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B978-3-437-41784-9.00001-4

10.1016/B978-3-437-41784-9.00001-4

978-3-437-41784-9

Adenosintriphosphat (ATP). Die negativ geladenen Sauerstoffatome stoßen sich gegenseitig ab, was durch Pfeile angedeutet ist. Rot: Phosphatreste, schwarz: Ribose, blau: Adenin.

Die energiereichen Verbindungen Kreatinphosphat (Phosphorsäureamidbindung), 1,3-Bisphosphoglycerat (gemischte Säureanhydridbindung) und Phosphoenolpyruvat (Phosphorsäureenolesterbindung): Durch ihr hohes Phosphatgruppenübertragungspotenzial sind sie in der Lage, ADP zu ATP zu phosphorylieren.

Der ADP-ATP-Zyklus. Er steht in biologischen Systemen im Zentrum des Energieaustauschs.

Schlüssel-Schloss-Prinzip (links) und Induced-fit-Modell (rechts).

Redoxreaktionen mit dem Coenzym NAD+ (a) und der prosthetischen Gruppe FAD (b).

Zeit-Umsatz-Kurve (rot). Die Tangente, mit deren Hilfe die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit ermittelt wird, ist blau dargestellt. Eine Zunahme der Extinktion bedeutet eine Zunahme der Produktkonzentration.

Michaelis-Menten-Diagramm: der Übergang einer Reaktion 1. Ordnung in eine Reaktion 0. Ordnung.

Michaelis-Menten-Diagramm (a) und Lineweaver-Burk-Diagramm (b) im Vergleich.

Kompetitive Hemmung im Michaelis-Menten-Diagramm (a) und im Lineweaver-Burk-Diagramm (b).

Nichtkompetitive Hemmung im Michaelis-Menten-Diagramm (a) und im Lineweaver-Burk-Diagramm (b).

Absorptionsspektren von NAD+/NADP+ und NADH+H+/NADPH+H+ (kurz: NADH/NADPH). Rib: Ribose, Ad: Adenin.

Wichtige phosphathaltige energiereiche Verbindungen

Tab. 1.1
Substanzklasse energiereiche Verbindung
Phosphorsäureanhydride Nukleosiddiphosphate: ADP, GDP, CDP, UDP
Nukleosidtriphosphate: ATP, GTP, CTP, UTP
gemischte Säureanhydride 1,3-Bisphosphoglycerat
Aminoacyl-AMP (1. Stufe der Aminosäureaktivierung)
Fettsäureacyl-AMP (1. Stufe der Fettsäureaktivierung)
3'-Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat (PAPS)
Carbamoylphosphat (Harnstoff- und Pyrimidinsynthese)
Phosphoamide Phosphokreatin (Kreatinphosphat, ein Guanidin)
Enolphosphat Phosphoenolpyruvat (energiereichstes Molekül der Glykolyse)
Glykosiddiphosphate u. a. UDP-Glucose, -Galaktose, Glucuronsäure, N-Acetylglucosamin (Aktivierung für die glykosidische Bindung)
GDP-Mannose, -Fucose (Aktivierung für die glykosidische Bindung)
CDP-Cholin (Aktivierung des Cholins für die Lecithinsynthese)

Wichtige nicht phosphathaltige energiereiche Verbindungen

Tab. 1.2
Substanzklasse energiereiche Verbindung
Thioester Acetyl-S-CoA, Succinyl-S-CoA, Acyl-S-CoA
Liponsäureverbindungen
Aminosäureester Aminoacyl-tRNA (2. Stufe der Aminosäureaktivierung)
Fettsäurecarnitinester Fettsäurecarnitin (2. Stufe der Fettsäureaktivierung)
Sonstige S-Adenosylmethionin (SAM)
Carboxybiotin
Formyltetrahydrofolsäure

G0'-Werte für Phosphatgruppendonoren (Freie Enthalpie bei Hydrolyse der Verbindung)

Tab. 1.3
Verbindung G0' in kJ/mol
Glycerin-3-phosphat 9,2
Glucose-6-phosphat 13,8
Fructose-1-phosphat 15,9
Pyrophosphat (PPi) 19,3
Glucose-1-phosphat 20,9
ATP 30,5
Kreatinphosphat 43,1
1,3-Bisphosphoglycerat 49,4
Phosphoenolpyruvat 61,9

Wichtige Isoenzyme

Tab. 1.4
Enzym Isoenzym von dem Isoenzym katalysierte Reaktion
Malat-Dehydrogenase zytoplasmatische
Malat-Dehydrogenase
Malat + NADH+H+ Oxalacetat + NAD+
mitochondriale
Malat-Dehydrogenase
Malat + NADH+H+ Oxalacetat + NAD+
Isocitrat-Dehydrogenase zytoplasmatische
Isocitrat-Dehydrogenase
Isocitrat + NADP+ -Ketoglutarat + CO2 + NADPH+H+
mitochondriale
Isocitrat-Dehydrogenase
Isocitrat + NAD+ -Ketoglutarat + CO2 + NADH+H+
Glycerin-3-P-Dehydrogenase zytoplasmatische
Glycerin-3-P-Dehydrogenase
Glyceron-P + NADH+H+ Glycerin-3-P + NAD+
mitochondriale
Glycerin-3-P-Dehydrogenase
Glyceron-P + FADH2 Glycerin-3-P + FAD
Carbamylo-Phosphat(P)-Synthetase zytoplasmatische
Carbamylo-P-Synthetase
Glutamin + 2 ATP + CO2 Carbamylo-P + 2 ADP + Pi
mitochondriale
Carbamylo-P-Synthetase
NH3 + 2 ATP + CO2 Carbamylo-P + 2 ADP + Pi

Einteilung der Enzyme in sechs Hauptklassen

Tab. 1.5
Hauptklasse katalysierte Reaktion Substrate pro Katalyse Beispiel
1: Oxidoreduktasen Elektronentransfer 2 (Coenzyme nötig) Alkohol-Dehydrogenase,Lactat-Dehydrogenase
2: Transferasen Gruppentransfer 2 Peptidyltransferase,Kinasen
3: Hydrolasen Hydrolyse (Spaltung mithilfe von H2O) 2 (H2O als 2. Substrat) Phosphodiesterase
4: Lyasen Spaltung oder Bildung von Bindungen ohne Energieverbrauch 1 Adenylatzyklase
5: Isomerasen Isomerisierungen 1 Glucose-6-phosphat-Isomerase
6: Ligasen Spaltung oder Bildung von Bindungen unter Energieverbrauch 2 (Cosubstrat, meist ATP, nötig) DNA-Ligase,Pyruvat-Carboxylase

Auswahl wichtiger Cofaktoren. FAD, FMN und Biotin sind prosthetische Gruppen

Tab. 1.6
Name Abkürzung Funktion abgeleitet von
Nikotinamidadenin-dinukleotid NAD+NADH+H+ Transfer von H (Redox) Nikotinsäureamid (Vitamin)
Nikotinamidadenin-dinukleotidphosphat NADP+NADPH+H+ Transfer von H (Redox) Nikotinsäureamid (Vitamin)
S-Adenosylmethionin SAM Transfer von Methylgruppen Methionin (Aminosäure)
Tetrahydrofolat H4-Folat, FH4 Transfer von Formylgruppen Folsäure (Vitamin)
Coenzym A CoA Aktivierung (z. B. Fettsäuren) Pantothensäure (Vitamin)
Flavinadenindinukleotid FAD Transfer von 2 H (Redox) Riboflavin (Vitamin)
Flavinmononukleotid FMN Transfer von 2 H (Redox) Riboflavin (Vitamin)
Biotin Transfer von CO2

Wichtige EnzymkonstantenEnzymkonstante

Tab. 1.7
Enzymkonstante Einheit Maß für konzentrationsabhängig
KM mol/l Affinität eines Enzymmoleküls zum Substrat nein
Vmax mol/(l s) Aktivität einer Enzymlösung bei Substratsättigung von [E]; [S] ist per Definition im Sättigungsbereich
kkat 1/s maximale Aktivität eines (gesättigten) Enzymmoleküls nein

Bioenergetik und Biokatalyse

U. Dettmer

  • 1.1

    Definitionen1

  • 1.2

    Bioenergetik2

    • 1.2.1

      Grundlagen der Thermodynamik2

    • 1.2.2

      Reversible und irreversible Reaktionen6

    • 1.2.3

      Fließgleichgewicht6

    • 1.2.4

      Gekoppelte Reaktionen7

    • 1.2.5

      Energiereiche Verbindungen7

  • 1.3

    Biokatalyse11

    • 1.3.1

      Enzyme11

    • 1.3.2

      Cofaktoren14

    • 1.3.3

      Enzymkinetik15

    • 1.3.4

      Hemmung von Enzymen19

    • 1.3.5

      Enzymaktivität: Einfluss des Milieus22

    • 1.3.6

      Photometrische Methoden23

IMPP-Hits

  • Entropie und Enthalpie, Gibbs' Freie Energie (Freie Reaktionsenthalpie), endergon und exergon, Massenwirkungsgesetz, thermodynamisches Gleichgewicht

  • reversible Reaktionen, Beurteilung der Reaktionsrichtung (Gleichgewichtskonstante, Konzentrationen der beteiligten Stoffe, Gibbs' Freie Energie)

  • Prinzip und Bedeutung von Fließgleichgewichten im Stoffwechsel

  • energetische Kopplung: Ermöglichung von endergonen Reaktionen (v. a. ATP-Hydrolyse)

  • Gruppenübertragungspotenzial energiereicher Verbindungen, Freie Reaktionsenthalpie, Energiegehalte energiereicher Bindungen

  • Wirkung von Enzymen als Biokatalysatoren, Proteinenzyme und Ribozyme, Isoenzyme, Spezifität (Substratspezifität, Stereoselektivität, Stereospezifität), aktives Zentrum, Coenzyme/Cofaktoren (lösliche und prosthetische Gruppen)

  • Enzymkinetik (Michaelis-Menten-Diagramm), Substratsättigung, Enzymkonstanten (KM, kkat), Unit (U) als Maßeinheit für Enzymaktivität (mol/min)

  • Enzymhemmung (kompetitiv, nichtkompetitiv) und Einfluss des Milieus auf die Enzymaktivität

  • Photometrie: Absorptionsspektrometrie, Lambert-Beer-Gesetz, enzymatische Bestimmung von Substratkonzentration und Enzymaktivität

Definitionen

Gegenstand dieses Kapitels sind
  • die Bioenergetik, d. h. die Energetik (Teilgebiet der Thermodynamik) biochemischer Reaktionen, sowie

  • die Biokatalyse, d. h.

    • die Eigenschaften von Biokatalysatoren (Substanzen, die eine biochemische Reaktion beschleunigen, ohne selbst verbraucht zu werden) und

    • die Kinetik, also der zeitliche Verlauf biochemischer Reaktionen.

