sein, sie können aber auch zum Abbruch der Replikation führen oder Mutationen auslösen, falls es zu Fehlpaarungen bei der Replikation kommt.
Mutationsauslösende Stoffe werden als Mutagene bezeichnet, tumorauslösende Stoffe als Karzinogene. Diese Klassen überlappen stark, sind aber nicht gleichzusetzen.
DNA-modifizierende Stoffe
Man unterscheidet direkt und indirekt wirkende mutagene Chemikalien. Die selteneren, direkt wirkenden Agenzien können ohne weitere Veränderung, meist als elektrophiler Partner mit Sauerstoff- oder Stickstoffatomen und den Doppelbindungen der Basenringe reagieren. Indirekt wirkende Stoffe sind dagegen selbst meist relativ inert und werden erst durch körpereigene Entgiftungsenzyme (z.B. Cytochrom-P450-Monooxygenasen) – v.a. in der Leber – modifiziert und so zu potenten und reaktiven Mutagenen.

Blick ins Labor

Der Ames-Test ist wohl das bekannteste Screeningverfahren, um Substanzen auf ihr mutagenes Potenzial zu testen (Abb. 14.3). Hierzu werden Salmonella-typhimurium-Stämme eingesetzt, die aufgrund einer Punktmutation oder eines Leserasterschubs einen Defekt in der Eigensynthese von Histidin aufweisen. Etwa 108 dieser sog. auxotrophen Bakterien werden auf histidinfreie Nährböden ausgestrichen. Gibt man nun einen mutagenen Stoff zu, so kann es in einzelnen Bakterien zu Mutationen kommen, die den Biosynthesedefekt wieder aufheben, und es wachsen Kolonien dieser nun prototrophen Revertanten an.

Um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass viele indirekt mutagene Stoffe erst durch Giftung aktiviert werden, kann der zu untersuchende Stoff zuvor mit einem Leberhomogenat bzw. der Mikrosomenfraktion, die P450-Enzyme enthält, inkubiert werden. Trotz dieser Verbesserung lassen sich die Ergebnisse natürlich nicht direkt auf den Menschen übertragen. Dennoch hat der Test – angepasst an hohen Durchsatz – breiten Eingang in der Industrie gefunden, da er ein sehr kostengünstiges Screening vieler tausend Substanzen in kürzester Zeit erlaubt.

Nitrosamine
Beim Abbau von Nitrosaminen entsteht salpetrige Säure, ein effektives Agens zur Desaminierung von DNA-Basen. Dieser Prozess der Desaminierung kann, wie in Kap. 14.2.2 beschrieben, auch bereits spontan ablaufen. Die Desaminierung von C bzw. A führt dabei zu Uracil bzw. Hypoxanthin. Diese können wiederum mit A bzw. C Basenpaarungen eingehen und führen bei ausbleibender Reparatur damit zu CT- bzw. AG-Transitionen (Abb. 14.4a).
Alkylierende Agenzien
Verschiedene Stoffe führen zu einer Addition von Alkylgruppen (Methyl-, Ethylgruppe) an die Basenringe. Je nach Lage können diese dann wiederum Fehlpaarungen eingehen (z.B. kann O6-Methylguanin als stark mutagene alkylierte Base nicht nur mit C, sondern genauso gut mit T paaren; Abb. 14.4b). Wichtige Alkylanzien sind Nitrosamine, Nitrosoharnstoffderivate und Alkylsulfate sowie der als Nervengift und Kampfstoff bekannte N-Lost (Abb. 14.4c). Aber auch durch das in der Zelle als Methylgruppendonor genutzte und sehr reaktive S-Adenosyl-Methionin (SAM) werden täglich Hunderte von Basen pro Zelle spontan methyliert. Von den Hauptprodukten verhält sich 7-Methylguanin wie die unmodifizierte Base, während 3-Methyladenin die Replikation der DNA blockiert.
Interkalierende Agenzien
Stoffe mit aromatischen Ringen wie Ethidiumbromid lagern sich zwischen den Basen eines oder beider Stränge ein (sog. interkalierende Agenzien). Sie bewirken v.a. eine Verzerrung der Raumstruktur mit partieller Entwindung der DNA und begünstigen dadurch Replikationsfehler. Die Vergrößerung des Abstands zwischen den Basen kann beispielsweise zu Insertionen oder Deletionen führen (Abb. 14.5a).
Komplexe Karzinogenaddukte
Als karzinogene Stoffe sind v.a. Teer- und Verbrennungsprodukte bekannt, z.B. polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (Benzpyren, Anthracen). Sie wirken meist indirekt und ergeben nach Aktivierung große, kovalent gebundene Basenaddukte, die Basen auf dem Gegenstrang verdrängen, interkalieren oder eine Quervernetzung der Basen und DNA-Stränge induzieren (Abb. 14.5b–d). Auch das Schimmelpizgift Aflatoxin B1 oder die Zytostatika Cisplatin und Mitomycin C wirken auf diesen Wegen.

Blick ins Labor

DNA-Färbung

Das Prinzip der Interkalation wird auch zur Fluoreszenzfärbung von DNA eingesetzt, bei der Stoffe wie Ethidiumbromid oder Hoechst 33258 nach Einlagerung im UV-Licht fluoreszieren und damit DNA sichtbar machen. Nach einer elektrophoretischen Auftrennung von DNA im Agarosegel können so DNA-Fragmente im UV-Licht nachgewiesen werden. Im Fluoreszenzmikroskop können Zellkerne auf gleichem Wege angefärbt werden (Abb. 14.6).

Klinik

Cisplatin (Abb. 14.7) wird seit den 70er Jahren als Zytostatikum bei vielen Tumorarten erfolgreich eingesetzt. Der einfache anorganische Platin(II)-Komplex mit zwei Chlorid- und zwei NH3-Liganden ist ungeladen und membranpermeabel. Durch die geringe intrazelluläre Chloridkonzentration wird Chlorid gegen Wasser ausgetauscht, und das entstehende Molekül kann als Elektrophil mit verschiedenen Zellbestandteilen reagieren. Entscheidend ist vermutlich die hocheffiziente Quervernetzung benachbarter Purinbasen (v.a. G) innerhalb eines Strangs, wodurch die DNA-Replikation gehemmt und die Apoptose der Zelle induziert wird. Derivate der zweiten Generation wie Carboplatin besitzen teilweise veränderte Liganden und weisen teils reduzierte Toxizität auf.

MERKE

Eine breite Palette von Chemikalien modifiziert DNA kovalent in Form von Alkylierung und komplexen Addukten oder verzerrt den DNA-Doppelstrang durch Interkalation. Dadurch werden Fehlpaarungen ermöglicht, oder die Replikation wird beeinträchtigt. Viele inerte Stoffe werden erst im Körper durch mikrosomale Enzyme aktiviert.

