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B978-3-437-41784-9.00010-5

10.1016/B978-3-437-41784-9.00010-5

978-3-437-41784-9

D-Ribose (links) und D-2-Desoxyribose (rechts) in der geschlossenen Form.

Nukleinbasen: Purine und Pyrimidine. In Nukleosiden und Nukleotiden erfolgt anstelle des rot markierten H eine Verknüpfung zum Zucker.

2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP).

Synthese der Purinnukleotide bis zum IMP.

Herkunft der Atome der Purinbase Hypoxanthin (Base des IMP).

Bildung von AMP und GMP aus IMP.

Pyrimidinnukleotid-Synthese bis zum UMP.

Synthese von CTP und dTMP aus UMP.

Mechanismus der Ribonukleotid-Reduktase und beteiligte Hilfsreaktionen. Reduzierte (einsatzfähige) Reduktionsmittel sind grün dargestellt, oxidierte (verbrauchte) rot.

Purinabbau.

Das Rückgrat von DNA und RNA. DNA: X H, RNA: X OH

Die Basenpaare der DNA.

B-Form der DNA-Doppelhelix. a: seitliche Ansicht, b: Ansicht von oben. Ein DNA-Strang ist gelb, der andere rot dargestellt. Helle Farben: Basen, dunkle Farben: DNA-Rückgrat.

Eukaryontisches Gen.

Replikationsblase mit Topoisomerase II. Rot: Helikase, blau: Single strand binding proteins (SSBPs), grün: Replikationsrichtung.

Die Synthese des Leit- und des Folge-Tochterstrangs. Rot: Helikase, blau: Single strand binding proteins (SSBPs), gelb: Primer, grün: Wachstumsrichtung des Tochterstrangs.

Die Wachstumsrichtung der DNA.

DNA-Polymerase-Dimer (gelb) mit Schleife am Folgestrang. Der Folgestrang ist blau, der Leitstrang rot, die Wachstumsrichtung der Tochterstränge grün dargestellt.

Die Initiation der Transkription. D: TFIID-Komplex, A: TFIIA, B: TFIIB, F: TFIIF ATP-abhängige Helikase, E: TFIIE, H: TFIIH, J: TFIIJ.

Transkriptionsblase.

Stammschleife als prokaryontisches Terminationssignal.

Eukaryontischer Promotor.

Prokaryontischer Promotor.

Struktur der 5'-Kappe einer mRNA.

Anhängen eines poly(A)-Schwanzes an eine eukaryontische prä-mRNA.

Spleißen einer eukaryontischen prä-mRNA. Y Purinnukleotid, R Pyrinidinnukleotid, N beliebiges Nukleotid.

Grundstruktur einer tRNA in 2D-Darstellung.

Initiation der Translation bei Prokaryonten.

Bildung der Peptidbindung.

Die Induktion des lac-Operons.

Aufbau eines Virus am Beispiel des HIV.

Verknüpfung zweier DNA-Moleküle durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym, das kohäsive Enden erzeugt.

Schritte der Proinsulin-Synthese in E. coli.

Mehrere aufeinanderfolgende PCR-Zyklen. Es wird deutlich, wie dank forward- und reverse-Primer irgendwann nur noch das Template vervielfältigt wird.

Zusammensetzung einer halbdenaturierten Lösung aus Eindomänen-Proteinen: Es liegen komplett gefaltete und komplett ungefaltete Proteine, jedoch praktisch keine teilweise gefalteten Proteine vor.

Schritte der Glykierung.

Mechanismus einer Aspartyl-Protease nach dem Säure/Base-Prinzip.

Katalytische Triade einer Seryl-Protease.

Angriff einer Peptidbindung durch eine Cysteinyl-Protease.

Mechanismus der Katalyse durch eine Metallo-Protease.

Basen, Nukleoside und Nukleotide der RNA und DNA

Tab. 10.1
Base Nukleosid Nukleotid
RNA
Adenin Adenosin Adenosinmonophosphat (AMP, Adenylat),-diphosphat (ADP),-triphosphat (ATP)
Cytosin Cytidin Cytidinmonophosphat (CMP, Cytidylat),-diphosphat (CDP),-triphosphat (CTP)
Guanin Guanosin Guanosinmonophosphat (GMP, Guanylat),-diphosphat (GDP),-triphosphat (CTP)
Uracil Uridin Uridinmonophosphat (UMP, Uridylat),-diphosphat (UDP),-triphosphat (UTP)
DNA
Adenin Desoxyadenosin Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP, Desoxyadenylat),-diphosphat (dADP),-triphosphat (dATP)
Cytosin Desoxycytidin Desoxycytidinmonophosphat (dCMP, Desoxycytidylat),-diphosphat (dCDP),-triphosphat (dCTP)
Guanin Desoxyguanosin Desoxyguanosinmonophosphat (dGMP, Desoxyguanylat),-diphosphat (dGDP),-triphosphat (dGTP)
Thymin Desoxythymidin (oft auch nur Thymidin, da stets in der Desoxyform) (Desoxy)Thymidinmonophosphat (dTMP, (Desoxy)Thymidylat),-diphosphat (dTDP),-triphosphat (dTTP)

NTP-verbrauchende und nicht-NTP-verbrauchende Enzymklassen

Tab. 10.2
Enzymklasse Katalysierte Reaktion NTP-Verbrauch
Oxidoreduktasen Redox-Reaktionen Nein
Transferasen Gruppentransfer u. U. (z. B. Kinasen)
Hydrolasen Hydrolysen (Spaltungen mithilfe von Wasser) u. U. (z. B. Na+-K+-ATPase)
Lyasen Spaltung oder Bildung von Bindungen ohne Energieverbrauch Nein
Isomerasen Isomerisierungen (Umwandlungen zwischen Isomeren) i. d. R. nein
Ligasen Spaltung oder Bildung von Bindungen unter Energieverbrauch Ja

Der genetische Code.

Tab. 10.3
Position 1 im Codon* T
Position 2 im Codon* T C A G
Position 3 im Codon* T: Phe
C: Phe
A: Leu
G: Leu
T: Ser
C: Ser
A: Ser
G: Ser
T: Tyr
C: Tyr
A: Stopp
G: Stopp
T: Cys
C: Cys
A: Stopp
G: Trp
Position 1 im Codon* C
Position 2 im Codon* T C A G
Position 3 im Codon* T: Leu
C: Leu
A: Leu
G: Leu
T: Pro
C: Pro
A: Pro
G: Pro
T: His
C: His
A: Gln
G: Gln
T: Arg
C: Arg
A: Arg
G: Arg
Position 1 im Codon* A
Position 2 im Codon* T C A G
Position 3 im Codon* T: Ile
C: Ile
A: Ile
G: Met (Start)
T: Thr
C: Thr
A: Thr
G: Thr
T: Asn
C: Asn
A: Lys
G: Lys
T: Ser
C: Ser
A: Arg
G: Arg
Position 1 im Codon* G
Position 2 im Codon* T C A G
Position 3 im Codon* T: Val
C: Val
A: Val
G: Val
T: Ala
C: Ala
A: Ala
G: Ala
T: Asp
C: Asp
A: Glu
G: Glu
T: Gly
C: Gly
A: Gly
G: Gly

Ableserichtung: 5'3'

Die an der Replikation beteiligten Enzyme und Proteine

Tab. 10.4
prokaryontischesEnzym/Protein eukaryontischesEnzym/Protein Funktion
Helikase Helikase ATP-abhängig: Aufwinden der DNA am ORI und Schieben der Replikationsgabel über das Replikon
SSBPs SSBPs Stabilisierung der Einzelstrangbereiche der Replikationsgabel bzw. -blase durch Verhinderung unkontrollierter Basenpaarung
Topoisomerase II (ATP-Bedarf) Gyrase bei den Bakterien Topoisomerase II Lösen der von der Helikase verursachten DNA-Spannung im noch nicht aufgewundenen Bereich durch Einführen einer negativen Superspiralisierung
Topoisomerase I(kein ATP-Bedarf) Topoisomerase I Aufheben der negativen Superspiralisierung
Primase (DNA-abhängige RNA-Polymerase) Primase (DNA-abhängige RNA-Polymerase, Untereinheit der DNA-Polymerase ) Synthese der RNA-Primer am Anfang des Replikons (Leitstrang) und am Anfang jedes Okazaki-Fragments (Folgestrang)
DNA-Polymerase I
  • 5'3'-Exonuklease: entfernt den Primer am Anfang des Replikons und am Anfang der Okazaki-Fragmente

  • 5'3'-DNA-Polymerase: füllt die Lücken zwischen den Okazaki-Fragmenten und die durch Abschneiden der Primer entstandenen Lücken

  • 3'5'-Exonuklease: Proofreading-Funktion

DNA-Polymerase III
  • 5'3'-DNA-Polymerase: verlängert RNA-Primer an Leit- und Folgestrang komplementär zum parentalen Strang

  • 3'5'-Exonuklease: Proofreading-Funktion

DNA-Polymerase
  • besitzt Primase-Untereinheit

  • 5'3'-DNA-Polymerase: knüpft die ersten ca. 20 dNTPs an den Primer

DNA-Polymerase
  • 5'3'-DNA-Polymerase: führt die von der DNA-Polymerase begonnene DNA-Synthese fort bis zu einem Primer (Leit- und Folgestrang)

  • 5'3'-Exonuklease: entfernt den Primer am Anfang der Okazaki-Fragmente

  • 3'5'-Exonuklease: Proofreading-Funktion

DNA-Ligase DNA-Ligase Verbindung der freien DNA-Enden von Okazaki-Fragmenten bzw. am ORI

Hemmstoffe der DNA-Replikation

Tab. 10.5
Substanz Wirkungsmechanismus wird eingesetzt als
Ciprofloxacin Hemmung der bakteriellen Topoisomerase (Gyrase) Antibiotikum
Mitomycin Quervernetzung von DNA-Strängen, dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Zytostatikum
Cyclophosphamid Quervernetzung von DNA-Strängen, dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Zytostatikum
Cytosinarabinosid Einbau in die DNA. Bei der Initiation der Replikation kann die Topoisomerase die Phosphodiesterbindung an Cytosinarabinosid zwar spalten, aber nicht wieder knüpfen. Zytostatikum

Hemmstoffe der Transkription

Tab. 10.6
Substanz Wirkungsmechanismus wird eingesetzt als
Ciprofloxacin Hemmung der bakteriellen Topoisomerase (Gyrase) Antibiotikum
Rifampicin Hemmung der prokaryontischen RNA-Polymerase Antibiotikum (bei Tuberkulose)
Actinomycin D Quervernetzung von DNA-Strängen (Komplexbildung mit Guanin), dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Zytostatikum
Mitomycin Quervernetzung von DNA-Strängen, dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Zytostatikum

Vergleich der an der pro- und eukaryontischen Translations-Initiation beteiligten Strukturen

Tab. 10.7
Strukturen Prokaryonten Eukaryonten
mRNA kein Cap, kein poly(A) Cap und poly(A)
Ribosomen
  • Untereinheiten (UE)

  • rRNAs

  • Anzahl ribosomaler Proteine

70S, 2570 kDakleine UE 30S, große 50S16S (30S-UE); 23S, 5S (50S-UE)ca. 55 80S, 4220 kDakleine UE 40S, große 60S18S (40S-UE); 28S, 5,8S, 5S (60S-UE)ca. 75
Initiations-tRNA meist Formyl-Met-tRNA Met-tRNA
Anzahl Initiationsfaktoren 3 ca. 12

Hemmstoffe der Translation

Tab. 10.8
Substanz Wirkungsmechanismus eingesetzt als
Streptomycin bindet an die kleine Untereinheit prokaryontischer Ribosomen und verursacht Fehler beim Ablesen der mRNA. Es entstehen defekte Proteine. Antibiotikum (bei Tuberkulose)
Tetracyclin bindet in therapeutischer Dosierung an prokaryontische Ribosomen und hemmt die Bindung von Aminoacyl-tRNA an die A-site Antibiotikum
Chloramphenicol bindet an die große Untereinheit prokaryontischer Ribosomen und hemmt die Peptidyltransferase Antibiotikum
Erythromycin bindet an die große Untereinheit prokaryontischer Ribosomen und hemmt die Translokation Antibiotikum
Puromycin Strukturanalogon des 3'-CCA-Endes der tRNA; bindet an die A-site pro- und eukaryontischer Ribosomen und führt zum Abbruch der Polypeptidkette Zytostatikum

Wichtige co- und posttranslationale Modifikationen an einzelnen Aminosäuren

Tab. 10.9
Aminosäure Modifikation Beispiel
Prolin Hydroxylierung 4-Hydroxyprolin in Kollagen
Lysin Hydroxylierung
Methylierung
3- oder 5-Hydroxylysin in Kollagen
N-Methyllysin in Histonen
Histidin Methylierung Methylhistidin in Aktin und Myosin
Glutamat -Carboxylierung -Carboxyglutamat in Prothrombin
Cystein Disulfidbrücke (Cystin)
Acylierung
Disulfidbrücken in Insulin
durch Fettsäuren in der Membran verankerte Proteine
Asparagin N-Glykosylierung viele extrazelluläre Proteine und Peptide, z. B. IL-10
Serin Phosphorylierung
O-GlykosylierungIsoprenylierung
durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung regulierbare Enzyme, z. B. die Glykogen-Phosphorylase
extrazelluläre Proteine, z. B. BlutgruppenantigeneIsoprenyl-verankerte Membranproteine
Threonin Phosphorylierung
O-Glykosylierung
durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung regulierbare Enzyme, z. B. Phospholipase D1
viele extrazelluläre Proteine und Peptide, z. B. IL-6
Tyrosin Phosphorylierung durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung regulierbare Enzyme, z. B. einige Tyrosinkinasen

Vergleich des E.-coli- und des menschlichen Genoms

Tab. 10.10
Kriterium E. coli H. sapiens
Größe des Genoms ca. 4,6 Mbp ca. 3.200 Mbp
Anzahl der Gene 2.000 ca. 23.000
Struktur des Genoms oft ringförmig 46 Chromosomen (23 Chromosomenpaare)
Strukturproteine der DNA keine Histone vor allem Histone
Struktur der Gene keine Introns Introns und Exons
Operons ja nein
polycistronische mRNA ja nein
Plasmide ja nein
mitochondriale DNA nein ja
Transkription und Translation parallel kompartimentiert

Beispiele für durch Proenzym-Konvertasen (Proteasen) aktivierte Enzyme

Tab. 10.11
Enzymklasse Beispiel eines Proenzyms zugehöriges aktives Enzym (sowie aktivierende Protease)
Verdauungsenzyme Trypsinogen Trypsin (Protease: Enteropeptidase)
Chymotrypsinogen Chymotrypsin (Protease: Trypsin; Trypsin spaltet v. a. Peptidbindungen, an denen Lys oder Arg beteiligt ist)
Procarboxypeptidasen Carboxypeptidasen (Protease: Trypsin)
Gerinnungsfaktoren Prothrombin Thrombin (Protease: Thromboplastin [Faktor Xa-Va-Phospholipid-Ca2+-Komplex])
Fibrinolysefaktoren Plasminogen Plasmin (Protease: z. B. tissue plasminogen activator [tPA])
Enzyme des Komplementsystems Zymogen C1 s aktives C1 s (Protease: Peptidase C1r)
Caspasen(11.13) Procaspase 9 Caspase 9 (Protease: Apaf-1)

Genprodukte von Protoonkogenen

Tab. 10.12
Protoonkogen Genprodukt Funktion
sis PDGF-B Wachstumsfaktor
int-2 FGF-3 Wachstumsfaktor
erbB EGF-Rezeptor Membranrezeptor für Wachstumsfaktor
fms M-CSF-Rezeptor Membranrezeptor für Wachstumsfaktor
ras (H-ras, K-ras, N-ras) ras-Proteine an der Signaltransduktion der Zellproliferation beteiligte G-Proteine, z. B. der Signaltransduktionskaskade des PDGF (platelet-derived growth factor)
ablsrc abl-Tyrosinkinasesrc-Tyrosinkinase an der Signaltransduktion der Zellproliferation beteiligte membranassoziierte Tyrosinkinasen
mos zytosolische Serin/Threonin-Kinase an der Signaltransduktion der Zellproliferation beteiligte Kinase
erbA Schilddrüsenhormonrezeptor Zellkernhormonrezeptor
myc, jun, fos,myb, rel Transkriptionsfaktoren DNA-bindende, Transkription stimulierende Proteine

Zytostatika-Klassen

Tab. 10.13
Substanzklasse Substanz (Beispiele) Wirkungsmechanismus
Alkylanzien Busulfan, Cyclophosphamid, Mitomycin alkylieren Basen, was zu Transitionen, oft auch Quervernetzung der DNA und zu Strangbrüchen führt
Antimetaboliten Fluorouracil, Mercaptopurin (Basenanaloga); Cytosinarabinosid (Nukleosidanalogon) hemmen die DNA-/RNA-Synthese durch Unterdrückung der De-novo-Synthese von Nukleotiden oder durch Einbau falscher Nukleotide
interkalierende Substanzen Actinomycin D, Anthrazykline schieben sich zwischen benachbarte Basen der DNA Hemmung der RNA/DNA-Polymerase; außerdem: Strangbrüche durch Bildung freier Radikale und Topoisomerase-Hemmung
Vinca-Alkaloide (Inhaltsstoffe der Pflanze Immergrün) Vincristin, Vinblastin vernetzen die Spindelfasern bei der Mitose, sodass die Zellen sich nicht teilen können und absterben
Taxane (Inhaltsstoffe der Eibe) Paclitaxel, Docetaxel verhindern den Abbau des Spindelfaserapparats und damit den Abschluss der Zellteilung
Platinverbindungen Cisplatin, Carboplatin Quervernetzung der DNA Hemmung der DNA-Replikation und der Transkription

Genetik

A. Lantermann

U. Dettmer

  • 10.1

    Nukleotide218

    • 10.1.1

      Definition und Struktur218

    • 10.1.2

      Synthese220

    • 10.1.3

      Funktion227

    • 10.1.4

      Abbau und Wiederverwertung228

    • 10.1.5

      Pathobiochemie230

  • 10.2

    Nukleinsäuren231

    • 10.2.1

      Definition und Struktur231

    • 10.2.2

      Synthese232

    • 10.2.3

      Abbau232

  • 10.3

    Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information233

    • 10.3.1

      Die genetische Information: das Genom233

    • 10.3.2

      Der Fluss der genetischen Information236

    • 10.3.3

      Der Schlüssel zur genetischen Information: der genetische Code236

    • 10.3.4

      Mutationen, ihre Auswirkungen auf den genetischen Code und ihre Reparatur238

    • 10.3.5

      Die Replikation der DNA241

    • 10.3.6

      Von DNA zu RNA: die Transkription246

    • 10.3.7

      Reifung, Transport und Nachbearbeitung der RNA251

    • 10.3.8

      Von mRNA zum Protein: die Proteinbiosynthese (Translation)254

    • 10.3.9

      Fertigstellung der Proteine260

    • 10.3.10

      Regulation der Genexpression261

    • 10.3.11

      Übertragung der genetischen Information bei Bakterien und Viren265

  • 10.4

    In-vitro-DNA-Rekombination und Gentechnik269

    • 10.4.1

      Molekulare Werkzeuge in der Gentechnik269

    • 10.4.2

      Übertragung der DNA271

  • 10.5

    Analyse von Nukleinsäuren271

    • 10.5.1

      Grundtechniken271

    • 10.5.2

      Anwendungsbeispiele274

  • 10.6

    Faltung und Modifikation von Proteinen275

    • 10.6.1

      Proteinfaltung275

    • 10.6.2

      Adressierung von Proteinen277

    • 10.6.3

      Limitierte Proteolyse278

    • 10.6.4

      Proteinglykosylierung279

    • 10.6.5

      Nichtenzymatische Glykosylierung (Glykierung)280

    • 10.6.6

      Verankerung von Proteinen in Membranen281

  • 10.7

    Proteolyse281

    • 10.7.1

      Einteilung der Proteasen (Peptidasen)281

    • 10.7.2

      Lysosomale Proteasen283

    • 10.7.3

      Zytosolische Proteasen284

  • 10.8

    Tumorentstehung und Tumortherapie: Die Vorgänge auf Gen-Ebene284

    • 10.8.1

      Tumorentstehung (Kanzerogenese)284

    • 10.8.2

      Tumortherapie durch Zytostatika287

IMPP-Hits

Nukleotide

  • Synthese von Purin- und Pyrimidinnukleotiden, Folsäure, Inhibitoren der Synthese

  • Funktion: Cosubstrate, Second messenger, Aktivierung von Molekülen; Nukleinsäuresynthese

  • Abbauwege der Purin- und Pyrimidinnukleotide, Endprodukte; Pathobiochemie

Nukleinsäuren

  • Grundlagen: Gen, Intron, Exon, Promotor, Genom; Rekombination, Mutationen, Chromosomenaberrationen

  • DNA-Replikation: Mechanismen und Enzyme, Replikationssysteme; Telomerase; Tumortherapie und Hemmstoffe der DNA-Synthese; DNA-Schädigung und -Reparatur

  • Transkription: RNA-Synthese, Mechanismen, RNA-Polymerasen I, II, III; Transkriptionsfaktoren, -komplexe, Promotoren, Enhancer; posttranskriptionale RNA-Prozessierung, Hemmstoffe der Transkription

  • Translation: Proteinsynthese, Mechanismen; Ribosomen, Polysomen, freie und ER-gebundene Ribosomen, genetischer Code; Hemmstoffe der Proteinsynthese; Pathobiochemie

  • Genexpression: Induktion und Repression der Transkription; Regulation der Translation

  • Grundzüge der Struktur von DNA- und RNA-Viren, Tumorviren; Viruserkrankungen, antivirale Therapie

  • Übertragung der genetischen Information bei Bakterien und Viren: Prinzipien der DNA-Transformation, Konjugation, Transduktion

  • In-vitro-DNA-Rekombination und Gentechnik: Methoden, gentechnische Synthese von Peptiden; Gentherapie (viral und nichtviral)

  • Methoden zur Analyse von Nukleinsäuren, Gendiagnostik

  • Abbau: Enzyme des DNA- und RNA-Abbaus

Faltung und Modifikation von Proteinen

  • Proteinfaltung: Primär- und Raumstruktur, Denaturierung und Renaturierung, Chaperone, Prion-Krankheiten, Alzheimer-Krankheit

  • Adressierung von Proteinen: Signalsequenzen, subzelluläre Proteinlokalisierung und Proteinsekretion

  • limitierte Proteolyse: Prohormon- und Proenzym-Konvertasen; Pathobiochemie

  • Proteinglykosylierung: Glykoproteine und Proteoglykane, Blutgruppenantigene

  • Verankerung von Proteinen in Membranen: Acylierung, Isoprenylierung, GPI-Anker

Proteolyse

  • Proteasen, lysosomale Proteasen, zytosolische Proteolyse

Tumorbiochemie

  • chemische und physikalische Kanzerogene, strahlenbedingte maligne Erkrankungen, Onkogene, Protoonkogene, Tumorsuppressorgene

Nukleotide

Definition und Struktur

Definition
Nukleotide bestehen aus einem Zucker Nukleotidemit fünf C-Atomen, einer Nukleinbase und Phosphorsäure. Sie bilden die Grundeinheit der Nukleinsäuren (DNA und RNA, 10.2). Weil sie energiereiche Bindungen enthalten, können sie als Energielieferanten dienen. Außerdem spielen sie eine Rolle in der Signaltransduktion und als Coenzyme.
Struktur

Ein Nukleotid bestehtTumortherapie:Substanzklassen aus drei Einheiten:

  • einer Pentose (Abb. 10.1):

    • D-Ribose bei der RNA

    • D-2-Desoxyribose bei der DNA. Die Desoxyribose entsteht aus der Ribose, indem die Ribonukleotid-Reduktase ein Sauerstoffatom am C-2-Atom entfernt.

  • einer stickstoffhaltigen Nukleinbase (Abb. 10.2): Man unterscheidet zwischen

    • Purinbasen (Derivate des bizyklischen Moleküls Purin): Adenin (A) und Guanin (G) kommen in DNA und RNA vor. Eine seltene Purinbase ist Xanthin, das ein Zwischenprodukt der Purinnukleotidsynthese ist und zu A oder G weiterverstoffwechselt wird.

    • Pyrimidinbasen (Derivate des monozyklischen Moleküls Pyrimidin): Cytosin (C) und Thymin (T) kommen nur in DNA, Uracil (U) kommt nur in RNA vor. tRNA enthält häufig seltene Pyrimidinbasen, z. B. Pseudouracil.

  • Phosphorsäure: Das C-5-Atom der Ribose bzw. Desoxyribose ist mit ein bis drei Phosphatmolekülen verbunden.

Lerntipp

Um die Purine und Pyrimidine nicht zu verwechseln, gibt es zwei Merkhilfen.

Chemische Struktur:

Pu-rin besteht nur aus zwei Silben und steht für den kürzeren Einfachring der Purine.

Py-ri-mi-din besteht aus vier Silben und steht für den längeren Doppelring der Pyrimidine.

Nomenklatur:

Pyrimidin: Thymin und Cytosin

Purin: Adenin und Guanin

Abb. 10.3 zeigt am Beispiel des Desoxyguanosintriphosphats (dGTP) den Zusammenbau der einzelnen Nukleotidbestandteile. Die ausführliche Schreibweise lautet 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat. Der C5-Zucker ist mit einer Nukleinbase über eine N-glykosidische Bindung verknüpft. Die Einheit aus C5-Zucker und Nukleinbase heißt Nukleosid.

Man unterscheidet Nukleoside und Nukleotide:

  • Ein Nukleotid ist ein Nukleosid-5'-Phosphat. Je nach Anzahl der Phosphate wird unterschieden zwischen Nukleosidmono-, -di- und -triphosphaten (Tab. 10.1). Nukleosidtriphosphate sind die Substrate der Nukleinsäuresynthese(10.2.2).

  • Eine Verbindung aus zwei Nukleotiden heißt Dinukleotid. Die Cosubstrate NAD und FAD sind Dinukleotide mit der Base Adenin und den Verbindungen Nikotinamid (NAD) bzw. Flavin (FAD) anstelle einer weiteren Nukleinbase.

  • Die zyklischen Nukleotide (Phosphorsäurediester zwischen C-3- und C-5-Atom der Ribose) cAMP und cGMP sind bei Signalwegen wichtige Second messenger.

  • DNA und RNA bestehen aus vielen Nukleotiden und sind Polynukleotide.

Merke

  • Base + Zucker Nukleosid (z. B. Adenosin, Desoxyadenosin)

  • Base + Zucker + (1–3 Moleküle) Phosphat Nukleotid (Nukleosidphosphat)

  • Base + Zucker + 1 Phosphat Nukleosidmonophosphat (z. B. CMP und dCMP)

  • Base + Zucker + 2 Phosphate Nukleosiddiphosphat (z. B. GDP und dGDP)

  • Base + Zucker + 3 Phosphate Nukleosidtriphosphat (z. B. UTP und dTTP)

Zu den Nukleosiden und Nukleotiden der RNA und DNA: Tab. 10.1.

Synthese

Die Synthese der Purinbasen Nukleotide:SyntheseGuanin und Adenin unterscheidet sich von der Synthese der Pyrimidinbasen Cytosin, Thymin und Uracil. Zwar benötigen beide Synthesewege die doppelt aktivierte Ribose 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP), jedoch zu unterschiedlichen Zeitpunkten: Während das Ringsystem der bizyklischen Purine direkt an einem Molekül PRPP entsteht, wird der Pyrimidin-Monozyklus zunächst synthetisiert und anschließend auf PRPP übertragen. Dabei entstehen Nukleotide.
Synthese und Aktivierung der Ribose

Ribose entsteht im oxidativen und im nichtoxidativen Zweig des Pentosephosphatwegs(3.5) in der aktivierten Form (Ribose-5-phosphat). Für die Nukleotidsynthese muss die Ribose zusätzlich am C-1-Atom aktiviert werden, an dem das Purinringsystem synthetisiert bzw. auf die der Pyrimidinring übertragen wird. Diese Aktivierung erfolgt durch die Ribose-5-phosphat-Pyrophosphokinase, die Pyrophosphat (PPi) überträgt:

Ribose-5-P + ATP PRPP + AMP

Dadurch entsteht 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP), die doppelt aktivierte Ribose. Die Ribose-5-phosphat-Pyrophosphokinase unterliegt einer Feedback-Hemmung durch das vorläufige Endprodukt der Purinnukleotidsynthese, IMP (Abb. 10.4), sowie durch die Endprodukte AMP und GMP.

Synthese der Purinnukleotide
Synthese von Inosinmonophosphat (IMP)

Lerntipp

Erfahrungsgemäß sind die genauen Details (z. B. Namen der Zwischenprodukte) der folgenden Reaktionswege nicht Gegenstand der IMPP-Fragen. Die Abfolge der Schritte und insbesondere die beteiligten Moleküle sollte man sich einprägen. Hilfreich ist dabei u. a. die Abb. 10.5.

Inosinmonophosphat (IMP) ist das primäre Endprodukt der Purinsynthese und wird folgendermaßen synthetisiert (Abb. 10.4):

  • 1.

    Das Enzym Glutamin-Phosphoribosyl-Amidotransferase (GPAT) katalysiert den Austausch der Pyrophosphatgruppe am C-1-Atom des PRPP gegen eine Aminogruppe. Es entsteht 5-Phosphoribosyl-1-amin. Donor der Aminogruppe ist die Aminosäure Glutamin, die durch die hydrolytische Abspaltung der Aminogruppe zu Glutamat wird. Die Energie für die Reaktion stammt aus der gleichzeitigen Abspaltung des Pyrophosphats von PRPP. Als Schrittmacherenzym der Purinbiosynthese ist die Glutamin-Phosphoribosyl-Amidotransferase wirksam reguliert: PRPP aktiviert das Enzym. ATP, ADP, AMP sowie GTP, GDP, GMP und IMP hemmen es gemäß einer Feedback-Hemmung.