Bioenergetik

Grundlagen der Thermodynamik

Thermodynamik Bioenergetik

Lerntipp

Mit den Lerninhalten aus diesem Kapitel lassen sich IMPP-Fragen zur Enzymkinetik sicher beantworten. Darüber hinaus sind sie als Hintergrundwissen zum Verständnis biochemischer Reaktionen essenziell. Nach der Lektüre sollte man wissen und verstehen, dass für eine Reaktion:

:
  • ein negativer G0'-Wert die Bildung der Produkte C und D begünstigt,

  • eine große Gleichgewichtskontante die Bildung der Produkte C und D begünstigt,

  • ein anfänglicher Überschuss an den Edukten A und B die Bildung der Produkte C und D begünstigt,

  • eine Weiterreaktion von C und D in anderen Stoffwechselwegen zur kompletten Umwandlung von A und B in C und D führt,

  • A und B sehr stabil sein können, obwohl C und D thermodynamisch begünstigt sind – solange kein Katalysator anwesend ist.

Die Gibbs-Helmholtz-Gleichung
Gibbs-Helmholtz-Gleichung

Es gibt grundsätzlich zwei Triebkräfte für eine chemische Reaktion, in der Edukte (Ausgangssubstanzen) zu Produkten umgesetzt werden:

  • 1.

    Die EnthalpieEnthalpie H (der Energieinhalt, der in Wärme umgewandelt werden kann) des Systems verringert sich. Weil Energie nicht verloren gehen kann, setzt dies eine Umwelt voraus, die die Wärmeenergie aufnimmt (Prinzip vom Enthalpieminimum).

  • 2.

    Die EntropieEntropie S (der Unordnungsgrad) des Systems wächst. Das System strebt nach größtmöglichem Chaos, d. h. einem Maximum an Zuständen, über die es seine Energie verteilen kann (Prinzip vom Verteilungsmaximum).

Beide Triebkräfte werden in der Gibbs-Helmholtz-Gleichung zu einer einzigen Triebkraft zusammengefasst: Freie Enthalpie oder Gibbs' Freie Energie G:

  • H ergibt sich, wenn man die Enthalpie des Systems nach und vor der Reaktion vergleicht: H HProdukteHEdukte. H ist für Produkte wie Edukte der Unterschied zwischen ihrem aktuellen Energiegehalt und einem definierten Zustand: für organische Verbindungen i. d. R. gegenüber der vollständig oxidierten Verbindung (Verbrennungsenthalpie). Einheit von H ist Joule pro Mol (J/mol). Ist H einer Verbindung groß, so ist in ihr viel Energie gespeichert.

  • T ist die absolute Temperatur, gemessen in Kelvin (T/K T/C + 273,15; also 25 C 298,15 K).

  • S ergibt sich, wenn man den Ordnungsgrad des Systems nach und vor der Reaktion vergleicht: S SProdukteSEdukte. Ein entropieerhöhender Vorgang ist z. B. die Bildung von zwei Molekülen aus einem. Die Einheit der Entropie J/(mol K) spiegelt die Tatsache wider, dass die Entropie mit zunehmender Temperatur eine bedeutendere Rolle spielt. Nach Multiplikation mit der bei der Reaktion herrschenden Temperatur kann die Entropie mit der Enthalpie verrechnet werden.

  • G ergibt sich, wenn man die Freie Enthalpie des Systems nach und vor der Reaktion vergleicht: G GProdukteGEdukte. G ist Ausdruck der Triebkraft chemischer Reaktionen und ein Maß für die maximale Arbeitsfähigkeit eines Systems. Negatives G bedeutet, dass das System bei der Reaktion einen thermodynamisch günstigeren Zustand erreicht. Nur dann läuft eine Reaktion spontan bzw. freiwillig, d. h. ohne Netto-Energiezufuhr ab.

Merke

Die Freie Enthalpie G ist ein Maß für die Triebkraft einer Reaktion. Je negativer G ist, desto größer ist diese Triebkraft. G enthält Anteile der Enthalpie (Wärme) und der Entropie (Unordnung), die bei der Reaktion entstehen.

Die Freie Enthalpie G darf nicht mit der Enthalpie H verwechselt werden, daher sind für die Freie Enthalpie auch die Begriffe Gibbs-Energie oder Gibbs' Freie Energie gebräuchlich.

G kann als sog. Zustandsgröße den (theoretischen) Energieinhalt einer Verbindung beschreiben. Oft begegnet man dem Ausdruck G0', der Freien Standardreaktionsenthalpie bei biochemischen Standardbedingungen. Dies ist die Freie Enthalpie, wenn die Verbindung bei biochemischen Standardbedingungen zu 100 % in Produkt umgesetzt wird. Die biochemischen Standardbedingungen sind wie folgt festgelegt: 1-molare Konzentration der Reaktanden, T 298,13 K, P 1 bar, pH 7,0, [H2O] 55,5 mol/l.

Exergone und endergone Reaktionen
Reaktionen:exergon Reaktionen:endergon

Man unterscheidet:

  • exergone Reaktionen (freiwillig): G < 0

  • endergone Reaktionen (nicht freiwillig): G > 0

Vier Kombinationen von H und S sind möglich. Deren Betrachtung hilft dabei, sich die Bedeutung der Vorzeichen in der Gibbs-Helmholtz-Gleichung bewusst zu machen:

  • H < 0 und S > 0: Reaktion immer exergon

    • Verbrennung von Zucker zu H2O und CO2: Aus einem energiereichen Molekül entstehen mehrere Moleküle (Entropiegewinn) mit energiearmen Bindungen (Enthalpieverlust).

  • H > 0 und S < 0: Reaktion immer endergon

    • Photosynthese: Ein großes Glucosemolekül mit energiereichen Bindungen entsteht aus mehreren kleinen Molekülen mit energiearmen Bindungen. Nur unter Energiezufuhr (Sonnenlicht) kann diese Reaktion stattfinden.

  • H > 0 und H > 0: Reaktion temperaturabhängig endergon oder exergon (mit steigender Temperatur zunehmend exergon)

    • Schwitzen: Flüssiges Wasser geht in die entropisch günstigere Gasphase über. Bei entsprechend hohen Temperaturen (vgl. Gibbs-Helmholtz-Gleichung) findet der Vorgang statt, obwohl Wärmeenergie aus der Umgebung aufgenommen werden muss. Der Körper kühlt sich dadurch ab. Bei niedrigeren Temperaturen verhindert die enthalpisch günstige Wechselwirkung zwischen Wassermolekülen die Verdunstung.

  • H < 0 und S < 0: Reaktion temperaturabhängig endergon oder exergon (mit steigender Temperatur zunehmend endergon)

    • Proteinfaltung: Die vielen nichtkovalenten Wechselwirkungen, die die dreidimensionale Struktur eines Proteins bestimmen, sind enthalpisch begünstigt. Entropisch begünstigt ist das ungefaltete Protein. Mit steigender Temperatur beginnen Proteine sich zu entfalten, sie denaturieren.

Merke

Reaktionen

  • Für exergone Reaktionen (freiwillig) gilt: G < 0. Alle spontan (ohne Energiezufuhr) ablaufenden Reaktionen sind exergon.

  • Für endergone Reaktionen (nicht freiwillig) gilt: G > 0. Endergonen Reaktionen muss Energie zugeführt werden, damit sie ablaufen.

Cave

Die Begriffe endergon und exergon dürfen nicht mit endotherm und exotherm verwechselt werden. Endotherm und exotherm sagt nur etwas über die Aufnahme oder Abgabe von Wärme durch die Reaktion aus, ohne die Entropie zu berücksichtigen. Bei (bio)chemischen Vorgängen sollte stets mit G und nicht mit H argumentiert werden.

Energiearme und energiereiche Zustände
Organische Verbindungen wie Glucose sind energiereich. Sie haben viel Freie Enthalpie G gespeichert und setzen diese frei, wenn sie oxidiert werden. H2O und CO2 sind energiearm. Sie sind die thermodynamisch begünstigten Oxidationsendprodukte der Energiegewinnung aus größeren organischen Molekülen und können im Stoffwechsel keine Energie mehr liefern.
Freigesetzte Energie kann im Körper in energiereichen Bindungen, z. B. einer Ester- oder Säureanhydridbindung, gespeichert werden. Dies wird als Fixierung bezeichnet. Fixierte Energie kann bei Bedarf durch Spaltung der energiereichen Bindung wieder freigesetzt werden, z. B. durch hydrolytische Spaltung einer Anhydridbindung.
Aktivierungsenergie

Um einen Ester hydrolytisch (mit H2O) in Alkohol und Säure zu spalten, muss man zunächst Aktivierungsenergie zuführen. Diese ist nötig, um die Reaktion über einen Energieberg (energiereicher Übergangszustand) hinweg voranzutreiben (Lehrbücher der Organischen Chemie). Die Reaktion ist dennoch exergon, weil die Energie in den Produkten (Alkohol und Säure) kleiner ist als die Energie in den Edukten (Ester und H2O). Bei der Reaktion wird die gesamte Aktivierungsenergie zurückerhalten sowie ein zusätzlicher Energiebetrag frei. Eine exergone Reaktion, die viel Aktivierungsenergie benötigt, dauert unter milden Bedingungen (Zimmertemperatur) – und ohne Katalysatoren – sehr lange. Aus diesem Grund sind die in thermodynamischer Hinsicht ungünstigen Makromoleküle wie Proteine und DNA relativ stabil. Man spricht von kinetischer Stabilität.

Merke

Aktivierungsenergie

Damit eine Reaktion ablaufen kann, ist oft Aktivierungsenergie nötig. Dies sagt nichts über die Freiwilligkeit der Reaktion aus. Die Freiwilligkeit hängt allein von G zwischen Produkten und Edukten ab. Eine exergone Reaktion mit hoher Aktivierungsenergie läuft (unter milden Bedingungen und ohne Katalysatoren) sehr langsam ab.

Thermodynamisches (chemisches) Gleichgewicht
GleichgewichtGleichgewicht:thermodynamischIn einer Lösung aus Alkohol und Säure entsteht immer eine gewisse Menge des thermodynamisch ungünstigen Esters. Der Grund hierfür ist, dass die innere Energie der Alkohol- und Säuremoleküle einer Normalverteilung folgt. Die Moleküle mit sehr hohem Energiegehalt besitzen genug Energie, um für die Reaktion zum Ester aktiviert zu sein. Die höhere Energie wird in der energiereichen Esterbindung gespeichert, bis der Ester wieder in Säure und Alkohol zerfällt. Nach einer gewissen Zeit hat sich in der Lösung ein Zustand herausgebildet, in dem sich keine Konzentrationsveränderungen von Edukten und Produkten messen lassen, da in jedem Moment genau so viele Neubildungen wie Zerfallsprozesse stattfinden. Dies ist der Zustand des thermodynamischen Gleichgewichts.

Merke

Im Zustand des thermodynamischen (chemischen) Gleichgewichts werden im gleichen Maße Produktmoleküle gebildet, wie Produktmoleküle wieder zu Eduktmolekülen zerfallen. Die Nettokonzentrationen bleiben damit stabil.

Gleichgewichtskonstante und Massenwirkungsgesetz
Gleichgewichtskonstante Massenwirkungsgesetz

Im Gleichgewicht lassen sich trotz stetiger Reaktionen keine Konzentrationsveränderungen messen. Hin- und Rückreaktion weisen also die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit auf, obwohl sie unterschiedliche Geschwindigkeitskonstanten k1 und k1 (Lehrbücher der Chemie) besitzen. Dieser Unterschied wird durch die Stoffkonzentrationen im Gleichgewicht ausgeglichen. Es gilt für eine Reaktion (eckige Klammern bedeuten Konzentrationen in mol/l) im Gleichgewicht:

Durch Umformung ergibt sich das sogenannte Massenwirkungsgesetz (MWG):

(Gleichgewichtskonstante)

Das Verhältnis der Produktbildungskonstante (k1) zur Zerfallskonstante (k1) im Gleichgewichtszustand ist eine Naturkonstante (für eine bestimmte Reaktion bei bestimmten Bedingungen). Das Verhältnis der Produkte der Produktkonzentrationen zu den Produkten der Eduktkonzentrationen im Gleichgewicht liefert bei denselben Bedingungen dieselbe Konstante. Diese Konstante wird als Gleichgewichtskonstante K bezeichnet.

