1.1

Definition und Basisinformation

Angeborene Störungen der Thrombozytenfunktion sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die oft erst bei Auftreten von Blutungen erkannt werden. Im klinischen Bereich haben sich nur wenige Methoden zur Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen bewährt. Für eine rationelle Diagnostik ist ein stufenweises Vorgehen empfehlenswert. Anamnese und klinische Untersuchung sind Grundvoraussetzungen. Das Von-Willebrand-Syndrom und andere plasmatische Gerinnungsstörungen sollten vor einer spezifischen Thrombozytenfunktionsdiagnostik immer ausgeschlossen werden. Die Bestimmung von Zahl, Größe, Volumen (MPV) und Morphologie der Thrombozyten erlauben Rückschlüsse auf die zugrunde liegende Störung.

Die PFA-100®-Verschlusszeit eignet sich als Screening zum Ausschluss schwerer Thrombozytenfunktionsstörungen. Die Aggregometrie ermöglicht die Untersuchung zahlreicher Aspekte der Thrombozytenfunktion. Die Durchflusszytometrie ist zur Diagnose von Thrombasthenie Glanzmann, Bernard-Soulier-Syndrom und Freisetzungsstörungen geeignet. Molekulargenetische Untersuchungen können die Verdachtsdiagnose bestätigen oder zum Nachweis nicht beschriebener Defekte verwendet werden.

Die Leitlinie soll die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytopathien/Thrombozytenfunktionsstörungen bei Kindern und Jugendlichen erleichtern. Zur rationalen und zielgerichteten Diagnostik wurden einzelne Kapitel erarbeitet. In einem Stufenalgorithmus wird zunächst die Diagnose einer Thrombozytopathie gestellt. Gegebenenfalls sind die diagnostischen Schritte individuell anzupassen, abhängig von:

• ●

  einer positiven Familienanamnese,

• ●

  dem Lebensalter des Kindes,

• ●

  akuter und chronischer Blutungsneigung,

• ●

  verfügbarer Blutmenge u.a.

Für die häufigsten und am besten charakterisierten Thrombozytopathien werden weitere Informationen gegeben. Die wichtigsten allgemein anerkannten Methoden, Aggregometrie einschließlich Varianten und Durchflusszytometrie, sind im Detail beschrieben. Zur Unterstützung einer Klassifizierung der Thrombozytopathie, insbesondere solcher mit Thrombozytopenie und assoziierten Symptomen (syndromal) ist eine Liste beigefügt (› Tab. K1-3). Die Liste enthält detaillierte Informationen zu klinischer Präsentation, OMIM-Nummer (www.ncbi.nlm.nih.gov/omim), Vererbungsmodus, genetischen Defekt und wichtigsten Diagnosekriterien. Für die weiterführende Diagnostik stehen die spezialisierten Zentren des Kompetenznetzes der Ständigen Kommission Pädiatrie der GTH zur Verfügung (www.gth-online.org).

Die Leitlinie ist nicht geeignet für die Beurteilung von Patienten, die plättchenaktive Substanzen erhalten oder erworbene Störungen der Thrombozytenfunktion bzw. -zahl aufweisen.

1.2

Stufendiagnostik einer hämorrhagischen Diathese

Für eine rationale Diagnostik einer hämorrhagischen Diathese wird ein Stufenschema (› Abb. K1-1) verwendet (3–9).

1.3

Screening-Methoden

In der klinischen Routine werden keine Tests der Thrombozytenfunktion durchgeführt (2). Durch Fortschritte in der Medizin und dem stark zunehmenden Einsatz von plättchenhemmenden Medikamenten gibt es ein steigendes Interesse an Thrombozytenfunktionstests. Die Bedeutung dieser Methoden für die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen ist beschränkt. Für die Durchführung einer rationalen Thrombozytenfunktionsdiagnostik soll immer ein Stufenplan (Abklärungsalgorithmus; › Abb. K1-1) verwendet werden, der auch die lokalen Gegebenheiten berücksichtigt. Als Vorinformation sollen zumindest Angaben zur Familien- und Individualanamnese vorliegen und eine körperliche Untersuchung durchgeführt werden. Beispiele für Fragebögen zur Blutungsneigung sind verfügbar unter www.GTH-online.org, www.oegari.at und www.netzwerk-von-willebrand.de. Zumindest muss nach einer Neigung zu Epistaxis, Petechien, kutanen Hämatomen, Schleimhautblutungen, Menorrhagie, Weichteil- und Gelenkblutungen sowie postinterventionellen/postoperativen Blutungen gefragt werden.

Die Leitsymptome von Kindern mit klassifizierter Thrombozytenfunktionsstörung nach THROMKID (2) sind in › Tab. K1-1 zusammengefasst.

Als Basisuntersuchung soll eine Blutbildbestimmung einschließlich Retikulozytenzahl und Leukozytendifferenzierung erfolgen. Eine im Rahmen der Routineblutbildbestimmung an allen marktüblichen Großgeräten verfügbare Thrombozytengrößenverteilungskurve und das mittlere Thrombozytenvolumen sollen angefordert und evaluiert werden. Die Thrombozytengröße und Morphologie sind in der Lichtmikroskopie in Blutausstrichen mittels der Färbemethode von May-Grünwald-Giemsa zu beurteilen. Bei lokaler Verfügbarkeit hat sich die Thrombozytenaggregation (LTA, IA) mit mindestens drei verschiedenen Agonisten (ADP, Kollagen und Ristocetin) als Erstuntersuchung bewährt (› Abschnitt „Aggregometrie“).