  • 2.

    Nun wird die Aminosäure Glycin durch Phosphorylierung der Carboxylgruppe aktiviert. Durch Reaktion mit der Aminogruppe des 5-Phosphoribosyl-1-amins entsteht das Glycinamid-Ribonukleotid.

  • 3.

    Ein H-Atom der freien Aminogruppe des ankondensierten Glycins wird durch einen Formylrest ersetzt. Donor der Formylgruppe ist N10-Formyl-Tetrahydrofolsäure (N10-Formyl-THF oder -FH4). Es entsteht das Formyl-Glycinamid-Ribonukleotid.

  • 4.

    Unter ATP-Verbrauch wird das C-Atom der inneren Amidbindung des Moleküls aktiviert. Eine Aminogruppe, die von Glutamin stammt, wird auf dieses C-Atom übertragen. Es entsteht das Zwischenprodukt Formyl-Glycinamidin-Ribonukleotid.

  • 5.

    Das Formyl-Glycinamidin-Ribonukleotid zyklisiert zum 5-Aminoimidazol-Ribonukleotid. Dabei wird H2O freigesetzt und ein Molekül ATP verbraucht.

  • 6.

    Der entstandene 5-Zyklus (Imidazolring) wird von aktiviertem Hydrogencarbonat (phosphoryliertes HCO3) carboxyliert, zu-nächst an der Aminogruppe, dann durch intramolekulare Umlagerung am C5-Atom.

  • 7.

    Nun wird der Carboxylatrest am Imidazolring aktiviert, um mit der Aminosäure Aspartat unter Ausbildung einer Peptidbindung zu kondensieren. Vom Aspartat bleibt nur eine Aminogruppe zurück, der Rest wird als Fumarat (Zwischenprodukt des Citratzyklus) abgespalten.

  • 8.

    Das letzte fehlende C-Atom wird von N10-Formyl-THF geliefert.

  • 9.

    Unter H2O-Abspaltung wird der zweite Ring geschlossen. Dadurch entsteht Inosinmonophosphat (IMP), das Nukleotid mit der Base Hypoxanthin.

Merke

Die Synthese der Purinnukleotide beginnt mit dem Aufbau des Bizyklus auf PRPP. Unter Beteiligung von einem PRPP, zwei Glutamin, einem Glycin, zwei N10-Formyl-THF und einem Aspartat entsteht das Primärprodukt IMP. Insgesamt werden hierbei sechs ATP (die Ribose-5-P-Aktivierung mitgerechnet) und zwei energiereiche N10-Formyl-THF verbraucht.

Synthese von Adenosinmonophosphat (AMP) und Guanosinmonophosphat (GMP)
Purinnukleotide:Synthese

AMP wird in einem Schritt aus IMP gebildet (Abb. 10.6). Dabei wird der Carbonylsauerstoff am C-6-Atom durch eine Aminogruppe ersetzt. Donor der Aminogruppe ist die Aminosäure Aspartat, die durch die Adenylsuccinat-Synthetase in Fumarat umgewandelt wird. Die Energie für die Reaktion stammt aus der Hydrolyse von GTP.

Für die Synthese von GMP wird IMP zuerst durch die IMP-Dehydrogenase zu Xanthosinmonophosphat (XMP) oxidiert (Abb. 10.6). Hierbei greift der Sauerstoff von einem H2O-Molekül am C-2-Atom an, Wasserstoffakzeptor ist NAD+. Der Sauerstoff der entstandenen Ketogruppe wird nun durch Übertragung einer AMP-Gruppe aktiviert und dann durch eine NH2-Gruppe (aus Glutamin) ersetzt. Katalysiert wird die Reaktion durch die GMP-Synthetase; die Energie stammt aus der Hydrolyse von ATP. Die GMP-Synthetase unterliegt einer Produkthemmung durch GMP.

Da die Adenylsuccinat-Synthetase GTP und die GMP-Synthetase ATP benötigt, sind die Synthesen beider Nukleotide aneinandergekoppelt.

.Synthese der Pyrimidinnukleotide
Synthese von Uridinmonophosphat (UMP)
Adenosinmonophosphat (AMP):PurinnukleotidsyntheseGuanosinmonophosphat (GMP):PurinnukleotidsyntheseBei Pyrimidinnukleotide:Syntheseder Uridinmonophosphat (UMP):PyrimidinsynthesePyrimidinnukleotidsynthese entsteht in mehreren enzymkatalysierten Schritten Uridin(-5'-)monophosphat (UMP) als primäres Endprodukt (Abb. 10.7):
  • 1.

    Carbamoylphosphat, die Ausgangssubstanz der Pyrimidinsynthese, entsteht durch Verknüpfung von Hydrogencarbonat (HCO3) mit Ammoniak (NH3) und anschließende Phosphorylierung. Katalysiert wird diese Reaktion von der Carbamoylphosphat-Synthetase II des Zytosols. NH3 stammt aus der Hydrolyse von Glutamin.

  • 2.

    Die Aspartat-Transcarbamoylase verbindet Carbamoylphosphat mit Aspartat zu Carbamoylaspartat. Dabei wird ein Molekül Phosphat frei.

  • 3.

    Katalysiert durch die Dihydroorotase zyklisiert das Carbamoylaspartat zu dem Sechsring Dihydroorotat.

  • 4.

    Die Orotat-Dehydrogenase oxidiert dieses Molekül zu Orotat. Dabei wird das Cosubstrat NAD+ zu NADH+H+ reduziert.

  • 5.

    Nun tritt PRPP hinzu: Katalysiert von der Pyrimidin-Phosphoribosyltransferase reagiert Orotat mit PRPP unter Abspaltung von Pyrophosphat zu Orotidin(-5'-)monophosphat (OMP, Orotidylat).

  • 6.

    Die Orotidylat-Decarboxylase (OMP-Decarboxylase) decarboxyliert OMP zu dem Nukleotid Uridin(-5'-)monophosphat (UMP, Uridylat), das die Base Uracil enthält.

Merke

Die Synthese der Pyrimidinnukleotide beginnt mit dem Aufbau des Monozyklus, der auf PRPP übertragen wird. Ausgangssubstanz ist Carbamoylphosphat, das auch Substrat der Harnstoffsynthese ist. Carbamoylphosphat entsteht

  • bei der Harnstoffsynthese im Lebermitochondrium aus NH4+ und HCO3 (sowie 2 ATP), katalysiert durch die Carbamoylphosphat-Synthetase I (Aktivator: N-Acetylglutamat).

  • bei der Pyrimidinsynthese im Zytoplasma aus der Aminogruppe am -C-Atom von Glutamin und HCO3 (sowie 2 ATP), katalysiert durch die Carbamoylphosphat-Synthetase II (Aktivator: PRPP, Inhibitor: UTP).

Cave

Die Carbamoylphosphat-Synthetase II der Pyrimidinsynthese im Zytosol, sollte nicht verwechselt werden mit der Carbamoylphosphat-Synthetase I aus dem Harnstoffzyklus des Leber-Mitochondriums!

Synthese von Cytidinmonophosphat (CTP) und Desoxythymidinmonophosphat (dTMP)
Für Desoxythymidinmonophosphat (dTMP):PyrimidinsyntheseCytidinmonophosphat (CTP):Pyrimidinsynthesedie Synthese von CTP (Abb. 10.8) wird UMP durch zweimalige Phosphorylierung in UTP umgewandelt. Am C-4-Atom des Pyrimidinrings wird durch die CTP-Synthetase der Keto-Sauerstoff gegen eine Aminogruppe ausgetauscht. Dafür wird das O-Atom durch Phosphorylierung aktiviert und die Phosphorylgruppe anschließend durch Ammoniak (aus der Hydrolyse von Glutamin) ersetzt.
Für die Synthese von dTMP (Abb. 10.8) wird UMP zu UDP phosphoryliert, das anschließend zu dUDP reduziert wird (unten). Durch Abspaltung eines Phosphatmoleküls entsteht dUMP. Die Thymidylat-Synthase methyliert dUMP am C5-Atom des Pyrimidinrings, wodurch dTMP entsteht. Donor der Methylgruppe ist (N5-N10-)Methylen-THF. Nach der Reaktion liegt es oxidiert als Dihydrofolat (DHF) vor und wird von der Dihydrofolat-Reduktase mithilfe von NADH+H+ wieder zu THF regeneriert. Aus THF lässt sich mit der Aminosäure Serin als Methylgruppen-Donor wieder Methylen-THF gewinnen.

Merke

Alle Ribonukleotide außer CTP liegen nach ihrer Synthese zunächst als Nukleosidmonophosphate vor. CTP entsteht aus UTP.

Alle Desoxyribonukleotide außer dTMP liegen nach ihrer Synthese zunächst als Nukleosiddiphosphate vor. dTMP entsteht aus dUMP.

Klinik

Hemmstoffe der Nukleotidsynthese lassen sich einteilen in Purin- bzw. Pyrimidinanaloga und in Folsäureantagonisten.

  • Das Purinanalogon Mercaptopurin hemmt Enzyme der Purinbiosynthese kompetitiv (z. B. die IMP-Dehydrogenase) und verhindert dadurch die DNA- und RNA-Synthese. Außerdem wird dieses Basenanalogon in Form von Mercaptopurinnukleotiden in die DNA eingebaut, was zu fehlerhafter Replikation führt.

  • Wichtige Pyrimidinanaloga sind 5-Fluorouracil (5-FU) und Cytosinarabinosid (Cytarabin). Das Basenanalogon 5-FU hemmt die Thymidylat-Synthase, blockiert also die dTMP-Synthese. Das Nukleosidanalogon Cytosinarabinosid enthält statt Ribose den Zucker Arabinose (unterschiedliche Stellung der OH-Gruppe am C-2-Atom), wodurch die DNA-Replikation gestört ist.

  • Folsäureantagonisten wie Methotrexat und Aminopterin hemmen die Dihydrofolat-Reduktase, die DHF in THF umwandelt. Die Purin- und Pyrimidinnukleotidsynthese, für die THF wichtiger Cofaktor ist, kommt zum Erliegen.

Alle drei Substanzklassen dienen als Zytostatika(10.8.2), d. h., sie hemmen die Zellteilung, vor allem von teilungsaktiven Zellen wie Tumorzellen. In der Gruppe der Zytostatika zählen diese Substanzen zu den Antimetaboliten, körperähnlichen Substanzen, die zu kompetitiver Hemmung von Enzymen oder zum Einbau falscher Moleküle führen.

Phosphorylierung der Ribonukleosidmonophosphate
RibonukleosidmonophosphateRibonukleosidmonophosphate werden durch einmalige Phosphorylierung zu -diphosphaten und durch zweimalige Phosphorylierung zu -triphosphaten. Benötigt werden die Enzyme
  • Nukleosidmonophosphat(NMP)-Kinase: Phosphorylierung zum Diphosphat, Cosubstrat ist ATP: NMP + ATP NDP + ADP.

  • Nukleosiddiphosphat(NDP)-Kinase: Phosphorylierung zum Triphosphat, Cosubstrat ist meist ATP, u. U. auch ein anderes Nukleosidtriphosphat: NDP + ATP NTP + ADP.

Merke

Die Adenylatkinase (AMP-Kinase) ist eine besonders wichtige NMP-Kinase. Sie katalysiert die Reaktion AMP + ATP 2 ADP. Nur aus ADP kann in Atmungskette und Glykolyse ATP regeneriert werden.

Diese Reaktion erklärt auch, warum die Umwandlung ATP AMP + PPi energetisch dem Verbrauch von zwei ATP entspricht.

Reduktion von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden

Durch die Ribonukleotid-Reduktase werden aus Ribonukleosidphosphaten Desoxyribonukleosidphosphate. Substrat des Enzyms sind ausschließlich Ribonukleosiddiphosphate. NMPs müssen also zunächst phosphoryliert werden.

  • Im aktiven Zentrum der Ribonukleotid-Reduktase befinden sich zwei SH-Gruppen (Cysteinylreste). Diese binden die 2'-OH-Gruppe der Ribose und reduzieren das 2'-C-Atom, indem sie zwei Elektronen und zwei H+ übertragen. Der Sauerstoff des 2'-C-Atoms wird als H2O abgespalten (Abb. 10.9). Die beiden Cysteinylreste werden dabei zu Schwefelradikalen, die sich zu einer Disulfidbrücke (S-S-Bindung) verbinden.

  • Zur Regeneration der Ribonukleotid-Reduktase in ihre reduzierte Form dient das Protein Thioredoxin, das eine noch stabilere S-S-Brücke als das Enzym ausbildet und die Enzym-Disulfidbrücke deshalb reduzieren kann.

  • Oxidiertes Thioredoxin wird über die Oxidation von FADH2 zu FAD in seine reduzierte Form überführt.

  • Durch die Oxidation von NADPH+H+ zu NADP+ wird FAD wieder zu FADH2 reduziert.

Die Gesamtbilanz der Reaktion ist:

Durch Phosphorylierung der dNDPs entstehen dNTPs, die Substrate der DNA-Synthese.

Funktion

Funktion der Ribonukleotide
Coenzyme (Cosubstrate)
Ribonukleotide:Reduktion

ATP ist ein wichtiges Coenzym der Kinasen (eine Phosphorylgruppe übertragende Transferasen), die durch Übertragen eines Phosphats z. B. zur Enzymregulation beitragen können (Interkonversion, 2.5).

Energielieferanten
Ribonukleotide:Funktion

ATP und andere NTPs enthalten energiereiche Bindungen und können unter Beteiligung von Transferasen (Tab. 10.2) Moleküle für anabole Stoffwechselwege aktivieren(1.2.5).

  • Zur Aktivierung über Phosphorylierung (Kinasen) wird ein von ATP stammendes Phosphat (oder Pyrophosphat) angehängt.

  • Aktivierung kann auch durch Verknüpfung mit Nukleosiden oder Nukleotiden erfolgen:

    • PAPS (Phosphoryladenosyl-Phosphosulfat) ist als aktiviertes Sulfat Coenzym der Sulfatasen.

    • UDP-Glucose (Uridindiphosphat-Glucose) ist die aktivierte Form der Glucose, die z. B. für den Einbau in Glykogen wichtig ist.

    • CDP-Cholin (Cytidinphosphat-Cholin) ist die aktivierte Form des Cholinphosphats und wird unter Abspaltung von CMP auf Akzeptoren übertragen. Durch Übertragung auf den Akzeptor Diacylglycerol (DAG) entsteht Phosphatidylcholin (Lecithin).

    • SAM (S-Adenosyl-Methionin) entsteht aus der Aminosäure Methionin und dient der Übertragung von Methylgruppen, z. B. auf Noradrenalin, wodurch Adrenalin entsteht.

Ligasen (Tab. 10.2) knüpfen unter ATP-Verbrauch thermodynamisch ungünstige Bindungen. Gemeinsam mit den Transferasen (oben) gewährleisten sie den anabolen Stoffwechsel. Auch manche Hydrolasen gewinnen durch Hydrolyse von ATP Energie, die zur Änderung ihrer Konformation führt. Sie ermöglichen unter anderem den aktiven Membrantransport durch Pumpen (z. B. Na+-K+-ATPase), sowie intrazelluläre Transportaktivitäten (z. B. Kinesin-ATPase) und Bewegungsvorgänge (z. B. Myosin-ATPase).

Signalmoleküle und Regulatoren

  • Zyklisches AMP (cAMP) und zyklisches GMP (cGMP) sind Second messenger(13.1.4). An-/Aus-Zustand regulatorischer G-Proteine ist an das GTP-Angebot gekoppelt, die Aktivität vieler Enzyme ist an das ATP- bzw. cAMP-Angebot gekoppelt.

Bausteine für Coenzyme

ATP bildet die Basis der Dinukleotid-Coenzyme NAD (Nikotinamid-adenin-dinukleotid), NADP (NAD-Phosphat) und FAD (Flavin-adenin-dinukleotid). Auch Coenzym A und Cobalamin enthalten einen AMP-Anteil.

Bausteine für die RNA(10.2.2)
Funktion der Desoxyribonukleotide

Desoxyribonukleotide sind Bausteine für die DNA(10.2.2), den Träger der Erbinformation.

Abbau und Wiederverwertung

DesoxyribonukleotideNukleotide werden häufig nicht komplett, sondern nur zu Nukleosiden oder zu Basen abgebaut, die dann zur Synthese neuer Nukleotide verwendet werden (Wiederverwertung Salvage pathway).
Abbau der Nukleotide zu Basen
Der Abbau aller Nukleotide beginnt aufNukleotide:Abbau der Stufe der Nukleosidmonophosphate.
Adenosinmonophosphate werden i. d. R. in IMP umgewandelt, das abgebaut wird:
  • AMP wird durch die AMP-Desaminase desaminiert. Es entsteht IMP (Abb. 10.10), das die Base Hypoxanthin enthält.

  • dAMP wird dephosphoryliert und anschließend von der Adenosin-Desaminase (ADA) zu Desoxyinosin desaminiert.

Die übrigen Nukleosidmonophosphate werden in zwei enzymkatalysierten Schritten direkt abgebaut:
  • Die Nukleotidase katalysiert die Hydrolyse des Monophosphats:

    • Nukleosidmonophosphat (z. B. IMP) + H2O Nukleosid (z. B. Inosin) + Pi

  • Die Spaltung der Bindung zwischen Zucker und Base erfolgt

    • hydrolytisch (Nukleosidase): Nukleosid (z. B. Cytidin) + H2O (Desoxy-)Ribose + Base (z. B. Cytosin)

    • phosphorolytisch (Nukleosid-Phosphorylase):Nukleosid (z. B. Desoxyguanosin) + Pi (Desoxy-)Ribose-1-P + Base (z. B. Guanin)

Abbau der Basen
Abbau der Purinbasen (Abb. 10.10)

  • Die Guanase katalysiert die Desaminierung von Guanin zu Xanthin. Xanthin entsteht ebenfalls bei der Oxidation von Hypoxanthin, katalysiert von der Xanthin-Oxidase.

  • Die Xanthin-Oxidase oxidiert in einem weiteren Schritt Xanthin zu Harnsäure. Der Donor des Sauerstoffatoms ist O2, dessen zweites Atom auf H2O übertragen wird. Dabei entsteht H2O2, das von Peroxidasen abgebaut wird. Die Xanthin-Oxidase ist eine Monooxygenase mit FAD als prosthetischer Gruppe.

Beim Menschen endet der Purinbasenabbau auf der Stufe der Harnsäure, die mit dem Urin ausgeschieden wird.

Cave

Nicht verwechseln:

Harnsäure ist das Ausscheidungsprodukt des Purinbasenabbaus.

Harnstoff das das Ausscheidungsprodukt des Aminosäureabbaus(7.4.3).

Abbau der Pyrimidinbasen
Purinbasen:Abbau

  • Cytosin wird zu Uracil desaminiert.

  • Uracil und Thymin werden mittels NADPH+H+ reduziert. Es entstehen Dihydrouracil und Dihydrothymin.

  • Die Ringsysteme werden zwischen N-3 und C-4 hydrolytisch gespalten.

  • Nun werden NH3 und CO2 abgespalten. Dabei entsteht

    • beim Uracilabbau -Alanin. Es wird zu Acetat, CO2 und NH3 abgebaut.

    • beim Thyminabbau -Aminoisobutyrat. Es wird zu Propionat, CO2 und NH3 abgebaut. Alternativ kann -Aminoisobutyrat zu Methylmalonyl-CoA transaminiert und oxidiert werden. Methylmalonyl-CoA kann in Succinyl-CoA umgewandelt werden, das in den Citratzyklus einfließt.

Wiederverwertung von Basen und Nukleosiden
Basen-Recycling
Pyrimidinbasen:Abbau

Bis zu 90 % der freien Purinbasen werden wiederverwendet und nicht abgebaut:

  • Die Adenin-Phosphoribosyl-Transferase überträgt Adenin auf PRPP, von dem Pyrophosphat abgespalten wird:

    • Adenin + PRPP AMP + PPi

  • Die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) katalysiert die Bildung von IMP und GMP aus PRPP und den entsprechenden Basen:

    • Guanin + PRPP GMP + PPi

    • Hypoxanthin + PRPP IMP + PPi

Es existiert auch eine Pyrimidin-Phosphoribosyltransferase, das Basen-Recycling spielt bei den weniger komplexen Pyrimidinen aber eine geringere Rolle.

Nukleosid-Recycling
Basen:Recycling

Die Adenosin-Kinase, die Guanosin-Kinase und die Uridin-Cytidin-Kinase phosphorylieren die entsprechenden Nukleoside, es entstehen die jeweiligen Nukleosidmonophosphate.

Pathobiochemie

Hyperurikämie und Gicht
Nukleosid:Recycling

Beim Menschen endet der Purinnukleotidabbau mit der Harnsäure. Durch verminderte Harnsäureausscheidung, Steigerung der Purinnukleotidsynthese und purinreiche Ernährung steigt der Harnsäurespiegel im Blut an (Hyperurikämie, bei Männern > 8 mg Harnsäure/dl Plasma, bei Frauen > 6 mg/dl). In verschiedenen Geweben fallen Urate (Salze der Harnsäure) aus, was zum Krankheitsbild der Gicht führt:

  • Arthritis urica: Natriumuratkristalle lagern sich in den Gelenken ab. Es kommt zu Entzündungsreaktionen.

  • Gichtnephropathie: Uratkristalle lagern sich in den Nierentubuli ab, was zu einer progredienten Niereninsuffizienz (Uratniere) führt.

Eine primäre Hyperurikämie beruht auf vererbten Stoffwechseldefekten, die zum Anstieg des Harnsäurespiegels führen, z. B.:

  • Polygen vererbte Verminderung der tubulären Harnsäuresekretion (ca. 75 % aller Fälle)

  • Fehlen von Salvage-Enzymen (z. B. HGPRT, unten Lesch-Nyhan-Syndrom)

  • Hyperaktivität der Xanthin-Oxidase

Eine sekundäre Hyperurikämie kann als Folge diverser Krankheiten entstehen:

  • Bei Niereninsuffizienz, Keto- und Lactatazidose ist die Harnsäureausscheidung vermindert.

  • Bei Psoriasis, Zytostatika- und Strahlentherapie sterben vermehrt Zellen ab, sodass vermehrt Purine anfallen.

  • Bei Erkrankungen des hämopoetischen Systems wie Leukämien oder Polycythaemia rubra vera ist die Purinnukleotidsynthese gesteigert, sodass auch mehr Purinnukleotide abgebaut werden müssen.

Die Therapie der Hyperurikämie besteht in

  • Reduktion der Purin-Zufuhr: Verzicht oder Einschränkung purinreicher Nahrungsmittel, vor allem von Innereien, aber auch von Fleisch, Fisch, Meeresfrüchten, Hülsenfrüchten und Spargel (Milch ist purinarm); nachhaltige Gewichtsreduktion; Alkoholverzicht, da Alkohol die tubuläre Harnsäuresekretion behindert; vermehrte Flüssigkeitszufuhr.

  • der Gabe von Medikamenten:

    • Urikostatika (z. B. Allopurinol) hemmen die Xanthin-Oxidase, d. h., die Harnsäure-Bildung wird unterdrückt und ihre Vorstufen Xanthin und Hypoxanthin werden renal eliminert.

    • Urikosurika (z. B. Probenezid) steigern die Harnsäureausscheidung, indem sie die tubuläre Rückresorption hemmen.

Lerntipp

Die Gicht und ihre Behandlung (vor allem durch Hemmung der Xanthin-Oxidase) sind ein sehr beliebtes Physikumsthema.

Lesch-Nyhan-Syndrom
Hyperurikämie Gicht

Ein X-chromosomal-rezessiv vererbter Defekt der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) stört die Wiederverwertung der Purinbasen und führt zu vermehrtem Basenabbau. Dadurch ist die Harnsäureproduktion erhöht, was zu primärer Hyperurikämie führt. Zusätzlich wird die De-novo-Synthese der Purinnukleotide stimuliert, was die Folgen des Defekts weiter verschlimmert:

  • Nierensteine und Gicht bereits im Säuglings- und Kindesalter

  • autoaggressives Verhalten, Spastik und geistige Behinderung

Adenosin-Desaminase-Mangel und SCID
Lesch-Nyhan-Syndrom

Bei homozygotem Adenosin-Desaminase-Mangel (ADA-Mangel) kann Desoxyadenosin nicht in Desoxyinosin umgewandelt werden. Desoxyadenosin reichert sich an und wird enzymatisch in dATP zurückverwandelt, das in höheren Konzentrationen für Zellen toxisch ist. Besonders betroffen sind Lymphozyten, die eine sehr hohe ADA-Aktivität aufweisen. Entscheidend ist hier vermutlich die Hemmung der Ribonukleotid-Reduktase durch dATP: die DNA-Synthese in B- und T-Zellen wird dadurch gehemmt, was zu einem schweren Immundefekt führt. Etwa 50 % der Patienten mit Severe-Combined-Immunodeficiency-Syndrom (SCID) weisen einen Adenosin-Desaminase-Mangel auf.

Nukleinsäuren

Definition und Struktur

Definition
Adenosin-Desaminase-MangelSCIDDie Nukleinsäuren NukleinsäurenDesoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) sind Polynukleotide. Sie liegen gehäuft im Zellkern (Nukleus) vor und sind aufgrund des Phosphorsäureanteils Säuren. Die DNA ist Träger der Erbinformation in Lebewesen. Die RNA erfüllt Aufgaben, die mit der Transkription und Translation zusammenhängen.
Struktur
Prinzip

Nukleinsäuren sind lange unverzweigte Polymere aus bis zu mehreren Millionen Nukleosidmonophosphaten (NMPs), die über Phosphodiesterbrücken miteinander verknüpft sind: Die 5'-OH-Gruppe des Zuckers eines NMPs ist über Phosphorsäure mit der 3'-OH-Gruppe des Zuckers des folgenden NMPs verbunden. Der Anfangspunkt der DNA weist eine 5'-OH-Gruppe mit gebundenem Phosphat auf, der Endpunkt eine freie 3'-OH-Gruppe. Die DNA hat also eine Richtung, sie ist polar. Die verknüpften Zucker bilden das Rückgrat der Nukleinsäure (Abb. 10.11), aus dem die Stickstoffbasen herausstehen. Die Reihenfolge dieser Basen enthält die genetische Information und ist für ein Polynukleotid charakteristisch: man kann ein Polynukleotid also eindeutig durch seine Basen darstellen, wobei man die Polarität beachtet und von 5'- in 3'-Richtung schreibt: ACGT und TGCA sind demnach verschiedene Moleküle.

Unterschiede zwischen DNA und RNA

RNA und DNA unterscheiden sich strukturell:

  • RNA enthält Ribose, DNA Desoxyribose: Die Desoxyribose ist gegenüber Hydrolyse stabiler als die RNA und eignet sich besser zur dauerhaften Informationsspeicherung.

  • RNA enthält die Base Uracil (U), DNA die Base Thymin (T).

  • RNA liegt i. d. R. als Einzelstrang, DNA i. d. R. als Doppelstrang vor.

Struktur der DNA

Die Struktur der DNA wurde durch James Watson und Francis Crick aufgeklärt. Die Doppelstrang-Bildung der DNA kommt durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Basen zweier gegenüberliegender DNA-Stränge zustande (Basenpaarung). Es paaren sich (Abb. 10.12):

  • Guanin und Cytosin

  • Adenin und Thymin

Lerntipp

Um sich zu merken, welche Basen miteinander paaren, kann man sich merken:

Die Runden zusammen (G & C) und die Kantigen zusammen (A & T).

Merke

Aufgrund der Basenpaarung lässt sich die Zusammensetzung einer DNA angeben, wenn man den Anteil eines Nukleotids kennt. Als Beispiel: Bekannt sei der Anteil von 30 % T. Daraus lässt sich erschließen: 30 % A, 20 % G und 20 % C.

Die beiden DNA-Stränge sind in einer Doppelhelix-Struktur um eine gemeinsame Achse, meist rechts herum, umeinander gewunden. In der rechtsgängigen Doppelhelix bilden die Wasserstoffbrückenbindungen einen 90-Winkel mit der Helixachse (B-Form der DNA). Nach ca. 10,6 bp (Basenpaaren) ist eine Drehung um 360 erreicht. Die Basen liegen im Inneren der Helix, das Rückgrat ist außen (Abb. 10.13). Aufgrund der Verdrillung der Stränge weist die DNA nach außen hin eine große und eine kleine Furche auf.

Ein DNA-Strang dient als Matrize für die mRNA-Synthese (kodogener Strang, []-Strang) und ist somit zur mRNA-Sequenz komplementär. Der gegenläufige Strang (kodierender Strang, [+]-Strang) hat Schutzfunktion und ermöglicht die DNA-Verdopplung.

Synthese

Prinzip

Nukleosidtriphosphate (dNTPs und NTPs) sind die Substrate der Nukleinsäuresynthese. Die Energie für die Knüpfung der Phosphodiesterbindung zwischen dNTPs/NTPs stammt aus der Abspaltung von Pyrophosphat PPi. Die anschließende hydrolytische Spaltung von PPi macht die Reaktion irreversibel(1.2.5).

Merke

RNA wird aus ATP, UTP, CTP und GTP, DNA aus dATP, dTTP, dCTP und dGTP unter Pyrophosphat-Abspaltung synthetisiert.

Ablauf
Nukleinsäuren:SyntheseKapitel. 10.3.5 und 10.3.6.