Ermittlung der Gleichgewichtskonstante

Die Gleichgewichtskonstante lässt sich auf unterschiedlichen Wegen ermitteln:

  • über die Konzentrationen der Edukte (A, B) und Produkte (C, D) im Gleichgewicht:

(Massenwirkungsgesetz)

  • man beachte, dass die stöchiometrischen Koeffizienten in Potenz in das Produkt eingehen: Bei der Reaktion errechnet sich K aus

  • über Produktbildungs- (k1) und Zerfallskonstante (k1):

  • (Massenwirkungsgesetz, kinetische Ableitung)

  • über die Freie Standardreaktionsenthalpie G0'. Es gilt:

  • Dabei ist R die allgemeine Gaskonstante [8,314 J/(mol K)], T die Standardtemperatur in Kelvin (298,13 K). Zur Berechnung von K muss die Gleichung nach K aufgelöst werden.

Wie groß die Gleichgewichtskonstante ist, hängt von der Differenz der Freien Enthalpie von Edukten und Produkten ab. Liefert die Reaktion viel Freie Enthalpie, so liegt das Reaktionsgleichgewicht auf der Produktseite. Das Verhältnis der Produkte zu Edukten wird groß, ebenso die Gleichgewichtskonstante. Es gilt:

  • K > 1: Gleichgewicht der Reaktion auf der Produktseite, Reaktion exergon

  • K < 1: Gleichgewicht der Reaktion auf der Eduktseite, Reaktion endergon

Merke

Eine große Gleichgewichtskonstante bedeutet, dass bevorzugt Produkt entsteht.

Voraussetzungen und Eigenschaften des thermodynamischen Gleichgewichts

  • Voraussetzung für die Einstellung eines thermodynamischen Gleichgewichts ist ein abgeschlossenes System: Es darf weder Zu- noch Abfluss erfolgen.

  • Die Konstante K ist meist für Standardbedingungen angegeben. Eine Veränderung der Rahmenbedingungen führt zu einer Veränderung der Gleichgewichtskonstanten. So führt ein äußerer Zwang, wie z. B.

  • höherer Druck oder höhere Temperatur, zu einer vermehrten Reaktion energetisch bergauf.

  • Im Gleichgewicht sind weder Energiegewinn noch Arbeitsleistung möglich.

  • Das Gleichgewicht stellt sich unabhängig davon ein, ob man mit reinem Edukt, reinem Produkt oder einer irgendwie zusammengesetzten Mischung aus beidem startet.

  • Für eine Reaktion bedeutet ein positiver G0'-Wert, dass das Gleichgewicht unter Standardbedingungen auf der Eduktseite liegt, ein negativer G0'-Wert bedeutet, dass das Gleichgewicht unter Standardbedingungen auf der Produktseite liegt.

Merke

Ein thermodynamisches (chemisches) Gleichgewicht kann sich nur im abgeschlossenen System einstellen. Im Gleichgewicht ist weder Energiegewinn noch Arbeitsleistung möglich. Die Einstellung erfolgt unabhängig davon, in welchem Verhältnis Produkt und Edukt zu Beginn vorliegen.

Beurteilung der Reaktionsrichtung bei bekannten Ausgangskonzentrationen

Für eine Reaktion unter biochemischen Standardbedingungen (oben) gilt:

G0' ist die Freie Standardreaktionsenthalpie, wenn 1 mol A und 1 mol B bei Standardbedingungen vollständig zu 1 mol C und 1 mol D reagieren. Hier ist mit der Gleichgewichtskonstanten K der Reaktion gleichzusetzen.

Welche Energie G bei einer realen Reaktion tatsächlich frei wird, ob und in welche Richtung diese Reaktion überhaupt stattfinden wird, hängt von den Anfangskonzentrationen von A, B, C und D ab. G einer realen Reaktion hängt mit G0' über folgende Gleichung zusammen:

In dieser Formel ist nicht die Gleichgewichtskonstante K, sondern es sind die tatsächlichen Anfangskonzentrationen einzusetzen. Es gilt:
  • G ist ein Maß für den Abstand der Reaktion vom thermodynamischen Gleichgewicht und für die Arbeit, die bei konstantem Druck und konstanter Temperatur geleistet werden kann.

  • Mit steigender Eduktkonzentration und sinkender Produktkonzentration nimmt der exergone Charakter einer Reaktion zu.

  • Erhält man für G einen positiven Wert, so muss man Edukte und Produkte vertauschen, um die tatsächlich ablaufende Reaktion zu erhalten.

  • Temperatur- und Druckänderungen verändern die Lage des Gleichgewichts: Höherer Druck und höhere Temperatur führen zu einer vermehrten Reaktion energetisch bergauf.

Merke

G ist ein Maß für den Abstand vom thermodynamischen Gleichgewicht und gleichzeitig ein Maß für die Arbeit, die bei konstantem Druck und konstanter Temperatur von der Reaktion geleistet werden kann. Mit steigender Eduktkonzentration und sinkender Produktkonzentration nimmt der exergone Charakter einer Reaktion zu.

Reversible und irreversible Reaktionen

Reversibel ist eine Reaktion, deren relevante Konzentrationen sich in der Nähe des Gleichgewichtszustands befinden. Durch minimale Veränderungen der Bedingungen (Stoffzufuhr und -entnahme, Temperaturänderung, Druckänderung u. Ä.) kann die Reaktionsrichtung leicht umgedreht werden. Die meisten Reaktionen im Zellstoffwechsel laufen in der Nähe des thermodynamischen Gleichgewichts ab. Sie können deshalb nur sehr geringe Arbeitsbeträge liefern und sind durch Änderung der Bedingungen leicht umkehrbar.

Für die Stoffwechselregulation im Organismus müssen Stoffwechselwege irreversible Reaktionen enthalten. Regulationsmechanismen greifen oft an den irreversiblen Reaktionen an und legen so die Richtung eines Stoffwechselwegs fest. Sie sind selten (bei der Glykolyse sind drei von zehn Reaktionsschritten irreversibel), laufen in der Regel langsam ab und sind weit vom Gleichgewichtszustand entfernt. Nahezu 100 % der Energie für die gesamte Reaktionskette stammen aus irreversiblen Reaktionen.

Merke

Sind die Konzentrationsverhältnisse einer Reaktion weit vom thermodynamischen Gleichgewicht entfernt, ist sie irreversibel, sind sie in der Nähe des thermodynamischen Gleichgewichts, ist sie reversibel.

Reaktionen:reversibel Reaktionen:irreversibel

Fließgleichgewicht

Können Edukte zu 100 % zum Produkt reagieren? Ja: Wenn dem System fortwährend gebildete Produkte entzogen werden, z. B. durch eine zusätzliche Hilfsreaktion, die das Produkt weiter umsetzt. Gemäß dem Massenwirkungsgesetz reagiert das System darauf mit ständiger Produktbildung, bis alle Edukte aufgebraucht sind. Durch die Produktentnahme wird aus dem geschlossenen System ein offenes System, das sich im Ungleichgewicht befindet, da die Eduktkonzentrationen immer mehr abfallen. Auch in einem offenen System kann sich aber ein Gleichgewicht einstellen: Das Fließgleichgewicht, dynamische Gleichgewicht oder steady state. In obigem Beispiel bedeutet das, dass man ständig entsprechend viel Edukt nachliefert. Auch dann lässt sich in der Lösung keine Änderung der Konzentration von Edukten und Produkten über die Zeit feststellen. Die thermodynamische Gleichgewichtskonstante wird dabei angestrebt, aber nie erreicht, da ständig Edukte zu- und Produkte abfließen.

Ein gutes Beispiel für ein Fließgleichgewicht ist das offene Bicarbonat-Puffersystem des Bluts: Durch Zellatmung wird ständig neues CO2 gebildet und im Blut in Form von HCO3- gelöst, auf der anderen Seite verlässt CO2 den Körper durch Ausatmen (12.1.2).

Merke

Das Bemühen, die vielen thermodynamischen Gleichgewichtszustände innerhalb des Fließgleichgewichts zu erreichen, ist die Triebfeder für Stoffwechselvorgänge. Trotz ständigen Material- und Energieflusses im Stoffwechsel bleibt das System Organismus durch komplizierte Rückkopplungsmechanismen weitgehend stabil (Homöostase).

Gekoppelte Reaktionen

Fließgleichgewicht

Produktabfluss im Stoffwechsel bedeutet in der Regel, dass das Produkt einer Reaktion das Edukt der Folgereaktion ist. Zum Beispiel ist im Citratzyklus jeder Teilschritt mit dem vorhergehenden Teilschritt gekoppelt. Ohne energetische Kopplung wären lebenswichtige endergone Stoffwechselschritte nicht möglich. Das Prinzip: Eine exergone Reaktion liefert die Energie für eine endergone Reaktion. Die Verknüpfung erfolgt über ein gemeinsames Zwischenprodukt:

Zentral in diesem Zusammenhang ist die universale Energiewährung Adenosintriphosphat (ATPATP). Das Prinzip am Beispiel der ATP-abhängigen Phosphorylierung von Glucose (Glc):

______________________________________

In diesem Fall ist das gemeinsame Zwischenprodukt anorganisches Phosphat Pi (i für inorganic bedeutet, dass Phosphat frei vorliegt und nicht an ein organisches Molekül gebunden ist). Katalysiert wird der Schritt in der Glykolyse von dem Enzym Hexokinase, das Glucose als Substrat und ATP als Cosubstrat bindet. Betrachtet man das chemische Gleichgewicht, so lässt sich sagen, dass durch energetische Kopplung an die ATP-Hydrolyse die Konzentration eines energetisch benachteiligten Produkts erhöht wird.

Merke

Energetische Kopplung verschiebt das Gleichgewicht gegenüber der ungekoppelten Reaktion in die thermodynamisch ungünstigere Richtung.

Energiereiche Verbindungen

Definition und Beispiele
Reaktionen:gekoppeltEine energiereiche Verbindung besitzt eine oder mehrere energiereiche Bindungen. Eine energiereiche Bindung ist eine labile, thermodynamisch ungünstige Bindung. Ist ein günstiger Reaktionspartner vorhanden, kann der Energiereichtum eingelöst werden. Vom energiereichen ATP war bereits die Rede, die Tab. 1.1 und Tab. 1.2 stellen weitere energiereiche Verbindungen vor.
Gruppenübertragungspotenzial
Die GruppenübertragungspotenzialMaßgröße für den Energieinhalt einer energiereichen Verbindung ist ihr Gruppenübertragungspotenzial. Das Gruppenübertragungspotenzial ist definiert als die Freie Enthalpie G0', wenn 1 mol der terminalen Gruppe eines Donormoleküls auf den Standardakzeptor H2O unter Standardbedingungen übertragen wird. Je negativer der Betrag von G0' ist, desto größer ist das Gruppenübertragungspotenzial.
Das Gruppenübertragungspotenzial von ATP

Für ATP gilt beispielsweise (die Tilde ~ symbolisiert eine energiereiche Bindung):

Das relativ hohe Übertragungspotenzial für die terminale Phosphatgruppe hat mehrere Gründe, u. a. die elektrostatische Abstoßung zwischen den negativen Ladungen der Phosphatgruppen (Abb. 1.1). Oft wird der terminale Phosphatrest nicht auf H2O übertragen (und damit zum freien Pi), sondern es werden andere Moleküle phosphoryliert (1.2.4 energetische Kopplung).

