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B978-3-437-29695-6.50028-5

10.1016/B978-3-437-29695-6.50028-5

978-3-437-29695-6

Elektromagnetisches Spektrum. Wellenlänge der Strahlung in Nanometer (nm) und Farbskala des sichtbaren Lichts zwischen 400 und 780 nm.

Lambert-Beer-Gesetz und Schema eines Spektralphotometers. Die Küvette (d = 1 cm) enthält die zu messende Substanz (Konzentration c in mol/L).

UV/VIS-Spektren von Hämoglobin in Wasser (a), von Chlorophyll in Methanol (b).

UV-Spektren von NAD und NADH in Wasser bei pH = 7.

Schwingungsfreiheitsgrade des H2O- und CO2-Moleküls.

IR-Spektrum von Acetylsalicylsäure in KBr.

1H-NMR-Spektrum von Essigsäureethylester in CDCl3 bei 300 MHz.

13C-NMR-Spektrum von Essigsäureethylester in Deuterochloroform (CDCl3) bei 125,7 MHz.

Vergleichende MRT- und CT-Aufnahmen des Kopfes eines Patienten. Sagittale Aufnahmen (oben) und axiale Aufnahmen (unten).

Schematische Darstellung eines MR-Tomographen: a) Längsschnitt, b) Querschnitt

(aus Kauffmann G, Moser E, Sauer R. Radiologie. 3. A. München, Urban & Fischer, 2006).

Struktur der Acetylsalicylsäure im Kristall.

(modifiziert nach Kim Y et al. Chem Pharm Bull 1985;33:2641 2647)

a) Röntgenaufnahme einer rechten Hand; b) Schädel-CT mit Augenlinsen.

a) (aus Wicke L. Röntgenanatomie. 7. A. München, Elsevier/Urban & Fischer, 2005) b) (axiale Aufnahme)

EI-Massenspektrum von Acetylsalicylsäure (C9H8O4, Molmasse 180).

Valenzschwingungen ausgewählter funktioneller Gruppen.

Tab. 22/1
Bindung funktionelle Gruppe Wellenzahl
C - H aliphatische CH3-Gruppe 2850 – 2960 cm−1
O - H Alkohol (nicht assoziiert) 3590 – 3600 cm−1
C=O aliphatischer Ester 1735 – 1750 cm−1
Keton 1705 – 1725 cm−1
aromatische Carbonsäure 1680 – 1700 cm−1
C=C Alken 1620 – 1680 cm−1
C - O Alkohol 1040 – 1150 cm−1

Spektroskopie in Chemie und Medizin

Orientierung

Als Ärztin oder Arzt benötigen Sie für Ihre Diagnose häufig Daten, die mit spektroskopischen Methoden gewonnen wurden. Dazu gehören z. B. „Laborwerte” aus Blutuntersuchungen, Röntgenbilder bei Verletzungen oder Aufnahmen aus der Kernspin- oder Computer-Tomographie bei Krebserkrankungen. Um die Methoden anwenden zu können, bedarf es jeweils einer speziellen Ausbildung an z. T. sehr teuren Geräten. Dies zu lernen, bleibt Spezialisten vorbehalten. Sie sollten die Ihnen vorgelegten Daten aber beurteilen und die Bilder, „lesen” können, damit Sie auf der Diagnose eine für den Patienten hilfreiche Therapie aufbauen können.

Im Folgenden erhalten Sie einige grundlegende Informationen über chemisch-analytische Verfahren als Vorbereitung auf spätere Ausbildungsabschnitte. Die Inhalte gehören nur bedingt zu den Prüfungsanforderungen im Rahmen der naturwissenschaftlichen Grundausbildung. Die spektroskopischen Methoden basieren jedoch auf Eigenschaften von Substanzen, die nur aus der Chemie heraus zu verstehen sind.

Antwort erhalten Sie u. a. auf folgende Fragen:

  • Welche Informationen können mit sichtbarem oder infrarotem Licht gewonnen werden?

  • Worauf basiert die NMR-Spektroskopie und was wird angezeigt?

  • Worin unterscheiden sich die Diagnostikmethoden MRT und CT?

  • Wie lassen sich von kleinen und großen Molekülen die Molekülmassen genau bestimmen?

  • Welche Möglichkeiten eröffnen Röntgenstrahlen?

Allgemeines

Die spektroskopischen Eigenschaften gehören zu den physikalischen Eigenschaften einer chemischen Substanz. Sie dienen der Identifizierung einer Verbindung, ermöglichen Reinheitsbestimmungen oder erlauben die Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen.
In der Spektroskopie nutzt man die Wechselwirkungen einer Substanz mit elektromagnetischer Strahlung verschiedener Wellenlänge. Man beobachtet dabei z. B. Absorption (Aufnahme von Strahlung), Emission (Abgabe) oder Streuung der Strahlung. Die Quantenmechanik bildet die Grundlage für die Beschreibung dieser Phänomene.

