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B978-3-437-44433-3.00001-5

10.1016/B978-3-437-44433-3.00001-5

978-3-437-44433-3

Präparatherstellung\"\iPräparatherstellung. Erforderliche Präparationsschritte, um von frisch entnommenem Gewebe einen gefärbten und für die lichtmikroskopische Untersuchung geeigneten histologischen Schnitt (Dicke: 5–8 μm) zu erhalten.

(Nach [R252])

Hämatoxylin-Eosin-H.E.-Färbung\"\iFärbung. Hämatoxylin färbt Zellkerne und Zytoplasmaanteile, die reich an rauem endoplasmatischem Retikulum sind, blau-violett. Eosin färbt andere Zytoplasmaanteile sowie viele faserige extrazelluläre Komponenten rot; 1 apokrine Duftdrüsen; 2 holokrine Talgdrüsen; 3 Bindegewebe. Hautdrüsen einer Antilope (Aepyceros melampus); Vergr. 250-fach.

Masson-Trichrom-Masson-Trichrom-Färbung\"\iFärbung, ähnlich der Azan-Färbung (Abb. 1.8). Kollagenfasern des Bindegewebes (1) tiefblau, zelluläre Bestandteile in verschiedenen Rottönen; 2 apokrine Duftdrüse:apokrine\"\iDuftdrüsen; 3 holokrine Talgdrüse:holokrine\"\iTalgdrüsen. Hautdrüsen einer Antilope (Aepyceros melampus); Vergr. 250-fach.

Goldner-Goldner-Färbung\"\iFärbung, gebräuchliche Trichrom-Trichrom-Färbung\"\iFärbung, die Kollagenfasern im Bindegewebe (1) türkisgrün und zelluläre Anteile rotviolett bis rotbraun anfärbt; 2 Schleimhaut (= Mukosa); 3 Brunner-Brunner-Drüse:Goldner-Färbung\"\iDrüsen in der Submukosa. Duodenum einer Katze; Vergr. 200-fach.

Elastika-Elastika-Färbung\"\iFärbung (Orcein-Färbung\"\iOrcein), selektive Darstellung elastischer Membranen und Fasern (➔); 1 Gefäßlumen; 2 Elastica interna, besteht aus kräftiger, gewellt verlaufender elastischer Membran; 3 Media; 4 Adventitia:Elastika-Färbung\"\iAdventitiaTunica:adventitia. Muskuläre Arterie, Mensch; Vergr. 400-fach.

PAS-PAS-Färbung\"\iFärbung (Perjodsäure-Schiff-Perjodsäure-Schiff-Reaktion\"\iReaktion). Darstellung neutraler Glykoproteine und Schleime sowie des Glykogens. Hier ist der Schleim in den mukösen Drüsenzellen der Gl. submandibularis intensiv purpurrot angefärbt, andere glykoproteinhaltige Strukturen, darunter Basalmembranen, treten schwächer hervor. Mensch; Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämalaun (ähnlicher Farbton wie der des Hämatoxylins). Vergr. 200-fach.

Immunhistochemischer Nachweis des Zytokeratins 19Zytokeratin:19, Nachweis\"\i (CK19:immunhistochemischer Nachweis\"\iCK19), einer Komponente des Zytoskeletts. Nur ein Teil der Epithelzellen reagiert positiv (Braunfärbung); es handelt sich mehrheitlich um basal gelegene oder nachwachsende Zellen. Bronchus, Mensch; Vergr. 250-fach.

Schrumpfspalte\"\iSchrumpfspalten (∗) zwischen Epithelbasis und Bindegewebssockel der Dünndarmzotten, sog. Grünhagen-Grünhagen-RaumRäume. Jejunum, Mensch; Azan-Färbung; Vergr. 270-fach.

Schnittdefekt\"\iSchnittdefekt. Durch eine Scharte im Mikrotommesser hervorgerufene kleinere Zerreißungen des Gewebes. Aortenklappe, Mensch; Färbung: Resorcin-Fuchsin; Vergr. 100-fach.

(Aus [R252])

Phasenkontrastmikroskopie, Lebendpräparat\"\iPhasenkontrastmikroskopie bei lebenden Fibroblasten:Phasenkontrastmikroskopie\"\iFibroblasten in Zellkultur. Außer dem Zellkern, einzelnen granulären Zellorganellen und dem Gesamtumriss der Zellen sind kaum Details des Aufbaus dieser Zellen zu erkennen. Vergr. 450-fach.

Ultrastruktur einer Zelle im Transmissionselektronenmikroskop. Leberepithelzelle der Ratte mit großem Zellkern:ElektronenmikroskopieZellkern (1) und typischen Zellorganellen. 2 rauesRetikulum, endoplasmatisches:raues endoplasmatisches Retikulum; 3 glattes endoplasmatisches RetikulumRetikulum, endoplasmatisches:glattes; 4 Golgi-Golgi-Apparat:ElektronenmikroskopieApparat; 5 Mitochondrien; 6 Lysosomen. Als Einschlüsse enthält diese Zelle viel Glykogen (7). An der Oberfläche zum Gallenkanälchen (8) bildet die Zelle Mikrovilli aus. ➔ Nukleolus. Vergr. 12.000-fach.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von leicht dehydrierten Haselnusspollen. Vergr. 1.700-fach.

Schnittpräparat:Interpretation\"\iPräparate:Interpretation\"\iInterpretation von Schnittbildern. Quer- und Längsschnitte durch ein gekrümmtes (a) oder gerades Rohr (b) bzw. durch ein Hühnerei (c) erlauben – für sich allein genommen – weder einen Rückschluss auf die räumliche Gestalt noch einen auf die Zusammensetzung des jeweils vorliegenden Gebildes.