Folgende Methoden sind eingeschränkt zur Feststellung einer Thrombozytenfunktionsstörung geeignet:

• ●

  In-vivo-Blutungszeit (10): Es sollen nur standardisierte Verfahren nach Ivy, Duke, Mielke, Borchgrevink oder Marx mit Surgicutt, Template, Precisette oder Hemostilette von erfahrenen Untersuchern angewendet werden. Die Patienten sollen über die Möglichkeit einer Narbenbildung aufgeklärt werden. Für Kleinkinder, Patienten mit Bindegewebs- und Hauterkrankungen ist die Methode nur eingeschränkt geeignet. Mangelnde Kooperation des Patienten, Anämie und Thrombozytopenie < 100.000/µl führen zu verfälschten Ergebnissen.

• ●

  PFA-100®-Verschlusszeit (In-vitro-Blutungszeit) (11–13) eignet sich insbesondere zur Diagnose von schweren Störungen der Thrombozytenfunktion. Das Von-Willebrand-Syndrom und die Thrombasthenie Glanzmann führen zu einer Verlängerung der Verschlusszeit. Zu beachten ist, dass der Von-Willebrand-Faktor beim Neugeborenen, Schwangeren und anderen Zuständen (Akute-Phase-Protein!) erhöht ist. Bei Kindern mit rezidivierenden Infekten ist mit einer großen Variabilität der Verschlusszeiten zu rechnen. Grundvoraussetzung für die Testdurchführung ist eine Thrombozytenzahl über 100.000/µl und ein Hämatokrit (HKT) über 30 l/l. Verkürzte Verschlusszeiten werden durch Hämolyse, HKT > 50 l/l, Thrombozyten > 500.000/µl und verlängerte Verschlusszeiten durch Ikterus, Hämolyse, Anämie (HKT < 35l/l), Thrombozytopenie verursacht

  1

  Aufgrund des verwendeten Vollblutes kann eine Hämolyse/Ikterus nicht detektiert/ausgeschlossen werden. Hämatokrit und Zellzahlen haben einen direkten Einfluss auf die Fließeigenschaften des Blutes. Eine Bestimmung und Beurteilung des Blutbildes wird empfohlen.

  und aufgrund der angewendeten Scherkräfte ist diese Methode grundsätzlich sensitiv zum Nachweis des Von-Willebrand-Syndroms, der Thrombasthenie Glanzmann und des Bernard-Soulier-Syndroms. Die PFA-100®-Verschlusszeit eignet sich auch zum Nachweis einer durch ASS induzierten Thrombozytenfunktionsstörung. Eine P2Y-Messzelle wurde zum Nachweis einer medikamentösen Hemmung der Thrombozytenfunktion durch den ADP-Rezeptorinhibitor Clopidogrel entwickelt. Ein verdächtiger oder pathologischer Befund bedarf einer weiteren Abklärung.

• ●

  Ungeeignete Methoden zur Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen sind die native Thrombelastografie, der Prothrombinverbrauchstest, der Rumpel-Leede-Test und der Thrombusretraktionstest.

• ●

  Das für das Drugmonitoring entwickelte halbautomatische System Verify-Now® (Accumetrics) und das Impact-R® (Matis Medical) sind für die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen nicht evaluiert und daher nicht geeignet.

Von den individuell eingesetzten und seltenen Methoden sind das Elektronenmikroskop (ELMI) und die histochemische Färbung von Zellen als diagnostische Verfahren anerkannt. Beide Methoden erfordern viel Erfahrung und werden daher nur an wenigen Zentren durchgeführt. Methodik, Befundung und Befundinterpretation unterscheiden sich wesentlich von Labor zu Labor. Hinweise über diese Methoden überschreiten die Ziele des Leitlinienprojekts. Informationen zu hoch spezialisierten Labors können der Liste des Kompetenznetzwerks auf www.gth-online.org entnommen werden. Die Bedeutung der konfokalen Lasermikroskopie als Ersatz oder Ergänzung der ELMI ist in Erforschung. Über die klinische Anwendung der aus der Wissenschaft bekannten Durchflusssysteme (Flow Chamber), die als standardisierte Systeme erworben werden können, kann zurzeit noch keine Aussage getroffen werden.

1.4

Aggregometrie

Die Aggregometrie ist als Standarduntersuchung der Thrombozytenfunktionsdiagnostik zu bezeichnen. Es lassen sich damit eine Vielzahl von funktionellen Eigenschaften der Thrombozyten charakterisieren. Die Durchführung der Untersuchung, die Interpretation der Befunde und die Zuordnung zu einem definierten Krankheitsbild stellen eine große Herausforderung dar.

1.4.1

Lichttransmissionsaggregometrie (LTA)

Die Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) ist auch nach über 40 Jahren seit der Erstbeschreibung durch Born der Goldstandard zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion (4, 6, 8, 14). Die eingeschränkte Standardisierbarkeit und eine große Auswahl an Agonisten und deren Konzentrationen haben diese Methode in der Vergangenheit auf die Verwendung in spezialisierten Laboren eingeschränkt. Verschiedene Fachgruppen und Organisationen haben sich in den letzten Jahren der Standardisierung dieser Methode gewidmet.

Prinzip

• ●

  Kontinuierliche Registrierung der im Verlauf der Aggregation sich ändernden Transmission langwelligen Lichts.

• ●

  In einem in Bewegung gehaltenem plättchenreichen Zitratplasma oder in einer Suspension gewaschener Thrombozyten kommt es nach Zusatz von Agonisten zur Aggregation.

• ●

  Zunehmende Aggregation führt zum Auftreten von Aggregaten und damit zur Zunahme der Lichttransmission, die fortlaufend fotometrisch registriert und in Kurvenform aufgezeichnet wird.