Absorption

Emission

Das elektromagnetische Spektrum (Abb. 22/1) reicht von sehr energiereicher kosmischer γ-Strahlung mit kurzer Wellenlänge bis zu energiearmen Radiowellen großer Wellenlänge. Die für das menschliche Auge sichtbare Strahlung zwischen 400 und 780 nm stellt nur einen sehr kleinen Ausschnitt innerhalb dieser Skala dar. Für die verschiedenen Arten der Spektroskopie (lat. spectrum = Abbild, griech. skopein = schauen) wird Strahlung aus bestimmten Bereichen der Skala in Abbildung 22/1 verwendet. Werden andere physikalische Parameter gemessen, spricht man von Spektrometrie, z. B. werden die Massen von Ionen einer Substanz mit Hilfe der Massenspektrometrie bestimmt.

elektromagnetisches Spektrum

Wir betrachten im Folgenden eine kleine Auswahl an Methoden, bedienen damit ein erstes Verständnis und versuchen eine Brücke zur Anwendung der Methoden zu schlagen.

UV/VIS-Spektroskopie

Die UV/VIS-Spektroskopie (ultraviolett/visible) findet breite Anwendung in der qualitativen und quantitativen Analyse, in der Medizin z. B. zur Bestimmung der Konzentration verschiedener Stoffe im Blut, die vorher entsprechend aufbereitet werden müssen. Dann wird ultraviolettes oder sichtbares Licht mit einer definierten Wellenlänge λ (z. B. 480 nm) durch eine Lösung des zu analysierenden Stoffes geschickt und die Änderung der Lichtintensität gemessen. Eine Abnahme bedeutet, dass die Moleküle in der Probenlösung Licht absorbieren, d. h. Energie aufnehmen. Absorption kommt durch Elektronenübergänge von energieärmeren auf energiereichere Molekülorbitale zustande.
Mathematisch wird die Intensitätsabnahme des Lichtstrahls durch das Lambert-Beer-Gesetz ausgedrückt (Abb. 22/2), wobei I0 die Intensität vor und I die Intensität nach Durchtritt durch die Lösung in der Küvette wiedergeben. Man definiert die Extinktion E (= optische Dichte) bei gegebener Wellenlänge. E ist von der Konzentration c (mol/L) der Probe abhängig, von der Schichtdicke d (cm) der Messzelle (= Küvette) sowie vom molaren Extinktionskoeffizienten ε, einer stoffspezifischen Konstanten.

Lambert-Beer-Gesetz

molarer Extinktionskoeffizient

Absorptionsmaxima

Absorptionsmaxima.
Variiert man die Wellenlänge λ innerhalb eines bestimmten Bereiches (meist 200 – 800 nm) und zeichnet die zu jeder Wellenlänge gehörende Extinktion E als Messpunkte auf, so erhält man das charakteristische UV/VIS-Spektrum einer Verbindung, das durch seinen Verlauf qualitative Aussagen ermöglicht. Die Spektren weisen z. B. Absorptionsmaxima bei der Wellenlänge λmax auf, die für bestimmte im Molekül enthaltene Teilstrukturen charakteristisch sind. λmax = 413 nm deutet auf das Häm im Hämoglobin (Abb. 22/3a) hin. Die Absorptionsmaxima erscheinen nicht als scharfe Banden, sondern sind immer verbreitert. Dies liegt darin begründet, dass neben den Übergängen der Elektronen auch die Schwingungen einzelner Bindungen im Molekül und dessen Rotation angeregt werden ( Kap. 22.3).
Da je nach eingestrahlter Wellenlänge immer nur Übergänge bestimmter Elektronen innerhalb eines Moleküls angeregt werden, lässt sich durch UV/VIS-Spektroskopie nicht die komplette Struktur einer unbekannten Verbindung bestimmen. Möglich ist es jedoch, einzelne Strukturelemente und somit die Zugehörigkeit zu bestimmten Verbindungsklassen zu erkennen. Die für das Auftreten eines Absorptionsmaximums verantwortliche Teilstruktur bezeichnet man als Chromophor. Liegt das Absorptionsmaximum eines Chromophors bei einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich (400 – 780 nm), so erscheint die Verbindung farbig. Dem weißen Sonnenlicht fehlt eine Farbe, das Auge nimmt nur die Farbe wahr, die übrig bleibt. Dies ist die Komplementärfarbe zur Farbe des absorbierten Lichts. Absorbiert ein Chromophor blaues Licht (380 – 460 nm), erscheint die Verbindung dem Auge gelb/orange. Wird gelb/orangefarbenes Licht absorbiert (540 – 640 nm), erscheint die Verbindung blau. Häufig absorbieren Chromophore jedoch bei mehreren Wellenlängen, es kommt zu Mischfarben.

Chromophor

Das Hämoglobin z. B. wäre mit der Absorptionsbande bei 413 nm (Abb. 22/3a) nur gelb, erst in Verbindung mit den kleineren Absorptionsbanden zwischen 500 und 600 nm tritt die typische rote Farbe hervor. Chlorophyll (Abb. 22/3b) absorbiert bei 431 und 664 nm, das hindurchtretende Licht erscheint dem Auge grün. Farbstoffe sind in der Natur weit verbreitet und weisen häufig konjugierte Doppelbindungen und aromatische Systeme auf. Ergänzend zu nennen sind z. B. Indigo, das Jeans-Blau aus dem Indigostrauch (Indigofera tinctoria L.), oder Alizarin aus Krappwurzeln (Rubia tinctorium L.), ein Dihydroxyanthrachinon.