Abbau

Enzyme des Nukleinsäureabbaus heißen Nukleasen. Man unterscheidet DNasen (Desoxyribonukleasen) und RNasen (Ribonukleasen). Endonukleasen hydrolysieren eine Phosphodiesterbindung im Inneren der Polynukleotidkette, Exonukleasen spalten vom 3'- oder 5'-Ende der Kette ein Mononukleotid ab. Die Einsatzgebiete von Nukleasen im menschlichen Organismus sind vielfältig:

  • DNasen: Die Pankreas-DNase verdaut mit der Nahrung aufgenommene Nukleinsäuren im Darm. Die Caspase Activated DNase (CAD) verdaut die DNA von Zellen, die in Apoptose gehen. DNasen in den Lysosomen verdauen die DNA phagozytierter Mikroorganismen. Die eukaryontische DNA-Polymerase (10.3.5) verfügt über eine Exonuklease-Funktion.

  • RNasen: Die Pankreas-RNase verdaut mit der Nahrung aufgenommene Nukleinsäuren im Darm. Die alkalische RNase des Zytoplasmas reguliert über die Geschwindigkeit des RNA-Abbaus die Genexpression. Die Abbaugeschwindigkeit hängt dabei von der mRNA-Struktur/-Sequenz ab.

Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information

Nukleinsäuren:AbbauDNA ist der Träger genetischer Information. Vor jeder Zellteilung wird die DNA deshalb verdoppelt (Replikation) und bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. DNA-Abschnitte, die Informationen für Proteine enthalten, werden im Zellkern in Messenger-RNA (mRNA) umgeschrieben (Transkription). Im Zytosol dient die mRNA bei der Aneinanderreihung der Aminosäuren zum Polypeptid oder Protein (Translation) als Vorlage.

Die genetische Information: das Genom

Definition

Der Gesamt-DNA-Gehalt einer Zelle wird als Genom bezeichnet. Dazu gehören das Hauptgenom im Zellkern und das Nebengenom in den Mitochondrien. Jede Körperzelle enthält das ganze Genom.

Struktur

Die DNA liegt im Zellkern der diploiden Körperzelle in Form von 46 Chromosomen 23 Chromosomenpaaren vor: Je zwei Chromosomen sind homolog (ein väterliches und ein mütterliches als Ergebnis der geschlechtlichen Rekombination), d. h., sie besitzen die gleichen Gene. Ausnahme sind die Geschlechtschromosomen X und Y, die verschiedene Gene besitzen. Die Basensequenzen homologer Gene sind identisch oder weichen höchstens minimal voneinander ab. Genorte (Loci), die auf den homologen Chromosomen verschieden sind, werden Allele genannt.

Merke

Chromosomenmutationen (Chromosomenaberrationen) entstehen durch Chromosomenbrüche:

  • Duplikation: Ein Chromosomenabschnitt liegt auf einem Chromosom in zweifacher Ausführung vor, z. B. aufgrund ungleichen Crossing-overs bei der Meiose.

  • Deletion: Ein abgebrochener Chromosomenabschnitt fehlt.

  • Translokation: Der abgebrochene Chromosomenabschnitt ist in ein nichthomologes Chromosom integriert.

  • Inversion: Der abgebrochene Chromosomenabschnitt wurde verkehrt herum in das betroffene Chromosom integriert.

Da der Chromosomensatz der Körperzellen diploid ist, steht im Falle eines Gendefekts auf dem einen Chromosom das Gen auf dem homologen Chromosom noch zur Verfügung. Gendefekte auf einem der homologen Chromosomen bleiben deshalb bei rezessivem Erbgang einer Krankheit häufig ohne Folgen, jedoch kann sich der Funktionsverlust eines Gens auch dominant auswirken (sog. Haploinsuffizienz).

Die DNA der Chromosomen im Zellkern hätte im entwundenen Zustand eine Gesamtlänge von ca. zwei Metern und liegt deshalb komprimiert vor. Die wichtigsten Strukturproteine für die DNA-Verpackung sind die Histon-Proteine, kleine basische und daher positiv geladene Proteine (hoher Anteil an Lysin und Arginin). Diese werden an Ribosomen im Zytoplasma synthetisiert und anschließend in den Zellkern transportiert. Die Sequenz der Histon-Proteine ist stark konserviert, d. h., sie hat sich im Verlauf der Evolution kaum verändert. Die DNA-Doppelhelix wird in ca. 1,75 linksgängigen Windungen um ein Histon-Oktamer gewickelt, das aus je zwei der vier Histon-Proteinen H2A, H2B, H3 und H4 besteht. Die Interaktion zwischen der negativ geladenen DNA und den positiv geladenen Histonen beruht auf elektrostatischen Wechselwirkungen. Histon-Oktamer und die um ihn gewickelte DNA-Doppelhelix bezeichnet man als Nukleosom. Die durch die DNA verbundenen Nukleosomen bilden die Nukleosomenfaser, die sich über weitere Kondensationsstufen (Abb. 11.15) zu den Chromosomen der Metaphase organisiert. Die DNA und die mit ihr assoziierten Histon- und Nicht-Histon-Proteine werden als Chromatin bezeichnet. Die Histone sind an der Regulation der Genexpression beteiligt(10.3.10). Wenig transkribierte oder genfreie DNA-Abschnitte (Heterochromatin) sind besonders dicht um Histone gepackt, häufig transkribierte, genreiche DNA-Abschnitte (Euchromatin) sind weniger dicht gepackt.

Cave

Nicht vom Namen in die Irre führen lassen: Histone sind nicht reich an Histidin, sondern an Lysin und Arginin. Die positiv geladenen, basischen Aminosäuren sind die Grundlage der Bindung an die negativ geladene DNA.

Die kodierenden Einheiten: die Gene
Genom

Ein Gen ist allgemein formuliert eine kodierende Einheit auf dem DNA-Strang. Der Genbegriff wurde mit zunehmender wissenschaftlicher Erkenntnis schwerer zu fassen. So ist die Ein-Gen-ein-Protein-Hypothese überholt, weil sowohl verschiedene Gene am Aufbau eines einzigen Proteins beteiligt sein können als auch ein Gen verschiedene Proteine (u. a. durch alternatives Spleißen, 10.3.7) hervorbringen kann. Und schließlich sind auch DNA-Abschnitte, die für strukturelle RNA (z. B. die in Ribosomen enthaltene RNA) kodieren, Gene. Auf DNA-Ebene gibt es bestimmte Sequenzen, die ein Gen ausmachen. Ein eukaryontisches (und für ein Protein codierendes) Gen besitzt (Abb. 10.14):

  • eine Promotorsequenz: Diese Kontrollsequenz enthält die Ansatzstelle für die RNA-Polymerase (das Transkriptionsenzym) und ihre Cofaktoren, die Transkriptionsfaktoren.

  • ein Start-Codon(10.3.3): die ersten drei Basen, die translatiert werden. Diesen gehen jedoch Basen voraus, die transkribiert, aber nicht translatiert werden: die sog. 5'-untranslated region 5'-UTR. Sie hat regulatorische Funktion auf der mRNA.

  • ein Stopp-Codon(10.3.3): die ersten drei Basen, die nicht translatiert werden. Dem Stopp-Codon folgen weitere Basen, die transkribiert, aber nicht translatiert werden: die sog. 3'-untranslated region 3'-UTR. Sie hat regulatorische Funktion auf der mRNA.

  • einen Open reading frame (ORF, offenes Leseraster): Dies sind alle Basen zwischen Start- und Stopp-Codon. Sie werden in die primäre (unreife) mRNA transkribiert.

  • eine Terminatorregion. Hier endet die Transkription.

Ein Gen ist zudem oft eine Abfolge von Introns und Exons:

    • Exons: Basen, die sich in der reifen mRNA wiederfinden, d. h. die translatierten, kodierenden Basensequenzen plus die 5'- und 3'-UTR-Regionen

    • Introns: die nichttranslatierten, nichtkodierenden Basensequenzen zwischen den Exons. Sie werden zwar transkribiert, dann aber aus der primären RNA herausgeschnitten (Spleißen Splicing, 10.3.7). In reifer mRNA sind sie nicht mehr enthalten. Durch sog. alternatives Spleißen können zwei oder mehr verschiedene Polypeptide aus einem Gen hervorgehen.

Merke

Exons in der reifen mRNA enthaltene Sequenzen eines Gens (kodierende Bereiche + UTRs).

Introns Sequenzen zwischen den Exons, die zwar transkribiert, aber bei der RNA-Reifung durch Spleißen wieder entfernt werden.

Lerntipp

Der Begriff Exon steht für expressed region also den Teil eines Gens, der später als Protein exprimiert wird. Wenn man sich das merkt, ist man vor Verwechslung von Exon und Intron geschützt.

Mit eukaryontischen Genen sind außerdem Enhancer- und Silencer-Sequenzen assoziiert. Diese können in 5'-Richtung (upstream), in 3'-Richtung (downstream) oder innerhalb des Gens liegen. Sie können Gene aktivieren (Enhancer) oder hemmen (Silencer)(10.3.10).

Prokaryonten besitzen keine Introns, dafür liegen bei ihnen oft mehrere jeweils für ein Protein kodierende Einheiten auf einer einzigen mRNA (polycistronische Gene).

Statistik des menschlichen Genoms

Das menschliche Genom umfasst ca. 3,2 Milliarden Basenpaare und ca. 23.000 Gene, aus denen durch alternatives Spleißen vermutlich über 100.000 verschiedene Proteine hervorgehen können. Ca. 28 % der Basensequenzen des menschlichen Genoms werden in primäre RNA transkribiert und davon 5 % translatiert, d. h., nur ca. 1,5 % des menschlichen Genoms (ca. 45 Millionen Basen) sind kodierend. Kodierende Sequenzen kommen i. d. R. nur einmal im Genom vor (Ausnahme: Gene für tRNA und Histon-Proteine). Die nichtkodierenden ca. 98,5 % der Basensequenzen lassen sich unterteilen in:

  • Introns (ca. 26,5 % des Genoms): nichtkodierende Basensequenzen innerhalb der Gene

  • nichtkodierende Basensequenzen zwischen den Genen (Nonsense-Sequenzen, ca. 72 % des Genoms). Diese lassen sich einteilen in:

    • nichtrepetitiv (ca. 19 % des Genoms): Sequenz kommt nur einmal im Genom vor, z. B. spezifische Promotor- oder Enhancer-Sequenzen.

  • repetitiv (ca. 53 % des Genoms): Sequenz kommt mehrmals im Genom vor. Man unterscheidet zwischen hoch- (mehrere Millionenen Kopien) und niedrigrepetitiven (wenige Kopien), zwischen kurzen und langen sowie zwischen verstreut und aneinandergereiht (tandem-repeats) vorliegenden repetitiven Sequenzen. Gene für die rRNA liegen als tandem-repeats vor. Hochrepetitive, kurze tandem-repeats liegen in den Zentren und an den Enden der Chromosomen vor. Diese und andere genarme Chromosomenbereiche bilden das Heterochromatin, das im Gegensatz zum genreichen Euchromatin stark kondensiert ist (oben: Struktur). Heterochromatin (dunkel) und Euchromatin (hell) ergeben nach Färbung die charakteristischen Bandenmuster auf den Chromosomen. Repetitive Sequenzen sind bei genetischen Untersuchungen von Bedeutung(10.5.2). Veränderungen repetitiver Sequenzen können Krankheiten hervorrufen. In prokaryontischen Genomen fehlen repetitive Sequenzen.

Merke

Das menschliche Genom umfasst:

  • 46 Chromosomen (23 Chromosomenpaare)

  • ca. 23.000 Gene

  • ca. 3,2 Milliarden Basenpaare

  • kodierende (ca. 1,5 %) und nichtkodierende (ca. 98,5 %) Basensequenzen

  • repetitive und nichtrepetitive Basensequenzen

Der Fluss der genetischen Information

Bei Eukaryonten liegt das Hauptgenom im Zellkern vor, die Ribosomen als Orte der Proteinbiosynthese befinden sich jedoch im Zytoplasma. Als Boten fungieren die Messenger-RNAs (mRNAs), die auch in den zellkernlosen Prokaryonten als Zwischenschritt dienen. Bei der Transkription wird unter Verwendung eines DNA-Strangs als Matrize die einzelsträngige mRNA durch die RNA-Polymerase hergestellt(10.3.6). Auf Basis der ins Zytoplasma transportierten mRNA erfolgt an den Ribosomen die Proteinbiosynthese: die als Translation(10.3.8) bezeichnete Übersetzung der mRNA in die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins gemäß den Regeln des genetischen Codes. Das Dogma vom Fluss der genetischen Information lautet:
DNA mRNA Protein.

Lerntipp

Den Fluss der genetischen Information kann man sich wie ein Rezeptbuch vorstellen: Das Genom stellt das gut gehütete Rezeptbuch des Lebens dar, das in Form von DNA geschrieben ist. Aus diesem werden nun einzelne Rezepte herausgeschrieben (Transkription) und dann noch etwas modifiziert. Diese Rezeptblätter werden als mRNA geschrieben. Nun wird das Rezept nachgekocht (Translation), es entsteht fertiges Protein.

Der Schlüssel zur genetischen Information: der genetische Code

Definition

Die Aminosäuresequenz von Polypeptiden ist in der DNA-Sequenz verschlüsselt. Die vier DNA-Buchstaben A, T, C, G müssen deshalb die 20 proteinogenen Aminosäuren abbilden können. Die Übersetzung von DNA in Polypeptid erfolgt nach den Regeln des genetischen Codes.

Eigenschaften

Vier Nukleinbasen-Buchstaben müssen 20 Aminosäure-Buchstaben abbilden können. Dies ermöglicht der genetische Triplett-Code, d. h., die kodierenden Einheiten sind Basentripletts. Drei Basen können 43, also 64 Buchstaben kodieren. Substrat des Ribosoms sind aber nur 20 verschiedene Aminosäuren. Trotzdem kommen alle 64 möglichen Tripletts im Genom vor (Tab. 10.3). Dabei stehen für eine Aminosäure bis zu sechs verschiedene Tripletts (Synonyme) zur Verfügung, die sich meist nur im dritten Buchstaben unterscheiden. Für Tryptophan (TGG) und Methionin (ATG) existiert jeweils nur ein Triplett. Aufgrund der zahlreichen Synonyme enthält der genetische Code nicht das Maximum an Information (64 Aminosäuren), man bezeichnet ihn als degeneriert. Aufgrund der Synonyme ist der Code nur in eine Richtung, nämlich DNA Polypeptid, eindeutig.

Durch äußere Einflüsse (z. B. Strahlung), Replikationsfehler oder spontane Reaktionen können die DNA-Basen mutieren. Wird eine Base durch eine andere ersetzt, liegt eine Substitution oder Punktmutation(10.3.4) vor. Eine Substitution der letzten Base eines Tripletts ist häufig ohne Bedeutung, die Degeneration des Codes wirkt sich auf die Eigenschaften des kodierten Polypeptids konservativ aus. Auch eine Substitution der ersten Base ist oft nicht schwerwiegend, da der Charakter der Aminosäure (hydrophob, hydrophil, amphiphil) meist erhalten bleibt. Bei Ausfall einer Base allerdings verschiebt sich das gesamte Leseraster, da der genetische Code ohne Punkt und Komma auskommen muss. Der genetische Code gilt für alle Lebewesen, er ist universell.

Es gibt Codons, die nicht für eine Aminosäure, sondern für das Ende der Translation stehen. Gelangt das Ribosom an diese Stelle, dissoziiert es von der mRNA ab, ohne eine Aminosäure andas Polypeptid anzufügen. Stopp-Codons sind TGA, TAA und TAG bzw. in RNA-Sprache UGA, UAA und UAG. Dagegen gibt es (bei Eukaryonten) nur ein Start-Codon als Ansatzstelle des Ribosoms, nämlich ATG (DNA) bzw. AUG (RNA). Das Start-Codon kodiert für die Aminosäure Methionin, auch innerhalb der Sequenz. Ein echtes Start-Codon wird dem Ribosom deshalb durch vor AUG liegende Nukleotide angekündigt. Jedes am Ribosom entstehende Polypeptid beginnt mit Methionin. Dem gereiften Protein fehlt diese Start-Aminosäure jedoch häufig.

Cave

Der Begriff Stopp-Codon bezieht sich nur auf die Translation (keine passende Aminosäure). Die Transkription erfolgt über das Stopp-Codon hinaus. Entsprechendes gilt für das Start-Codon (Ansatzstelle des Ribosoms): Die Transkription beginnt vor dem Start-Codon.

genetische Code

Merke

Der genetische Code ist

  • ein Triplett-Code ohne Punkt und Komma.

  • degeneriert: Zu den meisten Aminosäuren gibt es mehrere Codons.

  • eindeutig: Zu jedem Codon gibt es nur eine Aminosäure.

  • konservativ: Die Tripletts sind relativ gut gegen Basen-Austausch geschützt.

  • universell: Alle irdischen Lebewesen benutzen ihn.

Lerntipp

Um sich die Start- und Stoppsequenzen zu merken, helfen folgende Merksprüche:

Start:

AUf Geht's AUG (codiert gleichzeitig für Methionin)

Stopp:

yoU Go Away UGA

yoU Are Away UAA

yoU Are Gone UAG

Klinik

Am gefährlichsten ist ein Austausch der zweiten Base des Tripletts, da hierdurch z. B. eine hydrophobe Aminosäure durch eine hydrophile ersetzt werden kann. Dies kann die Struktur und Eigenschaften des Proteins verändern. Beispiel hierfür ist die Sichelzellanämie: Durch Umwandlung des Tripletts GAG in GTG wird die polare Aminosäure Glutamat durch die unpolare Aminosäure Valin ersetzt. Es entsteht ein verändertes Hämoglobin, das den Erythrozyten Sichelzellform verleiht. Die starren Sichelzellen können bei Homozygoten Gefäße verschließen und zu Organinfarkten führen.

Mutationen, ihre Auswirkungen auf den genetischen Code und ihre Reparatur

Eine Stärke und Schwäche zugleich der DNA liegt in ihrer MutationenFähigkeit zu mutieren. Einerseits sind Mutationen die Grundlage der Evolution. Andererseits sind Mutationen für viele Erkrankungen verantwortlich, z. B. Krebserkrankungen.
Mutationsformen
Man unterscheidet Chromosomenmutationen (verändern das Erscheinungsbild eines Chromosoms) und Genmutationen (beschränken sich auf ein Gen).
Chromosomenmutationen(10.3.1)
Genmutationen

Von Bedeutung sind Mutationen innerhalb der kodierenden Regionen, die beim Menschen ca. 1,5 % der DNA ausmachen, aber auch Mutationen innerhalb der nichttranslatierten regulatorischen Bereiche.

Substitution

Bei der Substitution wird eine Base durch eine andere ersetzt. Eine einzelne Substitution (Punktmutation) verändert ein Codon. Dank der Degeneration des genetischen Codes wird trotz der Punktmutation meist die kodierte Aminosäure oder eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften in das Polypeptid eingebaut (Missense-Mutation). Der Einbau einer anderen Aminosäure mit entgegengesetzten Eigenschaften dagegen (Sichelzellanämie, 10.3.3) oder die Bildung eines Stopp-Codons (Nonsense-Mutation) hat schwere Folgen.

Man unterscheidet:

  • Transition: eine Purinbase wird durch eine andere Purinbase ersetzt (A durch G oder umgekehrt) bzw. eine Pyrimidinbase durch eine andere Pyrimidinbase (C durch T oder umgekehrt).

  • Transversion: Austausch einer Purinbase (A, G) durch eine Pyrimidinbase (T, C).

Insertion und Deletion
Mutationen:Genmutationen Mutationen:Chromosomenmutationen

Bei der Insertion ( Addition) werden eine oder mehrere Basen in die Basensequenz eingefügt, bei der Deletion aus ihr entfernt. Beide Mutationsformen sind gefährlicher als die Substitution: Beträgt die Zahl der hinzugefügten oder entfernten Basen nicht drei oder ein Vielfaches von drei, kommt es zu einer Leseraster-Verschiebung innerhalb des Gens (Rasterschubmutationen Frameshifts). Dadurch werden alle Basentripletts, die der Rasterschubmutation folgen, falsch translatiert.

Mutationsursachen

Mutationen können durch externe Faktoren (Mutagene: chemische oder physikalische Faktoren, Mikroorganismen) oder spontan auftreten.

Chemische Mutagene sind:

  • Basenanaloga: 5-Bromuracil und 2-Aminopurin werden anstelle von Thymin bzw. Adenin in die DNA eingebaut. 5-Bromuracil paart beim nächsten Replikationszyklus mit Guanin statt mit Adenin (stabileres Tautomer, unten), 2-Aminopurin mit Cytosin statt mit Thymin. Es kommt zu ATGC-Transitionen.

  • desaminierende Reagenzien: Salpetrige Säure (HNO2) bewirkt Transitionen, indem sie mit Basen reagiert, die Aminogruppen enthalten. HNO2 desaminiert Cytosin oxidativ zu Uracil, das mit Adenin statt mit Guanin paart.

  • alkylierende Reagenzien: Sie führen zusätzliche Alkylgruppen in die Basen ein. Ethylmethansulfonat (EMS) erzeugt Transitionen, indem es eine Ethylgruppe an das N-7-Atom des Guanins hängt, das dann mit Thymin statt mit Cytosin paart. Benzopyren (aus Zigarettenrauch) wird im Körper in ein gefährliches Alkylans umgewandelt. Zu den Alkylanzien zählen auch bestimmte Pestizide und Kampfgase wie Lost (Senfgas), welches außerdem eine DNA-Quervernetzung bewirkt.

  • hydroxylierende Reagenzien: Hydroxylamin wandelt die Aminogruppe von Cytosin in eine Hydroxylaminogruppe um.

  • interkalierende Substanzen: Dies sind oligozyklische aromatische Verbindungen wie Ethidiumbromid (im Laboralltag) oder Actinomycin (ein Pilzgift). Sie schieben sich zwischen benachbarten Basenpaaren in die DNA ein. Das beeinträchtigt die Replikation und führt zu Insertionen oder Deletionen (mögliche Rasterverschiebung).

  • bestimmte anorganische Substanzen wie Arsen, Blei, Asbest und Chromat. (Asbest gilt als nicht gentoxisches Kanzerogen, d. h., es wirkt indirekt, indem es u. a. über Entzündung zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führt.)

  • sonstige Substanzen, z. B. Nitrosamine lösen alkylierende Prozesse aus, Aflatoxine (Pilzgifte) können durch kovalente Bindung an die DNA die Replikation stören. Weitere Substanzen führen über die Bildung freier Radikale zu DNA-Schäden.

Physikalische Mutagene sind

  • UV-Strahlung: Sie kann über kovalente Verknüpfung zweier benachbarter Thyminbasen ein Thymindimer hervorrufen. Dadurch entsteht ein Cyclobutanring als neues Strukturelement, das zu fehlerhafter Replikation führt. Durch körpereigene Enzyme kann die Reaktion rückgängig gemacht werden (unten).

  • ionisierende (radioaktive) (-, -, -)Strahlung: Sie kann alle Mutationsarten bis hin zu Chromosomenmutationen hervorrufen. Oft wirkt sie nicht unmittelbar auf die DNA ein, sondern generiert in den Zellen Radikale, die mit der DNA reagieren.

Biologische Mutagene sind vor allem Tumorviren(10.8.1) und springende genetische Elemente (Transposons).

Spontane Mutationen treten auf bei:

  • Tautomerisierungen: Dies sind Isomerisierungen, bei denen nur Protonen bzw. Doppelbindungen verschoben werden. Hierbei können vorübergehend leicht veränderte Basenformen (Enol-/Laktimform statt Keto-/Laktamform) entstehen, die bei der Replikation anomale Basenpaarungen ausbilden (z. B. AEnol-C).

  • thermischer Depurinierung: Dies ist die spontane Spaltung der N-glykosidischen Bindung zwischen Purinbase und Desoxyribose. Sie tritt ca. 5000-mal pro Zelle und Tag auf, kann aber in der Regel repariert werden (unten, Reparaturmaßnahmen).

  • Problemen während der Zellteilung: Sie können zu Chromosomenmutationen(10.3.1) führen.

  • Einbau falscher Nukleotide durch die DNA-Polymerase bei der DNA-Replikation: Dies kann trotz der Proofreading-Aktivität der DNA-Polymerase nicht komplett ausgeschlossen werden.

  • Basen-Alkylierungen und Desaminierung: Diese erfolgen auch spontan, erstere z. B. mehrere hundert Mal pro Zelle und Tag, können aber i. d. R. repariert werden.

Merke

Mutationen werden durch exogene chemische, physikalische oder biologische Faktoren verursacht oder entstehen spontan. Vor allem Mutationen in Genen, die die Zellproliferation kontrollieren, können krebserregend sein(10.8). Mutagene sind deshalb potenzielle Kanzerogene.

Reparaturmechanismen
Mutationen:Ursachen

Aufgrund der Mutationen, denen die DNA ausgesetzt ist, sind wirksame Reparaturmaßnahmen nötig. Menschen mit Defekten an Genen, die für Reparaturenzyme kodieren, sind einem erhöhten Krebsrisiko ausgesetzt. Es existieren verschiedene Reparaturmechanismen:

  • Direkte Reparatur: Das Enzym DNA-Photolyase (Bakterien, Pflanzen, Tiere; Aktivität beim Menschen nicht nachgewiesen) beseitigt durch photochemische Spaltung direkt das durch UV-Strahlung hervorgerufene Thymindimer. Photochemisch bedeutet, dass das Enzym seine Energie durch Photonen gewinnt. Daneben gibt es weitere Enzyme der direkten DNA-Reparatur, die auch der Mensch besitzt, z. B. ein Enzym, das die Alkylierung von Guanin rückgängig macht.

  • Basenexzisionsreparatur: Ein Reparatur-Enzymkomplex erkennt eine veränderte Base und schneidet sie heraus, wobei ein Desoxyribosephosphat-Rumpf erhalten bleibt. Eine 5'3'-Endonuklease öffnet den DNA-Einzelstrang vor dem Rumpf, eine 5'3'-Exonuklease schneidet ihn heraus. Daraufhin fügt eine DNA-Polymerase das Nukleotid mit der korrekten Base ein. Eine Ligase schließt den Strang.

  • Nukleotidexzisionsreparatur: Kurze DNA-Sequenzen (bis 32 Nukleotide) können herausgeschnitten und anhand der Basen des komplementären DNA-Strangs korrekt ersetzt werden.

  • Postreplikationsreparatur: Bei der Replikation wird die fehlerhafte Stelle umgangen, dann erfolgt die Reparatur auf Grundlage des homologen Chromosoms. Der Mechanismus ist relativ fehleranfällig.

  • Reparatur von Doppelstrangbrüchen: Zwei Reparatursysteme sind untersucht. Das eine basiert auf Information vom homologen Chromosom, das andere verbindet freie DNA-Enden so, wie sie sind (NHEJ non-homologous end joining).

Merke

Angesichts des Mutationsrisikos der DNA kann ein Organismus nur mit DNA-Reparaturmechanismen überleben. Man unterscheidet direkte Reparatur, Basenexzisions- und Nukleotidexzisionsreparatur sowie Postreplikationsreparatur und die Reparatur von Doppelstrangbrüchen.

Klinik

Xeroderma pigmentosum wird durch Defekte der DNA-Reparaturmechanismen ausgelöst. Es wird autosomal-rezessiv vererbt. Mehr als zehn Gendefekte, vor allem von Genen für Enzyme der Exzisionsreparatur (Erkennung, Repair-Endonuklease, Repair-Exonuklease, Repair-Polymerase) sind bekannt, die das Syndrom auslösen können. Vor allem UV-Schäden der DNA können so nicht repariert werden. Die Betroffenen neigen schon nach kurzer Sonnenlichtexposition zu Sonnenbrand, Hautentzündungen, Hauttrockenheit, Hyperpigmentierung und warzenartigen Gebilden. Durch die Gefahr von Hauttumoren ab frühester Kindheit ist die Lebenserwartung stark eingeschränkt. Die derzeit einzige Therapie besteht in kompletter Vermeidung von Sonnenlicht (jedoch nicht von Mondlicht Mondscheinkinder) sowie regelmäßigen Krebsvorsorgeuntersuchungen.

Ataxia teleangiectatica (Louis-Bar-Syndrom) wird ebenfalls autosomal-rezessiv vererbt. Ursache ist ein Defekt des ATM-Gens (Ataxia-teleangiectatica-Mutations-Gen), das für die ATM-Proteinkinase kodiert. Dieses Enzym wird bei strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen aktiviert und phosphoryliert daraufhin verschiedene Proteine, u. a. DNA-Reparaturenzyme. Die ATM-Mutation führt zu erhöhter Strahlenempfindlichkeit und Krebsgefahr. Weitere Symptome sind Erweiterung der Kapillaren (Tel[e]angiektasie), Schädigung der Haut und des Gehirns (Ataxie) sowie ein Mangel an IgG und IgA.

Die Replikation der DNA

Prinzip
Mutationen:Reparaturmechanismen

Vor jeder Zellteilung muss die DNA verdoppelt, also repliziert, werden. Dies erfolgt in der S-Phase des Zellzyklus. Der Replikationsmechanismus von Pro- und Eukaryonten ist sehr ähnlich, der eukaryontische jedoch komplexer. Den DNA-Abschnitt, der in einem Stück repliziert wird, bezeichnet man als Replikon. Bakterien besitzen nur ein Replikon: Ihre gesamte DNA wird in einem Stück repliziert. Das ringförmige Bakteriengenom besitzt nur einen Replikations-Startpunkt (Origin of replication, ORI). Die Chromosomen der Eukaryonten verfügen über viele Replika und ORIs (ca. 6.000 pro Chromosom). Nur durch gleichzeitige Replikation an vielen Replika können die Chromosomen ausreichend schnell repliziert werden. Ein Bakterium wie E. coli kann sein Genom in ca. 40 Minuten replizieren. Die menschliche Zelle benötigt mehrere Stunden.