Präanalytik

Patient

• ●

  Patient kurz ruhen lassen

  2

  Der Einfluss von den Punktionsschmerz lindernden Lokalanästhetika (EMLA®) auf das Testergebnis ist ungeklärt.

  . Kein Fasten

  3

  Alimentäre Hyperlipidämie vermeiden – interagiert mit Probenanalyse.

  , aber aufgrund des potenziellen Störfaktors alimentäre Lipidämie vermeiden.

• ●

  Medikamentenanamnese laut Medikamentenliste (› Tab. K1-4).

• ●

  Medikamente registrieren und nach Möglichkeit absetzen, sofern nicht dringend medizinisch indiziert. Gegebenenfalls bekannte Auswirkungen der Medikation bei Befundung berücksichtigen.

  • ○

    NSAR mindestens 3 Tage (unterschiedliche HWZ beachten)

  • ○

    Irreversible Aggregationshemmer (ASS) mindestens 10 Tage

  • ○

    P2Y12-Hemmer (z.B. Clopidogrel) mindestens 7 Tage

  • ○

    GP-IIb/IIIa-Inhibitor (z.B. Abciximab) mindestens 3 Tage

Blutgewinnung

• ●

  Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen (DIN/ISO 6710 – Vacutainer möglich).

• ●

  Natriumzitrat 109 oder 129 mmol/l resp. 3,2 oder 3,8%.

• ●

  Zitrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile.

• ●

  Bei schlechten Venenverhältnissen und kleinen Kindern ggf. abtropfen lassen.

• ●

  Nadel mit 19 bis 21 Gauge.

• ●

  Nur leicht und nicht zu lange stauen – bei problematischer Punktion 1. Röhrchen unbedingt verwerfen.

• ●

  3–4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden.

• ●

  Folgeabnahmeröhrchen für Thrombozytenanalyse verwenden, unbedingt Schaumbildung vermeiden.

• ●

  Über-/unterfüllte Proben ablehnen, Füllung der Röhrchen wie vom Hersteller gefordert.

• ●

  Proben nicht kühlen, Transport bei Raumtemperatur, keine Rohrpost!

• ●

  Angabe der Uhrzeit der Blutentnahme auf der Probe (als auch Analysezeitpunkt) verzeichnen. Thrombozytenzahl unbedingt vor Zentrifugation bestimmen.

Probenvorbereitung

• ●

  Zentrifugation bei Raumtemperatur.

• ●

  Bei Thrombozytenzahl in Ausgangsprobe < 100.000/µl Probe spontan sedimentieren lassen oder schonende Zentrifugation nach Laborspezifikation.

• ●

  PRP

  • ○

    150 × g für 10 min.

  • ○

    Keine Bremse.

  • ○

    Thrombozytenzahl im PRP messen.

  • ○

    Keine Einstellung der Thrombozytenzahl erforderlich, wenn Thrombozytenzahl im PRP zwischen 150.000 und 500.000/µl.

  • ○

    Bei Thrombozytenzahl im PRP < 150.000/µl Kontrolle mit angepasster Thrombozytenzahl mitmessen. Niedrige Thrombozytenzahl bei z.B. Bernard-Soulier-Syndrom, VWS Typ 2B, Platelet-Type-VWS!

  • ○

    Bei hoher Thrombozytenzahl > 500.000/µl mit autologem PPP korrigieren und auf 250.000–300.000/µl einstellen.

  • ○

    Für Riesenplättchen: Sedimentation für ca. 45 min, 45°-Winkel für Sedimentation, nicht aufrichten und in 45°-Winkel belassen für PRP-Entnahme.

• ●

  PPP

  • ○

    1.500 × g für 10 min.

  • ○

    Qualität der Proben kontrollieren.

  • ○

    Hämolytische Proben verwerfen.

  • ○

    Lipidämie berichten.

Methodik

• ●

  Normalkontrolle als Qualitätsstandard mindestens 1 ×/Woche mitführen.

• ●

  Eichung des Geräts mit plättchenarmen autologen Plasma als Markierung der Lichttransmission von 100%.

• ●

  Plättchenreiches Plasma bezeichnet den Nullwert der Lichttransmission.

• ●

  Rührgeschwindigkeit: 1.000 U/min.

• ●

  Temperatur: 37 °C.

• ●

  Kurve vor Induktorzugabe für mindestens 1 min beobachten (stabile Grundlinie, Spontanaggregation registrieren).

• ●

  Agonistenmenge (wässrige Lösung) darf 10% des Probenvolumens nicht übersteigen.

• ●

  Beobachtung der Kurve für mindestens 10 min bzw. bis zur maximalen Amplitude.

• ●

  Abschluss der Untersuchung möglichst nach 2 h, spätestens 4 h nach Blutabnahme (Zeitpunkt dokumentieren!).

Agonisten

• ●

  Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten.

• ●

  Prinzip: Zunächst niedrige Agonistenkonzentration wählen, da hohe Konzentrationen Defekte verdecken können.

• ●

  Keine sequenzielle Agonistenzugabe! Ausnahme: Ristocetin.

• ●

  Ristocetin: 1,2–1,5 mg/ml (0,5–0,6 mg/ml zur Erfassung des VWS Typ 2B). Bei Neugeborenen sind niedrigere Endkonzentrationen der Agonisten erforderlich.

• ●

  Arachidonsäure: 1,0–1,5 mmol/l.