Indigo

Photometrie.
Wird die UV-Spektroskopie für die quantitative Analyse von Stoffen genutzt, spricht man von Photometrie. Die oft farblose Probe wird hierbei gegebenenfalls durch Umsetzung mit geeigneten Reagenzien in eine farbige Verbindung überführt, um deren spezifische Lichtabsorption in einem Photometer bei der Wellenlänge λmax zu messen. Die Bestimmung vieler „Blutwerte” (z. B. Hämoglobin, Glucose) beruht auf diesem Verfahren. Weitere Anwendungen sind die Konzentrationsbestimmung bekannter Verbindungen, wie z. B. von aromatischen Aminosäuren aus Proteinen oder von Oligonucleotiden der DNA bzw. RNA mit ihren aromatischen Basen.

Photometrie

In Abbildung 22/4 sind als ein weiteres Beispiel die UV-Spektren des von vielen Dehydrogenasen benötigten Coenzyms NADH bzw. NAD (Kap. 21.3) gezeigt. Da NADH ein deutliches Absorptionsmaximum bei λ = 340 nm besitzt, während NAD bei dieser Wellenlänge keine nennenswerte Absorption zeigt, ergibt sich die Möglichkeit, die Zunahme oder Abnahme von NADH zu messen, wenn dieses Redoxsystem Teil eines Enzymtests ist.

Photometrische Blutuntersuchungen

Von diagnostischer Bedeutung für Lebererkrankungen wie Hepatitis sowie für Myokardinfarkt ist u. a. die Bestimmung der Aktivität des Enzyms Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT). Transaminasen katalysieren die Umwandlung von Aminosäuren in die entsprechenden α-Ketosäuren. GOT ist in den Zellen des Gewebes weit verbreitet und liegt innerhalb der Zellen im Zytoplasma und in den Mitochondrien vor. Bei Zellschädigung wird GOT freigesetzt, d. h., der GOT-Spiegel im Blut deutet auf den Grad einer Zellschädigung hin.
Die Bestimmung des GOT-Spiegels im Blutplasma wird vollautomatisch durchgeführt und erfolgt in einem gekoppelten Enzymtest. In einer ersten Reaktion werden aus α-Ketoglutarat und l-Aspartat durch GOT l-Glutamat und Oxalacetat gebildet. Diese Reaktion lässt sich photometrisch nicht direkt verfolgen. Daher wird in einer zweiten Reaktion das Reaktionsprodukt Oxalacetat durch Malatdehydrogenase (MDH) zu Malat reduziert. Das NADH wird hierbei zu NAD oxidiert. Die Abnahme der NADH-Konzentration wird bei der Wellenlänge 340 nm photometrisch verfolgt. Eine starke Abnahme von NADH ist auf eine hohe Konzentration an Oxalacetat zurückzuführen, was einer hohen Konzentration an GOT entspricht. Der Messwert kann für die Diagnose genutzt werden.

IR-Spektroskopie

IR-Spektroskopie wird zur Identifizierung und Strukturaufklärung organischer Verbindungen eingesetzt, z. B. bei der Analytik von Nierensteinen. Sie erlaubt die Unterscheidung einzelner funktioneller Gruppen und dient damit der Zuordnung einer Substanz zu einer Verbindungsklasse. Infrarote (IR) Strahlung hat eine größere Wellenlänge als UV-Strahlung und ist somit energieärmer als diese ( Abb. 22/1). Sie wird auch als Wärmestrahlung bezeichnet, Infrarotlicht durchwärmt z. B. bestrahlte Körperteile.
Schwingungsanregung.
Bei der IR-Spektroskopie werden durch Absorption von infrarotem Licht Schwingungen innerhalb des Moleküls angeregt. Bedingung für die Detektion dieser Schwingungsanregung ist eine Änderung des Dipolmoments während der Schwingung, d. h., nicht jede Schwingung ist IR-aktiv (Abb. 22/5). Das vermessene Molekül muss kein permanentes Dipolmoment besitzen. Es gibt verschiedene Arten von Schwingungen. Bei Streckschwingungen ändert sich der Abstand der schwingenden Atome, bei einer Beugeschwingung ändert sich der Bindungswinkel. Je nachdem, ob die Molekülsymmetrie im Verlauf der Schwingung erhalten bleibt, unterscheidet man symmetrische und asymmetrische Schwingungen.

Schwingungsanregung

Das Messprinzip ähnelt dem bei der UV-Spektroskopie beschriebenen, d. h., man variiert die Wellenlänge der eingestrahlten Strahlung und misst die Abnahme der Strahlungsintensität beim Durchtritt durch die Probe. Im IR-Spektrum (auch Schwingungsspektrum genannt) wird Transmission (in %) gegen die Wellenzahl v˜ (cm−1) aufgetragen. Letztere entspricht dem reziproken Wert der eingestrahlten Wellenlänge (Abb. 22/6). Unter Transmission (T) versteht man die Durchlässigkeit der Probe gegenüber der IR-Strahlung. Bei 100 % Transmission geht die gesamte eingestrahlte Energie durch die Probe hindurch, bei kleineren %-Werten wird ein Teil der Energie absorbiert, man sieht Absorptionsbanden mit z. T. scharfen Spitzen (Abb. 22/6).

