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10.1016/B9783437223655.10001-8
9783437223655
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Abb. K1-1

Diagnostisches Stufenschema
1Syndromal: Kinder mit komplexen Erkrankungen, Auffälligkeiten der Thrombozyten (› Tab. K1-3).
2Siehe Medikamentenliste › Tab. K1-4.
3Faktor-XIII-Mangel wird nicht von den globalen Gerinnungstests (PT, PTT) erfasst.
4Bei Jungen stets Faktor-VIII- und -IX-Mangel (Hämophilie A/B) ausschließen.
5Von-Willebrand-Faktor-Ag und Ristozetin-Kofaktor (alternativ Kollagenbindungsaktivität), evtl. Multimere; Faktor VIII bei erniedrigtem VWF: Ag bestimmen!
6Inhibitoren: Lupus-Antikoagulans, Antiphospholipid-Antikörper, FVIII/IX/VWF-Hemmkörper ausschließen.
7Protein Z (Relevanz umstritten).
8In-vitro-Phänomen bei Verwendung von EDTA als Antikoagulans.
9TTP häufig mit defekter VW-Protease (ADAMTS 13) assoziiert. TTP kann durch P2Y12-Inhibitoren ausgelöst werden.
10Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) im PRP, Impedanzaggregometrie (IA) und Durchflusszytometrie im Zitratblut.
11Siehe www.gth-online.org.
Leitsymptome von 123 Kindern mit klassifizierter Thrombozytenfunktionsstörung nach THROMKID (2)
Leitsymptom | Häufigkeit (%) |
Epistaxis | 54 |
Hämatome | 20 |
Schleimhautblutungen | 11 |
Peri- /postinterventionelle Blutungen | 7 |
Menorrhagie | 5 |
Gastrointestinale Blutungen | 2 |
Hämarthros | 1 |
Typische Befundkonstellation (LTA)
Erkrankung | Aggregation mit | |||
ADP | Kollagen | Arachidonsäure | Ristocetin | |
Thrombasthenie Glanzmann | herabgesetzt – fehlend | normal | ||
Bernard-Soulier-Syndrom | normal | herabgesetzt – fehlend | ||
Aspirin-like-Defekt | normal – herabgesetzt | herabgesetzt | normal | |
Storage-Pool-Defekt | normal – herabgesetzt | normal | normal |
Diagnose, klinische Präsentation, Laborauffälligkeit und Genetik definierter Thrombozytopathien
Defekt bzgl. | Thrombopenie (Abkürzung) | OMIM | Vererbung | Gen (Genort) | Thrombozyten | Syndromal | Laborabnormalität, klinische Manifestation bzw. Erscheinungsbild | |
Zahl | Größe | |||||||
Adhäsion/Aggregation | Bernard-Soulier-Syndrom (BSS) | 231200 | AR | GP1BA (17p13.2); GP1BB (22q11.21); GP9 (3q21.3) | Niedrig | Groß | / | Defektes GPIb/IX/V (CD42a/b/c/d)
|
DiGeorge/Velokardiofaziales Syndrom (DGS) | 188400 | AR | GP1BB (22q11.2) | Niedrig | Groß | Syndromal | T-Zell-Defekt: kardiale, faziale und kognitive Abnormalitäten, Hypoparathyreoidismus, Thymushypoplasie | |
Thrombozyten-Typ oder Pseudo-Von-Willebrand-Syndrom (PTVWD) | 177820 | AD | GP1BA (17p13.2) | Niedrig | Groß | / | Spontane Thrombozytenaggregation in vitro und erhöhte Thrombozytenagglutination nach Ristocetin; VWF-Multimere und VWF:AG erniedrigtWichtig: Unterscheidung zum Von-Willebrand-Syndrom 2B! | |
Glanzmann Thrombasthenie (GT) | 273800 | AR | ITGA2B, ITGB3,(17q21.31/32) | Normal | Normal | / | Defektes GPIIb/IIIa (CD41a, CD41b, CD61); wichtig: Heterozygotennachweis mit Durchflusszytometrie; defekte Thrombozytenaggregation (auf alle Agonisten, ausgenommen Ristocetin) | |
Velokardiofaziales Syndrom(VCFS) | 192430 | AD | CGSc-GP1BB (22q11) | Normal | Groß | / | Defektes GPIb/IX/V: Gaumenspalte, faziale Dysmorphie, kardiale Anomalien, Lernschwierigkeiten | |
Rezeptor | ADP-Rezeptor-Defekte P2Y12 (purinerger Rezeptor P2Y; P2RY12) | 600515 | AR | P2RY12 (3q24–25) | Normal | Normal | / | Thrombozytenaggregation: abnormale Reaktion auf ADP |
Kollagenrezeptor-Defekte (Glykoprotein VI, GP6) | 605546 | AR | GP6 (19q13.42) | Normal | Normal | / | Thrombozytenaggregation: abnormale Reaktion auf Kollagen | |