Das Prinzip der DNA-Replikation ist einfach: Die DNA-Stränge der DNA-Doppelhelix werden getrennt, die komplementären Basen der Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) binden an jeden Strang und werden unter Pyrophosphat-Abspaltung verbunden. Bei Prokaryonten vollzieht sich die Replikation von einem ORI aus in einer Struktur, die man Replikationsgabel nennt. Bei Eukaryonten findet die Replikation von einem ORI aus bidirektional statt, d. h., es bildet sich eine Öffnung (Replikationsblase), in der die DNA-replizierenden Enzyme in beide Richtungen über das Replikon wandern (Abb. 10.15).

Ablauf
Die Replikation innerhalb der Chromosomen
Replikation

Sie erfolgt in drei Schritten: Initiation (Vorbereitung und Start), Elongation (Kettenverlängerung) und Termination (Stopp).

Initiation

DNA-bindende Proteine leiten an einem ORI die Replikation ein. Bei Eukaryonten bilden Lizenzfaktoren und weitere Moleküle einen Präreplikationskomplex aus. Das Enzym Helikase entwindet ATP-abhängig den DNA-Doppelstrang am ORI, die Replikation findet von hier aus bidirektional statt mit zwei sog. Replikationsgabeln und einer Replikationsblase dazwischen (Abb. 10.15). Helikasen schieben die Replikationsgabeln ATP-abhängig über das Replikon vorwärts weiter. Die Replikationsgabel wird über Single strand binding proteins (SSBPs) stabilisiert, die unkontrollierte Basenpaarungen verhindern.

Die Entwindung der DNA-Doppelstränge an der Replikationsblase führt in den benachbarten DNA-Abschnitten zu übermäßiger Verdrillung. Es entsteht eine Spannung im DNA-Molekül. Um diese zu lösen, führt die Topoisomerase II ATP-abhängig eine negative Superspiralisierung in die DNA ein: Sie durchtrennt den DNA-Doppelstrang (Abb. 10.15), zieht eine andere Stelle des Doppelstrangs durch dieses Tor hindurch und schließt den Strangbruch wieder. Das Enzym Topoisomerase I sorgt hinterher über einen Einzelstrangbruch, DNA-Umorganisation und anschließende Heilung des Bruchs für die Entspannung der negativen Superspiralisierung – ein thermodynamisch begünstigter Vorgang, der kein ATP benötigt. Topoisomerasen können Phosphodiesterbindungen innerhalb eines DNA-Strangs spalten und wieder knüpfen. Durch das Zusammenspiel der beiden entgegengesetzt wirkenden Topoisomerasen wird eine optimale Anpassung der DNA-Spiralisierung erreicht. DNA-Polymerasen synthetisieren die DNA-Tochterstränge. Sie fügen an eine freie 3'-OH-Gruppe eines dNTPs unter Pyrophosphat-Abspaltung die Phosphatgruppe am 5'-C-Atom eines anderen dNTPs an. Für den DNA-Ketten-Start benötigen sie ein kurzes Nukleinsäurestück, den Primer, der am 3'-Ende eine freie 3'-OH-Gruppe aufweist. Der Primer wird von der DNA-abhängigen RNA-Polymerase Primase (bei Eukaryonten eine Untereinheit der Starter-DNA-Polymerase , unten) hergestellt. Sie synthetisiert de novo eine kurze RNA-Sequenz komplementär zum DNA-Elternstrang am ORI. Dieser Primer lagert sich über RNA/DNA-Hybridisierung komplementär an die DNA-Sequenz an.

Lerntipp

Topoisomerase II: Doppelstrangbruch (ATP-abhängig)

Topoisomerase I: Einzelstrangbruch

Elongation

Diese beginnt mit dem Anfügen von dNTPs an das 3'-Ende des Primers durch die DNA-Polymerase. Jeder neu entstehende DNA-Doppelstrang besteht aus einem Elternstrang und einem neu synthetisierten Tochterstrang, man bezeichnet die DNA-Replikation als semikonservativ (die Hälfte wird erhalten). Bei Prokaryonten werden die Tochterstränge vom Primer ausgehend von der DNA-Polymerase III synthetisiert. Bei Eukaryonten wird das Anfangsstück (die ersten ca. 20 an den Primer angehängten dNTPs) von der DNA-Polymerase synthetisiert, der Rest wird von der schnelleren DNA-Polymerase gebildet. Die DNA-Polymerase besitzt neben der 5'3'-DNA-Polymerase-Funktion eine Proofreading-Funktion: Sie überprüft die Korrektheit der zuletzt eingefügten Base. Eine 3'5'-Exonuklease-Untereinheit schneidet dabei eine unkorrekte Base wieder heraus, die durch eine korrekte ersetzt wird. Bei den Prokaryonten besitzen DNA-Polymerase I und III Proofreading- und damit 3'5'-Exonuklease-Funktion. Während der Elongation ist ein DNA-Polymerase-Dimer (Abb. 10.16) aktiv. An jedem Elternstrang findet sich ein katalytisches Zentrum. Die Synthese des einen Tochterstrangs ist ungleich schwerer als die des anderen:

Synthese des Leitstrangs ( Führungsstrangs): Der eine Elternstrang verläuft in 3'5'-Richtung. Der Tochterstrang muss in umgekehrter Richtung synthetisiert werden, nämlich von 5'3'. Dies passt zur 5'3'-Syntheserichtung der DNA-Polymerase, die die Phosphatgruppe am 5'-C-Atom des neu hinzukommenden Nukleotids mit der freien 3'-OH-Gruppe am 3'-Ende eines Nukleotidstrangs verknüpft (Abb. 10.17). Der in 5'3'-Richtung verlaufende Tochterstrang, der Leit- oder Führungsstrang, wird kontinuierlich synthetisiert.

Synthese des Folgestrangs ( Verzögerungsstrangs): Der andere Elternstrang verläuft in 5'3'-Richtung, die Synthese des komplementären Tochterstrangs müsste also in 3'5'-Richtung erfolgen. Dies ist nicht möglich, da weder die Polynukleotidkette am 5'- noch dNTPs am 3'-Ende aktiviert sind. Deshalb werden bei der Synthese dieses Folgestrangs multiple Primer eingesetzt: Die Primase (Prokaryonten) bzw. die Primase-Untereinheit der eukaryontischen DNA-Polymerase synthetisiert kurze, zum Elternstrang komplementäre RNA-Stücke, an deren freie 3'-OH-Gruppe die DNA-Polymerase III (Prokaryonten) bzw. die Polymerase-Domäne der DNA-Polymerase (Eukaryonten) dNTPs anhängt. Bei Eukaryonten erfolgt nach ca. 20 dNTPs ein Wechsel zur DNA-Polymerase .

Damit die Wachstumsrichtung dabei nicht in die falsche Richtung weist, führt die Replikationsgabel in den Folgestrang eine Schleife ein (Abb. 10.18).

Ausgehend vom Primer hängt die Polymerase mehrere tausend dNTPs aneinander. Bei Prokaryonten stellt sie ihre Tätigkeit ein, noch bevor sie auf den Primer des vorangegangenen Fragments stößt. Die DNA-Polymerase I schließt diese Lücke. Bei Eukaryonten bleibt der Abschnitt mit dem DNA-Polymerase--Dimer verbunden, bis die Polymerase auf den Primer des zuvor synthetisierten Fragments trifft. Eine DNA-Polymerase mit 5'3'-Exonukleaseaktivität entfernt den Primer. Dies ist bei Prokaryonten die DNA-Polymerase I (RNAse-H-Funktion), bei Eukaryonten die DNA-Polymerase . Dieselben Enzyme füllen die entstandene Lücke mit dNTPs, und eine DNA-Ligase (Termination) verknüpft die DNA-Fragmente. Der Vorgang wiederholt sich: Der folgende noch nicht replizierte Abschnitt des Elternstrangs bildet eine neue Schleife im Enzym und die Primase synthetisiert einen neuen komplementären Primer. Der Folgestrang wird also diskontinuierlich (in 5'3'-Richtung) synthetisiert (Abb. 10.16). Die Fragmente des Folgestrangs, die noch nicht mit dem bereits fertigen Teil der Tochterstrang-DNA verbunden sind, heißen nach ihrem Entdecker Okazaki-Fragmente.

Merke

Die prokaryontischen DNA-Polymerasen I und III sowie die eukaryontische DNA-Polymerase (indirekt auch ) besitzen eine Proofreading-Funktion, die die Korrektheit der zuletzt eingefügten Base überprüft. Eine 3'5'-Exonuklease-Untereinheit schneidet eine als unkorrekt erkannte Base wieder heraus, die sofort durch eine korrekte ersetzt wird. Dies gilt für Leit- und Folgestrang.

Termination

Bei Prokaryonten erreicht die Replikationsgabel aufgrund der ringförmigen DNA wieder den ORI und trifft dort auf den Primer des Leitstrangs. Bei Eukaryonten treffen die Replikationsgabeln auf dem Leitstrang auf den Primer des Nachbarreplikons. Eine 5'3'-Exonuklease schneidet den Primer ab. Die entstehende Lücke wird in 5'3'-Richtung gefüllt. Bei Prokaryonten erledigt beides die DNA-Polymerase I. Eine DNA-Ligase schließt bei Prokaryonten den DNA-Ring und verknüpft bei Eukaryonten die einzelnen Replika. Das DNA-Ende, das mit dem Primer verknüpft war, trägt am 5'-C-Atom keine Phosphatgruppe mehr, sodass keine Phosphodiesterbindung geknüpft werden kann. Um dieses Problem zu lösen, spaltet die Ligase ATP, überträgt AMP auf die 5'-OH-Gruppe und ligiert die beiden DNA-Enden unter AMP-Abspaltung.

Zusammenfassung

Tab. 10.4 zeigt alle an der Replikation beteiligten Enzyme und Proteine in chronologischer Reihenfolge.

Die Replikation an den Chromosomen-Enden
Bei der eukaryontischen Replikation tritt am 3'-Ende jedes Elternstrangs ein Problem auf: Die Lücke, die der abgespaltene Primer im Tochterstrang hinterlassen hat, kann nicht gefüllt werden, da keine 3'-OH-Gruppe vorliegt. Am 5'-Ende des Tochterstrangs (Leit- und Folgestrang) fehlt also im Vergleich zum korrespondierenden 3'-Ende des Elternstrangs ein Stück. Dennoch geht bei der Replikation der Chromosomenenden keine wichtige Information verloren, denn diese enthalten nichtkodierende hochrepetitive TTAGGG-Sequenzen, die Telomere. Nach ca. 40 Zellteilungen sind die Telomere somatischer Zellen in vitro aufgebraucht und die Zelle verliert ihre Teilungsfähigkeit (zelluläre Seneszenz). Dies ist für somatische Zellen offenbar gewollt (evtl. Verhinderung von Krebsentstehung, da sich mit multiplen Teilungen Fehler anhäufen können), u. a. in Keimbahnzellen jedoch nicht. Hier kommt mit der Telomerase ein besonderes Enzym ins Spiel, das die Telomere wieder verlängern kann. Sie nutzt dafür eine interne RNA-Sequenz als Matrize und ist somit eine reverse Transkriptase(10.3.11, HIV). Aktive Telomerase ist in embryonalen Zellen, Keimgeweben, manchen Stammzellen und oft in Tumorzellen nachzuweisen. Von der Erforschung der Telomerase erhofft man sich u. a. Ansätze zur Krebstherapie.
Hemmstoffe der DNA-Replikation (Tab. 10.5)
Replikation:Hemmstoffe
Transkription

Von DNA zu RNA: die Transkription

Prinzip

Bei der Transkription wird zu einer DNA-Sequenz eine komplementäre RNA-Sequenz erstellt. Die RNA wird vom Multienzymkomplex RNA-Polymerase aus den Ribonukleosidtriphosphaten ATP, CTP, GTP und UTP synthetisiert. Die RNA-Polymerase benutzt den ()-DNA-Strang als Matrize (kodogener Strang bzw. Matrizenstrang) und synthetisiert die primäre RNA (das primäre Transkript). Diese weist dieselbe Basensequenz auf wie der kodierende (+)-DNA-Strang, enthält aber U statt T. Durch Modifikation der primären RNA entsteht die reife RNA(10.3.7).

RNA-Typen

Man unterscheidet folgende RNA-Typen:

  • prä-mRNA (auch: heterogeneous nuclear RNA hnRNA) ist der Vorläufer der Messenger-RNA (mRNA), d. h. der proteinkodierenden RNA. Prä-mRNA wird durch Splicing und andere Modifikationen(10.3.7), zu reifer mRNA prozessiert. mRNAs verlassen bei den Eukaryonten den Zellkern und werden im Zytosol am Ribosom in die kodierte Aminosäuresequenz translatiert(10.3.8). Bei den zellkernlosen Prokaryonten sind Transkription und Translation räumlich und zeitlich eng verbunden.

    mRNA macht nur ca. 5 % der in der Zelle vorliegenden RNA aus. Da mRNA eine relativ kurze Haltbarkeit besitzt, dient die Transkription vor allem der mRNA-Synthese.

  • Transfer-RNA (tRNA) ist an der Translation als Bindeglied zwischen Aminosäuren und RNA-Sequenz beteiligt(10.3.8).

  • Ribosomale RNA (rRNA) ist Bestandteil der Ribosomen.

  • Small nuclear RNA (snRNA) ist beteiligt an Spleißvorgängen(10.3.7).

Die verschiedenen RNA-Typen werden bei Prokaryonten von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase synthetisiert. Bei Eukaryonten gibt es drei DNA-abhängige RNA-Polymerasen, die verschiedene RNA-Typen synthetisieren:

  • RNA-Polymerase I synthetisiert die rRNA (8S, 5,8S und 28S). Das Enzym ist im Nukleolus lokalisiert und resistent gegen -Amanitin, das Gift des Knollenblätterpilzes.

  • RNA-Polymerase II synthetisiert die mRNA (und snRNA). Sie ist im Nukleus lokalisiert und wird durch -Amanitin stark gehemmt.

  • RNA-Polymerase III synthetisiert die tRNA (sowie snRNA und 5S-rRNA). Sie ist ebenfalls im Nukleus anzutreffen und weniger empfindlich gegen -Amanitin als die RNA-Polymerase II.

Merke

Eukaryonten besitzen für jeden der drei RNA-Haupttypen eine eigene RNA-Polymerase: I für rRNA, II für mRNA, III für tRNA. Die RNA-Polymerase-Varianten sind gegenüber dem Knollenblätterpilz-Gift -Amanitin unterschiedlich empfindlich (I nicht empfindlich, II sehr empfindlich, III bedingt empfindlich).

Lerntipp

Die verschiedenen RNA-Typen und ihre Enzyme sind ein beliebtes Prüfungsthema.

RNA-Polymerase I rRNA

RNA-Polymerase II mRNA

RNA-Polymerase III tRNA

Klinik

Das Gift des Knollenblätterpilzes (Amanita spec.) -Amanitin ist eines der gefährlichsten natürlichen Gifte. Die tödliche Dosis beträgt beim Erwachsenen ca. 0,1 mg/kg Körpermasse, also für einen 70 kg schweren Menschen etwa 7,0 mg, was ca. 20–40 g Knollenblätterpilz entspricht. Die Giftwirkung beruht auf der Hemmung der RNA-Polymerasen II und III, wodurch die Synthese von mRNA und tRNA unterbunden wird. Die vergifteten Zellen sterben nach einer gewissen Zeit ab. Betroffen sind vor allem die Leberzellen. Die Vergiftungserscheinungen beginnen nach 8 bis 24 Stunden mit Durchfällen und Erbrechen. Nach ca. 3 Tagen treten schwere Leberschäden (und evtl. weitere Organschäden, z. B. der Niere) auf. Die Patienten versterben i. d. R. an fulminantem Leberversagen.

Ablauf

Die Transkription erfolgt bei Pro- und Eukaryonten in drei Schritten, die weitgehend denen der Replikation(10.3.5) entsprechen. RNA-Polymerasen benötigen allerdings keinen Primer.

Initiation
RNA-Typen

Für die Transkription spezifischer DNA-Abschnitte sind vor dem eigentlichen Gen DNA-Regionen nötig, an die die Polymerase bindet. Bei Prokaryonten bindet die RNA-Polymerase direkt, bei Eukaryonten binden zunächst DNA-bindende Regulatorproteine, die Transkriptionsfaktoren, dann die RNA-Polymerase. Die Andockstellen liegen im Promotor.

Initiation bei Prokaryonten
Transkription:AblaufDie prokaryontische RNA-Polymerase ist als Holoenzym ein Multimer mit den Untereinheiten 2'. Die -Untereinheit (-Faktor) dirigiert die RNA-Polymerase an die Andockstelle im Promotor. Ohne den -Faktor bindet die RNA-Polymerase relativ fest an jede DNA-Sequenz. Mit gebundenem -Faktor sinkt die Affinität für beliebige DNA-Sequenzen, und das Enzym gleitet so lange an der DNA entlang, bis es auf eine Andockstelle im Promotor trifft. Dort ist die Bindung mit -Faktor dafür umso stärker. Ist die Bindung der RNA-Polymerase erfolgt, so dissoziiert der -Faktor ab. Von nun an wirkt das Core-Enzym 2'.
Initiation bei Eukaryonten

Jede der drei eukaryontischen RNA-Polymerasen verwendet Promotoren mit spezifischen Andockstellen. Für die RNA-Polymerase II ist die wichtigste Andockstelle die TATA-Box (unten, Regulation). Eukaryontische RNA-Polymerasen binden indirekt über Transkriptionsfaktoren (TFs). TFs weisen zur Erfüllung ihrer Funktion spezielle DNA-bindende Strukturen auf:

  • Zinkfinger: Kleine Proteindomänen, die dank N- oder S-haltiger Aminosäuren Komplexe mit Zink-Kationen bilden. Die entstehenden Proteinschleifen mit den positiv geladenen Zink2+-Ionen greifen wie Finger in die negativ geladene DNA.

  • Leucin-Zipper (zipper Reisverschluss): i. d. R. eine Domäne eines Zweidomänen-Proteins. Dank positiv geladener Aminosäuren bindet die eine Domäne an die negativ geladene DNA. Die leucinreiche zweite Domäne dient der Interaktion mit weiteren Proteinen.

  • Helix-Loop-Helix-Strukturen: Ihre Loop-Domäne ähnelt der DNA-bindenden Domäne der Leucin-Zipper.

Jede RNA-Polymerase hat ihre eigenen Transkriptionsfaktoren. Zur RNA-Polymerase II gehört der Transkriptionsfaktor II (TFII), ein Sammelbegriff für alle Transkriptionsfaktoren der RNA-Polymerase II, die im Bereich der TATA-Box binden und die RNA-Polymerase hierhin dirigieren. In chronologischer Reihenfolge der Initiation sind dies (Abb. 10.19):

  • TFIID-Komplex: Er bindet mit seiner Untereinheit TBP (TATA-Box-Bindeprotein) an die TATA-Box des Promotors. TBP und DNA bilden einen asymmetrischen Komplex. Die Asymmetrie sorgt dafür, dass die Transkription nur in 5'3'-Richtung des kodierenden (+)-Strangs(10.2.1) verläuft. Das gebundene TBP stellt die Bindungsstellen für die folgenden TFII-Komponenten zur Verfügung:

  • Zunächst TFIIA, dann TFIIB. Schließlich bindet mit TFIIF eine ATP-abhängige Helikase, die den DNA-Doppelstrang für die RNA-Polymerase II auftrennt.

An den entstandenen Komplex bindet die RNA-Polymerase II, wird zunächst jedoch noch nicht aktiv. Weitere TFII-Komponenten (TFIIE, TFIIH und TFIIJ) vervollständigen und aktivieren den basalen Transkriptionsapparat. Im Bereich von 17 bp liegt nun eine lokale Entspiralisierung der DNA, die Transkriptionsblase, vor (Abb. 10.20).

Nach Aktivierung des basalen Transkriptionsapparats wird die RNA-Polymerase an ihrer carboxyterminalen Domäne (CTD-tail mit vielen Seryl- und Threonylresten) phosphoryliert und dadurch aktiviert, vermutlich durch die Kinasefunktion des Transkriptionsfaktors TFIIH. Die phosphorylierte RNA-Polymerase beginnt mit der Transkription der ersten Base (+1) und entledigt sich der nicht mehr benötigten Transkriptionsfaktoren.

Bei RNA-Polymerase I und III weicht der Ablauf der Initiation nur geringfügig von dem der RNA-Polymerase II ab.

Merke

Eukaryontische RNA-Polymerasen binden nie direkt an die DNA, die Bindung wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt.

Elongation

Die Transkriptionsblase läuft über das Gen. Eine Helikase entwindet die eintretende DNA-Doppelhelix, Topoisomerasen gleichen den entstehenden Druck im Molekül aus. Beim Austritt aus der Transkriptionsblase verdrillen sich die DNA-Doppelstränge wieder. In der Transkriptionsblase liegt ein DNA-RNA-Hybrid-Doppelstrang aus 8 bp vor (Abb. 10.20). Die RNA-Polymerase synthetisiert RNA in 5'3'-Richtung (wie die DNA-Polymerasen); Bausteine sind die Ribonukleosidtriphosphate ATP, CTP, GTP und UTP. Als Erstes ist somit das 5'-Ende der RNA fertiggestellt.

Im Unterschied zu DNA-Polymerasen benötigen RNA-Polymerasen keinen Primer und besitzen keine Proofreading-Funktion. Ihr Produkt ist um den Faktor 100.000 fehlerhafter als das der DNA-Polymerasen. Dies hat jedoch keine schwerwiegenden Folgen, da eine fehlerhafte RNA in der Fülle der korrekten RNAs keine Rolle spielt und der Fehler nicht weitervererbt wird. Die Transkription ist dennoch langsamer (die RNA wächst pro Sekunde um ca. 50 Nukleotide) als die Replikation (ca. 800 Nukleotide pro Sekunde).

Termination
Eukaryonten und Prokaryonten besitzen unterschiedliche Terminationsstrategien.
Termination bei Prokaryonten

  • Termination durch Stammschleife: Das Terminationssignal ist hier eine GC-reiche Palindromsequenz. Ein Palindrom ist ein DNA-Bereich, in dem (+)- und ()-Strang in 5'3'-Richtung abgelesen dieselbe Basensequenz aufweisen. Auf dem kodierenden (+)-Strang folgt auf die erste Hälfte des Palindroms, z. B. GCCGCC, die komplementäre Sequenz in umgekehrter Reihenfolge, z. B. GGCGGC (Abb. 10.21). Auf das Palindrom folgen mehrere T (U auf der RNA). Diese Struktur führt zur Beendigung der Transkription: Die Basen des Palindroms bilden mit sich selbst eine Stammschleife (Abb. 10.21). Diese ist aufgrund der in ihr vorliegenden GC- bzw. CG-Paarungen besonders stabil. Besonders instabil sind hingegen die Paarungen zwischen der auf das Palindrom folgenden poly(U)-Sequenz auf RNA- und der poly(A)-Sequenz auf DNA-Seite. Die Stammschleife führt zum Stocken der Transkription, was der schwach gebundenen poly(U)-RNA die Chance zum Ablösen von der DNA-Matrize und zum Verlassen des Enzyms gibt.

  • Attenuation: Dieser Mechanismus beruht darauf, dass Transkription und Translation bei Prokaryonten nicht räumlich getrennt sind. Hohe Konzentrationen der Aminosäure Tryptophan z. B. bewirken ein schnelleres Fortschreiten des Ribosoms auf der entstehenden mRNA. Es bildet sich eine mRNA-Struktur aus, die die weitere Translation der Gene für die Tryptophansynthese unterbindet.

Termination bei Eukaryonten

Über die Termination der eukaryontischen Transkription ist relativ wenig bekannt. Reife eukaryontische RNA besitzt an ihrem 3'-Ende die Polyadenylierungssequenz, die der posttranskriptionalen Anfügung des Poly(A)-Schwanzes(10.3.7) dient. Die DNA-Grundlage dieser Sequenz ist evtl. gleichzeitig Terminierungssignal, auch wenn die RNA-Polymerase II ca. 300 Nukleotide über diese Sequenz hinaus transkribiert.

Regulation

Die Kontrollelemente der Transkriptionsregulation ( Regulation der Genexpression, 10.3.10) lassen sich einteilen in:

  • cis-Elemente: DNA-Sequenzen, die der Regulation dienen, z. B. Promotoren

  • trans-Elemente: DNA-bindende Moleküle, die der Regulation dienen, z. B. der prokaryontische -Faktor oder die eukaryontischen Transkriptionsfaktoren.

Regulation bei Eukaryonten

Die Regulation der Transkription ist bei Eukaryonten komplexer als bei Prokaryonten. Es wirkt eine Vielzahl von cis- und trans-Elementen:

  • cis-Elemente:

    • Promotoren: DNA-Sequenzen, die die Transkription eines Gens regulieren. Sie enthalten Bindungsstellen für die eukaryontischen Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase. Für die RNA-Polymerase II ist die wichtigste Bindungsstelle die TATA-Box, die die Consensus-Sequenz TATA (oft folgen zwei bis drei weitere A) besitzt und zwischen Nukleotidposition 30 und 100 (upstream von ATG) liegt. Vor allem konstitutive Gene (Housekeeping genes) besitzen statt einer TATA-Box oft eine CAAT-Box im Bereich 40 bis 150 (Abb. 10.22) oder eine GC-Box. Der Promotor umfasst alle vorhandenen Boxen, die dazwischenliegenden Bereiche und evtl. noch weitere Sequenzen (Abb. 10.22). RNA-Polymerase I und III binden an Promotoren mit eigenen spezifischen DNA-Bindungsstellen.

    • Enhancer: DNA-Sequenzen, die die Transkriptionstätigkeit stimulieren, indem sie die Bindung von trans-Elementen an die Promotor-Sequenzen unterstützen und Gene für den Transkriptionsapparat zugänglich machen(2.7 und 10.3.10). Enhancer sind unabhängig von ihrer Ausrichtung oder Lokalisation auf dem (+)- oder ()-Strang wirksam. Sie können im Gen, aber auch mehrere tausend Basenpaare vor (upstream) oder hinter dem Gen (downstream) liegen. Das inhibierende Gegenstück zum Enhancer heißt Silencer.

  • trans-Elemente:

    • Enhancer-bindende Proteine

    • GC-Box- und CAAT-Box-assoziierte Transkriptionsfaktoren

    • Transkriptionsfaktor II (spezifisch für RNA-Polymerase II): oben

Regulation bei Prokaryonten
Transkription:Regulation
  • cis-Elemente:

    • Ein optimaler prokaryontischer Promotor weist in der –35-Region die Sequenz TTGACA und in der 10-Region die Sequenz TATAAT (Pribnow-Box, Abb. 10.23) auf. Diese beiden Regionen sind idealerweise 17 Nukleotide voneinander entfernt. Je mehr ein Promotor von diesen Bedingungen abweicht, desto schlechter ist er. Dies ist eine einfache Möglichkeit der Genregulation: Einem selten benötigten Gen ist ein schwacher Promotor vorangestellt.

    • Prokaryonten besitzen keine Enhancer im klassischen Sinne, dennoch besitzen sie weitere Regulationssequenzen auf der DNA (Operatoren, 10.3.10).

  • trans-Elemente:

    • -Untereinheiten der RNA-Polymerase: Es existieren verschiedene -Untereinheiten für verschiedene Umweltfaktoren. Bei stark erhöhter Umgebungstemperatur wird eine andere -Untereinheit exprimiert als bei normaler Umgebungstemperatur. Diese bindet an Promotoren spezieller Hitzeschockgene.

    • Transkriptionsfaktoren: Auch Prokaryonten besitzen spezifische Regulatorproteine, die an bestimmte DNA-Sequenzen binden und mit der RNA-Polymerase wechselwirken können. Transkriptionsfaktoren spielen hier aber eine geringere Rolle als bei Eukaryonten.

Hemmstoffe der Transkription (Tab. 10.6)

Reifung, Transport und Nachbearbeitung der RNA

Co- und posttranskriptionale RNA-Prozessierung
Die RNA-Prozessierung findet co- undRNATranskription:Hemmstoffe posttranslational statt und RNA-Prozessierungbeinhaltet die Reifung von primärer (prä-)RNA zur fertigen RNA. Die primären rRNA- und tRNA-Transkripte werden bei Pro- und Eukaryonten in vergleichbarer Weise prozessiert. Prä-mRNAs werden nur bei Eukaryonten wesentlich prozessiert: Durch Spleißen werden die Introns herausgeschnitten und die verbleibenden Exons verbunden. Zusätzlich versehen Eukaryonten ihre primären Transkripte mit speziellen Kappen am 5'- und mit Schwänzen am 3'-Ende. Diese Prozessierungsschritte erfolgen im Zellkern.
Prozessierung der primären rRNA-Transkripte
Die rRNA-Gene sind bei Eukaryonten in Chromosomenbezirken lokalisiert, die im Nukleolus liegen. Die Gene liegen als hochrepetitive tandem-repeats(10.3.1) vor. Nukleasen schneiden in Pro- und Eukaryonten aus einer einzigen großen prä-rRNA die verschiedenen rRNA-Untereinheiten (Eukaryonten: 18S, 28S und 5,8S, Prokaryonten: 16S, 5S und 23S) heraus. Die eukaryontische 5S-rRNA wird nicht im Nukleolus transkribiert.
Prozessierung der primären tRNA-Transkripte
Die tRNA-Vorläufer werden auf vielfache Weise prozessiert (Beispiel der Eukaryonten):
  • Eine 5'-Leader-Sequenz wird entfernt.

  • Ein Intron wird herausgespleißt (Mechanismus unten).

  • Das UU-Dinukleotid am 3'-Ende wird durch CCA ersetzt.

  • Mehrere Basen werden modifiziert (methyliert, desaminiert, reduziert), wobei seltene Basen wie Pseudouracil entstehen.