IR-Spektrum

Spektrenauswertung.
Zur Auswertung betrachtet man im Spektrum zwei große Bereiche. Oberhalb 1500 cm−1 befinden sich Absorptionsbanden, die einzelnen funktionellen Gruppen zugeordnet werden können. Die Valenzschwingungen von z. B. C–H-, O–H-, C=O-, C=C-Bindungen werden in diesem Bereich bei verschiedenen Wellenlängen angeregt (Tab. 22/1). Unterhalb 1500 cm−1, im sog. Fingerprint-Bereich, finden sich viele Banden, die vorwiegend von Deformationsschwingungen herrühren und charakteristisch für das Molekül als Ganzes sind. Wie ein Fingerabdruck beim Menschen charakterisiert ein IR-Spektrum ein Molekül. Wenn zwei IR-Spektren in allen Banden übereinstimmen, ist der Schluss erlaubt, dass die vermessenen Verbindungen identisch sind. Moderne FT-IR-Spektrometer (FT = Fourier Transformation) erlauben auch bei Substanzmischungen die Zuordnung der Einzelverbindungen.

Fingerprint-Bereich

NMR-Spektroskopie

Die NMR-Spektroskopie (nuclear magnetic resonance, kernmagnetische Resonanz) wird vornehmlich zur Identifizierung und Strukturaufklärung organischer Verbindungen benutzt und gehört heute zu den wichtigsten spektroskopischen Methoden der Chemie. Andere Anwendungen zielen in der Biochemie z. B. auf die Klärung der 3D-Struktur von Proteinen, auf die Untersuchung von Ligand-Protein-Wechselwirkungen oder auf den Ablauf von Stoffwechsel- bzw. Biosyntheseprozessen. In der Medizin findet die Magnetresonanz-Tomographie (MRT, Kernspintomographie) als bildgebendes Verfahren in der Diagnostik breite Anwendung.
Kernspin.
Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erhält man Informationen über Atomkerne und deren Umgebung, so dass Rückschlüsse auf die chemische Struktur eines Moleküls möglich sind. Voraussetzung für NMR-Messungen ist das Vorliegen eines sog. Kernspins bei einzelnen Atomen einer Verbindung. Diesen kann man sich anschaulich, aber nicht ganz zutreffend als Rotation des Atomkerns um die eigene Achse vorstellen. Der Kernspin wird durch die Kernspinquantenzahl I charakterisiert, die halb- und ganzzahlige Werte (I = ½, 1, 1 ½, … 6) annehmen kann. Ist I = 0, so besitzt der Kern keinen Kernspin. Dies ist der Fall für die Isotope 12C, 16O und 14N, die mit größter Häufigkeit in organischen Molekülen anzutreffen sind. Für NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignete Isotope sind 1H, 13C, 15N, 31P und 19F, die alle einen Kernspin I = ½ besitzen, und 2H mit einem Kernspin I = 1.

Kernspin

Kernresonanz.
Die NMR-Spektroskopie beruht auf der Wechselwirkung von Radiowellen ( Abb. 22/1) mit den Atomkernen einer Verbindung, die sich hierzu in einem starken Magnetfeld befinden muss. Atomkerne mit einem Kernspin besitzen ein Drehmoment und, da sie positiv geladen sind, auch ein magnetisches Moment. Sie verhalten sich wie kleine Stabmagneten. Ohne weitere äußere Einflüsse sind diese magnetischen Momente statistisch verteilt. Bringt man die Probe jedoch in ein starkes homogenes Magnetfeld, so sind bei 1H und 13C z. B. nur zwei Einstellungen dieses magnetischen Momentes zum äußeren Magnetfeld erlaubt, die kleinen Stabmagneten richten sich parallel oder entgegengesetzt zum Magnetfeld aus. Die Einstellungen unterscheiden sich geringfügig in ihrem Energiegehalt.
Bei der 1H-NMR-Spektroskopie werden kovalent gebundene Wasserstoffatome (1H) untersucht. Durch Einstrahlen von Radiowellen werden Übergänge zwischen beiden Energieniveaus angeregt, was zu einer (messbaren) Energieaufnahme führt. Diese bezeichnet man als Kernresonanz. Nach dem Abstellen der Strahlung kehren die angeregten Kerne unter Abgabe von Wärme wieder ins tiefere Niveau zurück (Relaxation). Dieser Prozess wird in einem alternativen Messverfahren neuerer Spektrometer als Funktion der Zeit aufgezeichnet und mathematisch in ein frequenzabhängiges Signal transformiert (Fourier-Transformation). Durch Variation der eingestrahlten Frequenz oder in modernen NMR-Spektrometern durch Einstrahlung eines Frequenzbandes, lassen sich so sämtliche Kerne einer Atomsorte, z. B. 1H, anregen. Aus der Lage (= chemische Verschiebung) eines Resonanzsignals im Spektrum erhält man Auskunft über die Art der chemischen Umgebung der einzelnen Kerne und damit über die Struktur der gemessenen Verbindung.