Thromboxane-A2-Rezeptor-Defekte (TBXA2R) | 188070 | AR | TBXA2R (19q13.3) | Normal | Normal | / | Thrombozytenaggregation: abnormale Reaktion auf Arachidonsäure | |
Granula und Signaltransduktion | Grey-Platelet-Syndrom (GPS) | 139090 | AR | NBEAL2 (3p21.31) | Niedrig | Groß | / | Graue Plättchen, keine α-Granula |
Arthrogrypose mit renaler Dysfunktion und Cholestase (ARCS1) | 208085 | AR | VPS33B (15q26.1) | Niedrig | Groß | Syndromal | Graue Plättchen, keine α-Granula | |
Quebec-Platelet-Syndrom (QPD) | 601709 | AR | PLAU Tandem-Duplikation(10q22.2) | Niedrig | Normal | / | Variable Thrombozytopenie, abnormale Urokinase in Thrombozyten, Nachblutungstyp | |
Paris-Trousseau-Typ Thrombozytopenie (TCPT); Jacobsen-Syndrom (JBS) | 188025147791 | AD | Deletion von 11q23–24; hemizygote Deletion von FLI1 (11q24.1-q24.3) | Niedrig | Groß | Syndromal | Kardiale und faziale Anomalie, mentale Retardierung, Riesen-α-Granula | |
Hermansky-Pudlak-Syndrom (HPS) | AR | HPS1–8, HPS1, AP3B1,HPS3, HPS4, HPS5, HPS6,DTNBP1, BLOC1S3 | Normal | Normal | Syndromal | Riesengranula, erniedrigte oder nicht vorhandene α-Granula; Luminometrie: erniedrigte oder gar nicht vorhandene ATP-Freisetzung; okulokutaner Albinismus | ||
Chediak-Higashi-Syndrom (CHS1) | 214500 | AR | CHS1 (1q42.3) | Normal | Normal | Syndromal | Rieseneinschlüsse in Neutrophile, erniedrigte oder irreguläre α-Granula, Immundefizienz | |
Griscelli-Syndrom Typ 2 (GS2) | 607624 | AR | RAB27A (15q21.3) | Niedrig | Normal | Syndromal | Ähnelt dem Chediak-Higashi-Syndrom (CHS; 214500): partieller Albinismus, häufig | |
RUNX1 | 151385 | AD | RUNX1 (21q22.12) | Niedrig | Normal | Normal | RUNX1 reguliert MYL9-Expression in Megakaryozyten: erniedrigte Thrombozytenaggregation und ATP-Sekretion, Neigung zur Leukämie | |
GATA-Bindungsprotein 1 (GATA1) | 305371 | XL | GATA1 (Xp11.23) | Niedrig | Groß | Syndromal | Dyserythropoetische Anämie, Makrothrombozytopenie, Neigung zur Myelodysplasie, wenig α-Granula | |
Zytoskelett | Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS) | 300392 | XL | WASP (Xp11.23-p11.22) | Niedrig | Klein | Syndromal | Immundefekt (T-Zell), Infektionen und Ekzeme; erniedrigte Aggregation und Sekretion, erniedrigtes oder nicht vorhandenes WAS-Protein in der Durchflusszytometrie |
X-chromosomale Thrombozytopenie (XLT) | 313900 | XL | WASP (XP11) | Niedrig | Klein | Syndromal | Mögliche milde Immundefizienz, defektes WAS-Protein | |
Filaminopathie A (FLNA) | 300017 | XL | FLNA (Xq28) | Niedrig | Groß | / | Erniedrigte Thrombozyten-Gefäßwandinteraktion auf Scherkräfte; periventrikuläre noduläre Heterotopie, otopalatodigitales Syndrom | |
May-Hegglin-Anomalie (MHA) | 155100 | AD | MYH9 (22q12.3) | Niedrig | Groß | Syndromal | Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Döhle-Körper in Leukozyten | |
Sebastian-Syndrom (SBS) | 605249 | AD | MYH9 (22q12.3) | Niedrig | Groß | Syndromal | Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Einschlüsse in Leukozyten | |
Fechtner-Syndrom (FTNS) | 153640 | AD | MYH9 (22q12.3) | Niedrig | Groß | Syndromal | Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Döhle-Körper in Leukozyten, Nephritis, Schwerhörigkeit, Katarakt | |
Epstein-Syndrom | 300392 | AD | MYH9 (22q12.3) | Niedrig | Groß | Syndromal | Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Nephritis, Schwerhörigkeit | |
Andere | Kongenitale amegakaryozytische Thrombozytopenie (CAMT) | 604498 | AR | c-mpl (1p34) | Niedrig | Normal | / | Schwere Thrombozytopenie, fehlende Megakaryozyten im Knochenmark |