• ●

  ADP: 2–3 µmol/l (Verdopplung der Konzentration, falls keine Reaktion mit niedriger Konzentration) – Beurteilung der Second Wave. Eine Probe sollte bei einer Konzentration von 2–3 µmol/l reagieren. Nach Standzeit benötigen Proben höhere Konzentrationen: Erhöhung auf 4 µmol/l.

• ●

  Epinephrin: 5 µmol/l (ggf. höhere Dosis, z.B. 10 µmol/l).

• ●

  Kollagen: 0,5–2 (–4) µg/ml – je nach Art des Kollagens!

• ●

  TRAP: 10 µmol/l.

Beurteilung von Aggregationskurven

• ●

  Für jeden Agonisten und jede Konzentration sollen hauseigene Referenzwerte durch mindestens jeweils 20 Analysen erfolgen – besonders wichtig bei Kollagen aufgrund der unterschiedlichen Kollagenarten mit erheblichem Einfluss auf die Testergebnisse. Normalbereiche definieren – bei größeren Fallzahlen dafür auch Verwendung von Perzentilen möglich – als pathologisch sind alle Werte anzusehen, die außerhalb eines Bereichs von ± 2 SD liegen (Normalverteilung vorausgesetzt).

• ●

  Visuelle Beurteilung der Kurven auf Plausibilität.

• ●

  Obligatorischer Bericht: Latenzphase, maximale Aggregation, Beurteilung einer Desaggregation (vorhanden, bei >10%-Angabe).

• ●

  Optionaler Bericht: Maximale Aggregationsgeschwindigkeit (Kurvenanstieg), Formenwandel (Shape Change), Bestimmung der Fläche unter der Aggregationskurve (› Tab. K1-2).

1.4.2

Impedanzaggregometrie im Vollblut – Whole Blood Aggregometry (WBA)

Die Impedanzaggregometrie (IA) ist eine Variante der Aggregometrie bei der mit isotoner Kochsalzlösung verdünnte und mit Zitrat antikoagulierte Vollblutproben analysiert werden (15). Diese Methode hat in letzter Zeit vermehrt Verwendung als Point-of-care in halb automatischen Geräten gefunden. Die Standardisierung ist schwierig.

Prinzip

Eine Halterung mit zwei Elektroden wird in die mit einem Rührstäbchen versehene, auf 37 °C erwärmte Probe eingetaucht.

Mit Zugabe eines Agonisten (Induktors) kommt es zu einer Impedanzerhöhung infolge der Anlagerung von aggregierten Thrombozyten an den Elektroden, die als zeitliche Funktion der Impedanzzunahme aufgezeichnet wird.

Präanalytik

Patient

Analog zur LTA.

Blutgewinnung

Analog zur LTA.

Ausnahme: Multiplate® ist für Hirudin-antikoagulierte Proben standardisiert. Empfohlenes Abnahmeröhrchen: Dynabite HIRUDIN 4,5 ml für Multiplate-Analyse, REF: MP0620.

Geräte

• ●

  Chronolog-Aggregometer® (Chronolog Corporation, Havertown, USA)

• ●

  Multiplate® (Dynabyte, München, Deutschland)

Probenvorbereitung

• ●

  Vor dem Test Blut für mindestens 10–30 min bei Raumtemperatur ruhen lassen.

• ●

  Im Chronolog-Aggregometer Blut in die mit NaCl 0,9% vorgefüllten Küvetten im Verhältnis von 1 : 1 (Gesamtprobenmenge 1.000 µl : 500 µl Vollblut und 500 µl NaCl 0,9%) überführen und bei 37 °C für 15–20 min im Gerät vorwärmen.

• ●

  Die Vollblutprobe für Multiplate laut Vorgabe (mit dem Gerät verbundene halb automatische Pipette) mit NaCl 0,9% verdünnen.

Agonisten (Chronolog-Aggregometer)

• ●

  Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten.

• ●

  Gleiches Prinzip wie bei LTA: mit niedriger Agonistenkonzentration beginnen.

• ●

  ADP: 10 µmol/l (ggf. steigern auf 20 µmol/l).

• ●

  Kollagen: 1 µg/ml (ggf. steigern auf 2 µg/ml).

• ●

  Arachidonsäure: 0,5 mmol/l (ggf. steigern auf 1,0 mmol/l).

• ●

  Ristocetin: 1,25 mg/ml (0,2–0,6 mg/ml bei Verdacht auf VWS Typ 2B).

Agonisten (Multiplate)

• ●

  ASPI-Test (Arachidonsäure) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20 °C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.

• ●

  RISTO-Test (Ristocetin) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20 °C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.

• ●

  COL-Test (Kollagen) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, bei Kühlschranktemperatur (4–6 °C)

• ●

  lagern!

• ●

  ADP-Test (ADP) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20 °C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.

• ●

  TRAP-Test (Thrombin Receptor Activating Peptide) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20°C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.

Auswertungsmodus der Aggregationskurven (Chronolog-Aggregometer)

• ●

  Vor Beginn der Messung Kalibration mit einer mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllten Küvette.

• ●

  Charakterisierung der Aggregationskurven durch folgende Parameter:

  • ○

    Obligatorisch: maximale Aggregation (in Ohm) und Latenzphase (in s).

  • ○

    Optional: Aggregationsrate (in %/min) und Fläche unter der Kurve.

  • ○

    Altersabhängige Referenzbereiche beachten (16, 17).

Auswertungsmodus der Aggregationskurven (Multiplate)

• ●

  Parameter: Fläche unter der Kurve (Area Under The Curve Units), maximale Aggregation (Aggregation Units), Aggregationsgeschwindigkeit (in U/min).

• ●

  Altersabhängige Referenzbereiche (12).