Kernresonanz

chemische Verschiebung

Wie viel Energie ist nötig, um eine 1H-Anregung in einer Verbindung zu erreichen? Diese Frage lässt sich nur beantworten, wenn man die Stärke des externen Magnetfeldes kennt. Bei den heute verfügbaren supraleitenden Magneten (2,35 – 21,14 T) liegen die Frequenzen zwischen 100 und 900 MHz. 100 MHz entsprechen einer Radiowelle mit λ = 3 m. Die bei der Kernresonanz absorbierte Energie beträgt nur 10−4 bis 10−5 kJ/mol, ist also sehr gering.
Auswertung von NMR-Spektren.
Für die Anwendung der NMR-Spektroskopie ist es wesentlich, dass das angelegte äußere Magnetfeld durch die Induktionswirkung der Elektronen und durch die Felder benachbarter Kerne abgeschwächt wird, d. h., die „effektive Feldstärke” am einzelnen Atomkern ist geringer als die angelegte. Man bezeichnet diesen Effekt auch als Abschirmung. Atomkerne gleicher Sorte, aber unterschiedlicher chemischer Umgebung zeigen daher Kernresonanz bei geringfügig unterschiedlicher Frequenz, was ihre Unterscheidung möglich macht (Abb. 22/7). Diese Unterschiede misst man in ppm (parts per million = millionster Teil) der eingestrahlten Frequenz. Relativ zu einer Eichsubstanz (für 1H-NMR: Tetramethylsilan, TMS = [CH3]4Si), die mit dem Signal der H-Atome der Methylgruppen den Nullpunkt festlegt, lässt sich nun eine frequenzunabhängige Größe, die chemische Verschiebung δ (in ppm), definieren.
Abbildung 22/7 zeigt das 1H-NMR-Spektrum von Essigsäureethylester. Die Anzahl der Signale spiegelt die Zahl unterschiedlicher Protonen im Molekül wider (hier drei), deren unterschiedliche chemische Verschiebung Rückschlüsse auf deren Umgebung zulässt.

1H-NMR-Spektrum

Das 1H-NMR-Spektrum liefert außer der chemischen Verschiebung noch weitere Informationen. Die Fläche unter einem Signal wird integriert (in Abb. 22/6 violett markiert) und zeigt die Anzahl der Protonen an, die dieses Signal hervorrufen (hier: CH3 : CH3 : CH2 = 3 : 3 : 2). Die Integrale führen zu relativen Zahlenverhältnissen. Außerdem gibt die Feinstruktur des Signals Auskunft über Anzahl und Geometrie benachbarter Protonen. Ähnlich, wie aneinandergereihte Stabmagneten sich gegenseitig beeinflussen, wechselwirken (koppeln) benachbarte Atomkerne über ihre Bindungselektronen miteinander, wodurch eine Aufspaltung der Signale eintritt. Die Anzahl der Linien eines Signals (= Multiplizität) und deren Abstände zueinander (= Kopplungskonstanten) werden zur Interpretation herangezogen. Tritt ein 1H-Kern mit n äquivalenten benachbarten Kernen in Wechselwirkung, so erfolgt die Aufspaltung des Signals in (n + 1) Linien. In unserem Beispiel (Abb. 22/7) sind die Signale für die Protonen der Ethylgruppe aufgespalten: das Signal der Methylgruppe (a) besteht aus drei Linien (Triplett), da zwei Protonen am benachbarten Kohlenstoffatom gebunden sind. Die Methylengruppe (b) zeigt vier Linien (Quartett) wegen der drei Protonen am benachbarten Kohlenstoffatom. Die Methylgruppe (c) der Essigsäure hat keine Kopplungspartner, so dass das Signal als eine Linie (Singulett) erscheint.

Protonenkopplung

13C-NMR-Spektren.
In ähnlicher Weise wie bei der 1H-NMR-Spektroskopie kann man auch die Signale beobachten und aufzeichnen, die vom Kohlenstoffisotop 13C hervorgerufen werden. Dieses Isotop hat in kohlenstoffhaltigen Verbindungen eine natürliche Häufigkeit von nur 1,1 %. Um diesen geringen Anteil zu beobachten, bedarf es besonders empfindlicher Messgeräte und spezieller Messtechniken. 13C-NMR-Spektren liefern Informationen über das Kohlenstoffgerüst einer organischen Verbindung und sind damit für die Strukturaufklärung besonders wertvoll.
Im Allgemeinen unterdrückt man bei der Aufnahme dieser Spektren die Kopplung einzelner Kohlenstoffatome mit benachbarten Protonen durch simultane Bestrahlung der Protonen (Protonen-Breitband-Entkopplung). Dadurch erscheinen die Signale der Kohlenstoffatome als einzelne Linien. Wegen der geringen natürlichen Häufigkeit des 13C-Isotops beobachtet man keine 13C-13C-Kopplung. Die chemische Verschiebung der einzelnen Signale im 13C-NMR-Spektrum erlaubt in Analogie zum 1H-NMR-Spektrum Rückschlüsse auf die Struktur des Moleküls (Abb. 22/8).