Prozessierung der primären mRNA-Transkripte
  • Cotranskriptionales Anhängen einer 5'-Kappe (mRNA-Capping): Noch während der RNA-Synthese wird das erste Nukleotid der prä-mRNA (liegt am 5'-Ende als Diphosphat vor) mit GMP verbunden. Es entsteht eine 5'-5'-Triphosphatbrücke (Abb. 10.24). Anschließend wird die Base des angefügten Nukleotids zu 7-Methyl-Guanin methyliert. Auch die Ribose-Einheiten der beiden folgenden Nukleotide werden u. U. an ihren 2'-OH-Gruppen methyliert (Abb. 10.24). Diese Kappe schützt die mRNA vor dem Abbau durch Nukleasen und vor Dephosphorylierung durch Phosphatasen und erhöht die Translationsrate an den Ribosomen.

  • Posttranskriptionale Polyadenylierung (poly[A]-Schwanz, Abb. 10.25): Eine spezifische Endonuklease erkennt im Bereich des 3'-Endes der prä-mRNA die Polyadenylierungssequenz (AAUAAA) und entfernt dahinterliegende Nukleotide. Eine Poly(A)-Polymerase fügt an das verkürzte 3'-Ende den poly(A)-Schwanz an; die AMPs stammen von ATPs. Eine mRNA mit poly(A)-Schwanz wird vermehrt translatiert und hat eine längere Halbwertszeit.

  • Spleißen (splicing, Abb. 10.26): Die prä-mRNA wird gespleißt, d. h., Introns werden entfernt und die Exons werden zur fertigen mRNA verbunden. Durch alternatives Spleißen einer prä-mRNA können aus einem Gen unterschiedliche Proteine entstehen (z. B. in den B-Zellen membranständige und freie Antikörpermoleküle). Das korrekte Spleißen gewährleisten konservierte, Intron anzeigende Sequenzen der prä-mRNA, die von der katalytisch aktiven small nuclear RNA (snRNA) spezifisch erkannt werden. Die snRNA ist Bestandteil der snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles), die auch Proteinanteile besitzen. Verschiedene snRNPs, spezifische Proteine (Spleißfaktoren) und die zu prozessierende prä-mRNA lagern sich zu den Spleißosomen zusammen. Das eigentliche Spleißen besteht in zwei Umesterungen (Abb. 10.26):

    • Eine 2'-OH-Gruppe eines Nukleotids im Inneren des Introns (Verzweigungsstelle branch point) bildet mit der 5'-Phosphatgruppe des Nukleotids am Intronanfang (5'-Spleißstelle) eine Phosphodiesterbrücke aus. Es entsteht eine intermediäre Lassostruktur.

    • Die 3'-OH-Gruppe von Exon 1 wird mit der 5'-Phosphatgruppe von Exon 2 verknüpft. Es entstehen das intronfreie Spleißprodukt und ein lassoartiges Intron mit einer internen Verzweigungsstelle.

Klinik

Nach der Fetalzeit besteht der Großteil des Hämoglobins aus zwei - und zwei -Ketten(15.1.4). Bei der -Thalassämie führt eine Punktmutation einer Base (G statt A) im Intron des Gens für die -Kette zu fehlerhaftem Spleißen und somit zu einer fehlerhaften reifen -Ketten-mRNA. Die auf Grundlage dieser mRNA synthetisierte -Kette kann nicht in Hämoglobin verwendet werden. Stattdessen wird fetales Hämoglobin (HbF) aus zwei - und zwei -Ketten gebildet. Zu den Formen und Symptomen der Thalassämie s. Kapitel 15.1.4.

mRNA-Transport
Bei Prokaryonten kann die Translation quasi mit dem ersten RNA:mRNA-Transporttranskribierten mRNA-Nukleotid beginnen. Bei Eukaryonten muss die reife mRNA zuerst aus dem Zellkern ins Zytosol zu den Ribosomen transportiert werden. Spezielle Carrier-Proteine unterstützen den ATP-abhängigen Transport durch die Kernporen. Im Zytosol binden Bindeproteine an die mRNA: Sie verhindern die Bildung einer Tertiärstruktur und entscheiden über das weitere Schicksal der mRNA: Translation, Warten oder Abbau. Der mRNA-Abbau ist neben der Transkriptionsrate für das Ausmaß der Genexpression entscheidend.
RNA-Editing

Durch RNA-Editing kann eine Nukleotidsequenz nach der Transkription verändert werden. Die Enzyme dafür kommen bei höheren Eukaryonten im Zytosol der Zellen bestimmter Gewebe vor. Ein bekanntes Beispiel für RNA-Editing ist das Apolipoprotein B (ApoB), das von Leber- und Dünndarmzellen in zwei verschiedenen Varianten synthetisiert wird: Das größere Apolipoprotein B-100 aus Leberzellen ist das Hauptprotein der LDL. Es besitzt eine Bindedomäne für den auf der Zelloberfläche lokalisierten LDL-Rezeptor. Die Bindung von Apolipoprotein B-100 an diesen Rezeptor löst rezeptorvermittelte Endozytose aus, wodurch die Zellen vor allem mit dem Cholesterin der LDL und mit fettlöslichen Vitaminen versorgt werden(4.10). Das kleinere Apolipoprotein B-48 aus dem Dünndarm, Hauptprotein der Chylomikronen, besitzt die LDL-Rezeptor-Bindedomäne nicht. Apolipoprotein B-100 und Apolipoprotein B-48 werden dennoch vom selben Gen kodiert. Dünndarmzellen besitzen eine spezifische Desaminase, die ein spezielles Cytidin der prä-mRNA zu Uridin desaminiert. Das Codon CAA (Glutamin) verwandelt sich dabei in UAA (Stopp-Codon). In den Dünndarmzellen wird die mRNA nur knapp bis zur Hälfte translatiert, wodurch statt des Apolipoproteins B-100 (100 % des gesamten Proteins) mit LDL-Rezeptor-Bindedomäne das Apolipoprotein B-48 (48 % des gesamten Proteins) ohne diese Domäne entsteht.

Von mRNA zum Protein: die Proteinbiosynthese (Translation)

RNA-EditingBei der Translation werden die mRNA-Basentripletts an den Ribosomen in die Translation20 proteinogenen Aminosäuren (+ Selenocystein, 7.1.2) übersetzt. Die Ribosomen sind also der Ort der Proteinbiosynthese.
Beteiligte Strukturen
Folgende Strukturen sind an einem Translationsvorgang beteiligt:
  • eine mRNA

  • tRNAs

  • Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

  • freie Aminosäuren

  • ein Ribosom

mRNA
Ein mRNA-Molekül wird gleichzeitig von mehreren Ribosomen abgelesen. Eine mRNA dient somit bei mehreren Translationsvorgängen als Vorlage und bringt mehrere identische Proteine hervor. Die Lebensdauer einer mRNA im Zytosol beträgt oft nur wenige Sekunden.
tRNAs

tRNAs gewährleisten den Transfer von Aminosäuren an die wachsende Polypeptidkette des translatierenden Ribosoms. Sie sind Adaptermoleküle zwischen der Basentriplett- und der Aminosäure-Sprache. tRNAs besitzen folgende Strukturmerkmale:

  • Sie bestehen aus 73–93 verketteten Nukleotiden.

  • 7–15 der Basen der Nukleotidkette sind i. d. R. ungewöhnlich modifiziert, häufig durch einfache oder doppelte Methylierung von A, U, C oder G. Zu den ungewöhnlichenNukleosiden der tRNA zählen Inosin (I), Methylinosin (mI) und Pseudouridin (). Die seltenen Basen sind wichtig für die Wechselwirkungen, die tRNAs eingehen.

tRNAs bilden eine charakteristische 2D- und 3D-Struktur aus. Die 2D-Struktur ist eine Kleeblatt-Struktur (Abb. 10.27): Einige Bereiche weisen eine Basenpaarung auf, andere – Schleifen (loops) – nicht. Die 3D-Struktur ist L-förmig. Das eine Ende des L ist die Anticodon-Schleife, die an ein komplementäres mRNA-Codon bindet. Das andere Ende ist die Aminosäure-Anheftungsstelle am 3'-CCA-Ende. Das CCA-Motiv wurde posttranskriptionell angehängt(10.3.7) und liegt in reifen tRNAs als Einzelstrang vor. Der überwiegende Rest des Kleeblattstiels, des Akzeptorstamms, liegt aufgrund von Basenpaarung als A-Helix vor. Zwei weitere Bereiche sind frei von Basenpaarung: die TC-Schleife und die DHU-Schleife. Mit dem Extraarm existiert eine weitere kleine variable Schleife. Insgesamt bestehen tRNAs aus vier Helix-Stämmen, drei Schleifen, einem Extraarm und der Aminosäure-Anheftungsstelle.

Für jede Aminosäure existiert eine spezifische tRNA, nicht aber für jedes mRNA-Codon. Vielmehr existieren isoakzeptierende tRNAs, die an Synonyme (unterschiedliche Basentripletts, die für dieselbe Aminosäure kodieren) binden können. Bei diesen tRNAs findet sich am 5'-Ende (auf Platz 3) des Anticodons I, das mit U, C und A basenpaaren kann. Diese variable Basenpaarung bezeichnet man als Wobble-Basenpaarung (to wobble wackeln).

Lerntipp

Die Wobble-Basenpaarung ist ein beliebtes Thema in mündlichen Prüfungen!

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen beladen eine tRNA mit der zu ihrem Anticodon passenden Aminosäure. Sie sind spezifisch sowohl für eine tRNA als auch für eine Aminosäure und stellen die Verbindung zwischen Aminosäure und Basentriplett-Code her. Manche dieser Enzyme besitzen eine Korrekturlese-Domäne.

Für jede Aminosäure existiert mindestens ein solches Enzym; es ist nach der Aminosäure benannt (z. B. Threonyl-tRNA-Synthetase). Eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase hat drei Aufgaben:

  • 1.

    die Aminosäure zu erkennen,

  • 2.

    die Aminosäure zu aktivieren (unten),

  • 3.

    die passende tRNA zu erkennen. Dies geschieht hauptsächlich anhand des Anticodons.

Freie Aminosäuren

Die Bildung eines Polypeptids ist endergon, d. h., die Verknüpfung freier Aminosäuren am Ribosom erfordert Energie. Deshalb werden die Aminosäuren durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen aktiviert. Dabei wird AMP mit der Aminosäure verknüpft und Pyrophosphat (PPi) abgespalten:

R-COOH ( Aminosäure) + ATP PPi + R-CO-AMP ( Aminoacyl-AMP, ein gemischtes Anhydrid)

Die sofortige Spaltung von PPi in 2 Pi macht die Reaktion irreversibel(1.2.5).

Die Aminoacyl-tRNA-Synthetase überträgt den Aminoacylrest unter AMP-Abspaltung auf das 3'-CCA-Ende der tRNA:

R-CO-AMP + tRNA R-CO-tRNA ( Aminoacyl-tRNA) + AMP

Die aktivierte Form der freien Aminosäuren sind somit beladene tRNAs, die Aminoacyl-tRNAs. Sie bilden die Grundlage der Peptidverknüpfung an den Ribosomen.

Merke

tRNA-Beladung: AS Aminoacyl-AMP Aminoacyl-tRNA

Ribosomen

Ribosomen bestehen aus einer großen und einer kleinen Untereinheit. Eukaryonten besitzen ein 80S-Ribosom mit den Untereinheiten 60S und 40S, Prokaryonten ein 70S-Ribosom mit den Untereinheiten 50S und 30S. Das Ribosom ist ein Ribozym, denn sein Anteil an rRNAs ist katalytisch aktiv. Diese machen zwei Drittel der Masse des Ribosoms aus, Proteine (Riboproteine) ein weiteres Drittel. Die Assemblierung zur großen und kleinen Ribosomen-Untereinheit findet im Nukleolus statt. Die rRNA-Bestandteile falten sich spontan zu definierten Doppelhelix-Abschnitten und bilden eine definierte 3D-Struktur aus (Self assembly). Die Untereinheiten werden dann ins Zytoplasma transportiert, wo sie sich mit tRNA und mRNA zu fertigen Ribosomen zusammenlagern. Prokaryonten besitzen nur zytosolische Ribosomen, Eukaryonten besitzen zytosolische und membranständige Ribosomen. Die membranständigen Ribosomen sind an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebunden. Hier werden nichtzytosolische Proteine (z. B. Membran- und Exportproteine) synthetisiert. Die wachsende Polypeptidkette gelangt dabei ins ER-Innere, wo sie modifiziert wird. Als Polysom bezeichnet man mehrere Ribosomen, die gleichzeitig ein mRNA-Molekül ablesen. Ribosomen können drei Aminoacyl-tRNAs gleichzeitig binden. Die Ribosom-Untereinheiten werden dabei nur von den gebundenen tRNAs zusammengehalten. Es gibt drei ribosomale Bindungsstellen für tRNAs:

  • Exitstelle (E-site): Hier verlässt eine leere tRNA das Ribosom.

  • Peptidylstelle oder Donorstelle (P-site): Hier bindet die erste tRNA und während der Elongationsphase sitzt hier die tRNA, die die jüngste der Aminosäuren an der Polypeptidkette – und damit die wachsende Polypeptidkette – trägt. Die Kette gelangt durch einen ribosomalen Tunnel, der Teil der großen Untereinheit ist, ins Zytosol. Dieser Tunnel bleibt immer mit der P-site verbunden.

  • Aminoacylstelle oder Akzeptorstelle (A-site): Hier kommen die Aminoacyl-tRNAs an. Wenn sie zum Codon der mRNA passen, werden sie in die P-site weitergeschickt, um die Polypeptidkette um ihre Aminosäure zu verlängern. Die neue Aminoacyl-tRNA übernimmt dabei die gesamte Polypeptidkette.

Ablauf
Translation:Aminoacyl-tRNA-SynthetasenDie Schritte der Translation:RibosomenTranslation sind Initiation, Elongation und Translation:AblaufTermination.
Initiation
Die Initiation der Translation unterscheidet sich bei Pro- und Eukaryonten leicht (Tab. 10.7), ist im Prinzip aber ähnlich. In beiden Fällen erfolgt das Ablesen der mRNA in 5'3'-Richtung und die Polypeptidkette wächst vom N(Amino)- zum C(Carboxy)-Terminus.
Initiation bei Prokaryonten
Prokaryontische mRNA-Moleküle besitzen an ihrem 5'-Anfang i. d. R. eine purinreiche (G, A) Sequenz, die nur teilweise variabel ist. Diese Shine-Dalgarno-Sequenz ist 3–9 bp lang und ca. 10 Nukleotide vom Start-Codon entfernt. Prokaryonten verwenden zwei Start-Codons: AUG (Methionin) und GUG (Valin), letzteres jedoch viel seltener. Neben Start-Codon und Shine-Dalgarno-Sequenz sind für die Initiation außerdem die drei Initiationsfaktoren IF1, IF2 und IF3 wichtig. Die Proteine IF1 und IF3 binden an die freie 30S-Untereinheit, um in Abwesenheit von mRNA und Initiator-tRNA eine Paarung mit der 50S-Untereinheit zu verhindern. Das G-Protein IF2 bildet, wenn es GTP gebunden hat, einen Komplex mit der Initiator-tRNA. Dies ist bei Prokaryonten i. d. R. Formylmethionyl-tRNAf, passend zum Initiations-Codon AUG. Die Initiator-tRNA unterscheidet sich von der tRNA, die für (nichtformyliertes) Methionin im Inneren der Polypeptidkette zuständig ist, diese heißt tRNAmet. Oft wird das Start-Formylmethionin noch während der Translation vom N-Terminus entfernt. Die Translation beginnt mit der Wechselwirkung zwischen der 30S-Untereinheit des Ribosoms und der Shine-Dalgarno-Sequenz. Beide Komponenten bilden einen Komplex, der sich mit dem IF2-tRNAf-Komplex zum 30S-Initiationskomplex vereinigt (Abb. 10.28).
Über eine tRNA-Brücke vereinigen sich 50S- und 30S- zum 70S-Ribosom. Das an IF2 gebundene GTP wird dabei zu GDP hydrolysiert, was zur Freisetzung aller Initiationsfaktoren führt. Es liegt nun der 70S-Initiationskomplex vor. In diesem besetzt die Formylmethionyl-tRNAf die P-site, die über ihr Anticodon an das Start-Codon AUG der mRNA bindet. A- und E-site sind frei (Abb. 10.28).
Prokaryontische Gene sind oft polycistronisch, d. h., ihre mRNA besitzt mehrere Shine-Dalgarno-Sequenzen, sodass aus einer mRNA verschiedene Proteine entstehen.
Initiation bei Eukaryonten
Eukaryonten besitzen keine Shine-Dalgarno-Sequenz und das Start-Codon ist immer AUG. Außerdem ist eukaryontische mRNA monocistronisch: Aus einer mRNA geht nur ein Protein (in mehreren Kopien) hervor, und es gibt nur eine Translationsstartstelle. Die Initiator-tRNA trägt stets Methionin, nicht N-Formylmethionin wie bei den Prokaryonten, und heißt Met-tRNAi. Sie unterscheidet sich von der Met-tRNAmet, die für Methionin im Inneren der Polypeptidkette zuständig ist. Eukaryonten besitzen mehr Initiationsfaktoren (eIFs) als Prokaryonten, denn die räumliche und zeitliche Trennung von Transkription und Translation erfordert komplexere Abläufe. Wie bei den Prokaryonten bindet ein Initiationsfaktor, eIF2, an die Initiator-tRNA. Zu Beginn der Translation wechselwirkt die kleine Untereinheit (40S) allein mit der 5'-Cap-Struktur der mRNA und sucht ATP-abhängig den mRNA-Strang nach dem Start-Codon ab. Die Initiator-tRNA bindet auf der P-site der 40S-Untereinheit an das Start-Codon. Die große Ribosom-Untereinheit (60S) bindet unter Ablösung der eIFs an die 40S-Untereinheit mit gebundener Met-tRNAi. Dadurch entsteht der 80S-Initiationskomplex.
Elongation
Der Ablauf der Elongation bei Pro- und Eukaryonten ist sehr ähnlich.
Elongation bei Prokaryonten
Im prokaryontischen 70S-Initiationskomplex befindet sich an der P-site des Ribosoms die Initiator-tRNA mit (meist) Formylmethionin. Die A-site mit dem nächsten translatierbaren mRNA-Codon ist noch frei.
Den Transport der Aminoacyl-tRNAs zur A-site übernimmt der Elongationsfaktor Tu (EF-Tu), ein G-Protein. EF-Tu bindet die Aminoacyl-tRNAs nur, wenn es GTP gebunden hat, und entlässt es nur, wenn GTP zu GDP hydrolysiert wurde. Diese Hydrolyse erfolgt nur, wenn die Paarung zwischen mRNA-Codon und tRNA-Anticodon korrekt ist. Somit gewährleistet EF-Tu die Translationsgenauigkeit. EF-Tu kann nicht an die Initiator-tRNA binden. Aus GDP-EF-Tu wird durch den Elongationsfaktor Ts (EF-Ts) GTP-EF-Tu regeneriert.
Sobald sich die zweite Aminoacyl-tRNA in der A-site des Ribosoms befindet, unterstützt das Peptidyltransferase-Zentrum in der großen Untereinheit die Bildung einer Peptidbindung. Bindungspartner sind die Aminogruppe der Aminoacyl-tRNA in der A-site und die Esterbindung der Aminoacyl-tRNA in der P-site (Abb. 10.29). Die Peptidbindung ist gegenüber der Esterbindung zwischen Aminosäure und zugehöriger tRNA energetisch begünstigt. (Die Energie für das Knüpfen der Peptidbindung stammt noch aus der ATP-Spaltung im Zuge der tRNA-Beladung, beteiligte Strukturen.) Nach Bildung der Peptidbindung ist die alte tRNA unbeladen und die neue tRNA trägt die gesamte Polypeptidkette: Zunächst entsteht eine Dipeptidyl-tRNA, bei weiterer Elongation eine Polypeptidyl-tRNA. Damit ist der obere (Aminosäure-tragende) Teil der neuen tRNA bereits in die P-site der 50S-Einheit gerückt, während der untere (Anticodon-)Teil noch in der A-site der 30S-Untereinheit steckt (Abb. 10.29). Entsprechend steckt die unbeladene alte tRNA teils bereits in der E-site und teils noch in der P-site. Der Elongationsfaktor G (EF-G Translokase), ein G-Protein, verschiebt unter GTP-Hydrolyse die mRNA und drückt eine eigene Domäne in die A-site, sodass alte und neue tRNA jeweils komplett in die E- bzw. P-site geschoben werden. Bei dieser Translokation wird die mRNA um drei Nukleotide weitergeschoben. Damit ist die A-site wieder frei, und der Zyklus kann von neuem beginnen.
Elongation bei Eukaryonten
Dem prokaryontischen EF-Tu entspricht der eukaryontische Elongationsfaktor eEF-1, EF-Ts entspricht eEF-1, und EF-G entspricht eEF-2.

Klinik

Diphtherietoxin führt zur ADP-Ribosylierung des eukaryontischen Elongationsfaktors eEF-2, der nach Bildung der Peptidbindung für die Translokation zuständig ist. Durch die ADP-Ribosylierung wird der GDP-GTP-Austausch an eEF-2 verhindert, und die Translation bricht ab. Zu den Folgen s. Kapitel 2.5.2.

Termination
Auch die Termination der Translation verläuft bei Pro- und Eukaryonten sehr ähnlich.
Termination bei Prokaryonten
Kommt an der A-site ein mRNA-Stopp-Codon (UAA, UGA oder UAG) zu liegen, so liegt keine passende Aminoacyl-tRNA vor, denn Stopp-Codons kodieren nicht für eine Aminosäure. Stattdessen binden hier Freisetzungsfaktoren (RFs, release factors): Das Protein RF1 bindet an die Stopp-Codons UAA und UAG, RF2 an UAA und UGA. Die dadurch ausgelösten Wechselwirkungen mit dem Ribosom werden von RF3 unterstützt. Es kommt zu einer hydrolytischen Auflösung der Esterbindung zwischen der letzten Aminosäure in der Polypeptidkette und ihrer tRNA. Das fertig translatierte Polypeptid verlässt das Ribosom durch den ribosomalen Tunnel. In Prokaryonten führt ferner der Ribosomenfreisetzungsfaktor (RRF) zur Auflösung des verbleibenden Komplexes aus mRNA und Ribosomen-Untereinheiten. Die Bestandteile können sich jederzeit zu einem neuen Komplex verbinden. Die mRNA ist i. d. R. nicht frei, da an ihr noch mehrere Ribosomen arbeiten (Polysom).
Termination bei Eukaryonten
Eukaryonten besitzen lediglich einen Freisetzungsfaktor. Dieser trägt den Namen eRF1.
Hemmstoffe der Translation

Tab. 10.8 zeigt die Hemmstoffe der Translation.

Fertigstellung der Proteine

10.3.9.1 Faltung
Translation:HemmstoffeNoch während der Synthese der ProteinePolypeptidkette am Ribosom beginnt sich Proteine:Faltungdas Polypeptid zu falten. Zum Mechanismus der Faltung s. Kapitel 10.6.1.
Co- oder posttranslationale Modifikation

Sowohl zytosolische als auch nichtzytosolische Proteine werden co- oder posttranslational kovalent modifiziert. Wichtige Proteinmodifikationen sind (Tab. 10.9):

  • Modifikation des N-Terminus:

    • Deformylase entfernt bei Prokaryonten den Formylrest des N-terminalen Formylmethionins.

    • Met-Aminopeptidase entfernt bei ca. 50 % der Proteine von Pro- und Eukaryonten das N-terminale Methionin.

    • N-Acetyltransferasen der Eukaryonten acetylieren 50–90 % aller naszierenden (frisch synthetisierten) Proteine am N-Terminus.

    • Signalpeptidase entfernt nach Erreichen des Zielkompartiments (z. B. ER) N-terminale Signalsequenzen.

  • Phosphorylierung: Sie dient u. a. der reversiblen Aktivierung oder Inaktivierung von Enzymen und anderen Proteinen wie z. B. Transkriptionsfaktoren (Interkonversion, 2.5).

  • Hydroxylierung, z. B. von Prolinen in Kollagen. Kollagen enthält ein repetitives Gly-X-Y-Motiv, wobei Y häufig 4-Hydroxyprolin ist, das die typische Tripelhelix des Kollagens stabilisiert. Auch 5-Hydroxylysin kommt in Kollagen vor. Es ermöglicht die Quervernetzung der einzelnen Kollagenmoleküle. Die Hydroxylierung von Prolin und Lysin in Kollagen ist Ascorbinsäure-abhängig(9.2.5).

  • Carboxylierung: -Carboxyl-Glutamat (Gla) spielt in Proteinen der Blutgerinnung und des Knochens eine Rolle, da es ein guter Ca2+-Chelator ist. Die Modifikation erfolgt durch eine Vitamin-K-abhängige Carboxylase im ER-Lumen(9.3.3).

  • Methylierung, z. B. von Histidylresten in Aktin und Myosin.

  • Glykosylierung: Dies ist die häufigste Modifikation bei Plasma- und Membranproteinen. Sie erfolgt sukzessive beim Durchlaufen des ER und der Golgi-Cisternen; zum Mechanismus s. Kapitel 10.6.4. Sie dient u. a. der Erhöhung der Löslichkeit von Plasmaproteinen, der Erhöhung der Stabilität gegenüber Proteasen und der molekularen Erkennung. Zudem ist sie eine Qualitätskontrolle: Nur korrekt gefaltete Proteine werden auf eine bestimmte Weise glykosyliert, was die Unterscheidung korrekt und falsch gefalteter Proteine ermöglicht.

  • Verankerung eines peripheren Membranproteins durch Verknüpfung mit lipophilen Membranankern, z. B. mit Lipiden, Fettsäuren (Acylierung) oder Isoprenoiden (Isoprenylierung): s. Kapitel 10.6.6.

  • Proteolytische Prozessierung (limitierte Proteolyse): s. Kapitel 10.6.3.

  • Disulfidbrücken: Sie entstehen durch Quervernetzung der SH-Gruppen zweier räumlich benachbarter Cysteine, die dadurch zu Cystin reagieren. Disulfidbrücken werden intramolekular, z. B. zur Stabilisierung der gefalteten Konformation eines Proteins, und intermolekular gebildet. Sie kommen fast nur bei sekretorischen Proteinen vor, da nur extrazellulär (und im ER) ein entsprechendes reduzierendes Milieu vorherrscht.

Regulation der Genexpression

Die Proteine:ModifikationRegulation der Genexpression ist bei Eukaryonten ausgefeilter als bei GenexpressionProkaryonten, da Eukaryonten ungleich komplexer sind. Alle Körperzellen des Menschen besitzen das gleiche Erbgut, und allein die Regulation der Genexpression bestimmt darüber, zu welchem Zelltyp eine Zelle differenziert.
Regulation bei Prokaryonten
Prokaryonten besitzen drei Arten von Genen:
  • Konstitutive Gene:Genexpression:Regulation Sie werden kontinuierlich exprimiert. Die Genexpression ist nicht reguliert, den Strukturgenen ist keine regulierende DNA-Sequenz vorangestellt. Konstitutive Gene kodieren für Proteine des Basisstoffwechsels, die ständig und in gleichmäßiger Konzentration benötigt werden.

  • Induktive Gene: Ihre Expression wird bei Bedarf induziert. Andernfalls wird die Transkription z. B. durch ein Repressor-Protein verhindert, das an die DNA bindet und ein Vorrücken der RNA-Polymerase verhindert. Erst ein Induktor-Molekül, das an eine definierte Stelle des Repressors bindet, führt zu dessen Ablösung (Prinzip: Das lac-Operon). Induktive Gene kodieren für Proteine des katabolen Stoffwechsels.

  • Repressive Gene: Dieser Gentyp unterscheidet sich vom induktiven dadurch, dass ein Repressor dann die Transkription verhindert, wenn er ein Molekül (den Corepressor) gebunden hat. Dieses Prinzip eignet sich für Gene des anabolen Stoffwechsels.

Repressive und induktive Gene sind nicht zwangsläufig an ein Repressor-Molekül gebunden (Weitere Strategien).
Das lac-Operon: Regulation durch Induktion

Das lac-Operon aus dem Bakterium Escherichia coli (E. coli) ist ein Beispiel für die Regulation durch Induktion. E. coli nutzt i. d. R. Glucose als Energiequelle. Entzieht man dem Nährmedium Glucose und setzt stattdessen Lactose zu, kann sich das Bakterium auch hiervon ernähren, weil folgende drei Enzyme exprimiert werden, die hintereinander in einem polycistronischen Gen kodiert sind:

  • Die Galaktosid-Permease macht die Zellwand für Lactose durchlässig.

  • Die Thiogalaktosid-Transacetylase hilft vermutlich beim Abbau giftiger Stoffe, die über die Galaktosid-Permease ebenfalls in die Zelle gelangen können.

  • Das Enzym -Galaktosidase baut das Disaccharid Lactose zu Galaktose und Glucose ab.

In Abwesenheit von Lactose bindet der Repressor an eine regulierende DNA-Sequenz vor den drei Strukturgenen, den Operator (o, Abb. 10.30). Vor dem Operator liegt ein Promotor (p) für die Transkription, doch bei gebundenem Repressor ist der Weg für die RNA-Polymerase blockiert und keine Transkription kann erfolgen. Promotor, Operator und die drei Gene (z, y, a) bilden zusammen das lac-Operon (lacZ kodiert für die -Galaktosidase, lacY für die Galaktosid-Permease, lacA für die Thiogalaktosid-Transacetylase).