(Nach [G070])

Spezielle Mikroskop:LichtmikroskopLichtmikroskope, Beispiele.VideomikroskopPolarisationsmikroskopPhasenkontrastmikroskopLaserscanning-MikroskopInterferenzmikroskopFluoreszenzmikroskop

Tab. 1.1
Mikroskop Eignung Technik
Phasenkontrastmikroskop lebende (oft ungefärbte) Zellen (Zellkultur, lebende Protozoen)
  • verstärkt den Kontrast von zellulären Strukturen, die im normalen Durchlichtmikroskop kaum zu erkennen sind

  • das Objekt (Präparat) wirkt als Zerteiler des Lichtstrahls zur Ergänzung interferenzfähiger Wellenzüge des Lichts

Interferenzmikroskop (nach Nomarski) lebende Zellen, auch immunhistochemische Präparate mit gefärbten Einzelzellen und ungefärbter Umgebung
  • Teilung des Lichtstrahls vor Eintritt in das Präparat durch spezifische optomechanische Einrichtungen

Fluoreszenzmikroskop Zellstrukturen mit Eigenfluoreszenz oder nach Bindung von Fluorochromen
  • besonders effektiv ist die Auflicht-(Epi-)Fluoreszenzmikroskopie, bei der die Erregerstrahlung von oben auf das Objekt trifft

  • Fluoreszenzbild kann rasch verblassen

Polarisationsmikroskop streng geordnete Strukturen, z. B. parallel angeordnete Kollagenfibrillen oder Pakete parallel verlaufender Myosinfilamente in den A-Banden der Skelett- und Herzmuskulatur
  • hochgeordnete Strukturen verhalten sich im polarisierten Licht doppelbrechend (anisotrop); sie leuchten hell auf, wenn sie zwischen 2 gekreuzten Polarisationsfiltern diagonal verlaufen

  • ungerichtet angeordnete Strukturkomponenten verhalten sich einfach brechend (isotrop) und bleiben im Polarisationsmikroskop immer dunkel

Videomikroskop lebende Zellen (z. B. Wanderung kleinster Partikel in der Zelle)
  • hochauflösende Videokamera, ggf. elektronische Manipulation des entstehenden Bildes

  • „video-enhanced differential interference contrast“ (VE-Dic): Verstärkung schwacher und kleiner Lichterscheinungen (Signale)

konfokales Laserscanning-Mikroskop dicke Präparate, Nachweis subzellulärer Proteinverteilungen und Stoffwechselmetaboliten, zeitaufgelöste Beobachtungen (z. B. die dynamische Verteilung des Zytoskeletts bei der Phagozytose)
  • Rasterung des Präparats mit einem Laserstrahl (meist Krypton-Argon-Laser)

  • Zerlegung des Bildes in Einzelebenen und Synthese zu einem dreidimensionalen Bild

Größenordnungen verschiedener Zelle:GrößenordnungenZellen und Zellbestandteile (Beispiele).

Tab. 1.2
Zelle/Zellbestandteile Größe
ausdifferenzierte Eizelle ca. 250–300 μm
Darmepithelzellen (Höhe) ca. 20–25 μm
Leberepithelzellen (je nach Funktionszustand) ca. 15–30 μm
Lymphozyten ca. 8 μm
Erythrozyten ca. 7,6 μm
Mitochondrien (Länge) ca. 2–5 μm
Mikrovilli (Länge im Dünndarm) ca. 1–1,5 μm
Bakterien ca. 1–2 μm
Viren ca. 10–100 nm
Glykogenpartikel (β-Partikel) ca. 20 nm
Keratinfilamente (Durchmesser) ca. 10 nm

Färbung:FormenFärbungen. (Aus [R252])Zellkern:FärbungenTrichrom-FärbungToluidinblau-FärbungPAS-ReaktionOrcein-FärbungMasson-Trichrom-FärbungKollagen:FärbungenH.E.-FärbungHämatoxylin-Eosin-Färbung\t \"siehe H.E.-FärbungGomori-FärbungGoldner-FärbungFeulgen-DNA-FärbungFettfärbungFärbung:histochemischeElastika-Färbung\bEisenhämatoxylinfärbungAzan-FärbungAlzianblau-FärbungZytoplasma:FärbungenFaser:elastische