Verbindungen mit größerem Gruppenübertragungspotenzial als ATP
ATP

Besäße ATP das größte Phosphatgruppenübertragungspotenzial, könnte ADP nur schwer aus ATP regeneriert werden. Es gibt jedoch energiereichere Bindungen (Tab. 1.3 und Abb. 1.2) als die Phosphorsäureanhydridbindung (Verbindung zweier Phosphorsäurereste unter Wasserabspaltung) in ATP:

  • die Phosphorsäureamidbindung (Verbindung einer Phosphorsäure und eines Amins unter Wasserabspaltung) im Kreatinphosphat,

  • die gemischte Säureanhydridbindung im 1,3-Bisphosphoglycerat (Verbindung einer organischen und einer Phosphorsäure unter Wasserabspaltung),

  • die Phosphorsäureenolesterbindung (Verbindung einer Phosphorsäure und eines Enols – ein Enol ist ein Stoff mit einer OH-Gruppe an einem C, das eine Doppelbindung zu einem anderen C hat – unter Wasserabspaltung) in Phosphoenolpyruvat.

Die mit einem Anteil von 90 % wichtigste ATP-Quelle ist die oxidative Phosphorylierung durch die ATP-ATP-SynthaseSynthase im Zuge der Zellatmung (6.3). Darüber hinaus wird über Phosphorylierung von ADP durch Phosphoenolpyruvat und 1,3-Bisphosphoglycerat während der Glykolyse direkt ATP gewonnen (Substratkettenphosphorylierung, 3.3.3). Als kurzfristige Energiespeicherform sorgt KreatinphosphatKreatinphosphat im Wirbeltiermuskel bei Beanspruchung für ATP-Regeneration, katalysiert durch das Enzym Kreatin-Kreatin-KinaseKinase (die Kreatinkinase-Reaktion ist reversibel).

Energiewährung ATP
Mit seiner mittleren Stellung in Bezug auf sein Gruppenübertragungspotenzial bietet sich ATP als Energiewährung der Zelle, wie es oft genannt wird, an. Es kann vielfältige Phosphorylierungen vornehmen und gut regeneriert werden (Abb. 1.3). ATP ist dabei eher Energiecarrier als Energiespeicher. Einer Gesamtmenge von ca. 100 g ATP im Körper eines Erwachsenen steht durch ständigen Auf- und Abbau ein täglicher ATP-Verbrauch von ca. 40 kg gegenüber. Als Energiewährung ermöglicht ATP endergone Vorgänge wie aktive Transportphänomene, Biosynthesen, Muskelarbeit und Wärmeerzeugung. Daneben spielt ATP auch eine Rolle bei intrazellulären Signalereignissen.
Aktivierung durch ATP

ATP kann andere Moleküle prinzipiell auf vier Möglichkeiten aktivieren:

  • 1.

    Übertragung eines Phosphats: ATP + R ADP + R-P

  • Eine Kinase (ein phosphorylierendes Enzym) bindet ATP als Cosubstrat, spaltet es hydrolytisch in ADP und Pi und überträgt dabei das Phosphat auf einen geeigneten Akzeptor. Als Akzeptor kommen infrage:

    • eine primäre Alkoholgruppe eines Substrats, es entsteht ein Phosphatester: z. B. Glucose + ATP Glucose-6-P + ADP

    • eine halbacetalische Alkoholgruppe, es entsteht ein Phosphatester: z. B. Galaktose + ATP Galaktose-1-P + ADP

    • eine Aminogruppe, es entsteht ein Phosphorsäureamid: z. B. Kreatin + ATP Kreatin-1-P + ADP

    • eine Carboxylgruppe, es entsteht ein gemischtes Säureanhydrid: z. B. 3-Phosphoglycerat + ATP 1,3-Bisphosphoglycerat + ADP

    • eine Phosphatgruppe, es entsteht ein Phosphorsäureanhydrid: z. B. AMP + ATPADP + ADP

Merke

Enzyme, die phosphorylieren, nennt man Kinasen. Kinasen sind Phosphoryltransferasen.

  • 2.

    Übertragung von AMP: ATP + R R-AMP + PPi

  • Fettsäuren, Aminosäuren und Ubiquitin werden auf diesem Weg aktiviert. Das entsprechende Enzym spaltet ATP hydrolytisch in AMP und Pyrophosphat PPi. AMP wird auf die Carboxylgruppe des Substrats übertragen. Es entsteht ein gemischtes Säureanhydrid

    • einer Fettsäure: Fettsäure + ATP Acyl-AMP + PPi

    • einer Aminosäure: Aminosäure + ATP Aminoacyl-AMP + PPi

    • von Ubiquitin: Ubiquitin + ATP Ubiquitinyl-AMP + PPi

  • 3.

    Übertragung von Pyrophosphat: ATP + R R-PP + AMP

  • Ein Anhydrid aus zwei Molekülen Phosphorsäure (sog. Pyrophosphat) wird übertragen:

  • z. B. Ribulose-5-P + ATP5-P-Ribulose-2-PP + AMP

  • 4.

    Übertragung von Adenosin: ATP + R R-Adenosin + PPi + Pi

  • Adenosin kann unter Abspaltung von Phosphat und Pyrophosphat übertragen werden:

  • z. B. Methionin + ATPS-Adenosylmethionin (SAM) + PPi + Pi

Gerichtete Biosynthese durch Hydrolyse von Pyrophosphat
ATP:Aktivierung

Biosynthesewege sind gerichtet, wenn sie irreversible Reaktionen enthalten. Ist Pyrophosphat ein (Neben-)Produkt einer Reaktion, so ist die Reaktion so gut wie irreversibel, weil Pyrophosphat sofort enzymatisch hydrolysiert wird und für eine eventuelle Rückreaktion nicht mehr zur Verfügung steht. Der Organismus bedient sich dessen zum Beispiel bei der Initiation des Fettsäureabbaus:

  • RCOO + HS-CoA + ATP + H2O RCO-CoA + AMP + 2 Pi

Das Enzym Pyrophosphatase katalysiert die schnelle Hydrolyse von Pyrophosphat (PPi) in zwei Pi. Für die Rückreaktion steht also zu wenig freies PPi zur Verfügung.

Weitere Beispiele:

  • Proteinsynthese: Aminosäure + tRNA + ATP Aminoacyl-tRNA + AMP + 2 Pi

  • Nukleinsäuresynthese: n1GTP + n2CTP + n3ATP + n4TTP DNA + (n1 + n2 + n3 + n4 1) 2 Pi

  • Cosubstratsynthese: FMN + ATP FAD + 2 Pi

  • Proteinmarkierung: Ubiquitin + HS-Enzym + ATP Ubiquitinyl-S-Enzym + 2 Pi

Merke

Da abgespaltenes Pyrophosphat sofort hydrolysiert wird, ist seine Abspaltung energetisch gleichwertig zu der Hydrolyse von 2 ATP zu ADP. Dies spielt häufig eine große Rolle bei der Betrachtung von Gesamtenergiebilanzen.

Biokatalyse

Enzyme

Prinzip der Wirkungsweise
Biosynthese Hydrolyse Hydrolyse:Pyrophosphat

Die Hydrolyse von Makromolekülen wie DNA und Proteinen ist thermodynamisch begünstigt, und ATP besitzt ein hohes Übertragungspotenzial für sein terminales Phosphat. Wieso sind DNA, Proteine und ATP dann überhaupt stabil? Der Grund ist die Anregungsenergie, die nötig ist, um die Hydrolyse in Gang zu bringen (Kap. 1.2.1 Aktivierungsenergie). Anders ausgedrückt: Ein H2O-Molekül muss eine Menge innerer Energie mitbringen, um die Hydrolyse über einen Energieberg (an dessen Spitze ein energiereicher Übergangszustand steht) hinweg durchzuführen. Ein derart energiereiches H2O-Molekül ist bei Körpertemperatur sehr selten, und die spontane Hydrolyse dauert sehr lange. DNA, Proteine und ATP sind somit kinetisch stabil – solange kein spezifischer Biokatalysator anwesend ist, der die Höhe des Energiebergs reduziert und damit die Hydrolyse beschleunigt: ein Enzym. Über Enzyme (und Katalysatoren im Allgemeinen) lässt sich sagen:

  • Sie werden bei der Reaktion nicht verbraucht.

  • Sie beschleunigen Hin- und Rückreaktion gleichermaßen, der Quotient k1/k1 ( Gleichgewichtskonstante K) ist identisch mit dem der unkatalysierten Reaktion. Das Reaktionsgleichgewicht ändert sich nicht, es stellt sich lediglich schneller ein. Das Gleichgewicht energetisch bergauf verschieben energieliefernde Cofaktoren wie ATP (1.2.3, 1.2.4).

  • Sie erhöhen die Geschwindigkeit von Stoffwechselreaktionen um ein Vielfaches. Ohne die Carboanhydrase würde z. B. die Hydratation von CO2 im Blut 107-mal länger dauern.

  • Sie erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit, indem sie energiereiche Übergangszustände stabilisieren oder Reaktionswege über neue energieärmere Zwischenprodukte eröffnen.

Merke

Enzyme verändern die Geschwindigkeit der Einstellung eines Reaktionsgleichgewichts, nicht das Gleichgewicht selbst. Sie beschleunigen Hin- und Rückreaktion in gleicher Weise, sodass der Quotient der zugehörigen

Geschwindigkeitskonstanten, k1/k1 (also die Gleichgewichtskonstante K), identisch mit dem der unkatalysierten Reaktion ist. Das Gleichgewicht kann durch energieliefernde Cosubstrate wie ATP verschoben werden.

Von herkömmlichen chemischen Katalysatoren heben sich Enzyme in vielfacher Hinsicht ab:

  • Sie steigern die Reaktionsgeschwindigkeit um das bis zu 1012-Fache.

  • Sie wirken im Körper bei milden Reaktionsbedingungen (pH 7, 37 C).

  • Ihre Reaktionsspezifität ist groß.

  • Sie lassen sich – über diverse Mechanismen – regulieren.

  • Sie sind zum Teil sehr komplexe Moleküle oder Molekülkomplexe.

Spezifität
Biokatalyse Enzyme

Enzyme binden Substrate im aktiven Zentrum. Die Bindung erfolgt meist über nichtkovalente Wechselwirkungen. Aufgrund dieser Wechselwirkungen erkennen Enzyme ihr Substrat anhand dessen Struktur (Substratspezifität:EnzymeSubstratspezifität). Früher veranschaulichte man dies mit dem Schlüssel-Schloss-Schlüssel-Schloss-Prinzip:EnzymePrinzip, wo Form des Substrats und die des aktiven Zentrums perfekt zueinander passen (Abb. 1.4). Neuer ist das Induced-fit-Induced-fit-Modell:EnzymeModell, wo das Substrat an der Ausbildung der passgenauen Form des aktiven Zentrums beteiligt ist (Abb. 1.4).