Mit dem lac-Operon in Verbindung steht das Regulatorgen (i), das für das Repressor-Protein kodiert. Das Regulatorgen ist ein konstitutives Gen, das Repressor-Protein wird also ständig synthetisiert. Es ist hochspezifisch für die und hochaffin zu der Operatorstelle, an die es über eine DNA-Bindedomäne andockt. Es besitzt aber auch eine allosterische Ligandenbindedomäne. Bindet hier der Induktor Allolactose, verliert der Repressor seine Affinität zum Operator. Dann kann die Transkription der drei Strukurgene zu einer polycistronischen mRNA beginnen. Durch den Einsatz von Allolactose als Induktor besitzt das Bakterium eine weitere Regulationsmöglichkeit: Allolactose entsteht enzymatisch aus Lactose. Das beteiligte Enzym ist so reguliert, dass es nur aktiv ist, wenn keine günstigere Energiequelle als Lactose zur Verfügung steht.

Merke

lac-Operon Promotor (p) + Operator (o) + 3 Gene (z, y, a). Das Regulatorgen (i) kodiert für das Operator-bindende Repressor-Protein.

Induktives Gen: Repressor hat ohne Ligand ( Induktor) eine höhere Affinität zum Operator.

Repressives Gen: Repressor hat mit Ligand ( Corepressor) eine höhere Affinität zum Operator.

Weitere Strategien (Beispiele)
  • lac-OperonKatabolitaktivator-Protein (CAP): Bei Mangel an energiereichen Verbindungen in der Bakterienzelle steigt der cAMP-Spiegel. cAMP bindet an das Katabolitaktivator-Protein (CAP). CAP bindet nun an bestimmte DNA-Promotor-Sequenzen, die vor Genen des katabolen Stoffwechsels liegen, und erhöht die Wahrscheinlichkeit der Transkription um den Faktor 50.

  • Attenuation: Das Prinzip beruht darauf, dass bei Prokaryonten die Translation fast parallel zur Transkription erfolgt. Ein Beispiel ist die Expression von Genen für die Enzyme der Tryptophansynthese. Wenn von der Aminosäure wenige Moleküle vorliegen, verzögert sich die Translation an einer mehrfach für Trp kodierenden Stelle auf der mRNA, da die zugehörigen wenigen Aminoacyl-tRNAs mit niedriger Frequenz am Ribosom ankommen. Dies führt zur Ausbildung einer mRNA-Struktur, die die weitere Transkription der mRNA begünstigt. Ist genug Tryptophan vorhanden, so ist das Ribosom näher an der RNA-Polymerase. Zwischen den beiden Enzymkomplexen bildet sich eine mRNA-Struktur aus, die die weitere Synthese der mRNA unterbindet.

Regulation bei Eukaryonten
Tab. 10.10 vergleicht die Genome von E. coli und Mensch. Allein aufgrund des größeren Genoms ist die Regulation der Genexpression für Eukaryonten schwieriger.
Regulation über die Transkription

Die Transkriptionsrate ist zentral für die Genregulation. Transkriptionsfaktoren (TFs) sind hier die wichtigsten Regulationsproteine. Sie lassen sich unterteilen:

  • Allgemeine (basale) TFs werden für jede Transkription benötigt(10.3.6).

  • Spezifische TFs fördern (Induktion) oder verhindern (Repression) gezielt die Transkription eines Gens, z. B. in Organen, Geweben oder Entwicklungsstadien.

Die spezifischen TFs sind für die Regulation entscheidend. In der DNA binden sie an:

  • Promotoren: Hier können sie z. B. mit basalen TFs wechselwirken.

  • Enhancer: Hier binden Aktivatoren.

  • Silencer: Hier binden Repressoren.

Induktion der Transkription

Spezifische Transkriptionsfaktoren, die die Transkriptionsrate eines Gens steigern (Aktivatoren), binden an Promotor- oder Enhancer-Bereiche und funktionieren nach zwei Hauptprinzipien:

  • 1.

    Sie sorgen dafür, dass die basalen Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase leichter binden.

  • 2.

    Sie lockern die DNA-Struktur und machen sie dadurch für die Transkription zugänglich: Die DNA ist um Histone gewickelt und dadurch komprimiert(10.3.1). Wie stark die Komprimierung ist, hängt von der Modifikation zahlreicher Lysinreste in den N-terminalen Schwänzen der Histone ab. Lysin ist eine positiv geladene Aminosäure. Nicht modifizierte Histone sind positiv geladen und ihre Affinität zur negativ geladenen DNA ist hoch. Die DNA ist komprimiert und für die RNA-Polymerase schwer zugänglich. Werden die Lysinreste acetyliert, geht positive Ladung verloren. Die Affinität zur negativ geladenen DNA nimmt ab, der Komprimierungsgrad sinkt, die DNA ist leichter zugänglich. Viele spezifische Transkriptionsfaktoren wirken, indem sie Coaktivator-Proteine hinzuziehen, die Histon-Schwänze acetylieren, oder sie besitzen selbst Histonacetylase-Aktivität. Es können zudem noch weitere Enzyme hinzugezogen werden, die den Zugang zur DNA u. a. durch Verschieben von Histonen (Chromatin-Remodellierung) weiter verbessern.

Beispiele für spezifische Transkriptionsfaktoren sind:

  • Zellkernhormonrezeptoren (Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren): Ihre Liganden sind vor allem lipophile Hormone, die durch die Zellmembran ins Zytosol diffundiert sind. Der Ligand bindet im Zytosol (oder Zellkern, wie im Falle der Schilddrüsenhormone) an den Rezeptor. Im Zellkern passiert dann z. B. Folgendes: Der Hormon-Rezeptor-Komplex bindet an einen Enhancer, sorgt über Coaktivatoren für die Acetylierung von Histon-Schwänzen und über weitere Faktoren für Chromatin-Remodellierung. Das Gen wird für den Transkriptionsapparat zugänglich, die Transkriptionsrate steigt. Zellkernhormonrezeptoren benötigen für ihre Wirkung also drei verschiedene Arten von Domänen:

    • eine Domäne zur Hormonbindung,

    • eine DNA-Bindungsdomäne,

    • eine Domäne zur Protein-Protein-Interaktion, z. B. mit Coaktivatoren.

  • Wichtige Zellkernhormonrezeptoren existieren für:

    • Schilddrüsenhormone

    • Steroidhormone (Gluco- und Mineralocorticoide, Sexualhormone, D-Hormon)

    • phosphorylierbare DNA-Bindeproteine: Durch Bindung eines hydrophilen Hormons, z. B. Glucagon, an seinen Rezeptor in der Zellmembran wird eine Signalkaskade aktiviert, die zur Phosphorylierung des DNA-Bindeproteins führt. Die Bindung von Glucagon z. B. aktiviert über ein intrazelluläres G-Protein die Adenylatzyklase. Die cAMP-Konzentration steigt, was die Proteinkinase A (PKA) aktiviert. Die PKA phosphoryliert u. a. das cAMP-Response-Element-Bindeprotein (CREB). CREB bindet an das cAMP-Response-Element (CRE), eine Basensequenz in der Promotorregion Glucagon-aktivierter Gene. Die Phosphorylierung erhöht die Affinität zu dem Coaktivator-Protein CBP. CBP initiiert einen Komplex, der Chromatinumbau und Transkription einleitet. So wird z. B. die Transkriptionsrate des Gens der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-CK), eines Enzyms der Gluconeogenese, gesteigert.

Repression der Transkription

Spezifische Transkriptionsfaktoren, die die Transkriptionsrate eines Gens senken (Repressoren), binden an Promotor- oder Silencer-Bereiche und funktionieren nach zwei Hauptprinzipien:

  • 1.

    Die Bindung von basalen TFs und/oder RNA-Polymerase wird erschwert.

  • 2.

    Der Komprimierungsgrad der DNA wird erhöht.

Die Transkriptionsrate eines Gens wird über folgende Mechanismen reduziert ( Repression):

  • Zellkernhormonrezeptoren können als Repressoren wirken, wenn sie ohne gebundenen Liganden an bestimmte DNA-Stellen binden. Dann können sie u. U. Corepressoren binden, die die Anlagerung von Coaktivatoren verhindern.

  • phosphorylierbare DNA-Bindeproteine können als Repressoren wirken, wenn sie nach Bindung eines Liganden an einen Membranrezeptor über eine Signalkaskade dephosphoryliert werden. So aktiviert die Bindung von Insulin an seinen Membranrezeptor über eine Signalkaskade Proteinphosphatasen, die u. a. die von der PKA phosphorylierten spezifischen DNA-Bindeproteine wieder dephosphorylieren. Dann überwiegt die Aktivität von Histon-Deacetylasen, die u. a. die Zugänglichkeit des PEP-CK-Gens für den Transkriptionsapparat wieder verringern. So reprimiert Insulin die Gene, die von Glucagon induziert werden. Daneben gibt es eine Gruppe von spezifischen DNA-Bindeproteinen, die nur in dephosphoryliertem Zustand die Coaktivatoren für insulinabhängige Gene herbeiziehen.

  • Silencer-Sequenzen: Diese sind an der gezielten Abschaltung von Genen beteiligt. Bindet ein spezifischer Hormon-Zellkernhormonrezeptor-Komplex an eine Silencer-Sequenz, so wechselwirkt der Komplex über die Domäne zur Protein-Protein-Interaktion mit Corepressoren. Das Gen bleibt unzugänglich und wird nicht transkribiert.

Weitere Regulationsmöglichkeiten auf Transkriptions- und Posttranskriptions-Ebene
Transkription:Induktion Transkription:Repression

  • DNA-Modifikation, vor allem Methylierung: Im Säuger-Genom sind in bestimmten Bereichen viele Cytosin-Moleküle am C-Atom 5 methyliert (5-Methylcytosin). Das Methylierungsmuster ist von Zelltyp zu Zelltyp unterschiedlich. Stark methylierte Bereiche werden vermindert exprimiert: Die zusätzliche Methylgruppe stört die Bindung von Aktivatoren der Genexpression.

  • RNA-Editing(10.3.7): posttranslationaler Austausch von mRNA-Basen

  • alternatives Spleißen(10.3.7): Durch unterschiedliche Exonzusammenstellung können aus einer prä-mRNA verschiedene Proteine hervorgehen.

  • RNA-Stabilität: Beschleunigung oder Verhinderung (durch spezifische RNA-Bindungsproteine) des Abbaus von RNA. Eine hohe Konzentration an freiem Häm z. B. verringert die Stabilität der mRNA für die -Aminolävulinsäure-Synthetase(2.3.2).

Klinik

Zur Induktion des Cytochrom-P450-Systems in Leberzellen durch körperfremde Stoffe s. Kapitel 2.6. und 16.5.4.

Übertragung der genetischen Information bei Bakterien und Viren

DNA-Übertragung bei Bakterien

Bakterien enthalten neben ihrem großen ringförmigen DNA-Molekül kleine, zwei bis einige hundert Kilobasen lange, ringförmige DNA-Moleküle, die Plasmide. Diese enthalten oft Gene, die den Bakterien das Überleben in einer feindlichen Umgebung ermöglichen, z. B. Antibiotika-Resistenzgene. Zwischen Bakterien wird DNA durch Transformation, Konjugation oder Transduktion übertragen. Diese Möglichkeiten macht man sich im Labor zunutze(10.4). Innerhalb des Genoms können DNA-Abschnitte durch Transposition umgelagert werden.

Transformation
Dies ist die (nachhaltige) Aufnahme extrazellulärer DNA-Moleküle (linearer Haupt-DNATransformation-Bruchstücke oder ganzer Plasmide) durch Bakterien. Durch die Neukombination von Genen entsteht eine transformierte Zelle mit einem veränderten Genotyp, der an die Nachkommen vererbt wird.
Transduktion
Ein (Bakterio-)Phage (ein Virus, das Bakterien befällt) nimmt hierbei die DNA aus Transduktioneinem Wirtsorganismus mit und überträgt sie auf einen anderen. Integriert er sich dauerhaft im Genom des zweiten Wirts (integrierter Phage Prophage), entsteht eine Wirtszelle mit vererbbarem verändertem Genotyp.
Konjugation
Dies ist der Transfer von DNA von einem Bakterium auf ein anderes durch einen KonjugationMechanismus, der Zellkontakt und ein Plasmid erfordert. Vermittelt wird die Konjugation durch eine röhrenförmige bakterielle Struktur, den Sexualpilus. Über diesen kann neu synthetisierte DNA vom Donor auf den Akzeptor übertragen werden. Männliche Bakterien tragen dabei den Fruchtbarkeitsfaktor F, der Gene für die Pilusbildung und den DNA-Transfer enthält, in weiblichen Bakterien fehlt er.
Transposition
Transposition ist die Umlagerung von genetischem Material innerhalb des TranspositionBakteriengenoms. Springende genetische Elemente, die sich aus dem Genom ausschneiden und an einer anderen Stelle integrieren können, nennt man Transposons. Als Transposons gelten z. B. Resistenzgene, die zwischen Plasmiden und Hauptgenom wechseln können. Die parasitischen DNA-Elemente können auch Eukaryonten und Viren befallen.
Übertragung der genetischen Information bei Viren
Viren sind kleine, obligat intrazelluläre Parasiten, die Lebewesen aller Reiche befallen Virenkönnen. Mit 20–350 nm Durchmesser sind sie noch kleiner als Bakterien (500–5.000 nm). Viren, die Bakterien befallen, heißen (Bakterio-)Phagen.
Zu einem vollwertigen Lebewesen fehlen den Viren mehrere Eigenschaften. Sie bestehen nicht aus Zellen und sind nicht zur selbstständigen Vermehrung fähig, sondern zur Vermehrung auf eine Wirtszelle angewiesen. Dabei tragen Viren die vollständige genetische Information für alle Virusbestandteile bei sich. Ihnen fehlt jedoch der Syntheseapparat (RNA-Polymerase, Ribosom etc.), um eine Vermehrung durchzuführen. Sie bedienen sich daher der Synthesemaschinerie einer Wirtszelle, die sie nach ihren Bedürfnissen umprogrammieren.
Grundlagen
Aufbau eines Virus

Viren bestehen im Prinzip aus zwei Bestandteilen: Erbgut und Hülle. Manche Viren besitzen ein paar Enzyme. Die einzelnen Virusbestandteile sind (Abb. 10.31):

  • Erbgut: Das Genom der Viren kann entweder aus DNA oder aus RNA bestehen, man unterscheidet zwischen DNA- und RNA-Viren. Bei beiden Typen kann das Erbgut einzelsträngig oder doppelsträngig, linear oder als geschlossener Ring vorliegen. Infektiöse und pathogene Parasiten, die nur aus einem RNA-Molekül bestehen, nennt man Viroide.

  • Hülle:

    • Proteinhülle (Capsid): Kleine Viren besitzen nur eine Proteinhülle, die sich aus einigen, oft identischen Einheiten (Capsomeren) zusammensetzt. Die Art und Weise der Capsomer-Anordnung führt zu einer für das jeweilige Virus typischen äußeren Form, z. B. kubisch, ikosaedrisch, helikal oder filamentär. Phagen weisen komplexere Strukturen mit funktionellen Untereinheiten auf. Capsid und Erbgut werden zusammen als Nucleocapsid bezeichnet.

    • Membran: Größere Viren besitzen zusätzlich zum Capsid eine Membran aus Lipiden, die mit Kohlenhydraten assoziiert sein können. In der Membran stecken Glykoproteine (Spikes), die der Wechselwirkung mit Zellstrukturen dienen.

  • Enzyme: Größere Viren verfügen teilweise über eigene Enzyme, z. B. bringt das Human-immunodeficiency-(HI-)Virus (HIV) die Enzyme reverse Transkriptase und Integrase mit in die Wirtszelle (unten).

Das vollständige Viruspartikel, d. h. Nukleinsäure plus Capsid, evtl. mit zusätzlicher Membran, nennt man Virion.

Vermehrung

Lytischer Zyklus: Vermehrungszyklus eines Virus, der mit der Freisetzung neuer Viren und evtl. der Lyse der Wirtszelle endet. Die Vermehrung erfolgt in vier Schritten:

  • 1.

    Adsorption: Durch Bindung an Rezeptoren auf der Zellmembran lagert sich das Virus an die Zellmembran der Wirtszelle an.

  • 2.

    Penetration: Das Virus dringt in die Wirtszelle ein. Dies erfolgt meist rezeptorvermittelt mit anschließender Endozytose oder Fusion von Virus- und Zellmembran. Im Anschluss wird die Nukleinsäure aus dem Capsid freigesetzt. Lediglich Phagen injizieren ausschließlich ihr Genom in die Wirtszelle.

  • 3.

    Intrazelluläre Vermehrung: Die virale Nukleinsäure wird transkribiert und repliziert. Der genaue Replikationsmechanismus hängt von der Virusart ab:

    • DNA-Viren bringen ihre DNA meist in den Zellkern ein. Die DNA-Replikation geschieht entweder durch viruskodierte Enzyme (Replikasen) oder durch zelluläre DNA-Polymerasen, die durch viruskodierte Proteine zur Virus-DNA-Replikation gezwungen werden. Anschließend erfolgt die Transkription. Es entsteht zuerst frühe, dann späte Virus-mRNA. Die übermäßige Produktion von Virus-mRNA und deren Anlagerung an die Ribosomen hemmt Stoffwechselschritte, die die Wirtszelle zur Virusabwehr benötigt. An den Ribosomen entstehen zunächst die frühen Virusproteine (v. a. Enzyme für die Virusgenom-Replikation), anschließend die späten Virusproteine (v. a. Virushüll- und Strukturproteine).

    • RNA-Viren mit einzelsträngiger (+)-RNA: Die eingebrachte (+)-RNA ( sense-RNA) hat den Charakter einer mRNA. Auf ihrer Grundlage werden an den Ribosomen direkt die Hüllproteine und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (Replikase) synthetisiert. Mithilfe dieses Enzyms repliziert das Virus seine RNA, wobei zunächst ()-Stränge als Matrizen hergestellt werden.

    • RNA-Viren mit einzelsträngiger ()-RNA: Diese Viren transkribieren zuerst mithilfe eines mit in die Wirtszelle gebrachten Enzyms ihre ()-RNA in die komplementäre (+)-RNA. Die synthetisierte (+)-RNA dient als mRNA für die Hüllproteine und die RNA-Polymerase und als Matrize für die Replikation.

    • (+)/doppelsträngige RNA-Viren: Diese Viren besitzen oft ein segmentiertes Genom. Mit Hilfe einer in die Zelle mitgebrachten RNA-abhängigen RNA-Polymerase transkribieren sie zuerst nur den (+)-Strang (asymmetrische Transkription). Dieser dient zunächst als mRNA, später als Matrize für die komplementäre ()-RNA.

    • Retroviren: Diese Viren besitzen einzelsträngige (+)-RNA und bringen das Enzym reverse Transkriptase mit in die Zelle. Dieses Enzym erzeugt zunächst ein DNA-RNA-Hybrid, anschließend auf Grundlage des DNA-Anteils eine doppelsträngige DNA. Diese gelangt in den Zellkern und wird dort durch das virale Enzym Integrase in das Genom integriert. Durch einen starken Promotor erfolgt die Transkription aller virusspezifischen (+)-RNA, die als mRNA und genomische RNA der Nachkommen dient.

  • Stehen alle Bestandteile zur Verfügung, werden sie durch self assembly zusammengebaut.

  • 4.

    Freisetzung: Diese erfolgt bei Viren mit Membran oft durch Knospung. Die Membran stammt aus der Zellmembran. Hüllenlose Viren werden durch Lyse der Wirtszelle oder kontinuierliche Exozytose freigesetzt.

Lysogener Zyklus: Als temperent oder lysogen bezeichnet man Viren (Phagen), die ihre DNA als sog. Provirus (Prophage) in die Wirts-DNA integrieren. Ihr Erbgut wird mit dieser zusammen repliziert und so an alle Tochterzellen ohne virulente Wirkung und Zugriff durch das Immunsystem weitergegeben. Bei veränderten Umweltbedingungen bzw. nach einer gewissen Zeit (bei HIV bis 15 Jahre) verlässt das Virus evtl. das Wirtsgenom (z. B. mithilfe der viralen Enzyme Integrase oder Excisase), übernimmt die Zellkontrolle und leitet einen lytischen Zyklus ein.

Transfer des Erbguts bei Retroviren: Das Beispiel HIV
Viren:Vermehrung

Das Human-immunodeficiency-(HI-)Virus (HIV) bringt neben seinem Genom aus einzelsträngiger (+)-RNA die Enzyme reverse Transkriptase und Integrase mit in die Wirtszelle.

Die reverse Transkriptase hat drei Eigenschaften:

  • Sie ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase: Sie synthetisiert anhand der retroviralen RNA und mithilfe in die Zelle mitgebrachter tRNA-Primer einen komplementären DNA-Strang (RNA-DNA-Hybrid).

  • Sie besitzt RNase-H-Aktivität: Mit ihrer Hilfe baut sie den RNA-Anteil ab.

  • Sie ist eine DNA-abhängige DNA-Polymerase: In dieser Eigenschaft synthetisiert sie einen zum DNA-Strang komplementären zweiten DNA-Strang (DNA-Doppelstrang).

An die Enden dieser DNA bindet die virale Integrase, die sowohl als Endonuklease als auch als Ligase wirkt. Die retrovirale Integrase katalysiert die Integration des Virusgenoms als Provirus in das Zellgenom.

Das HIV-Genom besteht aus den Gengruppen gag (gruppenspezifische Antigene), pol (Enzyme, z. B. reverse Transkriptase, Integrase, Protease) und env (Glykoproteine). Es wird nur im integrierten Zustand transkribiert. Jede Gengruppe wird zunächst zu einem Vorläuferprodukt translatiert, aus dem die retrovirale Protease die einzelnen Komponenten herausspaltet (z. B. reverse Transkriptase, Integrase und Protease aus pol). Die Glykoproteine der env-Gene werden in die Zytoplasmamembran der Wirtszelle eingebaut. Das Glykoprotein gp120 gewährleistet, dass das HI-Virus Zellen mit CD4-Antigen auf der Membran befällt. Auch die übrigen Virusbestandteile, das ungeschnittene Primärtranskript (die genomische Virus-RNA), die weiteren viralen Strukturproteine und die viralen Enzyme, wandern zur Zellmembran und vervollständigen dort die entstehenden Viruspartikel. Diese schnüren sich dann ab, ohne die Wirtszelle zu lysieren (lysogener Zyklus). Das Provirus verbleibt im Wirtsgenom, wird weiter transkribiert und bei der Zellteilung an die Tochterzelle weitergegeben.

Merke

Das Retrovirus HIV bringt die Enzyme reverse Transkriptase und Integrase mit in die Wirtszelle. Die reverse Transkriptase wandelt die einzelsträngige Virus-RNA in doppelsträngige DNA um. Diese wird von der Integrase in das Wirtsgenom integriert. Das virale Enzym Protease schneidet die reifen viralen Proteine aus Vorläuferproteinen.

Klinik

Viele Erkrankungen werden durch Viren ausgelöst und übertragen, z. B.:

  • Viele klassische Kinderkrankheiten wie Masern, Mumps, Röteln

  • Virusgrippe (Erreger: Influenza, Parainfluenza) und leichtere Erkältungskrankheiten (Erreger: vor allem Rhinovirus).

  • Herpeserkrankungen: u. a. Herpes labialis und Herpes genitalis (ausgelöst durch Typ 1 bzw. 2 des Herpes-simplex-Virus), Windpocken und Gürtelrose (Erstinfektion bzw. endogene Reinfektion mit dem Varicella-zoster-Virus) und die Mononukleose (Pfeiffer-Drüsenfieber, ausgelöst durch das Epstein-Barr-Virus).

  • Tropische Krankheiten: Dengue-Fieber, Gelbfieber, Ebola-Fieber, Lassa-Fieber. Diese Erkrankungen gehen typischerweise mit hämorrhagischem Fieber einher.

  • Virushepatitis: Man unterscheidet Hepatitis A, B, C, D und E.

  • Viruserkrankungen des ZNS: Poliomyelitis (Kinderlähmung), Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME).

  • AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome): Das Human immunodeficiency virus (HIV, Typ 1 oder 2) befällt mittels seines Oberflächenglykoproteins gp120 gezielt Zellen, die das CD4-Antigen auf ihrer Membran aufweisen (T-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen). Weil HIV diese Zellen des Immunsystems befällt, führt es zu der Immunschwächekrankheit AIDS, die sich in HIV-assoziierten opportunistischen Infektionen (z. B. Pneumocystis-carinii-Pneumonie, Candida [Soor]-Ösophagitis) und Tumoren (z. B. Kaposi-Sarkom, B-Zell-Lymphomen) äußert.

Manche Viruserkrankungen lassen sich durch Inhibitoren der Virusreplikation behandeln, z. B. durch Nukleosidanaloga, die als analoges Substrat die virale DNA-Polymerase hemmen. Ein Beispiel ist das Guanosin-Analogon Aciclovir zur Herpes-Therapie.

Die antiretrovirale Therapie (ART) bei HIV-Infektion bzw. AIDS setzt auf eine Mehrkomponenten-Strategie, um dem mutationsfreudigen Virus beizukommen:

  • Nukleosidale oder nukleotidale Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI): Diese Nukleosid- oder Nukleotidanaloga besitzen eine hohe Affinität zur reversen Transkriptase (RT), inhibieren sie dadurch und führen zum Kettenabbruch. Beispiel: Zidovudin ( Azidothymidin).

  • Nichtnukleosidale Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI)

  • Protease-Inhibitoren (PI): Hemmen die virale Protease (oben).

  • Integrase-Inhibitoren: Hemmen die virale Integrase (oben).

  • Entry-Inhibitoren: Verhindern den Eintritt von HIV in die Zelle.

In-vitro-DNA-Rekombination und Gentechnik

RetrovirenRetroviren:HIVDie moderne Gentechnik nutzt natürlich vorkommende In-vitro-DNA-RekombinationMoleküle (Enzyme, Plasmide etc.), um GentechnikGenome zu analysieren und gezielte Änderungen vorzunehmen.

Molekulare Werkzeuge in der Gentechnik

Lerntipp

Prinzip und Herkunft der Restriktionsenzyme und der reversen Transkriptase sind sehr beliebte Physikumsfragen.

Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme)

Restriktionsenzyme sind ein wichtiges Werkzeug der Gentechnik. Diese Endonukleasen kommen in Prokaryonten vor und dienen zum Schutz gegen Fremd-DNA. Jedes Restriktionsenzym erkennt eine bestimmte DNA-Sequenz, i. d. R. ein Palindrom(10.3.6: Ablauf, Initiation). Die eigene DNA ist durch Methylierung gegen die Restriktionsenzyme geschützt. Manche Restriktionsenzyme schneiden die DNA durch hydrolytische Spaltung zweier Phosphodiesterbindungen glatt durch, sodass glatte Enden (blunt ends) entstehen. Andere schneiden an jedem Strang um ein paar Basenpaare versetzt.

Dabei entstehen Fragmente mit überstehenden Einzelsträngen, sog. kohäsive bzw. klebrige Enden (sticky ends) (Abb. 10.32).

Merke

Restriktionsenzyme stammen aus Prokaryonten, wo sie dem Abbau fremder DNA dienen.

DNA-Ligasen

Diese Enzyme verknüpfen DNA-Fragmente miteinander.

Reverse Transkriptase
Gentechnik:Restriktionsendonukleasen

Die reverse Transkriptase, ursprünglich aus Retroviren, schreibt mRNA in DNA um. Es entsteht intronfreie DNA, die sog. kodierende DNA (cDNA), die die Expression eukaryontischer Gene in Prokaryonten (die mRNA nicht spleißen können) ermöglicht. (Mehr dazu: 10.3.11).

Vektoren

Um ein spezielles Gen in cDNA-Form in Bakterien zu klonieren (vervielfältigen) oder zu exprimieren (das kodierte Protein herstellen), benötigt man einen Vektor, der die Fremd-DNA in das Bakterium bringt. Alle Vektorsysteme bestehen aus Polynukleotiden. Für den Einbau der cDNA in den Vektor werden beide Komponenten mit demselben Restriktionsenzym geschnitten und dann mittels Ligase zu einem Vektor mit rekombinanter DNA fusioniert.

Es gibt verschiedene Vektor-Arten:

  • Plasmide(10.3.11): Fremd-DNA-Stücke von bis zu 10 kbp (Kilobasenpaaren) können hier eingebaut werden. Plasmide verfügen über folgende drei Strukturen:

    • Replikationsursprung (ORI)

    • Antibiotika-Resistenz-Gen zur Selektion (z. B. -Lactamase für Resistenz gegenüber Penicillin)

    • Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme, über die cDNA eingebaut werden kann (Polyklonierungsstelle multiple cloning site).

  • Cosmide: Lange DNA-Stücke, die durch spezifische Sequenzen (cos-sites) von einem Bakteriophagen aufgenommen werden. Dieser gewährleistet eine effiziente Transduktion des Bakteriums. cDNA einer Länge von bis zu 45 kbp kann hier eingebaut werden.

  • Artificial chromosomes: Über künstliche Chromosomen können sehr lange DNA-Stücke (Mbp-Bereich) in Pro- oder Eukaryonten eingebracht werden.

Man unterscheidet zwischen Klonierungsvektoren zur Vervielfältigung eingebrachter DNA und Expressionsvektoren, die dank eines starken und gezielt induzierbaren Promotors die Entstehung des kodierten Proteins gewährleisten.

Transgene Organismen
DNA-Ligasen Reverse Transkriptase

Dies sind pro- oder eukaryontische Organismen, in die fremde DNA eingeführt worden ist.

  • Prokaryonten: Der traditionelle Wirt zur In-vitro-DNA-Rekombination ist das Bakterium E. coli. Verschiedene Stämme erfüllen hier unterschiedliche Zwecke:

    • DNA-Vervielfältigung: Nach erfolgreicher Transformation können sich die Bakterien schnell vermehren. Den Haufen gleicher Bakteriennachkommen bezeichnet man als Klon. Hinsichtlich des eingebrachten Gens spricht man von Gen-Klonierung.