1.5

Luminometrische Bestimmung der ATP-Freisetzung

Mit dieser durch Lundin et al. erstmals vorgestellten Methode wird die thrombozytäre ATP-Freisetzung gemessen, wodurch Sekretionsdefekte der d-Granula (Storage-Pool-Defekt) identifiziert werden können (18).

Prinzip

• ●

  Zitratantikoaguliertem Vollblut oder PRP wird das Luciferin-Luciferase-Reagenz (LLR) zugefügt, das in Gegenwart von ATP luminesziert.

• ●

  Die bei der ATP-Freisetzung entstehende Lumineszens wird fotometrisch von einem Fotomultiplier erfasst.

• ●

  Mithilfe eines externen ATP-Standards erfolgt die Auswertung der ATP-Freisetzungskurve.

Gerät

Chronolog-Lumiaggregometer® (Chronolog Corporation, Havertown, USA).

Agonisten

• ●

  Gesamtprobenmenge 1.000 µl (450 µl Zitratblut, 450 µl NaCl 0,9% und 100 µl LLR).

• ●

  Ansätze nach Zugabe von LLR bei 37 °C für 2 min vorwärmen.

• ●

  Kollagen: 2 µg/ml.

• ●

  Thrombin: 1 E/ml.

Auswertungsmodus der Freisetzungskurve

• ●

  Freisetzungskurve bis zum Erreichen des Peaks aufzeichnen.

• ●

  Parameter zur Charakterisierung der ATP-Freisetzungskurve:

  • ○

    Obligatorisch: maximale ATP-Freisetzung (Berechnung erfolgt unter Verwendung eines ATP-Standards mit definierter ATP-Menge, die einer separaten Probe zugegeben wird).

  • ○

    Optional: Reaktionszeit bis zum Erreichen des Peaks.

  • ○

    Altersabhängige Referenzwerte beachten (analog zur Literatur unter IA für das Chronolog-Aggregometer)!

1.6

Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist als fixer Bestandteil der Zelldiagnostik etabliert. Die Beurteilung von Thrombozyten zur Diagnose von angeborenen Störungen der Thrombozytenfunktion ist relativ neu und unzureichend standardisiert (20). Die Durchflusszytometrie eignet sich sehr gut zur Diagnose

• ●

  der Thrombasthenie Glanzmann,

• ●

  des Bernard-Soulier-Syndroms und

• ●

  der Storage-Pool-Erkrankung (α-/δ-Granuladefekte).

Die besonderen Vorteile liegen in geringen benötigten Blutmengen und in der einstufigen Diagnostik mit der Möglichkeit der Identifizierung heterozygoter Träger (21).

Prinzip

Quantifizierung konstitutiver Oberflächenrezeptoren und Messung von Granulainhaltsstoffen vor und nach Aktivierung.

Präanalytik

Patient

• ●

  Blutbild einschließlich Thrombozytenzahl bestimmen!

• ●

  Kein Fasten.

• ●

  Koffeinabstinenz mindestens 2 h.

• ●

  Nikotinabstinenz mindestens 60 min.

• ●

  Patient kurz ruhen lassen.

• ●

  Medikamentenanamnese (› Tab. K1-4).

Blutgewinnung bei Indexpatient und gesundem Kontrollprobanden

• ●

  Nur leicht und nicht zu lange stauen.

• ●

  3–4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden.

• ●

  Unterdruck-Abnahmesysteme vermeiden (Vacutainer).

• ●

  Nadel mit 19 bis 21 Gauge.

• ●

  Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen.

• ●

  Natriumzitrat 109 oder 129 mmol/l resp. 3,2 oder 3,8%.

• ●

  Zitrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile.

• ●

  Probenverarbeitung 30–90 min nach Abnahme.

• ●

  Ausschließlich Analyse von Zitrat-antikoaguliertem Vollblut ohne Fixans oder Konservierung bis 3 h nach erfolgter Färbung

• ●

  Keine Lyse der Erythrozyten durchführen; cave: ATP- und ADP-Freisetzung.

• ●

  Proben bei Raumtemperatur transportieren und lagern, nie kühlen!

• ●

  Schütteln und mechanischen Stress (auch Rohrpost) für Thrombozyten vermeiden.

• ●

  Inkubation ca. 15 min im Dunkeln, dann mit Puffer (1% BSA auf PBS) verdünnen und messen.

Apparative Voraussetzung

• ●

  Durchflusszytometer; allgemeine Qualitätskontrollen werden vorausgesetzt.

• ●

  Thrombozytenzahl: Vollblutprobe benötigt im Regelfall keine Einstellung der Thrombozytenzahl. Cave: Gesamtzellzahl darf nicht über der „Auflösung“ des Geräts liegen (am FACS-Canto II z.B. 10.000 Events/s).

• ●

  Ansatz in Polypropylenröhrchen.

• ●

  Direkt mit Fluorochrom markierte AK verwenden.

• ●

  Schwach exprimierte Antigene mit stark fluoreszierenden Farben markieren (z.B. PE), stark exprimierte Antigene mit schwächeren Farben markieren (z.B. FITC).

• ●

  Positive immunologische Erkennung der Thrombozyten durch Färbung eines konstitutiv hochexprimierten Rezeptors mit einem PE- oder PE-Cy5-markierten AK gegen CD41 oder CD42 oder CD61.

• ●

  Sichere Erkennung von schwach exprimierten Rezeptoren oder aktivierungsabhängig exprimierten Rezeptoren durch Messung einer adäquaten Isotyp-Kontrolle vor der jeweiligen Rezeptormessung (IgG oder IgM beachten!). Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO-Kontrolle (Fluorescence Minus One) verwendet werden.