Tab. 1.3
Färbung Kerne Zytoplasma Kollagenfasern Elastische Fasern
H. E., Hämatoxylin-Eosin (Abb. 1.2) blauviolett rot; ribosomen- und RER-reiche Regionen blauviolett rot; Typ-I-Fasern werden kräftig gefärbt, Typ-III-Fasern schwach und zart ungefärbt bis rosa
Masson-Trichrom-Färbung (Abb. 1.3)
Celestinblau, Hämalaun, Säurefuchsin, Phosphormolybdänsäure, Methylblau
leuchtend rot blass-rosarot bis schwach bläulich blau ungefärbt (nur in größeren Mengen wie bei elastischen Membranen und Bändern: rot bis rotblau)
Azan-Färbung, Azokarmin/Anilinblau/Orange G (Abb. 3.1.9 und Abb. 3.1.16Abb. 3.1.9Abb. 3.1.16) rot rosa oder rot (Muskulatur ist kräftig rot gefärbt) blau nur wenn in kompakter Menge vorkommend rot
Elastika-Färbung, Resorcin-Fuchsin oder Orcein (Abb. 1.5) schwarzviolett (Resorcin-Fuchsin), rotbraun (Orcein)
van Gieson, Eisenhämatoxylin/Pikrinsäure/Säurefuchsin (Abb. 17.33) blauschwarz gelb bis hellbräunlich rot nicht speziell gefärbt (nur in starken Verdichtungen wie elastischen Membranen und Bändern: gelb)
Trichrom-Färbung nach Goldner, Eisenhämatoxylin/Azophloxin/Lichtgrün (Abb. 1.4) braunschwarz ziegelrot bis bräunlich grün oft nicht speziell gefärbt, z. T. grünlich bis hellrot
Eisenhämatoxylin (EH) nach Heidenhain (Abb. 3.3.2b) Heterochromatin und Nukleolus blauschwarz einzelne Komponenten, z. B. Zentriolen, Intermediärfilamentbündel und Querstreifung in Herz- und Skelettmuskulatur, treten tiefschwarz hervor evtl. grau-gelblich schwach-grau
Versilberungsmethode retikulärer Fasern nach Gomori, Imprägnierung mit Silbersalzen (Abb. 3.2.17) in verschiedenen Abstufungen grau retikuläre Fasern (mit Typ-III-Kollagen) schwarz, typische Kollagenfasern (mit Typ-I-Kollagen) braun
Histochemische Färbungen
PAS-Reaktion (Perjodsäure-Schiff-Reaktion) (Abb. 1.6)
  • Färbung rot-violett

  • Perjodsäure bildet Aldehydgruppen an Molekülen mit vielen Zuckerresten, z. B. Glykogen, Muzinen und Glykoproteinen; das Schiff-Reagens färbt diese rot-violett

  • positiv reagieren z. B. Glykogen, intra- und extrazelluläre Schleime und Basallaminae

Alzianblau (Abb. 5.6d)
  • Färbung blau

  • positiv reagieren unterschiedliche elektrisch negativ geladene Komponenten (Polyanionen), z. B. sulfatierte Schleime, Glukosaminoglykane, Hyaluronsäure; spezifischer Nachweis für Mastzellen

Fettfärbungen (z. B. Sudan III; Sudanschwarz, Ölrot)
  • Färbung je nach Farbstoff, z. B. orange-rot oder braun

  • positiv reagieren Lipide, z. B. Triazylglyzerine (= Triglyzeride) oder Lipide der Markscheiden

Feulgen-DNA-Färbung
  • Färbung purpur

  • HCl bildet Aldehydgruppen an Desoxyribose, dem Zucker der DNA; die Aldehydgruppen reagieren mit dem Schiff-Reagens, das DNA-haltiges Chromatin selektiv purpur anfärbt

Toluidinblau (selektive Basophilie)
  • Färbung blau

  • Toluidinblau, ein basischer Farbstoff, bindet selektiv an die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA und der RNA

  • positiv reagieren Chromatin (DNA), Nukleolus und Ribosomen (RNA)

Begriffe und Methodik

U. Welsch

  • 1.1

    Grundbegriffe1

  • 1.2

    Mikroskopie1

    • 1.2.1

      Lichtmikroskopie1

    • 1.2.2

      Elektronenmikroskopie2

    • 1.2.3

      Auflösungsvermögen und Größen2

  • 1.3

    Präparate für die Mikroskopie3

    • 1.3.1

      Fixieren4

    • 1.3.2

      Einbetten4

    • 1.3.3

      Schneiden4

    • 1.3.4

      Färben4

    • 1.3.5

      Artefakte5

    • 1.3.6

      Lebendpräparate6

  • 1.4

    Präparate für die Elektronenmikroskopie6

    • 1.4.1

      Transmissionselektronenmikroskopie6

    • 1.4.2

      Rasterelektronenmikroskopie8

  • 1.5

    Interpretation histologischerSchnittpräparate10

    • 1.5.1

      Aussage histologischer Schnitte10

    • 1.5.2

      Grundregeln zur Diagnosestellung10

Grundbegriffe

ZellenlehreDie ZellenlehreHistologie:GrundbegriffeZellenlehre erforscht alle Strukturen und Funktionen der Zelle. Die Strukturen der Zelle lassen sich mit Mikroskopen untersuchen, die Zellfunktionen mit biochemischen, molekularbiologischen, immunhistochemischen und zytochemischen Methoden. Die Zellenlehre wird heute verbreitet auch „Zellbiologie“Zellbiologie genannt; stehen strukturelle Betrachtungen über die Zelle im Vordergrund, spricht man auch von „Zytologie“. Die Zellenlehre ist der wesentliche Schlüssel zum Verständnis aller Gewebe- und Organfunktionen.Zytologie

Klinik

Der Begriff „Zytologie“ wird in der Klinik für die Diagnostik von Zellabstrichen oder anders gewonnenen Einzelzellpräparaten gebraucht.