Physikalische Mutagenese

UV-Licht
Während die UVC-Strahlung (200–280 nm) zum größten Teil in der Ozonschicht absorbiert wird, ist UVB (280–320 nm) Hauptquelle der DNA-Schädigung in der Haut. Dabei werden v.a. die Ringe direkt benachbarter Pyrimidine aktiviert und bilden einen Cyclobutanring aus (Abb. 14.8). In selteneren Fällen sind auch andere Atome des Pyrimidinrings beteiligt, sog. Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon-Dimere. Es können sowohl TT- als auch CC- und CT-Dimere entstehen. Die Effizienz der Entstehung dieser Photoprodukte wird durch DNA-Krümmung und Proteinbindung beeinflusst. Die Pyrimidindimere blockieren die Transkription, v.a. aber verzerren sie die DNA-Doppelhelix und können dadurch zu Replikationsfehlern führen. Charakteristische UV-Signaturmutationen sind CT- und insbesondere CCTT-Transitionen in Pyrimidinabfolgen. Diese entstehen nach der A-Regel, nach der bei fehlender oder nichtinformativer Base auf der Matrize bei der Replikation bevorzugt A eingebaut wird. Bei einem TT-Photoprodukt kommt es deshalb selten zu einer Mutation. Gegenüber einem CC-Photoprodukt ist der Einbau von A jedoch mutagen.
Ionisierende Strahlung
-, -, - und Röntgenstrahlung können sehr unterschiedlich auf die DNA wirken, abhängig von ihrem Ionisationsvermögen. Dies kann durch direkte Wechselwirkung mit der DNA geschehen oder bevorzugt indirekt durch die Bildung von reaktiven Peroxiden und Radikalen in der Zelle. Neben Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen kann es dabei v.a. auch zu komplexeren Schäden kommen, die die Replikation behindern und insbesondere zu Doppelstrangbrüchen führen.

MERKE

UV-Bestrahlung induziert Pyrimidindimere, während ionisierende Strahlung v.a. durch Radikalbildung und nachfolgenden chemischen Angriff auf die DNA-Bestandteile wirkt.

Klinik

Signaturmutationen – molekulare Epidemiologie von Tumoren

Mutagene erzeugen sehr unterschiedliche und oft charakteristische Mutationen in der DNA. Aus der Analyse von Mutationen in Tumorgewebe lassen sich manchmal Rückschlüsse auf das induzierende Agens oder den wahrscheinlichen Ursprungsort eines möglicherweise unbekannten Primärtumors ableiten. Besonders intensiv wurde dies beim Tumorsuppressorgen p53 untersucht, das bei verschiedenen menschlichen Tumoren in teils bis zu 50% der Fälle mutiert ist. Inzwischen wurden die Daten von über 25.000 Fällen gesammelt (IARC TP53 Mutation Database, www.p53.iarc.fr). Unerwartet war der Befund, dass 44% der Punktmutationen GA- bzw. CT-Transitionen sind, wovon 56% in CpG-Dinucleotiden vorkommen (Kap. 14.5.1). Frappierender sind jedoch klinische Korrelationen wie in den folgenden Beispielen:
  • Bei Rauchern zeigt sich eine direkte Korrelation von gerauchten Zigarettenpackungen und dem Lungenkarzinomrisiko. In vitro binden metabolisch aktivierte Benzpyrenderivate des Zigarettenrauchs v.a. an Guanin, bevorzugt in den häufig betroffenen p53-Codons, und induzieren GT-Transversionen. Bei Lungenkarzinomen von Rauchern findet sich eine starke Häufung dieser Transversionen, die zudem an charakteristischen Stellen im p53-Gen auftreten, während diese Häufung bei Lungenkarzinomen von Nichtrauchern nicht beobachtet wird.

  • Bei den v.a. durch UV-Licht verursachten Hauttumoren finden sich in vielen Fällen die erwarteten CT-Transitionen bei direkt benachbarten Pyrimidinen. Die sehr charakteristischen CCTT-Mutationen sind sogar nahezu ausschließlich in Hauttumoren an sonnenexponierten Stellen zu finden.

  • Aflatoxin B1, ein Schimmelpilzgift in verdorbener Nahrung, ist in Asien und Afrika zusammen mit dem Hepatitis-B-Virus für die dort endemischen Leberkarzinome verantwortlich. Aflatoxin B1 verursacht in vitro hochspezifisch die Transversion G T im Codon 249 des p53-Gens; sie ist in mehr als der Hälfte dieser Tumoren zu finden. Dies zeigt auch eindrücklich, dass die Sequenzumgebung (Basenabfolge, Chromatinverpackung etc.) maßgeblichen Einfluss auf die Mutationslokalisation und -häufigkeit haben muss.

Auswirkungen von Mutationen

Der größte Teil aller Mutationen im Genom bleibt stumm, da nur wenige Prozent der DNA kodierende oder regulatorische Funktionen besitzen. Mutationen in kodierenden Bereichen können sehr unterschiedliche Effekte haben. In regulatorischen Bereichen sind Vorhersagen über die vermutlichen Effekte einer Mutation sehr schwierig und derzeit zumeist unmöglich.
Punktmutationen, Insertionen und Deletionen
In der kodierenden Region eines Gens können Punktmutationen einen synonymen Austausch bewirken (stumm, die Aminosäure bleibt durch den degenerierten Code erhalten), sie können aber auch ein Codon für eine andere Aminosäure (Missense) oder ein Stoppcodon (Nonsense) erzeugen (Abb. 14.9). Je nach Art des Aminosäureaustauschs und der Lage im Protein, z.B. im aktiven Zentrum eines Enzyms oder an einer für die Struktur oder Funktion unwichtigen Stelle der Proteinoberfläche, können die Auswirkungen dieser Mutationen stark variieren und manchmal sogar überhaupt keinen Effekt zeigen.
Insertionen und Deletionen haben meist massive Auswirkungen, wenn sie das Leseraster für die Translation verändern (Länge 3n).
Neben den direkten Effekten auf die Aminosäuresequenz können jedoch auch subtile Veränderungen in den Kontrollsequenzen der Gene bedeutsam sein. Eine Mutation von Transkriptionsfaktorbindungsstellen kann zu einer veränderten Promotorfunktion und damit einer veränderten Regulation der Genexpression führen. Die Inaktivierung oder zusätzliche Generierung von Spleißstellen, z.B. durch Punktmutationen, kann zur Veränderung, zum Verlust oder Zugewinn einzelner Exons eines Gens führen.
Funktionelle Auswirkungen
Mutationen führen nicht nur zum Verlust oder zur Einschränkung der Proteinfunktion (Loss of function), sondern es kann manchmal auch zu einem Zugewinn einer Funktion (Gain of function) kommen. Ein Beispiel sind Wachstumsfaktorrezeptoren, die durch Mutation permanent – auch ohne ihren physiologischen Liganden – aktiviert sind. Dies führt zu einer dauernden Stimulation der Zelle und kann so zur Tumorbildung beitragen.
Außer an einzelnen Basen kann die Struktur der DNA auch an anderen Stellen gestört sein. DNA-Doppelstrangbrüche beeinträchtigen v.a. die Integrität der DNA und können bei der Reparatur zu Fehlverknüpfungen und somit zu Chromosomenmutationen führen. Quervernetzungen der Stränge blockieren sowohl die Transkription als auch die Replikation und sind daher besonders schwerwiegend.

MERKE

Die Mehrzahl aller Mutationen bleibt stumm. Abhängig von Lage und Art der Sequenzveränderung kann diese in kodierenden Bereichen jedoch als Missense- und Nonsense-(Stopp-)Mutation wirken. Deletionen/Insertionen können das Leseraster des restlichen Gens verschieben. Meist schränken effektive Mutationen die Proteinfunktion ein (Loss of function), selten findet sich ein Zugewinn neuer Funktionen (Gain of function). Strangvernetzung beeinträchtigt v.a. die Replikation und Transkription, während Strangbrüche zu Rekombination und Deletion führen können.