Neben dieser Substratspezifität katalysieren Enzyme in der Regel nur eine Reaktion (und deren Rückreaktion), z. B. nur die Spaltung eines speziellen Bindungstyps (Wirkungsspezifität:EnzymeWirkungsspezifität).

Enzyme sind also substrat- und wirkungsspezifisch. Ein besonderer Aspekt beider Spezifitäten ist die Stereoselektivität:EnzymeStereoselektivität: Enzyme selektieren oft nur eines von mehreren Stereoisomeren einer Verbindung. So ist die Proteinbiosynthese grundsätzlich nur mit L-Aminosäuren möglich (sterisch substratspezifisch). Dementsprechend produzieren die Enzyme des Aminosäureaufbaus nur L-Aminosäuren (sterisch wirkungsspezifisch).

Merke

Enzyme sind spezifisch hinsichtlich des Substrats (Substratspezifität) und der katalysierten Reaktion (Wirkungsspezifität). Die Substratspezifität ist bei verschiedenen Enzymen unterschiedlich stark ausgeprägt. Ein besonderer Aspekt ist die Stereoselektivität, die hinsichtlich des Substrats oder der Wirkung (Produkt) bestehen kann.

Lokalisation
Enzyme:SpezifitätViele Enzyme:LokalisationEnzyme wirken intrazellulär. Die Zelle besitzt verschiedene Kompartimente, in denen unterschiedliche Stoffwechselprozesse ablaufen. Deshalb sind die Kompartimente auch mit unterschiedlichen Enzymen ausgestattet. Beispielsweise enthalten die Lysosomen, eine Art Entsorgungsstätte der Zelle, Spaltungsenzyme wie Proteasen. Damit diese in der Zelle keinen Schaden anrichten können, ist ihre Funktionalität von einem sauren pH, wie er im Lysosom – nicht aber im Zytoplasma – herrscht, abhängig. Manche Enzyme, wie die Verdauungsenzyme, werden von der Zelle sezerniert und wirken extrazellulär. Wie die Zellkompartimente verfügen auch die Gewebe und Organe über einen ihren Funktionen entsprechenden Enzymsatz.
Isoenzyme (Isozyme)

Isoenzyme unterscheiden sich in ihrer Aminosäuresequenz voneinander, katalysieren aber die gleiche Reaktion. Oft unterscheiden sie sich auch in Merkmalen wie dem KM-Wert (1.3.3) oder in ihren regulatorischen Eigenschaften. Isoenzyme werden z. B. abhängig vom Gewebe oder Entwicklungsstadium unterschiedlich stark exprimiert.

Dies ermöglicht eine Feinregulation des Stoffwechsels. Tab. 1.4 zeigt wichtige Isoenzyme.

Praxistipp

Enzymdiagnostik beruht darauf, dass Enzyme beim Gesunden nur in Spuren im Plasma vorkommen. Werden bei Organschädigung intrazelluläre Enzyme freigesetzt, steigt ihre Aktivität im Plasma an. Wichtige Beispiele für Enzyme, deren Aktivitätsanstieg im Plasma diagnostisch verwendet werden kann, sind:

  • Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) Leberschädigung, Herzinfarkt

  • Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) Leberschädigung

  • Lactat-Dehydrogenase Herzinfarkt, Hämolyse

In manchen Fällen kann durch Isoenzymdiagnostik weiter differenziert werden, z. B. bei der Lactat-Dehydrogenase (LDH) Isoenzyme:Lactat-Dehydrogenase (LDH), einem Tetramer aus vier Enzymen. Jedes einzelne Enzym kann das Isoenzym H oder M sein. H und M haben unterschiedliche Aminosäuresequenzen, was eine elektrophoretische Unterscheidung aller fünf möglichen LDH-Isoenzyme zulässt. Das H4-Isoenzym besitzt die höchste, das M4-Isoenzym die niedrigste Substrataffinität, alle weiteren liegen entsprechend dazwischen. M4 arbeitet am besten unter anaeroben, H4 am besten unter aeroben Bedingungen. Deswegen unterscheiden sich die Isoenzyme auch in ihrem Vorkommen:

  • LDH I (HHHH) und LDH II (MHHH): vor allem in Herzmuskel, Erythrozyten und Niere,

  • LDH III (MMHH): vor allem in lymphatischem Gewebe und Malignomen,

  • LDH IV (MMMH) und LDH V (MMMM): vor allem in Leber, Skelettmuskel, Malignomen.

Das Auftreten der Isoenzyme im Blut lässt auf die ursächlichen Gewebeschäden schließen: Vermehrtes LDH I und LDH II im Blut deutet auf einen Herzinfarkt oder eine Hämolyse hin. Leber- und Skelettmuskelschäden äußern sich in erhöhten LDH-IV- und LDH-V-Werten.

Gegenstand einer Isoenzymdiagnostik ist auch das Enzym Kreatin-Kinase (CK)Isoenzyme:Kreatin-Kinase (CK): Diese ist ein Dimer mit den Untereinheiten M und B. Es existieren

  • CK-MM, vor allem in Herzmuskel und Skelettmuskel,

  • CK-MB, vor allem im Herzmuskel,

  • CK-BB, vor allem im Gehirn.

Bei Skelettmuskelschäden beträgt der Anteil des Isoenzyms MM an der Gesamt-CK im Blut mehr als 95 %, beim Herzinfarkt beträgt der Anteil des Isoenzyms MB an der Gesamt-CK mehr als 6 %. Bereits 6 Stunden nach dem Infarktereignis lässt sich der Herzinfarkt durch Bestimmung der CK-MB sicher diagnostizieren.

Klassifikation
Isoenzyme

Enzyme tragen oft einen Namen, der einen Rückschluss auf ihre Funktion zulässt. Den ersten Wortbestandteil bildet oft das Substrat, den zweiten die katalysierte Reaktion. So ergibt sich aus dem Substrat Alkohol und der Reaktion Dehydrogenierung das Enzym Alkohol-Dehydrogenase. Da Enzyme Hin- und Rückreaktion gleichermaßen katalysieren und viele Reaktionen im Stoffwechsel reversibel sind, kann es vorkommen, dass ein Enzym nicht nach der gerade betrachteten Reaktion, sondern der Rückreaktion benannt ist.

Die über 2.000 bekannten Enzyme werden mit einer vierstelligen sog. EC-Nummer (EC steht für Enzyme Commission) klassifiziert. Die erste Zahl im Code steht für eine der sechs Enzyme:HauptklassenHauptklassen (Tab. 1.5), die jeweils Enzyme ähnlicher Wirkungsspezifität zusammenfassen. Die beiden folgenden Zahlen beziehen sich auf Substrate und Cofaktoren. Die letzte Ziffer ist die laufende Nummer des Enzyms. Als Beispiel: Alkohol-Dehydrogenase trägt die EC-Nummer 1.1.1.1. Die erste Eins steht für die Hauptgruppe der Oxidoreduktase, die zweite für eine -CH-OH-Gruppe als Elektronendonor, die dritte für NAD(P)+ als Elektronenakzeptor.

Struktur
Enzyme:Klassifikation

Die meisten Enzyme sind Proteine, bestehen also aus Aminosäuren. Ihre Aminosäuresequenz ist im Genom kodiert und die Expression oft reguliert. Während Enzyme meist aus Hunderten bis Tausenden Aminosäuren bestehen, umfasst ihre katalytisch wirksame Region, das aktive Zentrum, oft nur einige Aminosäuren. Die anderen Bereiche dienen der Stabilität des aktiven Zentrums, regulatorischen Zwecken, der Wechselwirkung mit anderen Proteinen oder auch als Kanäle für Substrate und Produkte.

Außerdem gibt es katalytisch wirksame RNA-Moleküle, die man RibozymeRibozyme nennt. Ein prominentes Beispiel für ein Ribozym ist das Ribozyme:RibosomRibosom: Es enthält zwar auch Proteinbestandteile, doch katalytisch wirksam (Peptidyltransferase-Funktion) ist vor allem der RNA-Anteil.

Merke

Ribozyme sind katalytisch wirksame RNA-Moleküle. Ein Beispiel ist das Ribosom.

Cofaktoren

Enzyme:Struktur

Viele Enzyme können nur in Gegenwart von Cofaktoren wirken, die sie zur Übertragung von Elektronen, Ionen oder bestimmten Gruppen benötigen. Manche Oxidasen verwenden z. B. das Reduktionsäquivalent NAD+, um Elektronen abzugeben. Cofaktoren wie ATP, NAD(P) oder Coenzym A können während oder vor der Reaktion gebunden werden. Andere wie FAD, FMN und Biotin sind fester (kovalent gebundener) Bestandteil des Enzyms, man bezeichnet sie als prosthetische Gruppen. Kleine organische Cofaktoren werden auch CoenzymeCoenzyme oder Cosubstrate genannt. Die meisten dieser kleinen Nichtproteine leiten sich von Vitaminen ab. Der Vielzahl von Enzymen mit ihrer hohen Spezifität steht eine kleine Anzahl von Coenzymen gegenüber (Tab. 1.6).

Merke

Kleine organische Cofaktoren heißen Coenzyme (Cosubstrate). Ein Cofaktor, der fester Bestandteil des Enzyms ist, heißt prosthetische Gruppe.

Die Spezifität der Coenzyme ist gering, sie sind an verschiedensten Katalysevorgängen beteiligt. Für die Funktionsfähigkeit des Stoffwechsels ist eine ständige Regeneration der Coenzyme unerlässlich (Abb. 1.5).

Enzyme:MetalloenzymMetalloenzyme besitzen in ihrem aktiven Zentrum komplexiv oder kovalent gebundene Metallatome als Cofaktoren. Die Carboanhydrase enthält z. B. Zink2+. Beim Menschen sind außer Zink u. a. Eisen und Kupfer in Enzymen im Einsatz. Oftmals besitzen Metalle in Enzymen ungewöhnliche Oxidationsstufen.

Ein Enzym ohne seinen gebundenen Cofaktor (lösliches Coenzym, prosthetische Gruppe oder Metallatom) wird ApoenzymApoenzym genannt. Ist der Cofaktor gebunden, spricht man vom HoloenzymHoloenzym.

Merke

Holoenzym Apoenzym + Cofaktor

Enzymkinetik

Enzyme:CofaktorenDie EnzymkinetikEnzymkinetik untersucht den Zusammenhang zwischen der Geschwindigkeit einer katalysierten Reaktion und den herrschenden Bedingungen (z. B. Menge und Eigenschaften des katalysierenden Enzyms). Durch kinetische Untersuchungen erhält man Graphen, die es ermöglichen, hinter den Mechanismus einer Reaktion zu kommen oder auch die Wirkungsweise von Inhibitoren zu verstehen.
Die Michaelis-Menten-Kinetik

Ein verbreiteter Ansatz zum Verständnis einfacher Enzymkinetiken ist die Michaelis-Menten-Kinetik. Sie geht von einem stark vereinfachten Schema für eine Ein-Substrat-Reaktion aus:

Dabei gilt: E Enzym, S Substrat, ES Enzym-Substrat-Komplex, P Produkt.