HistologieHistologie Histologie:Definitionist im strengen Sinne die Lehre von den Geweben. Die Gewebe entsprechen einer mittleren Organisationsebene des Körpers und sind „Verbände gleichartig differenzierter Zellen und ihrer Abkömmlinge, der extrazellulären Substanzen“ (W. Bargmann, 1906–1976), die sich nach bestimmten Kriterien einteilen lassen. Heute werden 4 Grundgewebe unterschieden: Epithel-, Binde- (einschließlich Stütz-), Muskel- und Nervengewebe. Diese Einteilung geht auf Albert v. Koelliker (1817–1905) zurück. Alle Organe bestehen aus jeweils eigenen Varianten der 4 Grundgewebe. Durch moderne zellbiologische und entwicklungsgeschichtliche Kenntnisse sind die Grenzen zwischen diesen Geweben fließend: Myofibroblasten besitzen z. B. Merkmale sowohl der Fibroblasten (Bindegewebszellen) als auch der glatten Muskelzellen, quergestreifte Skelettmuskelzellen können bei manchen wirbellosen Tieren Epithelzellen sein, Nervengewebe besitzt spezifische Übereinstimmungen mit Epithelgewebe.
Mikroskopische AnatomieDie mikroskopische Anatomie Anatomie, mikroskopischebefasst sich mit der jeweils spezifischen Ausformung von Zellen und Geweben in den einzelnen Organen. Sie wird daher auch „Organhistologie“ Organhistologieoder „spezielle Histologie“ Histologie:speziellegenannt, da sie das Wissen aus Zellenlehre und Histologie voraussetzt und auf die Organe anwendet. Es geht ihr um das Verständnis der Organfunktionen unter konkreter Berücksichtigung der licht- und elektronenmikroskopischen morphologischen Gegebenheiten.

Mikroskopie

Lichtmikroskopie

Im 17. Jahrhundert wurde das Lichtmikroskop erfunden (Antoni van Leeuwenhoek, 1632–1723) und seither ständig weiterentwickelt. Es erlaubt eine bis 1.000-fache Vergrößerung und ist das wichtigste Gerät im histologischen Unterricht, in der klinischen und pathologischen Diagnostik und in der zellbiologischen Forschung. Es arbeitet mit einer elektrischen Lichtquelle, die das Präparat von unten durchstrahlt (Durchlichtmikroskopie).MikroskopLichtmikroskopieDurchlichtmikroskopie Im Unterricht tauchen zunehmend auch schon digitalisierte Präparate auf.
AufbauEin Lichtmikroskop besteht im Wesentlichen aus einer im Mikroskopfuß eingebauten Lichtquelle, deren Licht von unten durch die Linsensysteme des Mikroskops und durch das Präparat hindurchstrahlt, einem Kondensorlinsensystem, einem Mikroskoptisch, auf dem das histologische Präparat zu liegen kommt, Objektiven (gebräuchliche Vergrößerungen sind 4-, 10-, 20- und 40-fach) und einem oder (besser) 2 Okularen (oberster Teil des Mikroskops, in den man hineinschaut, Vergrößerung meist 10-fach). Blendensysteme erhöhen die Klarheit des Präparats.
VergrößerungDas von den Objektiven erzeugte vergrößerte Bild wird durch das Okular noch einmal vergrößert. Die Gesamtvergrößerung, Vergrößerung, Lichtmikroskopiemit der ein Präparat betrachtet werden kann, ergibt sich aus dem Produkt aus Objektiv- und Okularvergrößerung (z. B. ergibt eine 4-fache Vergrößerung des Objektivs und eine 10-fache Vergrößerung des Okulars eine 40-fache Gesamtvergrößerung).
TypenSpezielle Mikroskope werden in der Forschung eingesetzt (Tab. 1.1):

Elektronenmikroskopie

Das Elektronenmikroskop wurde in den 30er-Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelt und erweiterte die optische Auflösung erheblich.
Mikroskop:ElektronenmikroskopElektronenmikroskopieVergrößerungIn der Routinepraxis sind weit über 100.000-fache Vergrößerungen möglich.
TypenEs lassen sich folgende Typen des Elektronenmikroskops unterscheiden:
  • Beim Transmissionselektronenmikroskop (TransmissionselektronenmikroskopTEM) werden statt des sichtbaren Lichts mit seiner naturgegebenen Wellenlänge Elektronenstrahlen benutzt, deren Wellenlänge viel kürzer ist. Der Strahlengang in Licht- und Elektronenmikroskop ist im Prinzip ähnlich. Statt Glaslinsen werden im TEM sog. Elektronenlinsen verwendet. Elektronenquelle ist eine Kathode, der Elektronenstrahl wird durch Hochspannung beschleunigt und verläuft im Hochvakuum. Das Bild wird durch eine binokulare Lupe auf einem fluoreszierenden Leuchtschirm betrachtet. Mit dem TEM können aufwendig hergestellte kleine (1–3 mm2), sehr dünne (30–80 nm) Gewebeschnitte (Ultradünnschnitte, Dünnschnitte) analysiert werden, praktisch in Fortsetzung der Lichtmikroskopie. Das TEM erlaubt auch die Analyse der hauchdünnen Abdrücke (Replicae), die im Rahmen der Gefrierbruchmethode hergestellt werden.

  • Das Rasterelektronenmikroskop (RasterelektronenmikroskopRaster-EM) arbeitet ohne abbildende Linsen. Ein Präparat wird mit einem gebündelten Elektronenstrahl zeilenförmig abgetastet (gerastert). Der Bildentstehung dienen Rückstreuelektronen (Sekundärelektronen). Detektor ist ein Szintillatorscheibchen. Die Lichtsignale dieses Scheibchens werden durch Fotomultiplier verstärkt und in elektrische Signale rückverwandelt. Das Bild im Raster-EM, das wieder auf einem Leuchtschirm betrachtet wird, entsteht sukzedan über einen Zeilenraster. Im Raster-EM werden natürliche (oder auch künstliche) Oberflächen von Objekten (z. B. Epithelien, Zellen, extrazelluläre Fasern, Hartsubstanzen, Organe, ganze Tiere) betrachtet. Das Objekt muss vor Betrachtung im Raster-EM getrocknet und mit einem dünnen Edelmetallfilm beschichtet werden (Sputtern).