DNA-Reparaturmechanismen

Angesichts der riesigen Zahl von mehreren tausend DNA-Veränderungen, die täglich in jeder Zelle entstehen, muss der Organismus über sehr effiziente Systeme zur Reparatur dieser Schäden verfügen. Je nach Läsion (Basenfehlpaarung, modifizierte Basen, Pyrimidindimere, DNA-Verzerrung oder -Vernetzung, Strangbrüche) kommen dabei verschiedene Mechanismen zum Einsatz (Abb. 14.10):
  • direkte Reparatur

  • Basenexzisionsreparatur (BER)

  • Nucleotidexzisionsreparatur (NER)

  • Mismatch-Reparatur (MMR)

  • Toleranzsysteme

  • Rekombinationsreparatur.

Direkte Reparatur

Die Reparatur von Einzelstrangbrüchen durch die DNA-Ligase und bestimmte Dealkylierungen sind Beispiele für eine direkte Reparatur. So kann die O6-Methylguanin-Methyltransferase spezifisch die Methylgruppe von O6-Methylguanin auf ein Cystein der eigenen Polypeptidkette übertragen. Dieses System ist hochaktiv, aber für die Zelle sehr kostspielig, da das Protein sich im Rahmen der einmaligen Demethylierung selbst inaktiviert und abgebaut wird.
In vielen Organismen (Bakterien, Pflanzen bis hin zu einigen Vertebraten) kann die Photolyase mithilfe der Energie des sichtbaren Lichts die Bildung von Pyrimidindimeren rückgängig machen. Zwar sind beim Menschen verwandte Gensequenzen gefunden worden, eine Photolyaseaktivität konnte jedoch bislang nicht nachgewiesen werden (da Pyrimidindimere beim Menschen durch NER korrigiert werden, kann eine Photolyasereaktion zumindest keinen nennenswerten Beitrag leisten).
Insgesamt spielt die direkte Reparatur beim Menschen eine untergeordnete Rolle.

MERKE

DNA-Einzelstrangbrüche und wenige spezifische Basenmodifikationen werden durch direkte Reparatur korrigiert.

Basenexzisionsreparatur (BER)

Durch Basenexzisionsreparatur werden kleine Modifikationen der Basen und Basenverluste korrigiert. Methylierung, Desaminierung oder Oxidation einzelner Basen werden von verschiedenen DNA-Glykosylasen unterschiedlicher Spezifität erkannt. Ein Beispiel ist die DNA-Uracil-Glykosylase, die Uracil durch die Spaltung der glykosidischen Bindung zwischen Base und Desoxyribose entfernt (Abb. 14.11). Zurück bleibt eine sog. abasische oder AP-Stelle (apurinisch bzw. apyrimidinisch) im DNA-Doppelstrang. Im nachfolgenden Schritt werden Zucker und Phosphat meist durch eine AP-Endonuclease und Phosphodiesterase entfernt. DNA-Polymerase füllt die Lücke auf, die durch DNA-Ligase geschlossen wird. Auch die spontane thermische Depurinierung wird auf diesem Weg korrigiert. Defekte in diesem Reparatursystem gehen zumindest in niederen Organismen mit dramatisch erhöhten Mutationsraten einher.

MERKE

Bei der Basenexzisionsreparatur (BER) werden modifizierte Basen entfernt und die abasische Stelle durch Endonuclease/Polymerase ersetzt.

Nucleotidexzisionsreparatur (NER)

Räumlich umfangreichere Addukte an einzelnen Basen, UV-induzierte Dimere und andere strukturelle Verzerrungen der DNA-Helix werden von einem Multienzymkomplex repariert (Abb. 14.12). Die Läsionen werden von den Proteinen RPA (replication protein A) und XPA (xeroderma pigmentosum complementation group A) erkannt, an denen sich der Reparaturkomplex aus 16 Untereinheiten anschließend zusammensetzt. Der Doppelstrang wird durch den Transkriptionsfaktor TFIIH aufgetrennt; anschließend können zwei verschiedene Endonucleasen die DNA rechts und links von der Defektstelle schneiden. Dabei wird ein Einzelstrangsegment von 27–29 Nucleotiden herausgetrennt. Die Lücke wird anschließend durch DNA-Polymerase und und DNA-Ligase geschlossen (Kap. 11.2). Interessant ist die Verknüpfung von NER und Transkription – in beiden spielt TFIIH eine Rolle bei der Öffnung des DNA-Doppelstrangs (Kap. 12.3.3).

Klinik

NER-Defekte finden sich bei Xeroderma pigmentosum (XP), einer autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung mit extremer UV-Empfindlichkeit, die durch ausbleibende Reparatur UV-induzierter Läsionen zu multiplen Hauttumoren führt (Praxisfall). Viele Bestandteile des NER-Prozesses wurden ursprünglich als Gendefekte bei XP identifiziert und tragen daher Namen wie XPA, XPB etc.

Transkriptionsgekoppelte Reparatur
Nach UV-Bestrahlung reparieren Zellen den als Matrize dienenden DNA-Strang transkribierter Gene viel schneller als den Gegenstrang. Noch später wird der überwiegende Rest des Genoms, der nicht transkribiert wird, korrigiert. Man nimmt an, dass es sich bei transkriptionsgekoppelter Reparatur um einen Mechanismus handelt, der die an einer DNA-Läsion hängen gebliebene RNA-Polymerase entfernt und je nach Art des Defekts NER oder BER einleitet. Dadurch werden natürlich aktiv transkribierte Gene zuerst repariert und die übrige DNA nur im Rahmen eines Routine-Scannings des gesamten Genoms, das im Verlauf von Tagen erfolgt.

MERKE

Nucleotidexzisionsreparatur (NER) korrigiert größere Basenveränderungen und durch UV-Licht verursachte Dimere.

Mismatch-Reparatur (MMR)

Im Gegensatz zu mutageninduzierten Veränderungen in der DNA ergeben Replikationsfehler keine veränderten Basen, sondern nur eine Fehlpaarung oder kurze Insertionen bzw. Deletionen normaler Basen. Daher ist es essenziell, den neu synthetisierten Tochterstrang zu identifizieren und ihn durch Reparatur dem Elternstrang anzugleichen.
Mismatch-Reparatur bei E. coli
Bei E. coli ist dieser Reparaturweg gut aufgeklärt. Die beteiligten Mut-Proteine (Mutator) sind:
  • MutS (Scanning, also Absuchen des DNA-Doppelstrangs und Erkennung der Fehlpaarung)

  • MutL (Kopplung der Reaktionen)

  • MutH (Strangdiskriminierung, d.h. Erkennung des neuen fehlerhaften Strangs und Endonucleaseaktivität)

  • MutU (Helicaseaktivität).