13C-NMR-Spektrum

2D und 3D-Techniken.
Neuere Entwicklungen führten zur zweidimensionalen NMR-Spektroskopie (2D-NMR-Spektroskopie), die vor allem für die Strukturaufklärung größerer Verbindungen und für die Bestimmung der Struktur kleinerer Proteine wertvoll ist. Es gibt eine Fülle unterschiedlicher Experimente, durch die man Informationen über Nachbarschaftsverhältnisse von Atomen (z. B. 1H-13C, oder 1H-1H) durch die Kopplung einzelner Kerne über Bindungen oder aber über den Raum hinweg erhält. Neuere Techniken wie 3D-NMR- und Sättigungstransfer-Methoden erlauben es z. B., Proteine und deren Wechselwirkungen mit Substraten zu studieren.

Magnetresonanz-Tomographie (MRT)

NMR-Spektroskopie lässt sich auch am Menschen durchführen, in der medizinischen Diagnostik spricht man dann von (N)MR-Tomographie (MRT) oder Kernspintomographie. Messsignale liefern hier die Protonen, die im Körper hauptsächlich als Bausteine des Wassers oder der Fettbestandteile gehäuft vorkommen. Wasserreiche Gewebe geben ein starkes Signal und werden im Bild hell, wasserarme (wie z. B. Knochen) ein schwaches Signal und werden im Bild dunkel (Abb. 22/9) dargestellt. Hinzu kommt, dass die erhaltenen Bilder in charakteristischer Weise davon abhängen, wie das Wasser im Gewebe gebunden ist. Auch bei gleicher Wasserdichte lassen sich verschiedene Gewebearten sowie gesundes und krankes Gewebe unterscheiden (Hell-Dunkel-Kontraste), wodurch sich Tumoren, Gefäßerweiterungen oder andere pathologische Veränderungen erkennen und lokalisieren lassen. Abbildung 22/10 zeigt den schematischen Aufbau eines MR-Tomographen. Die Aufnahme eines MR-Tomogramms (MRT) dauert mehrere Minuten, dazu muss der zu vermessende Körperteil (z. B. der Kopf) ruhig in der Öffnung des Magneten liegen. Jede Messung erfasst nur kleine Volumenelemente oder Schichten des Körperteils. Viele Messungen werden dann zu einem Gesamtbild zusammengefügt. Ein großer Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu Röntgenaufnahmen und der Computertomographie (CT) ist, dass der Organismus des Patienten nicht mit energiereicher Strahlung belastet wird. Magnetfelder können sogar positiv aus das Gehirn Einfluss nehmen, z. B. nach einem Schlaganfall.
Von funktioneller MRT (fMRT) spricht man, wenn physiologische Funktionen im Inneren des Körpers dargestellt werden. Sie basieren bei Gehirnuntersuchungen z. B. darauf, dass oxygeniertes und desoxygeniertes Blut unterschiedliche magnetische Eigenschaften hat ( Kap. 21.1). Durch Verwendung paramagnetischer Kontrastmittel (z. B. Gadoliniumkomplexe) werden die Parameter für die Bildgebung deutlich verbessert. Gadolinium (Gd) gehört zu den Lanthanoiden ( Periodensystem) und wird als Gd3 z. B. von einem mehrzähnigen Chelator zum wasserlöslichen Gadovist komplexiert.

Röntgenstrukturanalyse

Durch Röntgenstrukturanalyse (X-Ray-Analyse, Diffraktometrie) lässt sich vornehmlich in kristallinen Festkörpern die Anordnung von Atomen bestimmen, d. h. die Bindungslängen und Bindungswinkel in einem Molekül. Monochromatische Röntgenstrahlung (Abb. 22/1), deren Wellenlänge etwa den Atomabständen im Kristallgitter (ca. 10−10 m) entspricht, wird an den Elektronen der Gitteratome gebeugt. Dadurch führen die Elektronen eine erzwungene Schwingung aus und werden so selbst zum Emitter von Kugelwellen. Im Raum hinter dem Kristall beobachtet man Interferenzerscheinungen, die auf einer Fotoplatte aufgezeichnet werden. Die Beugungsmaxima enthalten Informationen zur Gestalt der dem Kristall zugrunde liegenden Elementarzelle, aus ihnen lassen sich Elektronendichteverteilungen und damit die Schwerpunkte der Atome berechnen. Je mehr Elektronen ein Atom besitzt, umso genauer lässt sich dessen Lage im Kristall bestimmen.

Elementarzelle

Anwendung zur Strukturbestimmung.
Damit eine Substanz untersucht werden kann, muss sie kristallin als so genannter Einkristall (Kantenlänge ca. 0,5 mm) vorliegen, in dem das Kristallgitter überall dieselbe Orientierung aufweist. Für die Züchtung derartiger Kristalle muss Zeit und Geduld aufgebracht werden. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse werden heute auch komplexe Makromoleküle wie Proteine, DNA oder sogar Viren untersucht. Viele biologisch wirksame Moleküle entfalten ihre Wirkung jedoch nur in Lösung. Man muss also berücksichtigen, dass die in Lösung vorherrschende Raumstruktur anders aussehen kann als die im Kristall. Dies gilt besonders für konformativ bewegliche Verbindungen, wie z.B. Enzyme, die mit ihrem Substrat in Wechselwirkung stehen.
Abbildung 22/11 zeigt die Struktur von Acetylsalicylsäure im Kristall. Die Kreise entsprechen berechneten Aufenthaltswahrscheinlichkeiten für die Elektronen der einzelnen Atome. Acetylsalicylsäure kristallisiert in Schichten, die aus zentrosymmetrischen Dimeren bestehen, die über zwei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Carboxygruppen verbunden sind. Die Ebene der Acetoxygruppe steht senkrecht zu der des Benzolrings. Deutlich zu erkennen ist auch, dass die C–C-Bindungen im aromatischen Benzolring mesomeriebedingt gleich lang und deutlich kürzer als die C–C-Einfachbindungen sind.