• ●

  Darstellung der FSC- und SSC-Signale in logarithmischer Skalierung

• ●

  Stopp-Kriterium der Messung: ca. 10.000 Thrombozyten im Gate. Es wird empfohlen alle Zellen aufzunehmen, um Makrothrombozyten und Thrombozytenaggregate identifizieren zu können.

• ●

  Falls Zähl-Beads verwendet werden – nicht mit Thrombozyten zusammen ansetzen.

Empfohlen werden Antikörper gegen folgende Antigene:

• ●

  CD41a Fibrinogenrezeptor (GPIIb/IIIa) – gesamter Komplex (stöchiometrisch)

• ●

  CD41b Fibrinogenrezeptor (GPIIb)

• ●

  CD42a/b Von-Willebrand-Faktor-Rezeptor (GPIbα/IX)

• ●

  CD61 Fibrinogenrezeptor (GPIIIa)

• ●

  CD49b Kollagenrezeptor (GPIa/IIa)

Empfohlen werden folgende Antikörper gegen aktivierungsabhängig exprimierte Antigene: Messung nach Stimulation der Thrombozyten mit ADP und TRAP:

• ●

  CD62 P P-Selectin (α-Granula)

• ●

  CD63 GP-53 (lysosomale und δ-Granula)

• ●

  CD107a/b LAMP-1/2 (lysosomale Granula)

• ●

  PAC1 aktivierter GPIIb/IIIa-Komplex-Fibrinogenrezeptor (Inside-out-Signaling) gemessen durch den spezifischen IgM Antikörper PAC-1.

Zur Untersuchung der δ-Granula eignet sich der Mepacrine-Assay (22).

Glanzmann-Diagnostik

4

Vereinfachte Klassifizierung in Typ I und Typ II.

Thrombozyten-Zahl normal, Größe (Forward Scatter) normal

• ●

  CD41a (gesamten Rezeptorkomplex stöchiometrisch erkennend) Klon P2

• ●

  CD41b (GPIIb)

• ●

  CD61 (GPIIIa)

Aktivierungsmarker PAC-1, + CD42b (als Alternative FITC-markiertes Fibrinogen statt PAC1)

• ●

  Glanzmann-Typ I: CD41a < 10% (Fib. rez. homozygot verändert)

• ●

  Glanzmann-Typ II: CD41a > 10%

Bernard-Soulier-Diagnostik

Thrombozyten-Zahl vermindert, Größe (Forward Scatter) erhöht

• ●

  CD42a (GPIX) vermindert

• ●

  CD42b (GPIbα) vermindert

• ●

  CD42c (GPIbβ) vermindert

Es können selektiv einzelne Komponenten oder mehrere Untereinheiten durch stöchiometrische Bindungseffekte reduziert sein (› Kasten).

Vorschlag zum rationalen Einsatz der Durchflusszytometrie

Negativkontrolle: IgG1– FITC/IgG1-PE: Gleiche Ig-Subklasse, oder AK gegen AG, das nicht auf Thrombozyten exprimiert ist, z. B. gegen Neutrophile (CD16).

Positivkontrolle: CD41a- FITC/ CD42b-PE (zur Auffindung z. B. CD31/CD36).

Thrombasthenie Glanzmann

• ●

  IgG1–FITC/IgG1-PE

• ●

  CD41a-FITC oder CD41b-FITC/CD61-PE + FSC/SSC

• ●

  Normale Oberflächenpräsentation von CD62P und CD63 nach Stimulation

• ●

  Keine (erhöhte) Bindung von Fibrinogen oder dem Fibrinogen-simulierenden Anti-GPIIb/IIIa-Antikörper PAC1 nach Stimulation mit ADP, Kollagen, Thrombinrezeptor PAR-1 Aktivator (TRAP)

Bernard-Soulier-Syndrom

• ●

  IgG1–FITC/IgG1–PE oder korrekte Isotypkontrolle

• ●

  CD42a-FITC/ CD42b-PE/ CD42c + FSC/SSC (Shift wegen Größe)

Aktivierungsmarker

Fragestellungen:

• 1.

  ADP-Rezeptor-Stimulierbarkeit

• 2.

  Thrombinrezeptor-Stimulierbarkeit

• 3.

  Vorhandensein von Granula

• 4.

  Regelrechte Ausschüttung der Granula

Granuläre Aktivierungsmarker

• ●

  α-Granula: CD62P

• ●

  lysosomale Granula: CD63

• ●

  Dense-Granula: Mepacrine-Beladung oder Serotonin-Reuptake-Test

Rezeptorassoziierter Aktivierungsmarker

PAC-1: aktivierter Fibrinogenrezeptor

Storage-Pool-Disease-Diagnostik

Aktivatoren:

• ●

  Standard: ADP und TRAP-6 (SFLLRN) – humaner Protease Activated Receptor-1 (PAR1-Peptid für basale Aktivierungsuntersuchungen)

• ●

  Weiterführend: Kollagen und Tx-A2-Agonisten (U-46619)

Agonistenkonzentrationen:

• ●

  ADP: 2–10 µmol/l

• ●

  TRAP-6: (1–) 10–100 µmol/l (Konzentration produktabhängig!)

Inkubation mit Aktivator für 5 min, anschließend für weitere 15 min AK dazu (im Dunkeln inkubieren!), dann Abstoppen mit Puffer (1% BSA oder Albumin auf PBS) und innerhalb 30 bis max. 60 min messen (Kasten).