Die folgenden vereinfachenden Annahmen wurden getroffen:

  • Die Bildung von E + P aus ES ist der limitierende Schritt der Gesamtreaktion. Die Reaktion ist somit erster Ordnung (von einer Konzentration abhängig). Ihre Geschwindigkeit in mol/(l s) ergibt sich somit aus dem Produkt aus k2 (Einheit 1/s) und der Konzentration [ES] (Einheit mol/l). [ES] selbst ist von den Geschwindigkeitskonstanten k1 und k1 abhängig. Deshalb sind k1, k1 und k2 von Bedeutung.

  • Die Rückreaktion von EP in ES (und damit k2) ist zu vernachlässigen.

  • Die Affinität des Enzyms für das Produkt beträgt null (keine Reaktion E + P ES, kein k2).

Michaelis-Menten-Diagramm
Michaelis-Menten-Kinetik

Im Michaelis-Menten-Diagramm ist für eine enzymkatalysierte Reaktion die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0 (y-Achse) gegen die zugehörige Substratkonzentration [S] (x-Achse) aufgetragen. Ein solches Diagramm lässt sich erstellen über eine Reihe von Lösungen, die Substratkonzentrationen von sehr niedrig bis sehr hoch enthalten (Verdünnungsreihe). Zu jeder Lösung gibt man dieselbe Enzymmenge (jedes Michaelis-Menten-Diagramm gilt für eine bestimmte Enzymkonzentration). Nun misst man photometrisch (1.3.6) in jedem Ansatz z. B. die Zunahme der Produktkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit. Der Zusammenhang ist nichtlinear (Abb. 1.6), da mit Substratabnahme und Produktzunahme der Umsatz sinkt. Über eine Tangente durch den Nullpunkt schließt man auf die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0 zurück, als [S] maximal und [P] null war.

Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten aller Ansätze trägt man gegen die zugehörigen Substratkonzentrationen auf. Der Graph des Michaelis-Menten-Diagramms ist eine Hyperbel mit einer Asymptote parallel zur x-Achse (Abb. 1.7): Mit zunehmender Substratkonzentration lässt sich irgendwann keine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit mehr erreichen, weil die Enzyme gesättigt sind.

Es lassen sich drei Bereiche des Michaelis-Menten-Diagramms unterscheiden:

  • Sehr niedrige Substratkonzentration: Hier liegt eine Reaktion erster Ordnung vor. Die Enzymkonzentration ist so hoch, dass die Geschwindigkeit nur von der Substratkonzentration [S] abhängt. Jedes Substratmolekül findet leicht ein Enzymmolekül und bindet daran.

  • Mittlere Substratkonzentration: Die Reaktion erster Ordnung geht in eine Reaktion

  • nullter

    Ordnung über (Reaktion pseudo-nullter Ordnung). Die Substratmoleküle beginnen um die Bindung an ein freies Enzym zu konkurrieren. Deshalb wird bei weiterer Zugabe von Substrat die Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit immer geringer.

  • Hohe Substratkonzentration: Irgendwann hat eine weitere Zugabe von Substrat keinen Einfluss mehr auf die Reaktionsgeschwindigkeit. Das Enzym ist mit Substrat gesättigt (Substratsättigung) und katalysiert die Reaktion mit maximaler Geschwindigkeit (Vmax). Da die Geschwindigkeit konstant ist, liegt eine Reaktion nullter Ordnung vor.

Merke

Bei maximaler ReaktionsgeschwindigkeitReaktionsgeschwindigkeit (Vmax) ist eine Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit nur durch Zugabe von Enzym möglich.

Michaelis-Menten-Gleichung

Mithilfe der Michaelis-Menten-Gleichung kann man für jedes Michaelis-Menten-Diagramm die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0 für eine bestimmte Substratkonzentration [S] errechnen. Die Michaelis-Menten-Gleichung lautet:

Voraussetzung für die Berechnung von V0 ist neben der Substratkonzentration [S] die Kenntnis der Maximalgeschwindigkeit Vmax und der Michaeliskonstante KM:
  • Vmax hat die Dimension mol/(l s) und ist die höchstmögliche Geschwindigkeit, mit der eine Enzymlösung katalytisch tätig sein kann. Im Michaelis-Menten-Diagramm lässt sich Vmax als y-Wert ablesen an der Stelle, wo die Asymptote die y-Achse schneidet.

  • KM hat die Dimension einer Konzentration (mol/l) und ist die Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist (Vmax/2). (Man mache sich den Zusammenhang klar, indem man in der Michaelis-Menten-Gleichung [S] durch KM ersetzt!) KM lässt sich im Michaelis-Menten-Diagramm als x-Wert ablesen, indem man bei Vmax/2 ein Lot auf die x-Achse fällt.

Auf KM und Vmax soll im Folgenden näher eingegangen werden.

Wichtige Enzymkonstanten
Michaeliskonstante KM

KM ist die spezifische Substratkonzentration:MichaeliskonstanteSubstratkonzentration in mol/l, bei der ein Enzym mit halbmaximaler Geschwindigkeit arbeitet. Ist die Substratkonzentration gleich KM, so liegt die Hälfte aller Enzyme in der Lösung als Enzym-Substrat-Komplex ES vor. Deshalb wird KM auch als Halbsättigungskonzentration:MichaeliskonstanteHalbsättigungskonzentration bezeichnet.

KM ist ein Maß für die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat. Bei einem großen KM-Wert ist die Affinität niedrig: Viel Substrat ist nötig, um die halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen. So beträgt KM der Glucokinase 20 mmol/l. Bei kleinem KM ist die Affinität hoch: Bereits bei niedriger Substratkonzentration – 0,01 mmol/l bei der Hexokinase – ist die halbmaximale Geschwindigkeit erreicht. Ein Enzym kann für verschiedene Substrate jeweils einen eigenen KM-Wert besitzen.

Merke

KM ist die spezifische Substratkonzentration in mol/l, bei der ein Enzym mit halbmaximaler Geschwindigkeit arbeitet (Halbsättigungskonzentration).

Die Michaeliskonstante KM ist ein Maß für die Affinität eines Enzyms zu seinem Substrat. Je kleiner der KM-Wert, desto höher die Affinität.

Maximalgeschwindigkeit Vmax
Enzymkonstante Enzymkonstante:Michaeliskonstante

Vmax ist die höchstmögliche Geschwindigkeit in mol/(l s), mit der eine Enzymlösung katalytisch tätig sein kann. Sie wird erreicht, wenn Substratsättigung vorliegt. Vmax und k2 hängen über folgende Gleichung zusammen:

Weil bei Substratsättigung nahezu alle Enzyme als [ES] vorliegen, gilt auch:

Vmax ist somit von der Enzymkonzentration abhängig.

Merke

Die Michaeliskonstante KM ist eine Enzymkonstante, die für ein Enzymmolekül unabhängig von Enzym- und Substratkonzentration gilt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax bezieht sich dagegen auf eine bestimmte Konzentration eines Enzyms.

Cave

Aufgrund des hyperbolen Verlaufs der Substratumsatzkurve ist Substratsättigung nicht bei doppelter Halbsättigungskonzentration, also 2 KM, sondern erst bei wesentlich höheren Substratkonzentrationen erreicht.

Wechselzahl kkat (turnover number)
Maximalgeschwindigkeit:Enzyme

Die Wechselzahl kkat eines Enzymmoleküls ist die Anzahl von Substratmolekülen, die bei Substratsättigung pro Zeiteinheit vom aktiven Zentrum in das Produkt umgewandelt werden können (Einheit: 1/s s1). Die Wechselzahl ist damit gleich der Geschwindigkeitskonstante k2. kkat ist unabhängig von der Enzymkonzentration. Es gilt:

kkat Vmax/[E]

Die Wechselzahl der Carboanhydrase beträgt 6 105 s1. Das bedeutet, dass jedes einzelne Substrat nur 1,7 s (Mikrosekunden, also millionstel Sekunden) am Enzym verweilt. Ein langsames Enzym dagegen ist das Lysozym mit einer Wechselzahl von 0,5 s1. Für die meisten Enzyme liegt kkat zwischen 1 und 104 s1.

In Tab. 1.7 sind die Enzymkonstanten der Michaelis-Menten-Kinetik zusammengefasst.

Enzymaktivität

Man misst die Enzymaktivität in zwei verschiedenen Einheiten:

  • in Unit: 1 U 1mol (Substratumsatz)/min,

  • in Katal kat katalytische Einheit: 1 kat 1 mol (Substratumsatz)/s.

Die SI-Einheit Katal ist korrekter, Unit jedoch noch immer sehr verbreitet.

Wechselzahl:Enzyme

Merke

  • Unit: 1 U 1 mol (Substratumsatz)/min,

  • katalytische Einheit (Katal): 1 kat 1 mol (Substratumsatz)/s.

Es gilt: 1 U 16,7 nkat (1 nkat 103 kat).

Praxistipp

In der klinischen Praxis ist es oft sinnvoll, Enzymaktivitäten auf andere Messgrößen zu beziehen. Beispiele:

  • 1 l Blutplasma: In der klinischen Enzymologie sind die Einheiten kat/l oder nkat/l gebräuchlich. Auf Patientenbefunden findet sich häufig auch die Einheit U/l.

  • 1 kg Gewebe: Die Einheit lautet dann kat/kg, nkat/kg oder U/kg. Anwendungsbeispiel: Aktivitätsmessung der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK), Bestimmung der Gluconeogenese pro kg Körpergewicht.

Lineweaver-Burk-Diagramm
Enzyme:Aktivität

Das Michaelis-Menten-Diagramm ist eine Hyperbel (Abb. 1.8 a). Eine Hyperbel lässt sich in eine Gerade verwandeln, indem man 1/y gegen 1/x aufträgt. Darauf basiert das Lineweaver-Burk-Diagramm: Man trägt 1/V0 gegen 1/[S] auf und erhält eine Gerade (Abb. 1.8 b).

Die Formel für eine Gerade mit y f(x) (y Funktion von x) lautet:

  • a ist die Steigung der Gerade.

  • b ist der y-Achsenabschnittswert, also der Wert auf der y-Achse (Ordinate), bei dem die Gerade (der Graph) die y-Achse schneidet.

  • b/a ist der x-Achsenabschnittswert, also der Wert auf der x-Achse (Abszisse), bei dem der Graph die x-Achse schneidet (setzt man b/a in die Gleichung ein, ergibt sich der x-Wert 0).

Für das Lineweaver-Burk-Diagramm mit y f([S]) lautet die Gleichung der Geraden:

Die Steigung ist KM/Vmax.

  • Der y-Achsenabschnitt ist 1/Vmax.

  • Der x-Achsenabschnitt ist 1/KM (setzt man 1/KM für x ein, ergibt sich der x-Wert 0).

Bei der Erstellung und Interpretation sind folgende Punkte zu beachten:

  • Wegen der doppelt reziproken Auftragung sind die hohen Substratkonzentrationen auf der x-Achse links, die niedrigen rechts anzutreffen (1/1.000 ist kleiner als 1/10). Gleiches gilt für die V0 auf der y-Achse: Die höheren V0 finden sich weiter unten auf der y-Achse.

  • Der x-Achsenabschnitt ergibt sich erst durch die gedachte Verlängerung (Extrapolation) des Graphen in den negativen x-Bereich (gestrichelter Graph in Abb. 1.8 b).