Darüber hinaus gibt es weitere, nicht MMR-spezifische Proteine für die DNA-Entfernung und Neusynthese. Das im Rahmen der MMR ersetzte DNA-Stück ist deutlich länger als bei der Basen- oder Nucleotidexzisionsreparatur.
Mismatch-Reparatur bei Eukaryonten
Die MMR bei Eukaryonten hat viele Gemeinsamkeiten mit der in E. coli. So wird die Fehlpaarung in humanen Zellen durch die dimeren Komplexe MutS (MSH2/MSH6; MutS-Homolog 2 etc.) oder MutS (MSH2/MSH3) erkannt (Abb. 14.13). Die MutL-Homologe des Menschen sind MLH1/PMS2 und vermutlich MLH1/MLH3. Die Identifizierung des neu synthetisierten Strangs erfolgt bei E. coli anhand der nur langsamen Übertragung der Methylierungsmuster vom parentalen Strang (Kap. 12.8.1). Bei Eukaryonten ist das Unterscheidungsmerkmal aber noch unbekannt, und es wurde auch kein MutH-homologes Protein gefunden. Man vermutet, dass die MMR eng an die Replikation gekoppelt ist und bei Erkennung einer Fehlpaarung der Polymerasekomplex arretiert und die neu synthetisierte DNA einschließlich des fehlgepaarten Bereichs degradiert wird.

Klinik

Die Rolle der MMR beim Menschen wurde durch die Entdeckung verdeutlicht, dass eine Form des erblichen Darmkrebses (HNPCC, hereditary non-polyposis colon cancer) durch Mutationen in MMR-Genen verursacht wird. Aber auch in vielen anderen Tumoren konnten seither MMR-Defekte gefunden werden. Betroffen sind v.a. die Komponenten MSH2 (35%) und MLH1 (60%) der MutS- und MutS-Komplexe. Die Folge ist eine dramatisch erhöhte Mutationsrate durch ausbleibende Reparatur von Replikationsfehlern. Bei solchen Tumoren lässt sich dies u.a. anhand einer Mikrosatelliteninstabilität (z.B. Längenänderungen von [A]n- oder [CA]n-Sequenzen) erkennen und nachweisen, d.h. einer Verkürzung oder Verlängerung dieser repetitiven Einheiten durch Polymerase-Slippage bei der Replikation. Die zum Tumor führenden Mutationen sind aber vermutlich in anderen Sequenzen, z.B. Onkogenen und Tumorsuppressorgenen, zu suchen.

Gezielte Mismatch-Reparatur
Neben der beschriebenen Mismatch-Reparatur durch MutS/MutL-Komplexe gibt es auch noch eine weitere Art von MMR, die aber nur spezifische Fehlpaarungen erkennt. Ein Beispiel ist die G\T-spezifische Thymidin-Glykosylase, die ähnlich der BER eine Basenabspaltung durchführt. In diesem Fall wird die bei Desaminierung von 5-Methyl-C zu T entstehende G\T-Fehlpaarung erkannt und mit T einfach diejenige Base entfernt, die mit größerer Wahrscheinlichkeit fehlerhaft ist (Kap. 14.5.1). Ein A\G-spezifisches Enzym entfernt dagegen das gesamte Adeninnucleotid. Die Präferenz für A rührt wahrscheinlich daher, dass ein fehlerhafter Einbau von A der häufigste Polymerasefehler ist (A-Regel, Kap. 14.2.4).

MERKE

Mismatch-Reparatur (MMR) korrigiert Replikationsfehler – fehlende MMR prädisponiert zu Krebs.

Toleranzreparatursysteme

Bei der DNA-Replikation kann es vorkommen, dass veränderte oder fehlende Basen nicht rechtzeitig repariert werden und die Replikationsmaschinerie nicht über den Defekt hinweg synthetisieren kann.
Sowohl in pro- als auch in eukaryontischen Organismen gibt es evolutionär verwandte Polymerasen (Pol , , , und Rev1), deren Aufgabe in der DNA-Synthese über blockierende Läsionen hinweg zu liegen scheint (translesion synthesis, TLS). Dies geschieht unter Inkaufnahme einer sehr viel höheren Fehlerrate, die aber einem Abbruch der Replikation und dem Zelluntergang vorgezogen wird. Das PCNA-Protein des arretierten Polymerasekomplexes (Kap. 11.2.3) rekrutiert diese TLS-Polymerasen und kontrolliert den Polymerasewechsel. TLS-Polymerasen besitzen ein stark eingeschränktes Repertoire an DNA-Veränderungen, die sie als Matrize nutzen können, und sie weisen eine sehr geringe Prozessivität auf. Damit wird sichergestellt, dass diese mutagene Replikation nur im Notfall zum Zug kommt.
Bei E. coli ist eine dieser TLS-Polymerasen an der induzierbaren sog. SOS-Reparaturantwort auf massive DNA-Schädigung beteiligt. Unter hohem mutagenem Stress wird dabei eine fehlerbehaftete Replikation benutzt, um möglicherweise besser überlebensfähige Varianten zu generieren.

Klinik

Mutationen sind nicht nur auf intrinsische Instabilität der DNA oder exogene Schädigung zurückzuführen. So kommt es bei der Reifung der Immunglobuline zu einer gezielten somatischen Hypermutation, die insbesondere eine Region von ca. 2000 Basenpaaren um die aktiven V-Segmente des Immunglobulin-Gens betrifft. Der Mechanismus beruht auf einer Cytosindesaminierung ( Uracil) durch das AID-Enzym (activation-induced deaminase). Vermutlich sind sowohl die Replikation mit Uracil im Matrizenstrang als auch der Einbau zufälliger Nucleotide durch TLS-Polymerasen an den durch Uracil-Glykosylase generierten abasischen Stellen für die Mutationen verantwortlich. Die Mutationsrate wird in dieser Region um den Faktor 106 auf 10–3 bis 10–4 pro Base und Zellteilung gesteigert, wodurch die Variabilität der Antikörpermoleküle enorm zunimmt (Kap. 26.4).

Auch der Klassenwechsel beruht auf einer ähnlichen Wirkung von AID. Vermutlich kommt es durch eine Häufung von abasischen Stellen in der Switch-Region zu Doppelstrangbrüchen und nachfolgend zur Deletion von DNA.

MERKE

Toleranzreparatursysteme erlauben über kurze Strecken eine fehlerbehaftete DNA-Synthese an Matrizen, die eigentlich nicht mehr replizierbar sind. Die Mutationsrate ist jedoch dementsprechend hoch.

DNA-Rekombination und Rekombinationsreparatur

Die Rekombination der DNA erlaubt eine Restrukturierung des Genoms und ist damit ein entscheidender Faktor für die Evolution. Rekombination wurde zuerst beim Crossing-over der Meiose und bei der Konjugation der Bakterien beschrieben. Inzwischen kennen wir drei Arten:
  • homologe Rekombination

  • sequenzspezifische Rekombination

  • nichthomologe Verknüpfung von freien DNA-Enden.

Die Transposition von DNA, das Springen mobiler genetischer Elemente, wie z.B. Retrotransposons, LINE- oder SINE-Repeats, führt ebenfalls zur Veränderung und Rekombination der DNA und ist in Kap. 11.4.3 ausführlich beschrieben.