Beurteilung

• ●

  Nach mittlerer Fluoreszenzintensität und Vergleich gegenüber Normalkollektiv

• ●

  Nach MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) im Vergleich zur adäquaten Isotyp- oder FMO-Kontrolle

• ●

  Aktivierung auch als % positive Zellen (% over threshold)

• ●

  Deskriptive Angabe des Befundes (keine Zahlen)

Vorschlag zum rationalen Einsatz der Durchflusszytometrie mit Aktivierung

	FITC	PE	PE-Cy5/PE-Cy7
	IgG1	IgG1
unstimuliert	CD62P	CD63	CD41
2 µmol/l ADP	CD62P	CD63	CD41
1 µmol/l TRAP-6	CD62P	CD63	CD41
10 µmol/l TRAP-6	CD62P	CD63	CD41
5 µmol/l ADP	PAC-1	CD63	CD41

Beispiel aus der Arbeitsgruppe Harald Schulze (4 Farben)

Tube	Antikörper				Agonist
	FITC	PE	PE-Cy5/PerCP	APC
K1	CD61	CD29	CD42a	CD42b	–
K2	CD49b	CD49e	CD49f	CD41a	–
K3	PAC-1	CD63	CD41a	CD62P	–
K4	–	–	CD41a	CD62P	2 µmol/l ADP
K5	PAC-1	CD63	CD41a	FMO*	5 µmol/l ADP
K6	PAC-1	FMO*	CD41a	CD62P	1 µmol/l TRAP-6
K7	FMO*	CD63	CD41a	CD62P	5 µmol/l TRAP-6

* Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO-Kontrolle verwendet werden.

1.7

Molekulargenetische Methoden

Obwohl molekulargenetische Untersuchungen eine immer wichtigere Rolle spielen, sind deren Methoden aufgrund der großen Heterogenität der angeborenen und erworbenen Thrombozytendefekte in der klinischen Praxis von geringem Nutzen. Sie können dazu dienen, eine vermutete Diagnose zu bestätigen (23). Bis auf wenige gut definierte Erkrankungen (24, 25) kann mittels Molekulargenetik kaum eine Diagnose gestellt werden. Große Bedeutung hat die Molekulargenetik zur Familiendiagnostik und Bestimmung eines heterozygoten Status.

Diagnose, klinische Präsentation, Laborauffälligkeit und Genetik definierter Thrombozytopathien sind zur Unterstützung der Identifikation von angeborener Erkrankungen mit assoziierten Thrombozytenfunktionsstörungen/-penien aufgelistet (› Tab. K1-3). Die Einteilung erfolgt nach Adhäsions-, Aggregations-, Rezeptor- und Signaltransduktions-, Granula-, zytoskelettalen Defekten u.a.

Kommentar zur Leitlinie

Thrombozytenfunktionsteste

Das klassische Verfahren der gerinnungsphysiologischen Labordiagnostik ist die Messung der Fibrinbildung im Plasma. Diese Einschränkung auf die plasmatische Gerinnung führt zu dem lange bekannten und beklagten Mangel der Erfassung der primären Hämostase und der Thrombozytenfunktion. In der Routine- und Notfalldiagnostik ist immer noch nur die Thrombozytenzahl in der Patientenversorgung verfügbar.

Die Thrombozytenfunktionstestung blieb lange auf wenige Speziallabore beschränkt, die mit aufwendigen „händischen“ Methoden (z. B. Aggregometrie nach Born, Durchflusszytometrie) arbeiteten und arbeiten. Für Präanalytik, Aktivatoren und Bewertung der Befunde sind zahlreiche Varianten im Gebrauch. Offensichtlich ist der Ruf nach standardisierter, vergleichbarer Analytik und Ergebnismitteilung nicht wirklich erfüllbar.

Erst die weitgehend automatisierte Messung der Thrombozytenfunktion im Vollblut (PFA, Impendanzaggregometrie) ermöglicht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen Laboratorien. Diese wird auch für die aufwendigen klassischen Methoden mehr und mehr gefordert, nicht zuletzt weil sie noch als hochwertige Standardverfahren gelten.

Leitlinie und technischer Report

Die GTH gab den Anstoß zur Bildung einer interdisziplinären Gruppe aus der Kommission Pädiatrie, die eine Leitlinie zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik erarbeitet hat. Dabei wurden sowohl die aufwendigen Standardmethoden als auch neuere automatisierte Messsysteme eingeschlossen.

Diese Leitlinie ist als S2k-AMWF-Leitlinie verfügbar (Registernummer 086–003, www.awmf.org/leitlinien/detail/ll/086-003.html) und wird auch in der Hämostaseologie-Ausgabe 2014, 34: 201–212 präsentiert.

Automatisierte Methoden werden inzwischen vor allem zum Monitoring von Thrombozytenhemmern breit eingesetzt, komplexe Verfahren wie die Luminometrie bleiben dagegen nur ganz wenigen Laboratorien vorbehalten.

Obwohl evtl. einzelne technische Details in der Leitlinie nicht ganz auf aktuellem Stand sind, so ist dieses Dokument dennoch unverändert wertvoll, weil es die unterschiedlichen Testsysteme systematisch nebeneinander stellt und – wenn möglich – eine Standardisierung verschlägt. Des Weiteren haben einige GTH-Mitglieder in der DIN-Kommission Hämostaseologie einen technischen Report (Technical Report Nr. DIN SPEC 58961: 2013–04) zur Thrombozytenfunktion fertig gestellt, der über das Deutsche Institut für Normung (DIN, Beuth Verlag) bezogen werden kann.