Röntgendiagnostik

In der Medizin wird Röntgenstrahlung hauptsächlich in der Röntgendiagnostik zur Abbildung von Organen und Leitungssystemen oder für Schichtaufnahmen in der Computertomographie (CT) verwendet. Das Röntgenbild wird hier, im Gegensatz zur oben beschriebenen Röntgenstrukturanalyse, durch den Teil der Strahlung erhalten, die den Körper ohne Wechselwirkung durch Absorption oder Streuung passiert hat. Je größer die Elektronendichte auf dem Strahlenweg durch den Körper, umso höher ist der Anteil der Strahlung, der durch Wechselwirkung mit den Elektronen den Film nicht erreicht, und umso heller erscheint dieser Teil des Körpers auf dem Röntgenbild. Die Elektronendichte wird durch die Dicke des Objektes und die Anzahl der Elektronen darin bestimmt: Knochen sind aus Atomen mit einer hohen Atommasse, d. h. vielen Elektronen, aufgebaut, sie erscheinen im Röntgenbild weiß. Die Moleküle der Luftgase und Wasser haben niedrige Molmassen und besitzen somit eine geringe Elektronendichte, sie erscheinen schwarz. Die erhaltenen Grauabstufungen lassen sich nach zunehmender Elektronendichte auf Luft (schwarz), Fett, Wasser, Knochen und Metall (weiß) zurückführen (Abb. 22/9 und 22/12). Computertomographie (CT) wird zur Detailbeurteilung z.B. bei Krebserkrankungen häufig mit der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) verbunden ( Kap. 2.6).

Computer-tomographie

Röntgenstrahlung ist aufgrund ihrer kurzen Wellenlänge sehr energiereich. Weil sie im Körper unkontrolliert Ionen und Radikale bilden kann, schädigt Röntgenstrahlung den Organismus in unterschiedlicher Weise, wobei proliferierendes Gewebe (auch Krebszellen) stärker beeinträchtigt wird. Dieser Unterschied ist die Grundlage für die Strahlentherapie.

Massenspektrometrie

Mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS) lassen sich neben Molekülmasse und Summenformel einer Verbindung auch Strukturinformationen gewinnen. Voraussetzung ist, dass die Moleküle eine Ladung tragen, d. h. als Ionen vorliegen. Die hohe Empfindlichkeit und Messgenauigkeit, die Vielfalt der Ionisationsmethoden und die mögliche Kopplung mit chromatographischen Verfahren wie HPLC (high performance liquid chromatography) machen sie zu einem sehr wertvollen und weit verbreiteten Hilfsmittel in der Analytik.
Messvorgang.
Eine Substanzprobe wird in einen Strahl gasförmiger Ionen überführt, die dann nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) aufgetrennt werden. Damit gehört die MS streng genommen nicht zu den spektroskopischen Methoden, da sie nicht auf der Absorption oder Emission elektromagnetischer Strahlung beruht. Sie ist eine spektrometrische Analysenmethode.
Ein Massenspektrometer besteht aus drei Einheiten: der Ionenquelle, in der die Substanz ionisiert wird; dem Analysator, durch den die Auftrennung entsprechend dem m/z-Verhältnis im Vakuum erfolgt, und einem Detektor, der die eintreffenden Ionen registriert und als Signale aufzeichnet. Das so erhaltene Massenspektrum ist eine Auftragung der detektierten Ionen gegen die Signalintensität. Je höher das Signal ist, desto stabiler ist das zugehörige Ion (Abb. 22/13). Bei der Auswertung eines Massenspektrums muss man das mögliche Auftreten von Isotopenmustern berücksichtigen.
Verbesserte Methoden zur Beschleunigung und Ablenkung von Ionenstrahlen erlauben eine sehr genaue Massenbestimmung der Ionen. Durch Korrelation mit Referenzsubstanzen bekannter Masse und Summenformel lässt sich die exakte Molekülmasse so genau bestimmen, dass daraus die Summenformel des beobachteten Ions berechnet werden kann. Man spricht von hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS, high resolution mass spectrometry).

hochauflösende Massenspektrometrie

Ionisierungsmethoden.
Der Schlüsselschritt für die Aufnahme eines Massenspektrums ist die Ionisation der zu vermessenden Substanz. Heute steht eine Vielzahl an Ionisierungsmethoden zur Verfügung. Die älteste ist die Elektronenstoß-Ionisation (EI, electron impact), bei der die Probe mit energiereichen Elektronen beschossen wird. Formal verläuft die Ionisierung gemäß M + e→ M + 2 e unter Bildung des sog. Molekül-Ions M, eines Radikal-Kations. Zur Erzeugung des Elektronenstrahls beschleunigt man Elektronen aus einer Glühkathode mit einer Spannung von 70 – 100 V (70 – 100 eV). Diese Energie übersteigt die Ionisierungsenergie organischer Moleküle um ein Vielfaches, so dass sich an die Bildung des Molekül-Ions meist Zerfallsprozesse anschließen, bei denen charakteristische Fragmente (Fragment-Ionen und Neutralbruchstücke) gebildet werden. Für die Fragmentierung organischer Verbindungen gibt es verschiedene Regeln, die eine detaillierte Interpretation eines Massenspektrums erlauben (Abb. 22/13).