  • Das Rastertunnelelektronenmikroskop Rastertunnelelektronenmikroskoperlaubt die Analyse von Oberflächen bei atomarer Auflösung. Hierbei können nur winzige Rasterflächen (ca. 1 μm2) untersucht werden.

Auflösungsvermögen und Größen

Das bloße Auge hat die Grenze seines Auflösungsvermögens Auge:AuflösungsvermögenAuflösungsvermögen:Augebei ca. 0,08 mm, kann also Strukturen, die gut 100 μm groß sind, noch erkennen. Das Lichtmikroskop Lichtmikroskopie:AuflösungsvermögenAuflösungsvermögen:Lichtmikroskopiehat seine Auflösungsgrenze bei ca. 0,3 μm (in der Routinepraxis bei gut 1.000-facher Vergrößerung), mit ihm lassen sich gut Zellen und Bakterien erkennen. Die üblichen Größenordnungen der Lichtmikroskopie liegen zwischen wenigen Millimetern (mm) und einigen Mikrometern. Das Elektronenmikroskop Elektronenmikroskopie:AuflösungsvermögenAuflösungsvermögen:Elektronenmikroskophat seine Auflösungsgrenze bei ca. 0,3 nm; somit erlaubt es das Studium von Viren und der Ultrastruktur der Zellen und großer Proteinaggregate (zytoplasmatischer Filamente) oder Biopolymere (z. B. Glykogen). Die Größenordnungen der Routine-Elektronenmikroskopie liegen zumeist zwischen mehreren Mikrometern und wenigen Nanometern.
In Tab. 1.2 sind Größenordnungen verschiedener Zellen und Zellbestandteile zusammengestellt.

Präparate für die Mikroskopie

Die üblichen histologischen Präparate im Routinebetrieb der Anatomie, Pathologie, klinischen Forschung und im Histologiekurs werden durch die folgenden methodischen Schritte hergestellt (Abb. 1.1):PräparatherstellungMikroskop:PräparatherstellungPräparate:MikroskopieSchnittpräparat:Mikroskopie
  • Fixieren

  • Einbetten

  • Anfertigen der Schnitte

  • Färben

Fixieren

ZielFixieren soll:
  • Präparatherstellung:FixierenFixierenGewebe so weit wie möglich in naturgetreuem Zustand erhalten und seinen Zerfall bzw. seine Autolyse verhindern

  • Material härten und damit eine bessere Schneidbarkeit bewirken

  • vorhandene Bakterien oder andere Krankheitserreger im Untersuchungsgut abtöten

VorgehenOft werden Gewebeproben einfach in die Fixierungslösungen eingelegt (Immersionsfixierung).Immersionsfixierung Eine bessere Fixierung gelingt mit der Perfusionsfixierung, mit der das zu fixierende Organ über sein eigenes Gefäßsystem mit Fixierungsmittel durchspült und fixiert wird.
ÄquivalenzbildViele Fixierungsmittel, Fixierungsmittelz. B. 5-prozentige neutrale Formaldehydlösung, Pikrinsäure, Sublimat und Alkohol, sind erhebliche Eiweißfäller und Eiweißvernetzer. Die natürliche Struktur der lebenden Zelle wird daher mehr oder weniger deutlich umgebaut und das histologische Bild ist nur noch äquivalent mit dem lebenden Gewebe, nicht mehr identisch mit ihm. Mit dem Äquivalenzbild lässt sich jedoch gut arbeiten – nur sind die Ergebnisse verschiedener Methoden gedanklich zusammenzubringen, um ein Bild der lebendigen Zelle und ihrer Dynamik zu erhalten.

MERKE

Auch die beste technische Aufarbeitung von Zellen und Geweben ergibt nie ein vollkommenes Abbild der lebenden Zelle. Man spricht daher von einem ÄquivalenzbildÄquivalenzbild.

Einbetten

ZielDie fixierten Gewebeproben werden in erstarrendes Paraffin eingebettet und so verfestigt, um dann geschnitten werden zu können.
Präparatherstellung:EinbettenEinbettenVorgehenDie fixierten Proben werden zunächst in geeignete Lösungsmittel gebracht. Dazu dient eine schrittweise in der Konzentration ansteigende Alkoholreihe. In dieser Phase der Präparatherstellung können verschiedene Artefakte Präparatherstellung:ArtefakteArtefakt:Präparatherstellungwie Schrumpfungen und Zerreißungen des Gewebes entstehen. Anschließend werden die Präparate in Paraffin oder besser Paraplast eingebettet. Alternativ kann ein Kunstharz (z. B. Methacrylat) zur Einbettung verwendet werden (im folgenden Text und in den Bildlegenden als „Plastik“ gekennzeichnet). Plastikschnitte sind nur 1–2 μm dick und zeigen zelluläre und gewebliche Strukturen viel klarer als die 5–8 μm dicken Paraffinschnitte, in denen sich zahlreiche Strukturen überlagern. Eine weitere Möglichkeit ist die Kryomikroskopie, Kryomikroskopiebei der frische Organstücke in flüssigen Stickstoff eingebracht und dadurch verfestigt werden. Anschließend werden die Gewebeproben auf einem speziellen Gefriermikrotom geschnitten. Dieses Vorgehen vermeidet sowohl den Wasserentzug mit der Gefahr der Gewebeschrumpfung als auch die fettlösenden Lösungsmittel. Bei der Kryomikroskopie bleiben somit viele molekulare Komponenten in natürlicher Konfiguration erhalten, die dann mit histochemischen Methoden nachgewiesen werden können, z. B. die Enzyme der Atmungskette. Gefrierschnitte können außerdem sehr rasch angefertigt werden, sodass z. B. intraoperativ eine histologische Diagnose gestellt werden kann.