Homologe Rekombination

Das Holliday-Modell beschreibt den Austausch von DNA zwischen zwei homologen, also identischen oder zumindest stark sequenzverwandten DNA-Doppelsträngen, z.B. den beiden homologen Chromosomen einer diploiden Zelle (Abb. 14.14).
Der Prozess beginnt mit einem Einzelstrangbruch in einem der gepaarten Doppelstränge. Dieser kann durch Schädigung oder gezielt enzymatisch entstanden sein. Das freie 3'-Ende kann in die benachbarte homologe DNA-Helix einwandern, wobei das recA-Protein (E. coli) bzw. das RAD51-Protein (Eukaryonten) eine entscheidende Rolle für die Invasion und die korrekte Paarung spielen. Durch nachfolgenden reziproken Austausch des verdrängten Einzelstrangs der anderen DNA-Helix entsteht ein überkreuzter Heteroduplex. Diese bewegliche Überkreuzung kann nun entlang der DNA wandern. Sie wird durch zwei Einzelstrangbrüche und die erneute Ligation der freien Enden wieder aufgelöst. Je nach Art der Auflösung kommt es zu einem begrenzten Austausch von Einzelsträngen entlang der Wanderungsstrecke oder zu einem kompletten Austausch der DNA auf einer Seite der Überkreuzung.
Weisen die ausgetauschten DNA-Einzelstränge geringe Unterschiede auf und findet die Rekombination dennoch statt, so kommt es je nach Ergebnis einer nachfolgenden (Mismatch-)Reparatur zu einem lokalisierten Austausch von Allelen, beispielsweise in der Meiose.
In E. coli und Hefe sind die beteiligten Proteine und ihre Funktion weitgehend bekannt. Beim Menschen kennt man zwar einen großen Teil der entsprechenden homologen Proteine, z.T. fehlen aber noch funktionelle Untersuchungen.

MERKE

Das Holliday-Modell beschreibt den reziproken Austausch zwischen zwei identischen oder stark sequenzverwandten DNA-Doppelsträngen.

Sequenzspezifische Rekombination

Die spezifische Rekombination benutzt meist kurze Sequenzmotive – entweder nur auf einem oder auf beiden beteiligten Molekülen –, die für die Erkennung durch die ausführenden Enzyme benutzt werden. Insbesondere Bakteriophagen und Viren besitzen eigene Rekombinasen oder Integrasen, um ihre DNA effizient zu vermehren bzw. in das Wirtsgenom zu integrieren (Abb. 14.15). Weitere Beispiele sind die Integrasen der Retroviren, die für den Einbau der zirkulären proviralen DNA in das Zellgenom notwendig sind (Kap. 11.4.4). Virale Rekombinasen werden auch benutzt, um bei Mäusen maßgeschneiderte Veränderungen im Genom vorzunehmen (cre-loxP-System).
Beim Menschen stellt die Rekombination der Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor-Gene die wichtigste Form der spezifischen Rekombination dar. So werden bei den Immunglobulin-Genen die V- und J-Segmente der leichten Ketten und die V-, D- und J-Segmente der schweren Ketten anhand flankierender Erkennungssequenzen von einem spezifischen Rekombinasekomplex rekombiniert (Kap. 26.4.1 und 26.5.2Kap. 26.4.1Kap. 26.5.2). Neben der präzisen Erkennung spielt hier aber auch ein variables Prozessieren eine Rolle, das schließlich die hypervariablen Regionen generiert.

MERKE

Sequenzspezifische Rekombination erfordert keine ausgedehnte Sequenzhomologie, sondern nur kurze Erkennungssignale, an die Rekombinasen binden. Wichtigstes Beispiel sind die Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor-Gene.

Reparatur von Doppelstrangbrüchen

Durch ionisierende Strahlen und freie Radikale oder die Replikation von DNA mit Einzelstrangbrüchen können Doppelstrangbrüche entstehen. Diese sind für das Genom besonders fatal, da die Kontinuität des genetischen Materials unterbrochen wird. Ungeschützte freie DNA-Enden können durch Nucleasen angegriffen werden, außerdem rekombinieren sie sehr leicht, teils auch mit falschen Partnern ( Translokationen, Deletionen).
Bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen kommt es in der Regel zuerst zu einem partiellen Exonucleaseverdau, der 3' überstehende Einzelstränge produziert. Danach konkurrieren zwei Reparaturwege miteinander: homologe Rekombination und nichthomologe Endverknüpfung.
Reparatur durch homologe Rekombination
Sie stellt die optimale Art der Reparatur von Doppelstrangbrüchen dar. Hier dient das zweite Chromosom einer diploiden Zelle als Matrize, wobei sich (nacheinander) zwei Holliday-Kreuzungen ausbilden (Abb. 14.16). Dies erlaubt eine absolut fehlerfreie Reparatur. Bei geringen Sequenzunterschieden zwischen den Allelen kann es dabei zwischen den Holliday-Kreuzungen zu einer Genkonversion kommen, d.h. der anscheinend lokalen Umwandlung eines Allels in das zweite Allel einer heterozygoten diploiden Zelle. Die flankierenden Bereiche eines Chromosoms bleiben dabei unverändert heterozygot. Der Mechanismus der Auswahl der korrekten Matrize ist nicht geklärt. Da im menschlichen Genom bei einem Bruch in den repetitiven Alu- und LINE-Elementen unzählige Matrizen mit Sequenzhomologie über Hunderte bis Tausende von Basenpaaren für die Reparatur bereitstehen, könnten zumindest theoretisch viele Fehlkombinationen auftreten.

Blick ins Labor

Auf dem Mechanismus der homologen Rekombination basiert auch die Herstellung von Knock-out-Mäusen in der biomedizinischen Forschung. Homologe Segmente von Maus-DNA, die ein fremdes Stück DNA flankieren, erlauben den Einbau dieser DNA an der gewünschten Stelle im Genom embryonaler Stammzellen, aus denen wiederum genetisch veränderte Tiere generiert werden können (Kap. 15.3.3).

Nichthomologe Endverknüpfung
Nicht immer ist bei DNA-Schäden eine homologe Rekombination möglich. In diesem Fall kann die Zelle auf den Prozess der nichthomologen Endverknüpfung zurückgreifen, für den keine Sequenzübereinstimmung erforderlich ist; allenfalls werden sog. Mikrohomologien von ein bis vier Nucleotiden benutzt. Freie Enden des DNA-Doppelstrangs werden hierbei von einem Dimer aus den Ku70- und Ku80-Proteinen gebunden (Abb. 14.17). Zusammen mit der DNA-abhängigen Protein-Kinase DNA-PK, der DNA-Ligase IV, dem assoziierten XRCC4-Protein und anderen Komponenten kann dieser Komplex die DNA-Enden direkt verknüpfen. Dabei kann es im Fall eines vorausgegangenen Nucleaseverdaus oder bei Benutzung interner Mikrohomologien auch zu Deletionen kommen. Liegen gleichzeitig mehrere Brüche vor, sind auch völlig falsche Kombinationen, also Chromosomentranslokationen, möglich.
Homologe Rekombination versus nichthomologe Endverknüpfung
Wie wird zwischen den beiden Reparaturwegen entschieden? Während der G1-Phase des Zellzyklus benutzen Zellen vorzugsweise die nichthomologe Endverknüpfung, die eine rasche Reparatur von Brüchen erlaubt. Die oft damit verbundenen kleineren Deletionen sind bei höheren Vertebraten aufgrund des geringen Anteils kodierender Sequenzen meist ohne Bedeutung und somit tolerierbar. Der hohe Prozentsatz repetitiver Sequenzen macht auch die Suche nach der korrekten Matrize äußerst schwierig. Dagegen ist während der S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus ein möglicherweise in der Nähe liegendes identisches Schwesterchromatid für die homologe Rekombination vorhanden. In der Meiose sind zwar teilweise andere Proteine an der Rekombination beteiligt, da es aber zu einer kompletten Paarung der DNA-Stränge kommt, ist die Auswahl des korrekten Matrizenstrangs besonders leicht. In dieser kritischen Phase sind die Enzyme für die nichthomologe Endverknüpfung kaum aktiv, sodass die stabile Weitergabe des Genoms sichergestellt wird.