Elektronenstoß-Ionisation

Molekül-Ion

Fragmentierung

Bei der chemischen Ionisation (CI) erfolgt die Molekül-Ionen-Bildung durch Ion-Molekül-Reaktionen mit Reaktandgas-Ionen (z. B. XH, wobei X = CH4 oder NH3) gemäß M + XH → MH + X. Beim sog. FAB (fast atom bombardment) wird die zu untersuchende Substanz in einer schwer flüchtigen, aber flüssigen Matrix (meist Glycerin, p-Nitrobenzylalkohol) gelöst und mit einem Strahl schneller Atome oder Ionen (z. B. Ar, Cs) beschossen und als Ionen aus der Matrix herausgelöst. Empfindliche Makromoleküle wie Proteine werden heute besser durch MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) ionisiert, wobei die benötigte Substanzmenge im fmol-Bereich (f = femto = 10−15) liegt. Als Energiequelle dient hierbei ein gepulster Laser im UV-Bereich, die Probe wird mit einer in diesem Wellenlängenbereich absorbierenden Matrix kristallisiert (z. B. Nicotinsäure). Man detektiert Quasi-Molekül-Ionen und Ionen, die durch Zusammenlagerung mehrerer Moleküle entstanden sind.

chemische Ionisation

FAB

MALDI

Ergänzt wird MALDI durch die Elektrospray-Ionisation (ESI), deren Anwendung ebenfalls in der schonenden Ionisation von Makromolekülen wie Proteinen liegt. Hierbei wird die Lösung einer Probe durch Anlegen eines elektrischen Potenzials und mit Hilfe eines Spraygases (z. B. N2) in kleine Nebeltröpfchen zerstäubt (Elektrospray). Durch Anlagerung von Protonen oder anderen Ionen aus dem Lösungsmittel sind die Probenmoleküle je nach Zahl der enthaltenen basischen Gruppen einfach oder mehrfach geladen. Im Zuge der Entfernung des Lösungsmittels treten die Quasi-Molekül-Ionen (z. B. [M + H], [M + Na]) in die Gasphase über. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die mögliche Kopplung mit chromatographischen Methoden (z. B. HPLC/MS).

ESI

Checkliste

Folgende Bezeichnungen/Begriffe sollten Sie erklären oder definieren (s. a. Glossar) und – wo möglich – Formeln, Gleichungen oder Beispiele angeben können:

Elektromagnetisches Spektrum – UV/VIS-Spektroskopie – Lambert-Beer-Gesetz – molarer Extinktionskoeffizient – Absorptionsmaximum – Chromophor – Photometrie – IR-Spektroskopie – Schwingungsanregung – Fingerprint-Bereich – NMR-Spektroskopie – Kernspin – Kernresonanz – chemische Verschiebung – Protonenkopplung – Kernspintomographie – MRT – Röntgenstrukturanalyse – Elementarzelle – Computertomographie – Massenspektrometrie – Elektronenstoß-Ionisation – Fragmentierung – hochauflösende Massenspektrometrie – chemische Ionisation – MALDI – ESI.

Aufgaben

  • 1.

    Was sind Farbstoffe? Nennen Sie drei Beispiele!

  • 2.

    Sie erhalten eine Lösung, die eine bekannte UV-aktive Substanz enthält. Wie können Sie mit Hilfe der UV-Spektroskopie die Konzentration der Substanz in der Lösung bestimmen?

  • 3.

    Warum lässt sich bei biochemischen Experimenten die NADH-Konzentration neben vorhandenem NAD bestimmen?

  • 4.

    In Abbildung 22/6 ist das IR-Spektrum von Acetylsalicylsäure abgebildet. Welche Absorptionsbanden sind markiert? Worauf beruhen sie?

  • 5.

    Wie hängen Wellenzahl und Wellenlänge zusammen?

  • 6.

    Warum gibt es kein 12C-NMR-Spektrum?

  • 7.

    Wie viele 1H- und 13C-NMR-Signale erwarten Sie für

    a) Aceton, b) Milchsäure und c) Acetylsalicylsäure?

  • 8.

    Warum kann man in der MRT verschiedene Gewebe unterscheiden?

  • 9.

    Was erscheint im MRT bzw. im CT weiß, was dunkel?

  • 10.

    Warum ist ein MRT für den Patienten schonender als ein CT?

  • 11.

    Was leistet die Röntgenstrukturanalyse? Welche Bedingung muss eine Substanz, die man untersuchen will, erfüllen?

  • 12.

    Wie kommt es zum Röntgenbild von Körperteilen des Menschen?

  • 13.

    Was liegt den Signalen (Peaks) im Massenspektrum zugrunde?

  • 14.

    Nennen Sie drei verschiedene Ionisationsmethoden, die in der Massenspektrometrie Anwendung finden! Welche sind insbesondere für Proteine geeignet?

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