  • Wird Vmax verdoppelt, so halbiert sich der y-Achsenabschnittswert, wird Vmax halbiert, verdoppelt er sich.

  • Je größer KM ist, desto näher liegt der x-Achsenabschnitt an null (von links aus betrachtet). Je kleiner KM ist, desto weiter links liegt er.

Das Lineweaver-Burk-Diagramm ist vor allem bei der Untersuchung des Mechanismus einer Enzymhemmung von Bedeutung: Die unterschiedlichen Formen der Enzymhemmung (1.3.4) haben ganz charakteristische Auswirkungen auf dieses Diagramm (und auf das Michaelis-Menten-Diagramm).

Hemmung von Enzymen

Formen der Enzymhemmung
Lineweaver-Burk-DiagrammEs gibt Enzyme:Hemmungunterschiedliche Formen der Enzymhemmung, die ganz charakteristische Auswirkungen auf das Michaelis-Menten- und das Lineweaver-Burk-Diagramm haben.
Kompetitive Hemmung

Ein kompetitiver Inhibitor ist isosterisch: Er ähnelt in seiner Struktur dem Substrat und konkurriert mit dem Substrat um die Bindungsstelle im aktiven Zentrum. Gebundener Inhibitor blockiert die Bindungsstelle, ohne dass Produkt entstehen kann. Für die Katalyse stehen dadurch weniger freie aktive Zentren zur Verfügung, die Katalysegeschwindigkeit wird verringert.

Merke

Ein kompetitiver Inhibitor konkurriert mit dem Substrat um die Bindungsstelle. Er verringert die Katalysegeschwindigkeit, indem er den Anteil der Enzyme mit gebundenem Substrat (ES) verringert.

Je stabiler der Enzym-Inhibitor-Komplex (EI) ist, desto wirkungsvoller ist der Inhibitor. Ist die Affinität des Enzyms zum Inhibitor um ein Vielfaches stärker als zum Substrat (wie bei Kohlenmonoxid, Enzymhemmung in der Medizin), ist die Hemmung praktisch irreversibel. Andernfalls lässt sich die Wirkung durch einen Substratüberschuss aufheben.

Merke

Kompetitive Inhibitoren lassen sich außer Kraft setzen, indem man die Substratkonzentration erhöht.

Die kompetitive Hemmung erkennt man an folgenden Veränderungen im Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Diagramm:

  • Im Michaelis-Menten-Diagramm (Abb. 1.9a) steigt die Hyperbel weniger stark an als bei der Reaktion ohne Inhibitor. Dieselbe Vmax kann erreicht werden, jedoch erst bei höherer Substratkonzentration, wenn die Substratmoleküle alle Inhibitormoleküle vom aktiven Zentrum verdrängt haben. Dementsprechend ist auch KM, die Substratkonzentration, bei der die Hälfte aller Enzyme in der Lösung als Enzym-Substrat-Komplex ES vorliegt (1.3.3), in Gegenwart des Inhibitors größer als bei der ungehemmten Reaktion.

  • Im Lineweaver-Burk-Diagramm (Abb. 1.9b) bleibt der y-Achsenabschnitt – also 1/Vmax – im Vergleich zur ungehemmten Reaktion unverändert. Der x-Achsenabschnitt – also 1/KM – hat einen kleineren Betrag. KM ist somit größer als bei der ungehemmten Reaktion. Man spricht von der scheinbaren KM-Erhöhung (scheinbar, da KM für das Enzym an sich unverändert ist).

Lerntipp

Kompetitive Hemmung: KM ist erhöht.

Klinik

In der klinischen Therapie eingesetzte kompetitive Enzyminhibitoren:

  • ACE-Hemmer: Das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) ist wichtig für die Regulation von Blutdruck, Blutvolumen und Na+-Haushalt. ACE spaltet Angiotensin I in die aktive Form II: Angiotensin II bewirkt, dass sich Blutgefäße verengen, mehr Na+ und H2O von den Nieren in den Kreislauf zurückgeführt werden und damit der Blutdruck steigt. ACE-Hemmer senken somit den Blutdruck.

  • Zyklooxygenasehemmer: Die Zyklooxygenase (COX) ist ein Schlüsselenzym für entzündliche Prozesse im Körper, die auch Schmerz auslösen können. Zyklooxygenasehemmer wirken deshalb antientzündlich (antiphlogistisch) und schmerzhemmend (analgetisch). Acetylsalicylsäure (ASS, Aspirin) hemmt die COX sogar irreversibel, indem sie ein reaktives Serin im aktiven Zentrum des Enzyms alkyliert.

  • Das Antibiotikum Penicillin hemmt die Glykopeptid-Transpeptidase, die Bakterien für ihre Zellwand Klinisynthese benötigen. Es geht dabei eine kovalente Bindung mit einem Serinrest im aktiven Zentrum des Enzyms ein und kann nicht mehr verdrängt werden.

  • Allopurinol hemmt die Xanthin-Oxidase, die beim Abbau der Purinbasen die Umwandlung von Xanthin in Harnsäure katalysiert. Ausfallende Harnsäurekristalle, u. a. in Gelenken, führen zur Gicht. Allopurinol wird daher zur Gichttherapie eingesetzt.

Kompetitive Hemmung bei Vergiftungen:

  • Kohlenmonoxid (CO) bindet kompetitiv an Hämoglobin – und zwar etwa 250-fach stärker als O2 und somit nahezu irreversibel. Das macht die bei Bränden häufige CO-Intoxikation so gefährlich. Therapeutisch kann CO nur durch Beatmung mit reinem Sauerstoff oder gar durch hyperbare Oxygenierung aus der Bindung verdrängt werden.

  • Schwermetalle verdrängen kompetitiv Metallkationen im aktiven Zentrum von Metalloenzymen. Ihre Bindung an das Apoenzym ( Enzym ohne Cofaktor, 1.3.2) ist oft stärker als die der zur Funktion benötigten Metallkationen.

Nichtkompetitive Hemmung

Ein nichtkompetitiver Inhibitor konkurriert nicht mit dem Substrat um das aktive Zentrum. Er beeinflusst die Enzymaktivität, indem er außerhalb des aktiven Zentrums an das Enzym bindet (allosterisch) und dessen Eigenschaften verändert. Der Anteil von ES-Komplexen bleibt unverändert. Die nichtkompetitive Hemmung stellt sich im Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Diagramm wie folgt dar (Abb. 1.10):

  • Die Affinität des Enzyms zum Substrat – und damit KMist im Vergleich zur ungehemmten Reaktion unverändert.

  • 1/Vmax ist erhöht. Vmax ist erniedrigt: Auch eine noch so hohe Substratkonzentration kann die Wirkung des Inhibitors nicht ausschalten, da dieser nicht im aktiven Zentrum bindet und daher nicht verdrängt werden kann.

Klinik

Die nichtkompetitive Enzymhemmung hat in der Medizin im Vergleich zur kompetitiven eine untergeordnete Bedeutung. Wichtige, vor allem toxikologische Beispiele sind:

  • Hemmung der Cytochrom-Oxidase der Atmungskette durch Zyanid. Es bildet sich ein stabiler Komplex zwischen Zyanid und dem Fe(III) des Enzyms. Die Substratbindung ist dabei wohl nicht beeinträchtigt, sondern nur die Katalyse (nichtkompetitiv). Die Atmungskette wird unterbrochen, und es kann kein ATP mehr bereitgestellt werden.

  • Nichtkompetitive toxische Hemmung verschiedener Enzyme durch Schwermetalle. Diese können z. B. an Serinresten von Enzymen mit den SH-Gruppen Komplexe bilden und so die Denaturierung und Fällung des Enzyms herbeiführen.

Unkompetitive Hemmung
Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex (ESI), der dann nur noch schwer umgesetzt werden kann. Im Michaelis-Menten- bzw. Lineweaver-Burk-Diagramm zeigen sich folgende Veränderungen:
  • KM ist erhöht im Vergleich zur ungehemmten Reaktion,

  • Vmax ist vermindert.

Unkompetitive Hemmung ist selten.
Produkthemmung und Substrathemmung
Manche Produkte können ihr Enzym hemmen (Produkthemmung, negative Rückkopplung): Wenn genug Produkt vorhanden ist, wird die weitere Katalyse unterbunden. Aber auch Substrat kann, wenn es im Übermaß vorhanden ist, sein Enzym hemmen (Substrathemmung).
Produkthemmung
Man unterscheidet:
  • kompetitive Produkthemmung: Diese spielt in der Stoffwechselregulation eine wichtige Rolle, denn sie verhindert, dass Produkt im Überfluss gebildet wird. Sie beruht darauf, dass das Produkt dem Substrat in der Passform ähnlich, also isosterisch, ist.

  • nichtkompetitive Produkthemmung: Nichtkompetitiv hemmendes Produkt hat eine andere Passform als das Substrat, es ist allosterisch und bindet an eine regulatorische Einheit des Enzyms, das allosterische Zentrum. Durch Auswirkung auf das aktive Zentrum wird die Reaktionsgeschwindigkeit verändert.

Substrathemmung
Auch ein Übermaß an Substrat kann inhibitorisch wirken: Bei sehr hohen Substratkonzentrationen binden in einem aktiven Zentrum zwei Substrate, sodass ESS-Komplexe entstehen. Diese können nicht umgesetzt werden, weshalb die Reaktionsgeschwindigkeit mit weiter steigender Substratkonzentration immer mehr abnimmt.

Enzymaktivität: Einfluss des Milieus

Veränderungen der Umgebung hinsichtlich pH-Wert, Temperatur oder Ionenkonzentration wirken sich auf Enzyme aus. Das kann zu einer Steigerung oder Verringerung der Enzymaktivität führen.
pH-Abhängigkeit
Als Proteine bestehen Enzyme aus verschiedenen Aminosäuren. Saure Aminosäuren mit deprotonierten Carboxylgruppen (-COO) und basische Aminosäuren mit protonierten Aminogruppen (-NH3+) sind wichtig für Enzymstruktur und Wechselwirkungen mit Substraten. Sinkender pH-Wert (Zugabe einer Säure) bedeutet Zunahme der H+-Konzentration (12.1). Carboxylgruppen, die bisher negativ geladen waren, nehmen ein Proton auf und werden neutral. Steigender pH (Zugabe einer Base) bedeutet sinkende H+-Konzentration. Aminogruppen, die zuvor positiv geladen waren, geben ein Proton in die Lösung ab und werden neutral. Zu- und Abnahme des pH können so die Konformation des Proteins stören (Denaturierung). Bei intakter Polypeptidkette kann das Enzym durch Rückkehr zu milderen Bedingungen seine ursprüngliche Konformation wieder annehmen (Renaturierung). Extreme pH-Werte können zur irreversiblen Hydrolyse der Polypeptidkette führen.

Merke

Denaturierung Zerstörung der nativen Konformation eines Proteins,

Renaturierung Rückkehr zur nativen Konformation nach Denaturierung.