Schneiden

ZielEs werden dünne Schnitte hergestellt, die dann gefärbt werden können.
SchneidenPräparatherstellung:SchneidenVorgehenBei den lichtmikroskopischen Routinepräparaten sind die Schnitte ca. 5–8 μm, nach Einbettung in Kunstharz nur 1–2 μm dick. Dazu sind spezielle Schneidegeräte (Mikrotome) erforderlich. Die Kryomikroskopie erfordert spezielle Gefriermikrotome.

Färben

ZielDie verschiedenen Zell- und Gewebselemente nehmen Farbstoffe mit unterschiedlicher Affinität auf und können dadurch besser unterschieden werden.
Präparatherstellung:FärbenFärbungVorgehenDie meisten Farblösungen sind wässrige Lösungen. Daher muss der Schnitt wieder entparaffiniert und über weitere Zwischenstufen in Wasser gebracht werden. Die verschiedenen Zell- und Gewebselemente nehmen dann die Farbstoffe unterschiedlich auf: Komponenten mit negativen elektrischen Ladungen (anionische Komponenten), z. B. die DNA, nehmen basische (kationische) Farbstoffe, z. B. das Hämatoxylin, auf und werden basophil Basophiliegenannt (z. B. Zellkern, manche Muzine, extrazelluläre Proteoglykane und Nissl-Schollen). Zell- und Gewebekomponenten mit positiven elektrischen Ladungen, also kationischen Komponenten, nehmen saure (anionische) Farbstoffe auf und werden azidophil Azidophilieoder eosinophil Eosinophiliegenannt, weil der am häufigsten gebrauchte saure Farbstoff Eosin heißt. Saure Farbstoffe färben z. B. Erythrozyten und Kollagen.

MERKE

  • Basophil sind anionische Strukturen (mit negativen elektrischen Ladungen), sie nehmen basische Farbstoffe (z. B. Hämatoxylin) auf (z. B. Chromatin im Zellkern, manche Muzine, extrazelluläre Proteoglykane und Nissl-Schollen).

  • Eosinophil sind kationische Strukturen (mit positiven elektrischen Ladungen), sie nehmen saure Farbstoffe (z. B. Eosin) auf (z. B. Erythrozyten, Kollagen).

Routinefärbungen
Die typische Routinefärbung ist die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H. E.-Färbung, Abb. 1.2). Weitere Routinefärbungen (Tab. 1.3) sind die Azan- (Abb. 1.8), die Masson-Trichrom- (Abb. 1.3), die Van-Gieson- (Abb. 17.33) und die Goldner-Färbung (Abb. 1.4), die insbesondere die Verteilung des Kollagens klar erkennen lassen. Die Elastika-Färbungen machen das Elastin der elastischen Fasern sichtbar (Abb. 1.5).
Histochemische Methoden
Unter den Spezialfärbungen nehmen die histochemischen Methoden eine vorrangige Stellung ein; Tab. 1.3 nennt häufig verwendete Färbungen. Mit der Substrat- und Enzymhistochemie gelingt es, eine Fülle der verschiedensten definierten chemischen Substanzen, wie zahlreiche Enzyme, Glykogen, Ribo- und Desoxyribonukleinsäuren, Proteine, Proteoglykane oder Lipide, am Ort ihres natürlichen Vorkommens in Zellen und Geweben nachzuweisen, wodurch man einen guten Einblick in das dynamische Zellgeschehen erhält (Abb. 1.6).Routinefärbung
Färbung:histochemischeLektinhistochemieMit Lektinhistochemiekäuflich erwerbbaren Lektinen lassen sich spezifische Zuckerkomponenten in Zellen und Geweben nachweisen, z. B. in Glykokalyx und Schleimen.
ImmunhistochemieDabei Immunhistochemiewerden spezifische chemische Verbindungen, insbesondere Peptide und Proteine, mit einer Antigen-Antikörper-Reaktion nachgewiesen (Abb. 1.7). Das Prinzip ist, dass ein Gewebeschnitt, in dem eine bestimmte chemische Komponente, ein Antigen, nachgewiesen werden soll, mit einer Lösung inkubiert wird, in der ein spezifischer Antikörper gegen das gesuchte Antigen enthalten ist. Der Antikörper bindet sich an die Stellen in Zellen oder im extrazellulären Raum, an denen das Antigen vorkommt. Diese Reaktion kann z. B. sichtbar gemacht werden, indem der Antikörper mit einer fluoreszierenden Substanz markiert ist oder in einem zweiten Reaktionsschritt mit einem weiteren Antikörper markiert wird, der seinerseits mit einem Enzym (oft Peroxidase) markiert ist. Das Enzym wird dann mit klassischen enzymhistochemischen Methoden nachgewiesen.
In-situ-HybridisierungBei In-situ-Hybridisierungder In-situ-Hybridisierung können Nukleinsäuren im histologischen Schnitt durch komplementäre Proben (Oligonukleotide von RNA oder DNA, die radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert sind) lokalisiert werden. Damit lassen sich im Schnitt spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen nachweisen. Die Methode kann auch an Chromosomen, an Zellausstrichen oder an Ganzkörperpräparaten kleiner Tiere durchgeführt werden.