MERKE

Nur die homologe Rekombination arbeitet fehlerfrei, während nichthomologe Endverknüpfung leicht zu Deletionen oder auch Translokationen führen kann.

Klinik

Verschiedene erbliche Erkrankungen betreffen Mechanismen der DNA-Rekombination und der Reparatur von Doppelstrangbrüchen oder Quervernetzungen. Die beim erblichen Mammakarzinom häufig mutierten BRCA1- und BRCA2-Gene sind sowohl für die Rekombinationsreparatur der DNA als auch als Mediator bei der Checkpoint-Kontrolle (unten) aktiv. Beim Bloom-Syndrom (Chromosomeninstabilität) und Werner-Syndrom (vorzeitiges Altern) beruhen die Defekte auf Mutationen in Helicasen, die u.a. an Holliday-Strukturen binden und vermutlich die sog. illegitime Rekombination zwischen nicht übereinstimmenden DNA-Doppelsträngen unterdrücken.

Bei der Fanconi-Anämie weisen die Zellen eine Chromosomeninstabilität auf und sind im Experiment extrem empfindlich gegen quervernetzende Agenzien wie Mitomycin C. Solche Quervernetzung der Stränge führt bei der Replikation zu einem Stopp des DNA-Polymerasekomplexes. Die verschiedenen FANC-Proteine koordinieren die komplexe Reparatur, die vermutlich mehrere der bekannten Reparaturmechanismen benötigt.

Für viele der mit Chromosomenbrüchigkeit einhergehenden Erkrankungen sind die verantwortlichen Gene und Proteine inzwischen bekannt, und oftmals agieren diese sogar in gemeinsamen Komplexen. Noch ist jedoch offen, wie es zu den doch verschiedenen klinischen Ausprägungen und den typischerweise verknüpften unterschiedlichen Entwicklungsfehlbildungen kommt.

Schadensüberwachung und Checkpoint-Kontrolle
Beschädigte DNA kann nicht repliziert werden, ohne dass die Gefahr eines Anstiegs der Mutationsrate und damit insbesondere des Tumorrisikos besteht. Eine entscheidende Rolle für jede Zelle spielen sog. Checkpoints, Signalübertragungsmechanismen, mit denen die Zelle das Fortschreiten des Zellzyklus, insbesondere DNA-Synthese und Teilung, an bestimmten Stellen anhalten kann (Kap. 23.2.2). Dies erfolgt immer dann, wenn die Voraussetzungen für das erfolgreiche Durchlaufen der S-Phase oder den Eintritt in die jeweils nachfolgende Zellzyklusphase (G1 S, G2 M) nicht gegeben sind. Zu umfangreiche und damit nicht mehr ausreichend reparable Schäden führen zur Apoptose der Zelle.
An der Erkennung von DNA-Schäden sind zuerst Sensorproteinkomplexe beteiligt, von denen einzelne Komponenten vermutlich sowohl für die Übertragung der Schadenssignale als auch für die eigentliche Reparatur benötigt werden. Die Protein-Kinasen ATM und ATR sowie DNA-PK sind dabei zentrale Signalgeber, und sie besitzen eine gewisse Schadensspezifität (ATM für ionisierende Strahlung, ATR für UV-Strahlung, DNA-PK für Doppelstrangbruch). Über Mediatoren wie BRCA1 u.a. werden die nachfolgenden Kinasen Chk1 und Chk2 als weitere Überträgermoleküle aktiviert. Diese bewirken über Effektormoleküle, wie den Transkriptionsfaktor p53 und die CDC25-Phosphatasen, über verschiedene Angriffspunkte einen Stopp des Zellzyklus.

Klinik

Der Ausfall verschiedener Checkpoint-Gene führt zu genomischer Instabilität, verknüpft mit einem hohen Tumorrisiko. Der Ausfall des ATM-Proteins (ataxia teleangiectatica mutated) führt zu Ataxia teleangiectatica (zerebellare Ataxie, okulare Teleangiektasie, Immundefekte, Strahlensensibilität und lymphoide Tumoren). Eines der wichtigsten Proteine, das Schadensinformationen integriert und weiterleitet, ist p53. Bei seinem Ausfall steigt das Tumorrisiko enorm an. Patienten mit p53-Keimbahnmutationen (Li-Fraumeni-Syndrom) entwickeln schon sehr früh Tumoren, teils mehrerer Organsysteme.

MERKE

DNA-Schäden aktivieren Zellzyklus-Checkpoints, die eine Zelle bis zur Reparatur arretieren können bzw. im Extremfall auch die Apoptose induzieren können.

Caretaker und Gatekeeper
Nach einem Modell von Kinzler und Vogelstein werden Gene, die die Integrität der DNA kontrollieren bzw. an deren Reparatur beteiligt sind, als Caretaker (Hausmeister) bezeichnet. Wenn sie ausfallen oder in ihrer Funktion beeinträchtigt sind, steigt die Mutationsrate in der Zelle an: entweder weil DNA-Schäden nicht ausreichend repariert werden und zu Mutationen werden, weil die Chromosomenstabilität nicht gewährleistet ist oder weil Kontrollen wie die Zellzyklus-Checkpoints beeinträchtigt sind und Replikation bzw. Teilung trotz der DNA-Schäden fortschreiten. Dies ist oftmals entscheidender Auslöser für eine spätere Entartung, da die vermehrt auftretenden Mutationen auch sog. Gatekeeper-Gene (Pförtner) betreffen können. Dies sind Onkogene und Tumorsuppressorgene, deren Produkte direkt die Teilung und das Überleben der Zelle steuern. Ihre Fehlregulation kann dann unmittelbar zur Tumorbildung beitragen. Veränderungen in Caretaker-Genen führen dagegen nicht direkt zur Tumorbildung, sondern wirken eher prädisponierend.