M. Spannagl, München

R. Knöfler, Dresden

1.8

Anhang

Verfahren zur Konsensbildung

Interdisziplinäre S2K-Leitlinie der Ständigen Kommission Pädiatrie der Gesellschaft für Thrombose- und Hämostaseforschung e. V.

Weitere Autoren

T. Bakchoul, F. Bergmann, S. Gehrisch, C. Geisen, S. Gottstein, S. Halimeh, U. Harbrecht, G. Kappert, C. Kirchmaier, B. Kehrel, W. Lösche, M. Krause, R. Mahnel, O. Meyer, A. K. Pilgrimm, D. Pillitteri, H. Rott, S. Santoso, A. Siegemund, C. Schambeck, M. Scheer, M. Schmugge, T. Scholl, G. Strauss, B. Zieger, R. Zotz, M. Hermann

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. W. Streif

Klinik für Kinder- und Jugendheilkunde

Medizinische Universität Innsbruck

Anichstr. 35

A-6020 Innsbruck

Literatur

1.

1.Cox K, Price V, Kahr WH. Inherited platelet disorders: a clinical approach to diagnosis and management. Expert Rev Hematol 4: 455–472, 2011.

2.

2.Streif W, Olivieri M, Weickardt S et al. Testing for inherited platelet defects in clinical laboratories in Germany, Austria and Switzerland. Platelets 21: 470–478, 2010.

3.

3.Guidelines on platelet function testing. The British Society for Haematology BCSH Haemostasis and Thrombosis Task Force. J Clin Pathol 41: 1322–1330, 1988.

4.

4.Christie JD, Avari T, Carrington RL et al. H58-A – Platelet Function Testing by Aggregometry; Approved Guideline. Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008.

5.

5.Schambeck CM. Blutungsneigung: Diagnostische Strategie zur Abklärung einer Thrombozytendysfunktion. Consensus-Papier der DGKL-Arbeitsgruppe „Hämostaseologische Labordiagnostik“. J Lab Med 28: 453–462, 2004.

6.

6.Cattaneo M, Hayward CP, Moffat KA et al. Results of a worldwide survey on the assessment of platelet function by light transmission aggregometry: a report from the platelet physiology subcommittee of the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 7: 1029, 2009.

7.

7.Duncan EM, Bonar R, Rodgers SE et al. Methodology and outcomes of platelet aggregation testing in Australia, New Zealand and the Asia-Pacific region. Int J Lab Hematol 31: 398–406, 2009.

8.

8.Harrison P, Mackie I, Mumford A et al. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function. Br J Haematol 155: 30–44, 2011.

9.

9.Hayward CP, Moffat KA, Plumhoff E, Van Cott EM. Approaches to investigating common bleeding disorders: an evaluation of North American coagulation laboratory practices. Am J Hematol 87 (Suppl 1): S45-S50, 2012.

10.

10.Rodgers RP. Bleeding time tables. A tabular summary of pertinent literature. Semin Thromb Hemost 16: 21–138, 1990.

11.

11.Hayward CP, Harrison P, Cattaneo M et al. Platelet function analyzer (PFA)-100 closure time in the evaluation of platelet disorders and platelet function. J Thromb Haemost 4: 312–319, 2006.

12.

12.Halimeh S, Angelis G, Sander A et al. Multiplate whole blood impedance point of care aggregometry: preliminary reference values in healthy infants, children and adolescents. Klin Pädiatr 222: 158–163, 2010.

13.

13.Favaloro EJ. Clinical utility of the PFA-100. Semin Thromb Hemost 34: 709–733, 2008.

14.

14.Born GV. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature 194: 927–929, 1962.

15.

15.Cardinal DC, Flower RJ. The electronic aggregometer: a novel device for assessing platelet behavior in blood. J Pharmacol Methods 3: 135–158, 1980.

16.

16.Bonduel M, Frontroth JP, Hepner M et al. Platelet aggregation and adenosine triphosphate release values in children and adults. J Thromb Haemost 5: 1782–1783, 2007.

17.

17.Knöfler R, Weissbach G, Kuhlisch E. Platelet function tests in childhood. Measuring aggregation and release reaction in whole blood. Semin Thromb Hemost 24: 513–521, 1998.

18.

18.Lundin A, Richardsson A, Thore A. Continuous monitoring of ATP-converting reactions by purified firefly luciferase. Anal Biochem 75: 611–620, 1976.

19.

19.George JN, Shattil SJ. The clinical importance of acquired abnormalities of platelet function. N Engl J Med 324: 27–39, 1991.

20.

20.Schmitz G, Rothe G, Ruf A et al. European Working Group on Clinical Cell Analysis: Consensus protocol for the flow cytometric characterisation of platelet function. Thromb Haemost 79: 885–896, 1998.

21.

21.Michelson AD. Evaluation of platelet function by flow cytometry. Pathophysiol Haemost Thromb 35: 67–82, 2006.

22.

22.Wall JE, Buijs-Wilts M, Arnold JT et al. A flow cytometric assay using mepacrine for study of uptake and release of platelet dense granule contents. Br J Haematol 89: 380–385, 1995.

23.

23.Israels SJ, Kahr WH, Blanchette VS et al. Platelet disorders in children: A diagnostic approach. Pediatr Blood Cancer 56: 975–983, 2011.

24.

24.Balduini CL, Cattaneo M, Fabris F et al. Inherited thrombocytopenias: a proposed diagnostic algorithm from the Italian Gruppo di Studio delle Piastrine. Haematologica 88: 582–592, 2003.

25.

25.Nurden A, Nurden P. Advances in our understanding of the molecular basis of disorders of platelet function. J Thromb Haemost 9 (Suppl 1): 76–91, 2011.