Artefakte

Artefakte sind präparativ-technisch bedingte Kunstprodukte und entstehen z. B. durch schlechte oder nicht sofort durchgeführte Fixierung, alte Farblösungen, Scharten im Mikrotommesser oder aggressive Dehydrierung. Häufige Folgen sind kleinere oder größere Risse an der Grenze zwischen Geweben unterschiedlicher Konsistenz, z. B. zwischen Knorpel und Perichondrium. Auch Schrumpfspalten bilden sich gerne zwischen Geweben unterschiedlichen Aufbaus, z. B. zwischen Epithel und Bindegewebe (Abb. 1.8). Weitere mögliche Ursachen sind Quetschungen des Gewebes oder Gewebezerreißungen (Abb. 1.9). Die Kenntnis solcher Artefakte ist bei der Beurteilung eines Präparats sehr wichtig.

Lebendpräparate

Auch lebende Zellen und Gewebe können mit dem Mikroskop untersucht werden: Phasenkontrast- und Interferenzmikroskopie verstärken den Kontrast der lebendigen Zellstrukturen (Abb. 1.10), der sonst im Routine-Durchlichtmikroskop sehr schwach ist. Durch farb- oder fluoreszenzfarbstoffmarkierte Substanzen ist es so u. a. möglich, eine Endozytose oder die Umstrukturierung von Zellfortsätzen zu verfolgen. Varianten der Lebendmikroskopie sind z. B. der Einsatz von ultraviolettem Licht, Polarisationsmikroskopie und Dunkelfeldmikroskopie.Artefakt

Präparate für die Elektronenmikroskopie

Transmissionselektronenmikroskopie

FixierenFür die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sind besonders schonende Fixierungsverfahren nötig, um ein möglichst naturgetreues Abbild der Struktur lebender Zellen zu gewinnen. Das Gewebe muss möglichst sofort oder innerhalb weniger Minuten nach Entnahme oder Tod fixiert werden. Arbeitet man mit Versuchstieren, ist eine Perfusionsfixierung des narkotisierten Tiers optimal. Fixierungslösung ist erst gepuffertes LebendpräparatPräparate:ElektronenmikroskopieElektronenmikroskopie:PräparateGlutaraldehyd,Schnittpräparat:ElektronenmikroskopieTransmissionselektronenmikroskopie:Präparate Präparate:TransmissionselektronenmikroskopieGlutaraldehyddann Osmiumtetroxid. OsmiumtetroxidDas Schwermetall Osmium bindet an Lipide und erhöht z. B. den Kontrast von biologischen Membranen.
Einbetten, SchneidenNach Entwässerung werden Kunstharze wie Araldit oder Epon zum Einbetten eingesetzt. Mit Ultramikrotomen Ultramikrotomwerden 30–80 nm dicke Schnitte hergestellt.
FärbenDie Schnitte sind so dünn, dass die in ihnen vorhandenen Zellstrukturen kontrastiert („gefärbt“) werden müssen (Abb. 1.11), und zwar mit Uranylazetat, Bleizitrat und u. U. Phosphorwolframsäure.
MetallkopplungBei experimenteller Untersuchung können metallgekoppelte (Gold, Eisen, Kupfer) Substanzen, z. B. Lektine, eingesetzt werden. Die Metalle besitzen im TEM-Präparat einen hohen Kontrast und sind daher gut zu erkennen. Damit kann z. B. ein an sich unsichtbares Glykoprotein von der Aufnahme in die Zelle bis zum Abbau verfolgt und können Proteoglykane bzw. Glukosaminoglykane lokalisiert werden.
ImmunelektronenmikroskopieBei der Immunelektronenmikroskopie können z. B. Proteine mittels goldmarkierter Antikörper im TEM in situ nachgewiesen werden.
NegativkontrastierungBei einem Spezialverfahren, der Negativkontrastierung, können Zellpartikel, Bakterien oder Viren auf einen hauchdünnen transparenten Film aufgetragen werden. Die Objekte werden mit Schwermetallsubstanzen umgeben, wodurch sie hell in dunkler Umgebung erscheinen.
GefrierbruchmethodeBei Gefrierbruchmethodeder Gefrierbruchmethode werden freigelegte Flächen tiefgefrorener kleiner Gewebeproben mit einem hauchdünnen Metallfilm bedampft. Der so gewonnene Abdruck wird im TEM betrachtet. Zelluläre Membranen brechen entlang der hydrophoben Mittelschicht, sodass die Innenansichten der äußeren und inneren Membranhälften freiliegen und analysiert werden (Abb. 2.22c, f)

Rasterelektronenmikroskopie

Die Rasterelektronenmikroskopie beruht auf eigenen Prinzipien und erlaubt die Analyse von echten zellulären und epithelialen Oberflächen (Abb. 1.12).

Interpretation histologischer Schnittpräparate

Aussage histologischer Schnitte

Aussage und Beweiskraft histologischer Schnittpräparate müssen immer kritisch beurteilt werden:Rasterelektronenmikroskopie:PräparatePräparate:RasterelektronenmikroskopieHistologie:Interpretation von SchnittpräparatenPräparate:InterpretationSchnittpräparat:Interpretation
  • Das histologische Schnittpräparat liefert stets nur ein Momentbild eines sich ständig wandelnden lebendigen Ganzen.