DNA-Methylierung und Imprinting

DNA-Methylierung

Die Basen der DNA können nach der Replikation spezifisch methyliert werden. Die DNA-Methylierung bei Vertebraten erfolgt an der Position 5 des Cytosinrings, und zwar nur, wenn ein Guanin auf das Cytosin folgt (hier hat sich die Schreibweise CpGCytidin, Phosphat, Guanosin – eingebürgert). Die Mehrzahl der CpG-Abfolgen in der DNA ist methyliert, und die Methylierungsmuster werden dynamisch während der Entwicklung und Differenzierung der Zellen verändert. Die Methylierung geht nach der Fertilisation im Embryo komplett verloren und wird im sich entwickelnden Embryo stufenweise neu etabliert.
Inzwischen kennt man eine Reihe von Methylierungsenzymen. Mithilfe von S-Adenosyl-Methionin als Methylgruppendonor können sie entweder nicht methylierte DNA de novo methylieren (Dnmt3a, 3b) oder als Maintenance-Methyltransferasen (engl. maintenan Aufrechterhaltung) die komplementäre Methylierung des jeweils neu synthetisierten DNA-Strangs nach der Replikation durchführen (Dnmt1) und so die vorhandenen Methylierungsmuster in den Tochterzellen erhalten.
Bedeutung der Methylierung
Hauptaufgabe von 5-Methyl-CpG scheint die dauerhafte Abschaltung von Genen zu sein. Ein weiteres wichtiges Ziel ist vermutlich fremde integrierte DNA, z.B. virale DNA, Transposons und davon abgeleitete repetitive Sequenzen, die auf diese Weise inaktiviert werden. Generell findet sich eine sehr gute Korrelation zwischen dem Fehlen einer Methylierung (v.a. in der Promotorregion) und der Transkription, während Gene mit methyliertem Promotor in der Regel nicht abgelesen werden. Diese Inaktivierung eines DNA-Abschnitts erfolgt wahrscheinlich über die Bindung spezifischer 5-Methyl-CpG-bindender Proteine und v.a. durch zusätzliche Modifikation der Histone.
DNA-Methylierung ist jedoch keinesfalls als allein entscheidender Regulationsmechanismus für die gewebs- und entwicklungsspezifische Genexpression anzusehen, da sich beispielsweise Mausembryonen mit Methyltransferasedefekten bis zum Zeitpunkt der Organogenese normal entwickeln. Dennoch hat die Methylierung große Bedeutung für verschiedene Formen der Genregulation – wie auch das Imprinting oder die Inaktivierung eines der weiblichen X-Chromosomen –, meist zusammen mit Histonmodifikation oder regulatorischen RNA-Molekülen.
Nachteile der Methylierung
Aus 5-Methylcytosin kann durch spontane Desaminierung die regulär vorkommende Base Thymin entstehen. Bei der so entstehenden G/T-Fehlpaarung ist nicht mehr erkennbar, welches die ursprüngliche und welches die veränderte Base ist. Methylierte CpG-Dinucleotide weisen daher die höchste Mutationsrate auf (40fach höher als bei anderen Basenabfolgen), und sie sind für ein Drittel aller Punktmutationen bei Erbkrankheiten verantwortlich.
Die Abfolge CG kommt im menschlichen Genom jedoch nur mit 20% ihrer statistisch zu erwartenden Häufigkeit vor (CpG-Suppression), weil entstehende G/T-Fehlpaarungen nicht immer korrekt repariert werden. Eine Ausnahme sind die ca. 50.000 sog. CpG-Inseln, etwa 400–3000 Basenpaare lange G+C-reiche DNA-Abschnitte (> 55% G+C), die keine CpG-Methylierung und auch keine CpG-Suppression aufweisen. Sie kommen am Start der Mehrzahl aller Gene vor, umfassen oft auch deren erstes Exon und beinhalten zumeist regulatorische Elemente.

MERKE

Durch Cytosinmethylierung an CpG-Dinucleotiden kann die Expression einiger Gene unterdrückt werden. Auch allelspezifische Genexpression und X-Inaktivierung benutzen diesen Mechanismus. Desaminierung von 5-Methyl-C führt jedoch zu der formell normalen Base T, sodass sich die Mutationsrate an diesen Stellen enorm erhöht.

Genomisches Imprinting

Es macht manchmal doch einen Unterschied, ob wir ein Gen von Vater oder Mutter erben. Bestimmte Erbkrankheiten treten nur dann auf, wenn das defekte Gen von der Mutter (maternal) oder – bei anderen Erkrankungen – vom Vater (paternal) stammt. Beispiele sind das Prader-Willi-Syndrom (Hypotonie, Hyperphagie, Hypogonadismus; Chromosom 15q) und das Beckwith-Wiedemann-Syndrom (Hemihypertrophie, Makroglossie, Tumorprädisposition; Chromosom 11p15). Auch bei Tumoren findet sich in manchen Fällen ein selektiver Verlust der maternalen Kopie von Chromosom 11p15. Diese Befunde lassen sich heute mit dem Phänomen des genomischen Imprintings, der unterschiedlichen Markierung der beiden parentalen Genkopien, erklären.
Für über 50 Gene unseres Genoms gilt, dass sie nur von der väterlichen oder in anderen Fällen nur von der mütterlichen Kopie, also monoallelisch, abgelesen werden. Beispiele sind so unterschiedliche Gene wie IGF2 (Wachstumsfaktor), UBE3A (Ubiquitin-Protein-Ligase) oder KCNQ1 (Kaliumkanal). Der Defekt eines Gens, das z.B. nur vom maternalen Chromosom abgelesen wird, wäre demnach ohne Konsequenzen, wenn er vom Vater geerbt wird, da dessen Kopie stumm bleibt. Andererseits entspräche in diesem Fall die alleinige Mutation der mütterlichen Kopie einem Totalausfall des Gens.
Beim Imprinting handelt es sich um eine sog. epigenetische Modifikation. Epigenetisch heißt, dass die Veränderung trotz identischer Nucleotidsequenz dennoch zu unterschiedlichen Funktionen führt. Die Markierung der beiden elterlichen Allele durch die unterschiedliche epigenetische Modifikation wird bei jedem Durchlaufen der Keimbahn gelöscht und entsprechend dem Geschlecht neu etabliert. CpG-Methylierungsmuster spielen hier eine entscheidende Rolle.
Imprinting ist nur bei Säugern bekannt, und seine Rolle in der Evolution ist umstritten. Viele der meist in Clustern angeordneten Gene, die dem Imprinting unterliegen, sind für die Embryonalentwicklung essenziell, sodass bei uniparentaler Disomie (nur paternale oder nur maternale DNA) keine normale Entwicklung erfolgt und tumorartige Gebilde, sog. Blasenmolen oder Dermoidzysten, entstehen.
Nach einer Theorie von Haig und Moore ist Imprinting das Ergebnis der unterschiedlichen männlichen und weiblichen Reproduktionsstrategien: Paternal exprimierte Gene sind v.a. wachstumsfördernd (z.B. IGF2), um den Nachwuchs optimal auszustatten. Maternal exprimierte Gene kontrollieren das embryonale Wachstum, sorgen so für eine ausgewogenere Entwicklung und ermöglichen der Mutter auch zukünftige Schwangerschaften.
Weitere Informationen unter www.geneimprint.com.

Blick ins Labor

Tumorepigenetik

Es gibt inzwischen unzählige Befunde über bekannte und auch vermutete Tumorsuppressorgene, die in Tumoren durch Hypermethylierung abgeschaltet werden. Andererseits weisen Tumoren oft eine globale Hypomethylierung auf, die zur Reexpression zuvor abgeschalteter Gene und zur genomischen Instabilität führt. In vielen Tumoren findet sich darüber hinaus ein Loss of imprinting (LOI), d.h. eine biallelische Expression oder alternativ eine Abschaltung von Genen, die dem Imprinting unterliegen und daher eigentlich monoallelisch exprimiert sein sollten. Durch die Vielzahl der dabei betroffenen Gene ist es schwierig abzuschätzen, welche Bedeutung diese Methylierungsänderungen innerhalb der Tumorprogression haben. Es besteht jedoch die Hoffnung, durch Inhibitoren der DNA-Methyltransferasen (z.B. Azacytidin) stillgelegte Tumorsuppressorgene reaktivieren zu können.

Klinik

Reproduktives Klonen und Imprinting

Die große Mehrzahl aller bisher durch Nuclear transfer (Kerntransplantation) geklonten Tiere litt unter einer Reihe von Entwicklungsstörungen, angefangen von zu großen Plazenten über unreife Lungen, Herzfehler und Adipositas. Viele dieser Störungen sind vermutlich auf eine fehlerhafte Reprogrammierung der DNA zurückzuführen, und es konnte gezeigt werden, dass das Imprinting einiger Gene nur teilweise erfolgte und diese fehlerhaft exprimiert wurden. Nachkommen dieser Klone, die aus normal entstandenen Keimzellen und regulärer Fertilisation hervorgingen, entwickeln sich wieder völlig normal, da der Methylierungsimprint in der Keimbahn immer neu etabliert wird.