Für eine optimale Bindung an das Substrat und eine optimale Katalyse ist die Struktur des aktiven Zentrums des Enzyms entscheidend. Wenn sich der pH-Wert ändert, bleibt dies nicht ohne Einfluss auf die Struktur des aktiven Zentrums. Eine Änderung des pH-Werts kann sich negativ (Vmax sinkt, KM steigt) oder positiv (Vmax steigt, KM sinkt) auswirken: Alle Enzyme besitzen ein pH-Optimum, bei dem sie mit maximaler Wechselzahl arbeiten. Das muss nicht immer der neutrale pH-Wert 7 sein, wie bei der Amylase im Speichel. Das im (sauren) Magensaft vorkommende Enzym Pepsin z. B. hat sein pH-Optimum im deutlich sauren Bereich zwischen 2 und 3. Trypsin dagegen, das im (basischen) Saft des Dünndarms vorkommt, hat ein pH-Optimum von 8, also im basischen Bereich.
Temperaturabhängigkeit
Ein Enzym besitzt neben demTemperatur:enzymatische Reaktion pH- auch ein Temperaturoptimum. Bei vielen chemischen Reaktionen gilt die sog. RGT-Regel (RGT Reaktionsgeschwindigkeitstemperatur): Eine Temperaturerhöhung um 10 C führt zu einer Verdopplung der Reaktionsgeschwindigkeit. Die RGT-Regel gilt bei enzymkatalysierten Reaktionen nur für moderate Temperaturen. Ab einer gewissen Temperatur steigt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch langsam, ab ca. 45 C fällt sie: Schwache Kräfte wie Wasserstoffbrückenbindungen können dem Entropiegewinn (1.2.1) durch Denaturierung des Proteins nicht mehr widerstehen. Bei einer bestimmten, für jedes Enzym spezifischen Temperatur erlahmt die Katalyse. Man spricht von der Hitzedenaturierung des Enzyms. Das Temperaturoptimum ist somit ein Kompromiss aus RGT-Regel und zunehmender Hitzedenaturierung.

Praxistipp

Die Hitzeempfindlichkeit von Enzymen macht man sich bei der Tumorbehandlung mittels Hyperthermie zunutze. Durch gezielte Überwärmung von Körperregionen, die von einem Tumor befallen sind, werden gezielt die Tumorzellen geschädigt und dadurch empfindlicher für eine gleichzeitig durchgeführte Strahlen- oder Chemotherapie gemacht.

Abhängigkeit von der Ionenkonzentration
Für ihre Löslichkeit benötigen Proteine eine Hydrathülle. Diese wird durch zu hohe oder zu niedrige Ionenkonzentrationen gestört, und die Proteine fallen aus. Beides kann man sich in der Biochemie zur Proteinfällung zunutze machen.
Metalloenzyme (1.3.2) benötigen zur Katalyse in ihrem aktiven Zentrum und/oder zur Aufrechterhaltung ihrer Struktur Metallkationen. Ein Mangel an Metallkationen (Spurenelementen, 12.3) führt deshalb bei solchen Enzymen zu verminderter Enzymtätigkeit. Gleiches gilt für Elektrolyte wie z. B. Mg2+ (12.2.2), das einige Enzyme zur Katalyse benötigen.
Weitere Einflüsse auf die Enzymaktivität
Inhibitoren, Produkte, Substrate und Effektoren haben ebenfalls Einfluss auf die Enzymaktivität (1.3.4 und 2).

Photometrische Methoden

Grundlagen
Photometrische Methoden Photometrische Messung:Enzymaktivitätberuhen darauf, dass Licht durch eine Lösung der zu untersuchenden Moleküle geschickt wird. Der Intensitätsunterschied zwischen eingehender und ausgehender Strahlung wird gemessen. Licht besteht aus Photonen (Lichtteilchen/Lichtwellen). Trifft ein Photon beim Durchgang durch die Lösung auf ein Molekül, so wird das Photon geschluckt, wenn dadurch ein Elektron im Molekül von einem Grund- in einen angeregten Zustand versetzt werden kann. Dazu muss der Energiegehalt des Photons genau dem Energieunterschied zwischen den beiden Zuständen entsprechen. Der Energieinhalt eines Photons hängt von seiner Wellenlänge ab (Lehrbücher der Physik). Ist bei einem Molekül bekannt, bei welcher Wellenlänge Elektronen angeregt werden können, lässt sich die Molekülkonzentration photometrisch mit Licht dieser Wellenlänge bestimmen. Das Lösungsmittel Wasser absorbiert kein Licht, wohl aber einige Biomoleküle (unten). Mit Licht ist hier der UV/VIS-Bereich gemeint, also der für Menschen sichtbare Bereich des elektromagnetischen Spektrums (VIS: 380–780 nm Wellenlänge), ergänzt um den UV-Bereich (100–380 nm).
Quantitative Messungen
Der optische Test

Mit einem Photometer lässt sich die Konzentration einer in einer Küvette (einer Hohlform aus durchsichtigem Plastik oder Glas) befindlichen gelösten Substanz messen. Die Wellenlänge des Lichts ist am Photometer einstellbar. Die Substanz muss im UV/VIS-Bereich absorbieren. Zur Konzentrationsberechnung bedient man sich des Lambert-Beer-Lambert-Beer-GesetzGesetzes, das Konzentration und Absorption der Lösung zueinander in Beziehung setzt:

Dabei ist:

  • E log T log I/I0: Die Extinktion E ist der negative dekadische Logarithmus der Transmission T. T Intensität der aus der Lösung austretenden Strahlung (I)/Intensität der in die Lösung eintretenden Strahlung (I0). E ist ohne Einheit. Manchmal wird die Extinktion auch Absorption A genannt, es gilt jedoch: A 1 – T 1 – log (I/I0).

  • Der molare dekadische Extinktionskoeffizient mit der Einheit l/(mol cm) ist eine substanzspezifische Konstante. Es gibt für jede Wellenlänge einen spezifischen Extinktionskoeffizienten, wobei man die Wellenlänge als Index von angibt, z. B. 450 100 l/(mol cm).

  • Die Konzentration c der Substanz in der Probe hat die Einheit mol/l.

  • Die Schichtdicke d ist die Strecke, die das Licht durch die Probe in der Küvette zurücklegt, oft 1 cm.

Es besteht ein exponentieller Zusammenhang zwischen Lichtschwächung und Konzentration: T I/I0 10cd. Erst durch Logarithmierung entsteht der lineare Zusammenhang. Erst durch Multiplikation mit 1 ergibt sich ferner eine ansteigende Gerade.

Der einfache optische Test
Die eigentliche Photometrie dient der Bestimmung von Substratkonzentrationen und evtl. ihrer Änderung über die Zeit (kinetische Messungen). Im einfachen optischen Test lassen sich z. B. bestimmen:
  • DNA: Alle Substanzen, die Adenin enthalten, absorbieren bei 260 nm.

  • Moleküle deren Umsetzung NAD+- bzw. NADP+-abhängig ist, z. B. Substrate von Oxidoreduktasen. Nur die reduzierten Formen NADH+H+ und NADPH+H+ absorbieren bei 340 nm. Beispiel: Pyruvat + NADH+H+ Lactat + NAD+.

Über den Verlust an NADH+H+ ist die Bestimmung der Substratkonzentration bei einer Reihe von Enzymen möglich (z. B. Malat-, Lactat-, Glucose-6-phosphat- oder Isocitrat-Dehydrogenase). Die Messung gibt nur dann Aufschluss über die vorliegende Substratmenge, wenn das Substrat vollständig umgewandelt wird. Dafür müssen zwei Bedingungen erfüllt sein: Die Messreaktion muss irreversibel sein (Gleichgewicht auf der Produktseite) und das Cosubstrat muss im Überschuss vorliegen.
Unter diesen Bedingungen ist die Berechnung der Substratkonzentration über die folgende Formel möglich:
  • CSubstrat ist die Substratkonzentration in mol/l (mol Substrat/l Probelösung).

  • E ist die Extinktionsänderung, die durch den Substratumsatz erfolgt ist.

  • ist der molare dekadische Extinktionskoeffizient für das Cosubstrat (wahlweise die reduzierte oder oxidierte Form bei der entsprechenden Wellenlänge).

  • d ist die Schichtdicke der verwendeten Küvette.

  • Vgesamt ist das Volumen des gesamten Reaktionsansatzes (vorgelegte Lösung mit Enzym und Cosubstrat + zugegebene Probelösung).

  • VProbe ist das Volumen der zugegebenen Probelösung.

Der gekoppelte optische Test
In einem gekoppelten optischen Test ist es möglich, die Konzentrationen von Substanzen (indirekt) zu messen, die nicht Substrate von Oxidoreduktasen sind. Gekoppelt bedeutet, dass die vorliegende Substanz über Hilfsreaktionen in das Substrat einer Oxidoreduktase umgewandelt wird. Voraussetzung für den Test ist, dass eine solche Umwandlung möglich ist.
Das Prinzip soll am Beispiel der Glucosebestimmung mit Hilfe von Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase erläutert werden:
  • Hilfsreaktion:

Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP
  • Indikatorreaktion:

Glucose-6-P + NADP+ 6-P-Gluconat + NADPH + H+
Enzymaktivitätsbestimmung

In der Diagnostik wird oft die Aktivität einer Enzymlösung (1.3.3) bei Substratsättigung bestimmt. Mehrere Voraussetzungen müssen erfüllt sein:

  • Das richtige Substrat und Cosubstrat (z. B. NADP+) müssen im Überschuss vorliegen.

  • Zwischen Extinktion und Enzymkonzentration muss ein linearer Zusammenhang bestehen. Dies ist nur für niedrige Enzymkonzentrationen der Fall (evtl. die Probe verdünnen).

Dann lässt sich aus der Extinktionsdifferenz über 1 Minute hinweg die Enzymaktivität nach folgender Formel berechnen:

Man erhält als Einheit für b: mol/(l min).

Für die Umrechnung in Units gilt: mol/(l min) 106 mol/(l min) 106 Units/l.

  • b katalytische Aktivitätskonzentration, idealerweise in der Einheit U/l mol/(l min). Die standardmäßige Verwendung des molaren, und eben nicht molaren, dekadischen Extinktionskoeffizienten macht eine Umrechnung nötig (s. Formel).

  • E die Extinktionsänderung, die durch den Substratumsatz erfolgt ist,

  • der molare dekadische Extinktionskoeffizient mit der Einheit l/(mol cm) für das (reduzierte) Cosubstrat (z. B. NADPH+H+),

  • d Schichtdicke der verwendeten Küvette (meist 1 cm),

  • Vgesamt Volumen des gesamten Reaktionsansatzes (vorgelegte Lösung mit Enzym und Cosubstrat plus zugegebene Probelösung),

  • VProbe Volumen der zugegebenen Probelösung.

Qualitative Messungen

Moleküle mit Bestandteilen, die im UV/VIS-Bereich Licht absorbieren, können anhand ihrer Spektren (Spektrometrie) eindeutig identifiziert werden, wenn man die Extinktion oder den Extinktionskoeffizienten gegen die verwendete Wellenlänge aufträgt. Abb. 1.11 zeigt die entsprechenden Spektren von NAD+/NADP+ und NADH+H+/NADPH+H+. Nur die reduzierten Formen absorbieren zusätzlich bei 340 nm. Der einzige Unterschied zwischen reduzierten und oxidierten Molekülen besteht im Nikotinamidanteil (reduziert oder oxidiert), deshalb ist das Extinktionsmaximum bei 340 nm auf den reduzierten Nikotinamidanteil zurückzuführen. Für das Maximum bei 260 nm ist das Adenin verantwortlich: Alle Substanzen, die Adenin enthalten, absorbieren bei 260 nm.

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