  • Die meisten Schnittpräparate sind nur eine hauchdünne Scheibe eines u. U. sehr großen Organs, wie z. B. der Leber. In einem großen Organ können Strukturen unregelmäßig verteilt und müssen nicht zwangsläufig in jedem Schnitt vorhanden sein.

  • Das Schnittpräparat entwirft ein zweidimensionales Bild der immer dreidimensionalen Zellen und Gewebe. Die dritte Dimension erschließt sich z. B. erst, wenn dicke Schnitte verwendet und „durchfokussiert“ werden, oder in Serienschnitten.

Der Einzelschnitt erlaubt daher nur ausnahmsweise unmittelbare Rückschlüsse auf die wahre Gestalt der Bauelemente von Zellen und Geweben: Schneidet man ein hart gekochtes Ei an einem seiner beiden Pole quer, wird der zentrale Dotter nicht angeschnitten sein – er ist aber dennoch vorhanden. Ein Tangentialschnitt,TangentialschnittSchnittpräparat:TangentialschnittPräparate:Tangentialschnitt also ein flacher Anschnitt durch die Oberfläche einer Struktur, ergibt ein völlig anderes Bild als ein Querschnitt,Präparate:QuerschnittSchnittpräparat:Querschnitt also ein Schnitt mitten durch die gleiche Struktur. Der Querschnitt wiederum kann völlig andere Strukturen anschneiden als der Längsschnitt: Ein quer geschnittener gekrümmter Schlauch sieht völlig anders aus als ein Längsschnitt Schnittpräparat:LängsschnittPräparate:Längsschnittdurch den gleichen Schlauch (Abb. 1.13). Finden sich in einer Zelle 2 Kernanschnitte, beweist das nicht, dass die Zelle 2 Kerne hat – im Gegenteil, meist ist ein gekrümmter Kern zweimal angeschnitten worden.

Grundregeln zur Diagnosestellung

Ein unbekanntes histologisches Schnittpräparat kann oft schon mit der schwächsten, höchstens aber einer mittleren Vergrößerung erkannt und von anderen unterschieden werden:Histologie:Diagnosestellung\b
Schnittpräparat:DiagnosestellungPräparate:Diagnosestellung\bBetrachtung mit bloßem AugeBestimmte Organe sind bei typischer Schnittrichtung bereits mit bloßem Auge zu erkennen, z. B. ein Medianschnitt durch die Hypophyse, ein Querschnitt durch die Nebenniere oder ein Längsschnitt durch den Dünndarm.
Prüfung mit schwächster VergrößerungMit der schwächsten Vergrößerung des Mikroskops sind Gliederungsmerkmale zu finden: Innen- und Außenzonen (entsprechen Mark und Rinde), natürliche (epithelbedeckte) Oberflächen oder Kapseln, Bezirke, die sich färberisch ganz unterschiedlich verhalten, Lichtungen, regelmäßige Erhebungen der Oberfläche, z. B. Falten.
Außerdem ist bei schwächster Vergrößerung an (allen!) freien Rändern zu erkennen, ob ein Epithel Epithel:Diagnosestellungvorhanden ist. Ist dies der Fall, kann das Epithel die besten differenzialdiagnostischen Hinweise geben. Findet sich z. B. ein „einschichtiges prismatisches Epithel“, kann ein Schnitt durch den Magen-Darm-Kanal, die Tuba uterina oder die Gebärmutter vorliegen. Die typische Schichtengliederung des Darmrohrs ordnet das Präparat dem Magen-Darm-Kanal zu; fehlende Schichten, aber nachweisbare Kinozilien sind typisch für die Tuba uterina und die Gebärmutterschleimhaut in bestimmten Zyklusphasen – reich verzweigte Falten sprechen dann für die Tuba uterina, das Einsenken des Epithels zu Drüsenschläuchen für die Uterusschleimhaut. Fehlen Kinozilien und tubuläre Drüsen und sind an der Oberfläche schlanke, mit einschichtigem prismatischem Epithel bedeckte Falten ausgebildet, muss die Gallenblase differenzialdiagnostisch in Betracht gezogen werden.
Beispiel seröse DrüsenBei der Differenzialdiagnose seröser Drüsen Drüse:serösemuss auch das Pankreas berücksichtigt werden. Das Pankreas Pankreas:Diagnosestellungenthält Langerhans-Inseln und zahlreiche zentroazinäre Zellen, aber weder Streifenstücke noch Myoepithelzellen in den Azini. Die Langerhans-Inseln sind selten und fehlen auf manchen Schnitten; denkt man nun an die zentroazinären Zellen, benötigt man eine relativ hohe Auflösung und auch einige Erfahrung – viel leichter ist es, bei niedriger Auflösung nachzuweisen, dass keine Streifenstücke vorhanden sind.

MERKE

Diagnose eines histologischen Schnitts

  • Präparat erst mit bloßem Auge betrachten – kompaktes Organ, Hohlorgan, künstliche (gerade) Schnittkanten oder natürliche Oberflächen?

  • Präparat mit schwächster Vergrößerung prüfen – Gliederung (z. B. Rinde/Mark, Läppchen), bestimmte Konfigurationen von Lumina? Welche Epithelien finden sich an natürlichen Oberflächen?

  • Gesamten Schnitt bei kleiner und mittlerer Vergrößerung durchmustern – sorgfältige spezifische Gewebediagnosen, Erkennen von Flach- bzw. Tangentialschnitten und Artefakten.

  • Nur für zelluläre Details stark vergrößern, z. B. bei der Unterscheidung von Kinozilien und Bürstensaum.

Lernhinweise zu Kapitel 1 ▸ im Anhang

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