    • DNA-Speicherung: Um das gesamte Erbgut eines höheren Eukaryonten analysieren zu können, wird dieses in kleine Stücke zerschnitten, die dann in einen Vektor kloniert und in Bakterien eingebracht werden. Die Bakterien wachsen isoliert zu Klonen heran, die verschiedene DNA-Stücke enthalten und in Gesamtheit das ganze Genom repräsentieren. Möglichst kleine Überlappungen der Fremd-DNA-Sequenzen der einzelnen Klone ermöglichen, dass das Gesamt-Genom am Computer wieder zusammengepuzzelt werden kann. Eine Sammlung solcher Klone mit überlappenden Fremd-DNAs, die das gesamte Genom ausmachen, nennt man Genbank. Beruht die Genbank auf cDNA, spricht man von einer cDNA-Bank oder cDNA-Bibliothek.

    • Genexpression: In manchen Bakterienstämmen können einfache Peptide hergestellt werden, z. B. Insulin (in seiner Vorstufe Proinsulin, Abb. 10.33), Wachstumshormon oder der Gerinnungsfaktor VIII. Modifizierte, z. B. glykosylierte Proteine können in Prokaryonten nicht produziert werden.

  • Eukaryonten: Eukaryontische Expressionssysteme können im Gegensatz zu prokaryontischen auch modifizierte Proteine herstellen. Ihre Nachteile liegen in der geringen Transfektions-Effizienz und der längeren Generationsdauer. Beispiele für gentechnisch eingesetzte Eukaryonten:

    • Hefekulturen: Besitzen eine kurze Generationsdauer, komplexerer Modifikationen der Produkte sind aber oft nicht möglich.

    • Transgene Tiere: In den Milchdrüsen transgener Kühe oder Ziegen können bestimmte humane Proteine hergestellt und anschließend aus der Milch gewonnen werden.

    • Knockout-Tiere (vor allem Knockout-Mäuse): Gentechnisch veränderte Tiere, die durch gezielte Einführung von Mutationen ein bestimmtes Gen nicht exprimieren können. Dies ermöglicht z. B. Studien zur Bedeutung der ausgeschalteten Gene.

Übertragung der DNA

Vektoren

Die rekombinante DNA wird eingebracht:

  • in Prokaryonten durch Transformation oder Transduktion(10.3.11),

  • in Eukaryonten durch Transfektion: Dies ist die künstliche Übertragung von Fremd-DNA in eine Eukaryontenzelle. Dabei kann die DNA exprimiert und u. U. auch in das Genom integriert werden. Durch Integration in eine befruchtete Eizelle entstehen transgene Organismen (oben).

Klinik

Pathogene Bakterien besitzen Virulenzfaktoren. Diese ermöglichen es, die Abwehrmechanismen des Immunsystems zu überwinden, sich festzusetzen (Adhäsion), in Schleimhäute einzudringen oder die Zellen durch Gifte (Toxine) oder auflösende Enzyme (Zytolysine, Hämolysine) zu schädigen oder zu zerstören. Für die Virulenzfaktoren kodieren Virulenzgene, die im Bakteriengenom oft nebeneinander in Pathogenitätsinseln liegen. Das Cholerabakterium Vibrio cholerae benötigt zwei Faktoren für seine Virulenz:

  • 1.

    den Toxin-coregulierten Pilus (TCP): daran bindet der Bakteriophage CTXF, der das genetische Material für die Bildung des Choleratoxins (CTX) enthält. Durch die Übertragung des CTX-Gens vom Phagen auf das Vibrion wird dieses virulent.

  • 2.

    das Choleratoxin: Dieses besteht aus zwei Untereinheiten: Untereinheit A: Diese hat ADP-Ribosylase-Aktivität und führt in der Mukosazelle durch ADP-Ribosylierung eines G-Proteins zur irreversiblen Aktivierung der Adenylatzyklase. Dadurch werden Chloridkanäle zum Darmlumen hin geöffnet, starker NaCl- und Wasserausstrom und daraus resultierende wässrige Durchfälle sind die Folge. Untereinheit B: Diese bindet an das GM1-Gangliosid, ein Glykolipid auf der Zelloberfläche intestinaler Zellen. Durch diese Bindung wird die Untereinheit A rezeptorvermittelt in die Zelle eingeschleust.

Von der Gentherapie verspricht man sich Erfolge bei der Heilung schwerer Erkrankungen, z. B. monogener Erbkrankheiten und Krebserkrankungen. Das Prinzip besteht darin, Fremdgene mit therapeutischem Nutzen in die Körperzellen (somatische Gentherapie) einzuschleusen. Einen Ansatz zum effizienten Gentransfer stellen replikationsdefiziente virale Vektoren dar, daneben gibt es verschiedene nichtvirale Ansätze (z. B. Lipidvesikel). Bei der Transfektion menschlicher Zellen muss sichergestellt werden, dass dadurch keine Tumoren ausgelöst werden.

Analyse von Nukleinsäuren

Grundtechniken

Transgene OrganismenDie Gentechnik bedient sich der in Kapitel 10.4.1 genannten Werkzeuge und einiger im Folgenden beschriebenen Methoden.
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Diese In-vitro-Methode ermöglicht mithilfe einer DNA-Polymerase die Amplifikation (Vervielfältigung) von bis zu 50 kbp langen DNA-Molekülen (Templates). Da die DNA-Polymerase wie in vivo einen Primer benötigt, muss eine Sequenz von ca. 1525 bp im Anfangs- und Endbereich der zu amplifizierenden DNA bekannt sein. Die Sequenz des forward-Primers ist identisch zur Anfangssequenz des (+)-Strangs (5') des Templates, die Sequenz des reverse-Primers ist identisch zur Anfangssequenz des ()-Strangs. Die PCR ist ein zyklischer Vorgang, bei dem drei Schritte in definierten Zeitabständen aufeinander folgen. Mit jedem Zyklus verdoppelt sich die Template-Menge, sodass in 19 Durchgängen aus einem DNA-Molekül theoretisch 219 1.048.576 Moleküle entstehen. Die Schritte eines PCR-Zyklus sind:

  • Denaturierung: Bei ca. 90 C lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen. Es entstehen zwei Einzelstränge, die DNA ist denaturiert.

  • Annealing: Durch Abkühlen der Lösung auf ca. 50 C können die spezifischen Primer an die DNA-Einzelstränge binden. Die genaue Annealing-Temperatur hängt von der Primerlänge, der Basenzusammensetzung und der Salzkonzentration der Lösung ab.

  • Extension: Bei ca. 70 C synthetisiert die DNA-Polymerase von einem Primer ausgehend den komplementären DNA-Strang (Abb. 10.34). Die Substrate sind Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Die hitzebeständige taq-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus muss nur einmal zum PCR-Ansatz hinzugegeben werden, da sie die hohe Denaturierungstemperatur aushält. Die Extensionszeit hängt von der Template-Länge ab.

  • Der Zyklus wird wiederholt, sodass dank der beiden Primer nach kurzer Zeit nur noch die kurzen Stränge der gewünschten DNA-Sequenz als Produkt entstehen (Abb. 10.34).

Merke

PCR-Ansatz: Template, taq-Polymerase, dNTPs, (forward- und reverse-)Primer, Puffer (vor allem MgCl2).

RT-PCR

Bei der RT-PCR wird eine einzelsträngige RNA von dem retroviralen Enzym reverse Transkriptase (RT, 10.3.11) in eine doppelsträngige DNA umgeschrieben. Die entstehende intronfreie cDNA wird durch PCR amplifiziert, wodurch indirekt der Informationsgehalt von RNAs vervielfältigt wird. Mit der RT-PCR können Zellen auf die Expression bestimmter RNAs hin untersucht werden.

DNA-Trennung im Agarosegel
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

DNA wird samt Ladepuffer, der zum Beschweren und Anfärben der Probe dient, in Taschen eines Gels aus dem quervernetzten Zucker Agarose aufgetragen. An das Gel wird Spannung angelegt, sodass die negativ geladene DNA durch das Gel hindurch zum Pluspol wandert. Die Wanderungsgeschwindigkeit von DNA hängt bei gegebener Feldstärke, Agarosekonzentration und bei gegebenem pH-Wert nur von der Nukleotidanzahl der DNA-Moleküle ab. Die Spannungsquelle wird nach einiger Zeit entfernt und das Gel mit dem UV-Farbstoff Ethidiumbromid gefärbt. Dieser Farbstoff lagert sich zwischen die DNA-Basenpaarungen ein (Interkalierung) und macht DNA-Moleküle im UV-Licht sichtbar.

Blot-Techniken
RT-PCRSie dienen dem Nachweis spezifischer DNA-TrennungNukleinsäuresequenzen (Southern-, Northern-Blot) oder spezifischer Proteine (Western-Blot).
Southern-Blot

Der Southern-Blot (benannt nach Edwin Southern) dient dem Nachweis spezifischer Nukleotidabfolgen in der über Agarosegel aufgetrennten DNA:

  • Die noch im Agarosegel befindliche DNA wird (z. B. mit NaOH oder HCl) denaturiert, d. h., aus den Doppelsträngen werden Einzelstränge.

  • Das Gel wird mit einer Nitrocellulose-Folie und darüber mit wasserziehenden Papiertüchern bedeckt, und das Ganze beschwert. Dadurch kann die DNA mit einem Flüssigkeitsstrom aus dem Gel auf die Folie übertreten. Auf der Folie befindet sich dann einzelsträngige DNA.

  • Die Folie wird nun mit einer DNA-Sonde inkubiert, einem einzelsträngigen DNA-Stück, das komplementär zur gesuchten DNA-Sequenz auf der Folie ist. Die DNA-Sonde ist i. d. R. radioaktiv mit 32P markiert. Die Sonde hybridisiert mit der gesuchten DNA auf der Folie. Alle ungebundenen Sonden werden abgewaschen und die Folie wird entwickelt, d. h., die Stellen, wo Sonden gebunden haben, werden sichtbar gemacht (Autoradiogramm).

Northern-Blot
Der Northern-Blot weist spezifische Southern-BlotNukleotidabfolgen in RNA nach deren Auftrennung im Northern-BlotAgarosegel nach. Die Durchführung entspricht der des Southern-Blots.

Lerntipp

Merkhilfe für die Blot-Techniken: SNOW DROP

S D Southern-Blot, DNA-Analyse

N R Northern-Blot, RNA-Analyse

O O open (leer)

W P Western-Blot, Protein-Analyse

DNA-Sequenzierung
Didesoxy-Kettenabbruchmethode (nach Sanger)
Mit dieser Methode können bis 800 bp lange DNA-Fragmente sequenziert werden.
  • Von DNA-Sequenzierungdemselben Template werden vier PCRs durchgeführt. Jeder Ansatz enthält DNA-Polymerase und denselben forward-Primer (nur forward!). Außerdem enthält jeder Ansatz mit 32P markierte 2'-dNTPs sowie in geringer Konzentration ein 2'-3'-Didesoxyanalogon (ein Ansatz ddATP, einer ddCTP, einer ddGTP und einer ddTTP). Der Einbau von Didesoxyanaloga in die DNA führt zum Kettenabbruch, da keine freie 3'-OH-Gruppe für die Elongation zur Verfügung steht. Durch die geringe Konzentration der ddNTPs entstehen statistisch nur einige Abbruchfragmente, während noch genug Ketten mit 3'-OH-Gruppe für die Elongation übrig bleiben.

  • Anschließend werden die vier Proben in je eine Tasche eines Agarosegels aufgetragen und die DNA-Fragmente parallel aufgetrennt.

  • Das Gel wird geblottet und die Radioaktivität auf einem Röntgenfilm aufgezeichnet (Autoradiogramm). Das hochauflösende Gel kann DNA-Fragmente mit nur einer Base Längenunterschied trennen. Im Röntgen-Abbild des Gels kann demnach die Basenabfolge der DNA abgelesen werden. Das am weitesten gelaufene Fragment steht für die erste Base der untersuchten DNA-Sequenz. Liegt sie auf der Laufstrecke des ddTTP-Ansatzes, so ist die erste Base der Sequenz ein T.

Statt radioaktiver Markierung wird heute meist Fluoreszenzmarkierung verwendet, die weniger gefährlich und besser zu automatisieren ist. Markiert werden
  • die Primer: Jeder der vier Ansätze enthält Primer mit einer spezifischen Fluoreszenzmarkierung. Nach der PCR vereinigt man die Ansätze und trägt sie auf ein zylinderförmiges Gel auf. Die Elektrophorese läuft solange, bis die unterschiedlich langen DNA-Fragmente das Gel am Ende wieder verlassen. Dort sitzt ein Detektor, der die unterschiedlichen Fluoreszenzfärbungen erkennt (z. B. Primer im ddCTP-Ansatz rot, Originalposition somit von G besetzt)

oder
  • die ddNTPs: Durchführung analog zur Fluoreszenzmarkierung der Primer, hier reicht jedoch ein einziger PCR-Ansatz aus.

Anwendungsbeispiele

Die in den Kapiteln 10.4.1 und 10.5.1 vorgestellten Methoden werden bei diagnostischen Fragestellungen eingesetzt.
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)

Dieses Verfahren dient im einfachen Fall dem Vergleich des Genotyps zweier Individuen hinsichtlich eines Gens, also dem Vergleich der Allel-Situation. Grundlage sind die aus Kapitel 10.4.1 bekannten Restriktionsenzyme und die PCR. Durch Mutationen können DNA-Schnittstellen entstehen oder verschwinden. Die RFLP-Technik kann dann angewendet werden, wenn sich ein Allel A von Allel B durch das Vorhandensein einer Schnittstelle unterscheidet. Die PCR wird genutzt, um das untersuchte Gen aus dem gesamten Genom heraus spezifisch zu amplifizieren (durch Wahl der Primer). Nach Restriktionsenzymbehandlung kann man nun anhand der Laufstrecke in einem Gel untersuchen, wie groß die DNA-Stücke sind. Allel A enthält die Schnittstelle nicht, das entsprechende DNA-Stück ist lang (und nicht weit gelaufen). Dagegen enthält Allel B die Schnittstelle: Die beiden Teile von Allel B sind weiter gelaufen als Allel A. Da das Genom des Menschen diploid ist, kann sein Genotyp AA, BB oder AB sein: AB liefert im Gel nach DNA-Färbung zwei Banden mit jeweils halber Intensität.

Genetischer Fingerabdruck

Mit dem genetischen Fingerabdruck können Individuen eindeutig voneinander unterschieden werden. Man bedient sich hierzu des variab-lenumber-of-tandem-repeats-Polymorphismus (VNTRP) und des Short-tandem-repeats-Polymorphismus (STRP). Diese beruhen darauf, dass Individuen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viele Kopien gleichartiger Minisatelliten (10–100 Nukleotide; bei VNTRP) bzw. Mikrosatelliten (2–4 bp; bei STRP) hintereinander besitzen. Die eingesetzten Restriktionsenzyme schneiden bei allen Personen die DNA an denselben Stellen, wegen der unterschiedlichen Kopienzahl der wiederholten Sequenzen zwischen den Schnittstellen entstehen aber unterschiedlich lange Fragmente. Betrachtet man mehrere solcher Abschnitte im Genom, unterscheiden sich praktisch alle Individuen bezüglich der untersuchten Sequenzen voneinander (bis auf eineiige Zwillinge).

HIV-Diagnostik
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)Mittels PCR lässt sich die DNA von Genetischer FingerabdruckViren, die ihre DNA in Wirtszellen eingebracht haben, wieHIV-Diagnostik z. B. HIV, amplifizieren. Als Primer dient eine Sequenz, die zu einer HIV-spezifischen kurzen DNA-Sequenz komplementär ist. Wenn keine HIV-DNA vorhanden ist, führt die PCR zu einem negativen Ergebnis. Ebenfalls verbreitet sind Western-Blot und weitere Antikörper-Methoden.
Gendiagnostik
Die Gendiagnostik ermöglicht die Feststellung von Erbgutveränderungen, die z. B. Ursache für GendiagnostikKrankheiten sind. Aspekte der Gendiagnostik sind:
  • Mutations-Screening: Mit Screening-Methoden kann man eine DNA-Probe auf viele verschiedene Sequenzen gleichzeitig oder viele Proben auf eine Sequenz hin untersuchen. Auf Microarrays sind viele kurze einzelsträngige Gensequenzen auf einer kleinen Fläche untergebracht. Man zerkleinert einzelsträngige genomische DNA (oder RNA) und lässt sie über den Chip laufen. Die DNA bindet an komplementäre immobilisierte Sequenzen und die gebundenen Bereiche werden über Farbstoffe sichtbar gemacht.

  • Die pränatale Diagnostik ermöglicht nach Entnahme von Gewebe- oder Fruchtwasserproben den Nachweis von Genmutationen, was u. U. eine Abtreibung rechtfertigen kann. Vor einer künstlichen Befruchtung können mittels Präimplantationsdiagnostik (PID) Mutationen ausgeschlossen werden.

  • Die genetische Beratung von Paaren dient dazu, anhand der eigenen Genkonstitution das Risiko einer Erbkrankheit des Nachwuchses abzuschätzen.

Die Gendiagnostik kommt auch in der Transplantationsmedizin und der Pharmakogenetik (auf die Genkonstitution des Patienten optimierte Medikamente) zum Einsatz. Die Gendiagnostik eröffnet somit therapeutische und diagnostische Chancen.

Faltung und Modifikation von Proteinen

Proteinfaltung

Ein Protein ist ein Polypeptid mit einer biochemischen Proteine:FaltungFunktion und (in den Proteine:Modifikationmeisten Fällen) einer definierten dreidimensionalen Struktur (Tertiärstruktur, 7.2.2). Diese Struktur ist in der Aminosäuresequenz (Primärstruktur) festgelegt, zu der noch posttranslationale Modifikationen hinzukommen. Die Ausbildung der dreidimensionalen Proteinstruktur ist ein thermodynamisch kontrollierter Selbstorganisationsprozess, der auf verschiedenen Formen der Wechselwirkung basiert. Da dieser Prozess jedoch für große Proteine zu langsam ablaufen würde, sind weitere Faktoren (unten) für die Proteinbiosynthese nötig.
Triebkraft
Triebkraft der Proteinfaltung sind vor allem zwei Arten der Wechselwirkung:
  • 1.

    Die Wechselwirkung zwischen Wassermolekülen bzw. zwischen hydrophoben Aminosäuren in Proteinen. Die Wechselwirkung zwischen gleichartigen Molekülen ist energetisch günstiger als die zwischen H2O und hydrophoben Aminosäuren. Dieser hydrophobe Effekt ist ein entropisches Phänomen, bei dem die Besonderheit des Lösungsmittels Wasser eine wichtige Rolle spielt.

  • 2.

    Die Wechselwirkung von Gruppen innerhalb eines Moleküls ist energetisch günstiger als zwischen den Gruppen verschiedener Moleküle. Auch dies ist ein entropischer Effekt, der mit dem Gewinn von Freiheitsgraden der beteiligten Moleküle zu tun hat.

Beteiligte Faktoren

Bereits während der Synthese der Polypeptidkette am Ribosom beginnt sich das Polypeptid zu falten. Folgende Faktoren unterstützen den Selbstorganisationsprozess der Faltung:

  • Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPI): Peptidbindungen liegen i. d. R. in trans-Konformation vor(7.2.1). Peptidbindungen, an denen Prolin beteiligt ist, liegen aufgrund der zyklischen Prolinstruktur zu 5–30 % in cis-Konformation vor. Eine PPI katalysiert diese Isomerisierung der Peptidbindung zwischen Prolin und einer anderen Aminosäure, sodass der Faltungsprozess (Finden des Energieminimums) nicht aufgehalten wird.

  • Proteindisulfid-Isomerasen (PDI): Diese Enzyme katalysieren die Auflösung von falsch positionierten Disulfidbrücken und die Verknüpfung der korrekten Cysteinylreste. Die kovalenten Verknüpfungen zwischen zwei Cysteinylresten ergänzen die Stabilisierungseffekte schwacher Wechselwirkungen.

  • Chaperonproteine (Hitzeschockproteine, Hsps, Kap. 2.8): Diese Faltungshelfer unterstützen die korrekte Proteinfaltung und -funktion, indem sie die ungewollte Aggregation eines (unvollständig gefalteten) Proteins mit gleichartigen oder anderen Proteinen unterbinden. Manche Chaperone unterstützen die Proteinfaltung auch aktiv unter ATP-Verbrauch.

  • Ionen: Ionen (z. B. K+) müssen in vivo und in vitro im Medium vorhanden sein, damit sich Proteine korrekt falten.

Stabilisatoren und Stabilität des gefalteten Proteins

Ergebnis der Proteinfaltung ist das native Protein mit definierter Tertiärstruktur. Es wird stabilisiert durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Peptiden, elektrostatische Wechselwirkungen zwischen geladenen Aminosäuren und Van-der-Waals-Kräfte (Attraktion induzierter Dipole). Es entsteht eine kompakte Proteinstruktur, bei der sich die hydrophoben Seitenketten im Inneren des Proteins befinden.

Die Proteinfaltung ist ein hochkooperativer Vorgang, d. h. einem Dominoeffekt ähnlich. Bei einfachen Eindomänen-Proteinen gibt es deshalb praktisch keine halbfertig gefalteten Moleküle, sie liegen entweder im nativen, gefalteten oder im denaturierten, ungefalteten Zustand vor (Abb. 10.35).

Der gefaltete Zustand ist oft nicht sonderlich stabil. Denaturierung (Protein-Fällung) ist durch Temperatur- und pH-Änderungen, Detergenzien, Änderung der Salzverhältnisse im Medium, reduktive Auflösung von Disulfidbrücken oder Entzug von Cofaktoren wie Metallkationen möglich. Ist das Proteinrückgrat nicht beschädigt, so ist eine Rückfaltung zur nativen Konformation (Renaturierung) möglich durch Rückgängigmachen der Umstände, die zur Denaturierung geführt haben.

Klinik

Prionen (Prion-Proteine) kommen bei Mensch und Tier hauptsächlich im ZNS vor. Ihre physiologische Aufgabe ist nicht geklärt. Gemäß der Prion-only-Hypothese lösen infektiöse pathologische Prionen Krankheiten wie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD, alte und neue Form), die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE, Rinderwahnsinn) und die Traberkrankheit der Schafe (Scrapie) aus. Diese Krankheiten führen durch Degeneration des ZNS zum Tod. Nach derzeitigen Erkenntnissen beruht die Ansteckung auf einem DNA-freien Erreger:

  • Das physiologische Prion-Protein weist eine -helikale Struktur auf. Es kann von Proteasen abgebaut werden und ist hitzeempfindlich.

  • Das infektiöse Prion-Protein weist dieselbe Aminosäuresequenz auf, liegt aber in -Faltblattstruktur vor. Es wird von Proteasen nicht abgebaut und ist hitzestabil. Außerdem wandelt es physiologische Prionen in die infektiöse Struktur um, sodass diese ebenfalls infektiös sind.

Die Alzheimer-Krankheit zählt wie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit zu den Protein misfolding diseases. Bei den Betroffenen lagern sich Alzheimer-Plaques im Extrazellularraum des ZNS ein. Hauptbestandteil der Plaques ist das A-Peptid (-Amyloid-Peptid), ein zur Aggregation neigendes Peptid aus etwa 40 Aminosäuren (verschieden lange Spezies existieren, A42 ist die aggregationsfreudigste und gefährlichste). Es entsteht bei der Prozessierung des -Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch spezielle Proteasen (- und -Sekretase). Möglicherweise ist die Regulation der Sekretasen oder auch der Abbau von A bei der Alzheimer-Krankheit gestört. Das A-Protein aggregiert im Extrazellularraum zu Plaques von ca. 0,2 mm Durchmesser. Diese Aggregation wird ermöglicht durch die -Faltblattstruktur des A-Peptids. -Faltblatt-Brecher sind deshalb ein möglicher therapeutischer Ansatz gegen Alzheimer.

Adressierung von Proteinen

Die Synthese aller Proteine beginnt an zytosolischen Ribosomen. Nicht alle Proteine haben Proteine:Adressierungjedoch ihren Bestimmungsort im Zytosol. Nichtzytosolische Proteine durchlaufen den sekretorischen Weg: Ein Signalpeptid vermittelt den Transport (mitsamt dem Ribosom) zum rauen endoplasmatischen Retikulum (rER), wo ihre weitere Synthese stattfindet. Es folgen weitere Transportprozesse. Für das Zytosol (sowie Zellkern, Peroxisomen und Mitochondrien) beschreiten bestimmte Proteine den zytoplasmatischen Weg: Sie werden komplett an zytosolischen Ribosomen synthetisiert und erst danach, falls nötig, transportiert. Das Phänomen, dass die Zelle den Einsatzort frisch synthetisierter Proteine bestimmen kann, bezeichnet man als Protein-Sortieren (protein sorting). Dieses ist möglich, weil die Proteine adressiert sind (z. B. mit dem Signalpeptid).
Sekretorischer Weg
Diesen Weg beschreiten die für den Extrazellularraum bestimmten ( extrazelluläre) Proteine:Sekretorischer WegProteine, integrale Membranproteine, lysosomale Enzyme und Proteine des rER. Im Zentrum des sekretorischen Wegs steht das rER.
Extrazelluläre Proteine
Extrazelluläre Proteine, z. B. Insulin, Immunglobuline und Proteine des Komplementsystems, verlassen die Zelle über Exozytose. Die mRNA extrazellulärer Proteine enthält eine Basensequenz, die für eine Signalsequenz kodiert. Das korrespondierende ca. 1560 Aminosäuren lange Signalpeptid befindet sich am N-Terminus und wird an zytosolischen Ribosomen synthetisiert. Sobald es aus dem ribosomalen Tunnel herausragt, bindet daran das RNA-haltige Signal recognition particle (SRP) und bewirkt den Transport des Komplexes aus mRNA, Ribosom und naszierender Peptidkette zum rER. An der Membran des rER befindet sich der SRP-Rezeptor, ein G-Protein, an den das SRP spezifisch bindet. Nach Andocken des Ribosoms an die rER-Membran spaltet der SRP-Rezeptor GTP, woraufhin das SRP abdissoziiert und die Translation fortgesetzt wird. Andockstelle des Ribosoms ist ein Kanal in der rER-Membran, das Translokon, durch das die naszierende Peptidkette ins rER-Lumen gelangt. In den meisten Fällen trennt das Enzym Signalpeptidase das Signalpeptid noch vor der Fertigstellung ab. Das Protein wird aus dem ER über Vesikel zum Golgi-Apparat und von dort nach eventuellen weiteren Modifikationen über Vesikel zur Plasmamembran transportiert.
Integrale Membranproteine

Integrale Membranproteine werden in die Zellmembran oder in die Membranen von Zellkompartimenten eingebaut, wie z. B. membranständige Rezeptoren, Zell-Zell-Erkennungs-Antigene, Ionenkanäle und die Adenylatzyklase. Die Synthese der Membranproteine erfolgt zunächst wie die der extrazellulären Proteine. Eine unpolare Aminosäuresequenz, die Stopp-Transfer-Signalsequenz, sorgt dafür, dass das Protein an dieser Stelle in der rER-Membran stecken bleibt. Ein weiteres Signalpeptid kann jedoch den Durchtritt der naszierenden Polypeptidkette durch die Membran an einer anderen Stelle wieder einleiten. Auf diese Weise entstehen Proteine mit mehreren transmembranalen Helices, wie die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (7-Transmembrandomänrezeptoren). Das fertig gestellte Protein wird zum Golgi-Apparat und von dort zur Zielmembran transportiert, jeweils über Vesikel, die mit der Membran verschmelzen.

Lysosomale Enzyme

Lysosomale Enzyme, zumeist saure Hydrolasen, werden am rER synthetisiert. Dort werden sie kovalent mit verzweigtkettigen Mannoseresten (Zuckerbäumchen) verknüpft (Glykosylierung). Nach Transport der glykosylierten Enzyme in den Golgi-Apparat werden die endständigen Mannosereste des Zuckerbäumchens phosphoryliert. Alle lysosomalen Enzyme tragen eine Mannose-6-phosphat-(Man-6-P-)Markierung, mit der sie spezifisch an Man-6-P-Rezeptoren in der Golgi-Membran binden. Mithilfe des Proteins Clathrin werden lysosomales Protein und Rezeptor als Vesikel abgeschnürt und fusionieren mit einem Lysosom. Dort dissoziiert der Man-6-P-Rest des Enzyms vom Rezeptor ab, der wieder zum Golgi-Apparat zurückkehrt.

Proteine des rER

Manche Proteine, die das rER für seine Funktion benötigt, werden zum Golgi-Apparat transportiert und dort modifiziert. Ein spezielles Retrieval-Signal führt zur Rückkehr ins rER. Andere Proteine verbleiben über ein Retentionssignal von Anfang an im ER.

Zytoplasmatischer Weg

Proteine ohne Signalpeptid werden komplett an den zytoplasmatischen Ribosomen synthetisiert. Danach können spezifische Signale den Transport in den Zellkern, die Peroxisomen oder die Mitochondrien einleiten. Die im Zytoplasma synthetisierten mitochondrialen Proteine werden in ungefaltetem Zustand über bestimmte Translokationsproteine ins Mitochondrium geschleust. Kernproteine werden anhand spezifischer Sequenzen (oft reich an positiv geladenen Aminosäuren, z. B. PKKKRKV) erkannt und in den Kern transportiert. Möglich ist auch die Modifikation von im Zytoplasma synthetisierten Proteinen über einen Lipidanker zu Membranproteinen(10.6.6).