Zusammenfassung

Mutation und Rekombination

Mutationen können als Genom-, Chromosomen- oder Genmutationen auftreten. Sie können stumm (neutral) oder effektiv sein, Letzteres v.a., wenn kodierende Sequenzen oder Kontrollelemente von Genen betroffen sind. Bei der Rekombination wird die Abfolge der DNA-Sequenzen verändert, wie z.B. bei Deletionen/Insertionen oder Translokationen. Je nach betroffenem Zelltyp unterscheidet man somatische Mutationen, die auf das Individuum beschränkt sind, und Keimbahnmutationen, die vererbt werden können. Letztere können zu Erbkrankheiten führen, sind aber auch die Grundlage für die Selektion während der Evolution.

Ursachen und Folgen von Mutationen

Bei der Replikation wird etwa eine von 109 Basen fehlerhaft eingebaut, was bei einem dreimal so großen haploiden Genom bereits mehrere Fehler pro Zellteilung impliziert.
Mutationen können auch ohne Schädigung der DNA entstehen. So verursachen die tautomeren Formen der Basen (z.B. Imino-Adenin) Fehlpaarungen bei der Replikation, die zu Mutationen führen können. Ebenso kann sich bei repetitiven DNA-Sequenzen durch Strangverschiebung während der Replikation (Polymerase-Slippage) die Zahl der Repeat-Einheiten verändern.
Die Instabilität der Basen zeigt sich in der spontanen Depurinierung der DNA und der Desaminierung einzelner Basen mit veränderter Basenpaarungsspezifität. Auch oxidativer Stress mit Bildung von Hydroxylradikalen oder Methylierung durch S-Adenosyl-Methionin (SAM) kann zu Basenveränderungen und teilweise auch Strangbrüchen führen.
Exogene mutagene Chemikalien induzieren v.a. durch Alkylierung eine veränderte Basenpaarung. Interkalierende Agenzien und polyzyklische Kohlenwasserstoffe führen zu Verzerrungen des DNA-Strangs, Quervernetzung und Blockierung der Replikation durch komplexe Addukte. Viele der primär inerten Stoffe werden erst durch körpereigene Enzymsysteme metabolisch aktiviert.
Physikalische Mutationsursachen sind UV-Licht, das Pyrimidindimere hervorruft, und ionisierende Strahlung, die v.a. zur Radikalbildung beiträgt und damit wieder chemische Modifikationen der Basen und Strangbrüche induziert.

Reparaturmechanismen

Die verschiedenen DNA-Läsionen oder Basenfehlpaarungen werden durch eine Vielzahl mehr oder minder spezifischer Reparatursysteme korrigiert. Meist wird der Schaden durch entsprechende Reparaturkomponenten erkannt. Je nach Reparaturweg werden entweder zuerst die betroffene Base oder unterschiedlich große Einzelstrangbereiche exzidiert. Der Defekt wird anschließend durch Replikationsenzyme anhand des komplementären Strangs wieder geschlossen.
Kleinere Veränderungen einzelner Basen werden durch Basenexzisionsreparatur korrigiert. Größere Addukte oder Verzerrungen der Raumstruktur der DNA werden durch Nucleotidexzisionsreparatur beseitigt. Die Mismatch-Reparatur beseitigt Basenfehlpaarungen nach der Replikation.
Irreparable blockierende Läsionen können von speziellen Polymerasen überlesen werden (TLS-Polymerasen), die aber hohe Fehlerraten besitzen. Nur wenige DNA-Veränderungen werden direkt repariert, wie z.B. bei der direkten Reversion der O6-Methylierung von Guanin.

DNA-Rekombination und Rekombinationsreparatur

Die Rekombination zwischen DNA-Strängen wird zur Steigerung der genetischen Vielfalt im Rahmen der Meiose und zur Reparatur von massiven DNA-Schäden und Doppelstrangbrüchen verwendet. Die Rekombinationsreparatur erfolgt während der S-/G2- und M-Phase des Zellzyklus bevorzugt durch die fehlerfrei arbeitende homologe Rekombination anhand eines zweiten DNA-Stranges. In der G1-Phase wird dagegen meist die fehlerbehaftete nichthomologe Endverknüpfung genutzt.
Die sequenzspezifische Rekombination, die meist kurze Erkennungsmotive benutzt, kommt bei der Rekombination der V-, D- und J-Segmente von Immunglobulin-Genen, der Integration retroviraler Genome und der Transposition von DNA zum Tragen.
Alle größeren DNA-Schäden aktivieren die Checkpoint-Kontrolle, die sicherstellt, dass ein Fortschreiten des Zellzyklus erst nach erfolgreicher Reparatur erfolgt bzw. bei massiver Schädigung die Apoptose induziert wird.

DNA-Methylierung und Imprinting

Vertebraten weisen in der Basenfolge CG meist eine Methylierung von Cytosin auf, eine Modifikation, die oft mit dem Abschalten der betreffenden Gene einhergeht. Die Abfolge CG ist im menschlichen Genom unterrepräsentiert, da durch Desaminierung von 5-Methylcytosin das nicht als fehlerhaft erkennbare Thymin entsteht.
Cytosinmethylierung spielt auch beim genomischen Imprinting eine wichtige Rolle. Bei dieser epigenetischen Modifikation werden die beiden elterlichen Genkopien unterschiedlich methyliert, und je nach Gen ist nur die maternale oder paternale Kopie aktiv – ein Phänomen, das sowohl bei der Entstehung einiger Tumoren wie auch beim reproduktiven Klonen Bedeutung hat.
018 IMPP-Fragen

Fragen

  • 1.

    Welches sind erwünschte und welches unerwünschte Auswirkungen von DNA-Veränderungen?

  • 2.

    Welche Faktoren bestimmen, wie schwerwiegend sich eine Mutation auswirkt?

  • 3.

    Wie ist die Bedeutung somatischer Keimbahnmutationen einzuschätzen?

  • 4.

    Benennen Sie verschiedene mutagene Agenzien und beschreiben Sie deren Wirkungsweise.

  • 5.

    Welche endogenen Prozesse sind für eine basale Rate an Mutationen verantwortlich?

  • 6.

    Über welche Mechanismen können physikalische Schäden Mutationen auslösen?

  • 7.

    Wie erklärt man sich Erkrankungen mit Trinucleotidexpansion?

  • 8.

    Welche Arten der DNA-Reparatur kennen Sie?

  • 9.

    Was bedeutet der Begriff direkte Reparatur?

  • 10.

    Welches sind die wichtigen Unterschiede bei den mit einer Exzision einhergehenden Reparaturwegen?

  • 11.

    Welche Optionen besitzt eine Zelle bei DNA-Veränderungen, die von DNA-Polymerase nicht repliziert werden können?

  • 12.

    Welche Arten der Rekombinationsreparatur gibt es, was sind deren Hauptunterschiede, und wann kommen sie zum Tragen?

  • 13.

    Defekte der DNA-Reparatur können Grundlage erblicher Erkrankungen sein. Nennen Sie mehrere Beispiele.

  • 14.

    Was beschreibt das Holliday-Modell?

  • 15.

    Welche Funktionen besitzt die DNA-Methylierung?

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