Limitierte Proteolyse

Die limitierte Proteolyse ist eineProteine:Zytoplasmatischer Weg Möglichkeit der Proteinregulation: Ein Protein wird als Limitierte ProteolysePromolekül (Vorläuferprotein) synthetisiert. Das kürzere aktive Protein entsteht durch enzymatische Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen. Dieses Prinzip ist sinnvoll, wenn eine Proteinklasse nicht sofort bzw. nicht am Ort der Synthese wirken soll, z. B. bei Proteasen, die an Selbstverdau und dem ungewollten Verdau von Biomolekülen gehindert werden müssen.
Folgende Enzyme katalysieren limitierte Proteolysen:
Prohormon-Konvertasen

Viele Peptidhormone entstehen durch Prohormon-Konvertasen:

  • Bei der Translation der Insulin-mRNA entsteht Präproinsulin mit 104 Aminosäuren. Dieses trägt ein Signalpeptid, das den Transport in das ER veranlasst. Im ER wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase proteolytisch entfernt und es werden zwei Disulfidbrücken ausgebildet. Das entstandene Proinsulin (84 AS) gelangt über den Golgi-Apparat in Vesikel (-Granula). Im Golgi-Apparat oder in den Granula entsteht aus Proinsulin Insulin (51 AS), indem eine Peptidsequenz (C-Peptid) im Inneren der Peptidkette durch eine Prohormon-Konvertase herausgespalten wird.

  • Durch Prohormon-Konvertasen entstehen in der Hypophyse die Hormone ACTH, -Lipotropin (-LPH), MSH und Endorphin durch limitierte Proteolyse aus Proopiomelanocortin (POMC).

Proenzym-Konvertasen

Durch Proenzym-Konvertasen entstehen u. a. die in Tab. 10.11 aufgeführten aktiven Enzyme.

Die limitierte Proteolyse von Pepsin aus Pepsinogen erfolgt allein durch Einwirkung der Magensäure.

Prokollagen-Konvertasen

Bei der Translation der Kollagen-mRNA entsteht Präprokollagen, aus dem durch Abspaltung des Signalpeptids Prokollagen entsteht. Nach mehreren Modifikationen im Golgi-Apparat wird Prokollagen in den Extrazellularraum sezerniert. Dort entsteht Kollagen, indem ein N- und ein C-terminales Peptid (Propeptide) durch zwei spezifische Prokollagen-Proteinasen (Matrix-Metallo-Proteinasen) abgespalten werden.

Merke

Präproteine (z. B. Präproinsulin) besitzen Signalpeptide, die im ER proteolytisch entfernt werden. Proproteine (z. B. Proinsulin) reifen durch Abspaltung von Propeptiden.

Klinik

Das Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS) ist eine Erkrankung der Haut und des Bindegewebes, die durch dünne Kollagenfibrillen und Überdehnbarkeit des betroffenen Gewebes charakterisiert ist. Es gibt verschiedene Subtypen des Syndroms. Beim EDS Typ VII ist eine fehlerhafte Reifung des Typ-I-Prokollagens für die Symptome verantwortlich, die durch eine Mutation der Typ-I-Kollagen-Gene (Resistenz gegen limitierte Proteolyse) oder der Prokollagen-Konvertase-Gene (verminderte Aktivität der Protease) bedingt ist.

Auch die Hämophilie ist eine Erkrankung, die durch die Fehlfunktion von Proteasen hervorgerufen werden kann. Man unterscheidet zwischen Hämophilie A und B, s. a. Kapitel 15.4.2.

Proteinglykosylierung

Proteine werden im ER und/oder Golgi-Apparat durch das Anhängen von Monosaccharideinheiten Proteinglykosylierungposttranslational modifiziert. Nach dem Anteil des Kohlenhydratrests am Molekül unterscheidet man zwischen Glykoproteinen und Proteoglykanen(3.1.2).
Glykoproteine

Bei Glykoproteinen überwiegt der Proteinanteil, der Kohlenhydratanteil beträgt selten mehr als 50 %. In der Regel umfasst er 18–20 Monosaccharideinheiten.

Zu den Glykoproteinen zählen:

  • Membranproteine, z. B. Rezeptoren

  • Immunglobuline

  • die meisten Plasmaproteine, Ausnahmen: Albumin und Präalbumin

  • einige Hormone: EPO, TSH, HCG, LH, FSH (13)

  • Zelloberflächenantigene, z. B. Blutgruppenantigene

Die Glykosylierung dient über sehr ausgefeilte Mechanismen der Qualitätskontrolle im sekretorischen Weg, sie erhöht Löslichkeit und Stabilität extrazellulärer Proteine und ermöglicht auch molekulare Erkennung (Zelloberflächenantigene). Sie kann auf zweierlei Weisen erfolgen:

  • N-Glykosylierung: Kovalente Verknüpfung des Oligosaccharids mit dem Polypeptid über den Stickstoff einer Asparagin-Seitenkette in einem zweistufigen Prozess:

    • Ein Primär-Zuckerbäumchen, das mit einem Lipidanker (Dolicholphosphat) an der dem Lumen zugewandten Seite der rER-Membran befestigt ist, wird auf den Asparaginylrest übertragen.

    • Im ER-Lumen sowie nach Transport in den Golgi-Apparat wird das Zuckerbäumchen getrimmt: Endständige Glucosereste werden entfernt, bis eine definierte Core-Region mit endständigen Mannoseresten übrig bleibt. Endet die Modifikation an dieser Stelle, spricht man vom mannosereichen Glykoprotein-Typ (Abb. 11.11). Beim komplexen Typ (Abb. 11.11) finden weitere Modifikationen statt, bei denen spezifische Glykosyl-Transferasen Saccharidreste anfügen, z. B. N-Acetyl-Glucosamin, N-Acetylgalaktosamin, D-Galaktose, L-Fucose, Sialinsäure oder N-Acetyl-Neuraminsäure(11.2.2).

  • O-Glykosylierung: Kovalente Verknüpfung des Oligosaccharids mit dem Polypeptid über den Sauerstoff einer Serin- oder Threonin-Seitenkette. Diese Form ist seltener als die N-Glykosylierung. O-Glykosylierung führt zur Entstehung der Blutgruppenantigene an Proteinen der Erythrozytenmembran. Bei allen Blutgruppen des AB0-Systems synthetisieren Glykosyl-Transferasen im Golgi-Apparat ein Tetrasaccharid (0-Antigen, entsprechend der Blutgruppe 0, 14.4). Je nach Genotyp hängt nun eine terminale Transferase entweder Galaktose (Blutgruppe B) oder N-Acetyl-Galaktosamin (Blutgruppe A) an. Bei Blutgruppe 0 fehlt die terminale Transferase durch eine Nonsense-Mutation. Bei Blutgruppe AB sind beide Transferasetypen vorhanden.

Lerntipp

Die N-Glykosylierung beginnt im ER.

Die O-Glykosylierung findet im GOlgi-Apparat statt.

Proteoglykane

Bei Proteoglykanen macht der Kohlenhydratanteil über 90 % des Moleküls aus. Sie sind sehr große Moleküle und ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix(11.11). Sie besitzen einen Aufbau wie eine Feder: Von einer langen Mittelachse aus dem Polysaccharid Hyaluronsäure (Hyaluronat) zweigen einfach aufgebaute Proteine ab, von denen wiederum Poly- und Oligosaccharidketten abzweigen. Letztgenannte Ketten, die Glykosaminoglykane, bestimmen wesentlich die Eigenschaften des jeweiligen Proteoglykans. Sie sind aus identischen Disaccharideinheiten aufgebaut. Das Disaccharid besteht i. d. R. aus Uronsäure und acetyliertem Aminozucker. Deshalb sind Glykosaminoglykane negativ geladen, wodurch Proteoglykane andere Moleküle, z. B. H2O, reversibel binden können.

Nichtenzymatische Glykosylierung (Glykierung)

Proteinglykosylierung:Glykoproteine

Die spontane, nichtenzymatische Glykosylierung heißt Glykierung. Dabei greift das freie Elektronenpaar des Stickstoffs einer Aminogruppe (Lysin-Seitenkette oder N-Terminus eines Proteins) einen Carbonyl-Kohlenstoff (Keto- oder Aldehydgruppe) nukleophil an (Abb. 10.36). Unter Wasserabspaltung entsteht eine Schiff-Base. Die p-Elektronen der CN-Doppelbindung wandern zum Sauerstoff der OH-Gruppe des benachbarten C-Atoms im Zucker weiter, und es entsteht irreversibel das energetisch günstigere Ketoamin (Amadori-Umlagerung, Abb. 10.36).

Die Glykierung ist eine Reaktion, die unter physiologischen Bedingungen ständig abläuft. Der aktuelle Anteil an glykiertem Protein ist abhängig von der vorherrschenden Glucosekonzentration, vom Proteinumsatz und von der Zahl und Umgebung der freien Aminogruppen (zugängliche Lysin-Seitenketten, N-Terminus) des jeweiligen Proteins.

Beispiele glykierter Proteine:

  • Glykiertes Hämoglobin (HbA1c): Wird verwendet, um die Langzeitblutzuckereinstellung bei Diabetes mellitus zu beurteilen.

  • Plasmaproteine, Apolipoproteine, Myelin, Kollagen, Basalmembran- und Erythrozytenmembranproteine, Linsenproteine.

Durch weitere Umlagerungen der primären Produkte der oben beschriebenen Amadori-Umlagerung entstehen Glykosylierungsendprodukte (AGEs advanced glycation endproducts). Ein vermehrtes Vorkommen von AGEs wird beobachtet

  • in alterndem Bindegewebe (Dura mater, Haut, Niere),

  • bei Diabetes mellitus.

Klinik

AGEs binden an spezifische Oberflächenrezeptoren (RAGEs) auf Monozyten/Makrophagen und Endothelzellen. Die dadurch aktivierten Zellen setzen Entzündungsmediatoren frei. Dies spielt offenbar eine Rolle bei der Entstehung diabetischer Vaskulopathien und atherosklerotischer Gefäßveränderungen.

Verankerung von Proteinen in Membranen

Proteinglykosylierung:Proteoglykane

Proteine sind in Membranen zumeist mittels einer apolaren -Helix (oder mehrerer -Helices) oder über lipophile Membrananker fixiert. Proteine mit -Helix sind Transmembranproteine und gehören zu den integralen Membranproteinen(10.6.2). Durch Membrananker in der Membran fixierte Proteine heißen periphere Membranproteine. Die Verknüpfung mit dem Membrananker erfolgt co- oder posttranslational.

Als Membrananker dienen:

  • Fettsäuren (Acylierung): Am häufigsten verwendet werden Myristinsäure (C14) und Palmitinsäure (C16). Die Konjugation erfolgt am N-Terminus oder am -Aminostickstoff von Lysin-Seitenketten.

  • Isoprenoide (Isoprenylierung): Am häufigsten verwendet werden Farnesol (C15), Geranyl-Geranol (C20) und Dolicholphosphat (Isoprenderivat). Die Konjugation erfolgt an der SH-Gruppe von Cystein-Seitenketten.

  • Glykosyl-Phosphatidylinositol (GPI-Anker).

Klinik

Bei einigen Karzinomformen, z. B. Blasenkarzinom, ist die unkontrollierte Zellteilung auf die ständige Aktivität des G-Proteins Ras zurückzuführen(11.12.2). Es wird in der Zellmembran verankert, indem die Farnesyl-Transferase Farnesol auf ein Cystein von Ras überträgt. Die Transferase ist potenzielles Ziel einer Antitumortherapie.

Proteolyse

GlykierungProteolyse ist die hydrolytische Spaltung von Proteine:VerankerungProteinen, d. h., Peptidbindungen werden mithilfe von ProteolyseH2O gelöst. Protein-Hydrolasen werden unter dem Begriff Proteasen bzw. Peptidasen zusammengefasst. Um ein Protein vollständig abzubauen, sind verschiedene Proteasen nötig.

Einteilung der Proteasen (Peptidasen)

Proteasen können nach Wirkort, Angriffspunkt am Substratmolekül oder nach Wirkmechanismus klassifiziert werden.
Einteilung nach dem Wirkort
  • Extrazellulläre Proteasen:

    • Proteasen zur Aktivierung von Blutgerinnung (Thrombin) und Fibrinolyse (Plasmin)

    • Proteasen des Komplementsystems

    • Matrix-Metallo-Peptidasen

    • Verdauungsproteasen: Nahrungsproteine werden im Magen von Pepsin, im Darm von Pankreasproteasen (Trypsin, Chymotrypsin, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Elastase), in Enterozyten von Di- und Tripeptidasen gespalten.

  • Intrazelluläre Proteasen:

    • Lysosomale Proteasen: unten

    • Prohormon-Konvertasen: 10.6.3

    • Zytosolische Proteasen: unten

    • Signalpeptidasen im ER: 10.6.2

Einteilung nach dem Angriffspunkt am Substratmolekül

  • Endopeptidasen hydrolysieren Peptidbindungen im Inneren von Peptidketten. Sie werden i. d. R. als Zymogene (inaktive Vorstufen, die durch limitierte Proteolyse [10.6.3] aktiviert werden) gebildet.

  • Exopeptidasen spalten Peptidketten von ihrem Ende her. Sie werden i. d. R. nicht als Zymogene gebildet. Man unterscheidet:

    • Aminopeptidasen (Hydrolyse vom N-Terminus her)

    • Carboxypeptidasen (Hydrolyse vom C-Terminus her)

  • Dipeptidasen hydrolysieren Dipeptide.

Endopeptidasen spalten Peptidketten zu kleineren Kettenstücken, von deren Ende Exopeptidasen einzelne Aminosäuren abspalten.

Einteilung nach dem Wirkmechanismus

Lerntipp

Details zu den Katalysemechanismen werden im Physikum erfahrungsgemäß nicht abgefragt. Überblickswissen (z. B. Aspartyl-Proteasen wirken nach dem Säure/Base-Mechanismus) kann jedoch nicht schaden.

Im Folgenden werden kurz die Wirkmechanismen verschiedener Proteasearten illustriert:

  • Aspartyl-Proteasen wie z. B. Pepsin katalysieren nach einem Säure/Base-Mechanismus, der auf zwei Aspartylresten beruht (Abb. 10.37). Ein Asp-Rest entreißt als Base einem H2O-Molekül ein Proton (1), woraufhin OH die Peptidbindung angreifen kann. Der andere Asp-Rest wirkt als Säure, die das entstehende tetraedrische Zwischenprodukt (3) durch Protonierung stabilisiert.

  • Seryl-Proteasen wie z. B. Trypsin und Chymotrypsin spalten eine Peptidbindung im Zuge einer katalytischen Triade, an der die Aminosäuren Aspartat, Histidin und Serin beteiligt sind (Abb. 10.38).

    • Ein negativ geladener Aspartatrest wechselwirkt mit einem H-Atom an einem Stickstoff im Histidin (1). Diese Wechselwirkung geht mit Elektronenverschiebungen (2, 3) im Histidinrest einher, die dazu führen, dass His der OH-Gruppe eines Serinrests ein H+ entziehen kann (3).

    • Der negativ geladene Serinrest (-O) greift das Carbonyl-C-Atom der Peptidbindung als Nukleophil an (4), sodass ein tetraedrisches Zwischenprodukt (5) entsteht.

    • Beide Elektronen der Peptidbindung erhält das an ihr beteiligte N-Atom. Es nimmt ein H+-Atom auf. Die Peptidbindung ist damit gespalten, ein Teil des Proteins (R2) bleibt aber über Esterbindung mit Serin verbunden.

    • Erst beim Zurückfließen der Elektronen im System (6, 7) wird die Esterbindung zwischen Enzym und Substrat hydrolytisch (8) gespalten.

  • Cysteinyl-Proteasen sind in mechanistischer Hinsicht den Seryl-Proteasen ähnlich (Abb. 10.39). Das Nukleophil ist bei ihnen die S-Gruppe eines Serinrests.

  • Metallo-Proteasen (Abb. 10.40) besitzen z. B. einen Glutamatrest, der einem H2O ein H+ entreißt (1), woraufhin OH die Peptidbindung angreifen kann (2). Ein über Histidinreste komplexiertes Zink-Kation (Zn2+) stabilisiert (3) das tetraedrische Zwischenprodukt.

Lysosomale Proteasen

Lysosomen dienen dem Abbau höhermolekularer Verbindungen, die über Endozytose in die Zelle gelangt sind. Dazu enthalten Lysosomen Hydrolasen, vor allem Glykosidasen und Proteasen (u. a. Kollagenase, Elastase, Kathepsine). Da das pH-Optimum der lysosomalen Proteasen im sauren Bereich liegt, sind sie nur in den Lysosomen aktiv. Die Zelle ist so vor ungewollter Proteasenaktivität geschützt.

Die lysosomalen Kathepsine dienen dem Abbau von zelleigenem Material und Fremdprotein, wobei sie eine Schlüsselrolle in der Antigenprozessierung haben: In antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen, B-Zellen, dendritischen Zellen) zerlegen sie phagozytierte extrazelluläre Proteine in Peptide, die an MHC-Klasse-II-Moleküle gebunden auf der Zelloberfläche präsentiert werden(14.2.1). Komplexe aus Fremdpeptid und MHC-Klasse-II-Molekül aktivieren CD4-positive T-Zellen und lösen so eine Immunantwort aus.

Zytosolische Proteasen

Im Zytosol eukaryontischer Zellen ist das 26S-Proteasom die wichtigste proteolytische Einheit. Es besteht aus dem zylindrischen 20S-Proteasom (der eigentlichen Protease) und zwei regulatorischen 19S-Caps. Der Abbau im Proteasom ist ATP-abhängig. Die katalytischen Domänen des Proteasoms wirken im Inneren des zylindrischen Komplexes, d. h., die abzubauenden Proteine werden dorthin transportiert. Die regulatorischen Caps sorgen dafür, dass nur Proteine ins Innere gelangen, die mit dem 76 AS langen Protein Ubiquitin, dem Abbau-Signal der Zelle, markiert sind. Die Zelle steuert durch Ubiquitinmarkierung den Proteinabbau der intrazellulären Proteine. Die einzelnen Schritte der Ubiquitin[yl]ierung sind:

  • Aktivierung von Ubiquitin: ATP wird hydrolysiert und der AMP-Rest auf den C-terminalen Glycylrest von Ubiquitin übertragen:Ubiquitin + ATP Ubiquitin-AMP + PPi

  • Übertragung des Ubiquitinylrests auf den Cysteinyl-(SH-)Rest des regulatorischen Proteins E1:Ubiquitin-AMP + E1-SH E1-S-Ubiquitin + AMP

  • Übertragung des Ubiquitinylrests von E1 auf das regulatorische Protein E2: E1-S-Ubiquitin + E2-SH E2-S-Ubiquitin + E1-SH

  • Übertragung des Ubiquitinylrests von E2 auf die -Aminogruppe von Lysylresten der abzubauenden Proteine: E2-S-Ubiquitin + Protein E2-SH + Protein-Ubiquitin

Das Proteasom hat eine Schlüsselrolle in der Antigenprozessierung: Es zerlegt zytosolische Proteine in Peptide, die an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden auf der Zelloberfläche der meisten Körperzellen präsentiert werden(14.2.1). Komplexe aus Fremdpeptid und MHC-Klasse-I-Molekül aktivieren CD8-positive T-Zellen, die die antigentragende Zelle zerstören. Durch Komplexe aus Eigenpeptid und MHC-Klasse-I-Molekül gibt sich die antigentragende Zelle als selbst zu erkennen.

Tumorentstehung und Tumortherapie: Die Vorgänge auf Gen-Ebene

Proteolyse:Lysosomale ProteasenProteolyse:Zytosolische ProteasenNormale Körperzellen des Menschen sind ausdifferenziert, d. h., sie haben spezielle Funktionen übernommen und weisen ein spezifisches Expressionsmuster sowie eine durch das Zytoskelett bestimmte Struktur auf. Sie befinden sich oft in der G0-Phase des Zellzyklus(11.12) und ihre Teilung (z. B. die der adulten Stammzellen) ist streng kontrolliert. Tumorzellen dagegen sind wenig bis gar nicht differenziert, ihr Zytoskelett ist meist gering ausgeprägt und sie proliferieren (teilen sich) mehr oder weniger ungehemmt. Man unterscheidet:
  • Benigne (gutartige) Tumoren: Ihre Zellen wachsen relativ langsam, nichtdestruierend und sind noch differenzierter.

  • Maligne (bösartige) Tumoren (Krebs): Ihre Zellen wachsen schnell, destruierend, sind entdifferenziert und streuen im schlimmsten Fall im Körper (Metastasenbildung).

Tumorentstehung (Kanzerogenese)

Den Übergang einer gesunden Zelle in eine Tumorzelle nennt man Transformation. Ausgangspunkt der KanzerogeneseTumorentstehung ist die Transformation einer einzigen Zelle aufgrund einer Erbgutmutation. Erfolgt die Mutation in einer Keimzelle, so ist der Tumor vererbbar.
Auslöser der Transformation: Kanzerogene

Alle erbgutverändernden Faktoren (Mutagene) können theoretisch Krebs auslösen. Man nennt sie in diesem Zusammenhang Kanzerogene oder Karzinogene. Man unterscheidet:

  • Chemische Kanzerogene(10.3.4)

  • Physikalische Kanzerogene(10.3.4)

  • Virale Kanzerogene (unten)

Mechanismus der Transformation

Zur Transformation einer Zelle führt/führen

  • die Mutation zellulärer Gene: Die betroffenen Gene können Regulationsproteine der Zellproliferation oder deren Kontrolleure kodieren.

  • Viren, die die Regulation der Zellproliferation außer Kraft setzen (Tumorviren).

Transformation durch Mutation von Protoonkogenen oder Antionkogenen
Kanzerogenese:Kanzerogene

Protoonkogene (c-Onkogene) sind an sich ungefährliche zelleigene Gene, die zur kontrollierten Förderung von Zellproliferation und -differenzierung benötigt werden: Sie kodieren Proteine, die an der Signaltransduktion bei Wachstum und Differenzierung beteiligt sind (Tab. 10.12). Protoonkogene sind i. d. R. dominant, d. h., die Mutation eines Allels reicht für die kanzerogene Wirkung aus. Gefährlich werden Protoonkogene erst durch Mutationen, die ihre Kontrollmechanismen außer Kraft setzen. Ist ein Protoonkogen entsprechend mutiert, spricht man von einem Onkogen. Beispiele sind (Tab. 10.12):

  • Vervielfachung (Amplifizierung) des erbB-Protoonkogens Vervielfachung des EGF-Rezeptors Stimulation der Zellproliferation auch ohne Bindung eines Liganden an den Rezeptor Mammakarzinom

  • Punktmutation im ras-Protoonkogen ständige Aktivität eines ras-Proteins und damit ständige Zellproliferation Blasenkarzinom (H-ras)

  • Translokation des abl-Protoonkogens von Chromosom 9 auf Chromosom 22 Entstehung des sog. bcr-abl-Fusionsgens auf dem veränderten Chromosom 22, das als sog. Philadelphia-Chromosom nachweisbar ist. Das Produkt des Fusionsgens ist ein Protein mit unkontrollierter Tyrosinkinasefunktion chronisch-myeloische Leukämie.

  • Translokation des c-myc-Protoonkogens Kontrolle durch einen anderen Promotor ständige Aktivierung von Transkriptionsfaktoren Lungenkarzinom (Burkitt-Lymphom)

Antionkogene (Tumorsuppressorgene) sind zelleigene Gene, die die Zellproliferation hemmen. Sie kodieren Proteine, die die Genprodukte der Protoonkogene kontrollieren. Antionkogene sind rezessiv, d. h., zur Tumorentstehung führt erst die Mutation beider Allele (z. B. eine ererbte Mutation und eine erworbene). Zwei Beispiele:

  • Retinoblastom-Gen (Rb-Gen): Das Retinoblastom ist ein Tumor der Retina. Ursache ist beispielsweise ein ererbter Defekt (Keimbahnmutation) des Rb-Gens eines der beiden Chromosomen 13 und zusätzlich eine somatische Mutation des Rb-Gens auf dem homologen Chromosom. Das Genprodukt, das Rb-Protein, erfüllt wichtige Funktionen im Zellzyklus: Es bindet in ruhenden Zellen den Transkriptionsfaktor E2F und inaktiviert ihn dadurch. Durch Phosphorylierung des Rb-Proteins wird E2F freigesetzt, die Zelle tritt wieder in den Zellzyklus ein. Bindestellen für E2F sind in den Promotoren verschiedener S-Phasengene vorhanden (z. B. myc, myb), die dem Übertritt von der G1- in die S-Phase dienen.

  • p53-Gen: Das p53-Protein hält eine Zelle von der Teilung ab, wenn ihre DNA beschädigt ist. Das an sich instabile p53-Protein wird als Folge einer Schädigung der DNA posttranslational stabilisiert. Dann wirkt es u. a. als Transkriptionsfaktor für Gene, die den Zellzyklus stoppen. Außerdem fördert p53 die DNA-Reparatur und, wenn eine Reparatur unmöglich ist, die Apoptose(11.13). So wird die Vermehrung mutierter Zellen verhindert. Bei Mutation beider Allele des p53-Onkogens werden Zellen mit Erbgut-Mutationen nicht an der Teilung gehindert, sodass die Zahl der Mutationen mit der Zahl der Teilungen steigen und dadurch irgendwann ein Tumor entstehen kann. Tatsächlich steht offenbar nahezu die Hälfte aller menschlichen Krebsformen mit einem defekten p53-Gen in Zusammenhang.

Mutationen von Genen der DNA-Reparaturenzyme (z. B. bei Xeroderma pigmentosum, 10.3.4) können ebenfalls zur Transformation führen. Der Mechanismus ist ähnlich dem bei Antionkogen-Mutation.Kanzerogenese:Transformation

Transformation durch Tumorviren

Sowohl DNA-Viren wie z. B. HPV (Zervixkarzinom), EBV (u. a. Burkitt-Lymphom) und HBV/HCV (hepatozelluläres Karzinom) als auch RNA-Viren wie z. B. HTLV-1 (adulte T-Zell-Leukämie) können zur Krebsentstehung beitragen. Die Mechanismen sind dabei unterschiedlich.

DNA-Viren profitieren, wenn sie Zellen in die S-Phase zwingen, da dann viele Faktoren für die Replikation des viralen Genoms vorhanden sind. HPV z. B. exprimiert die Proteine E7 und E6, die die zellulären Antionkogene Rb und p53 inaktivieren.

RNA-Viren (oft Retroviren) können die Tumorentstehung prinzipiell auf zwei Arten fördern:

  • Echte virale Onkogene (v-Onkogene) sind ursprünglich zelluläre Protoonkogene (c-Onkogene), die durch Rekombination aus einer infizierten Zelle auf ein Retrovirus übergegangen sind. Die v-Onkogene sind mutiert und die resultierenden Proteine, die die Viren in befallenen Zellen exprimieren, daueraktiv. Solche Tumorviren im eigentlichen Sinne kommen u. a. bei Vögeln vor, beim Menschen spielen sie offenbar keine Rolle. Das humane HTLV1 (human T-cell lymphotropic virus 1) besitzt das Gen tax, das die Zellproliferation fördert, sich aber nicht von einem c-Onko-gen ableitet und somit kein echtes v-Onkogen ist.

  • Insertionale Mutagenese ist eine genetische Veränderung durch zufällige Virusinsertion. Geschieht diese z. B. in der Nähe eines Gens für einen Wachstumsfaktor, verstärken aktivierende Regionen des Virusgenoms auch dessen Transkription.

Merke

  • Protoonkogene (c-Onkogene): Zelleigene Gene, deren Mutation oder übermäßige Expression Tumoren auslösen kann. Falls sie entsprechend verändert sind, spricht man von Onkogenen. Die Mutation eines Allels genügt zur Krebsentstehung.

  • Virale Onkogene (v-Onkogene): Virale Analoga der Protoonkogene, deren Genprodukte tumorauslösend wirken.

  • Antionkogene: Tumorsuppressorgene, deren Genprodukte u. a. die Genprodukte von Protoonkogenen inaktivieren. Die Mutation von einem Allel kann meist noch kompensiert werden, bei Mutation beider Allele entsteht Krebs.

Klinik

Zellen, die sich teilen, sind strahlensensibel. Das hämatopoetische und lymphatische System (Knochenmark, Milz, Thymus, Lymphknoten) sowie z. B. Darmepithel, Gonaden und embryonales Gewebe sind besonders empfindlich. Leukämien und andere Krebsarten der genannten Gewebe können im Einzelfall als strahlenbedingte maligne Erkrankung erkannt werden. Vor allem myeloische Leukämien sowie akute lymphatische Leukämien treten nach Bestrahlung vermehrt auf.

Die familiäre adenomatöse Polypose (FAP) ist durch eine autosomal-rezessive Mutation des APC-Tumorsuppressorgens auf Chromosom 5 bedingt. Die Erkrankung geht mit der Bildung einer Vielzahl von Polypen im Dickdarmbereich einher, von denen meist einige im Laufe der Jahre entarten. Die Krankheit gilt daher als obligate Präkanzerose.

Tumortherapie durch Zytostatika

Prinzip

Zytostatika (Chemotherapeutika) hemmen die Zellteilung, meist durch Wechselwirkung mit der DNA. Die Folge ist eine irreversible Zellschädigung. Besonders betroffen sind teilungsaktive Zellen wie Tumorzellen, aber auch die Teilung körpereigener teilungsaktiver Zellen, z. B. die Zellen der Haare, der Mund- und Darmschleimhaut und des Knochenmarks, wird gehemmt. Oft sind apoptotische Vorgänge(11.13) am endgültigen Zelltod beteiligt.

Praxistipp

Die typischen Nebenwirkungen der Chemotherapie lassen sich durch Schädigung der teilungsaktiven Zellen leicht erklären:

Haarfollikel Haarausfall; Darmschleimhaut Übelkeit und Verdauungsstörungen; Knochenmark Anämie und Leukopenie.

Substanzklassen
Kanzerogenese:TumorvirenZu den Zytostatika zählen die in Tab. 10.13 genannten TumortherapieSubstanzklassen.

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