Amegakaryozytische Thrombozytopenie mit radioulnarer Synostose (CTRUS) | 605432 | AD | HOXA11 (17p15.2) | Niedrig | Normal | Syndromal | Proximale Fusion von Radius und Ulnar, Neigung zu Knochenmarkversagen | |
Thrombozytopenie mit fehlender Radii (TAR) | 274000 | Digenetisch | RBM8A (1q21.1)(200 kb Deletion) | Niedrig | Normal | Syndromal | Bilateral fehlende Radii |
AD: autosomal dominant; AR: autosomal rezessiv; XL: X-chromosomal; *lichtmikroskopisch
Medikamente, Nahrungsmittel, Gewürze und Vitamine mit Einfluss auf die Thrombozytenfunktion; modifiziert nach (19)
Agens | Abnormalität | ||
Antiphlogistika | Phenylbutazone | ATA | |
Piroxicam | ATA | ||
Naproxen | ATA/ABZ | ||
Acetylsalicylsäure | ATA/ABZ; klin. Blutungen | ||
Diclofenac | ABZ; klin. Blutungen | ||
Ibuprofen | ATA/ABZ | ||
β-Laktam-Antibiotika | Penicilline | Mezlocillin, Piperacillin | ATA/ABZ; klin. Blutungen |
Ampicillin, Penicillin G/Benzylpenicillin | ATA/ABZ | ||
Cephalosporine | Cefotaxim | ABZ; klin. Blutungen | |
Cefamandol | Klin. Blutungen | ||
Nitrofurantoin | ABZ; klin. Blutungen | ||
Kardiovaskuläre Medikamente | Dipyridamole | ATA | |
Diltiazem | ATA | ||
Isosorbidmononitrat | ATA | ||
Nimodipin | ATA | ||
Propranolol | ATA | ||
Verapamil | ATA | ||
Nifedipin | ATA | ||
Nitroglycerin/Glyceroltrinitrat | ATA/ABZ | ||
Antikoagulanzien und fibrinolytische Medikamente | Heparin | ATA/ABZ | |
Altepla | ABZ; klin. Blutungen | ||
Anästhetika und Narkotika | Benzocain | ATA | |
Kokain | ATA | ||
Hydroxychloroquin | ATA | ||
Lidocain | ATA | ||
Procain | ATA | ||
Tetracain | ATA | ||
Halothan | ATA | ||
Morphin | ATA | ||
NO | ATA | ||
Antiepileptika | Valproinsäure/Valproat | ATA | |
Antidepressiva | Duloxetin | Klin. Blutungen | |
Chemotherapeutika | Asparaginase | ATA | |
Kombinierte Chemotherapie | Cisplatin, Cyclophosphamid | ATA | |
Carmustein oder Melphalan, Vincristin | ATA | ||
Carmustin, Daunorubicin | ATA | ||
Plicamycin | ATA/ABZ; klin. Blutungen | ||
Antihistaminika | Chlorpheniramin, Diphenhydramin, Pyrilamin | ATA in vitro | |
Radiografische Kontrastmittel | Iopamidol | ATA | |
Diatrizoat/Amidotrizoesäure | ATA | ||
Meglumin-Diatrizoat und Natrium-Diatrizoat | ATA | ||
Andere Medikamente | Guaifenesin | ATA | |
Montelukast | ATA | ||
G-CSF | (Filgrastim/Lenograstim) | ATA | |
Prostaglandine | Alprostadil | ATA | |
Epoprostenol | ATA | ||
Iloprost | ATA | ||
Nahrungsmittel, Gewürze und Vitamine | Ingwer | ATA | |
Vitamin C/Ascorbinsäure | ATA | ||
Kreuzkümmel, Gelbwurz (Kurkuma), Nelken | ATA | ||
Alkohol, n-3-Fettsäuren | ATA/ABZ | ||
Omega-3-Fischöl, Gingko, Ginseng | ATA | ||
Mu-Err-Pilz, Knoblauch | ABZ; klin. Blutungen |
G-CSF: Granulocyte Colony Stimulating Factor; ATA: abnormale Thrombozytenaggregation; ABZ: abnormale In-vivo-Blutungszeit
Diagnose angeborener Störungen der Thrombozytenfunktion (S2k)
1.1
Definition und Basisinformation
-
●
einer positiven Familienanamnese,
-
●
dem Lebensalter des Kindes,
-
●
akuter und chronischer Blutungsneigung,
-
●
verfügbarer Blutmenge u.a.
1.2
Stufendiagnostik einer hämorrhagischen Diathese
1.3
Screening-Methoden
-
●
In-vivo-Blutungszeit (10): Es sollen nur standardisierte Verfahren nach Ivy, Duke, Mielke, Borchgrevink oder Marx mit Surgicutt, Template, Precisette oder Hemostilette von erfahrenen Untersuchern angewendet werden. Die Patienten sollen über die Möglichkeit einer Narbenbildung aufgeklärt werden. Für Kleinkinder, Patienten mit Bindegewebs- und Hauterkrankungen ist die Methode nur eingeschränkt geeignet. Mangelnde Kooperation des Patienten, Anämie und Thrombozytopenie < 100.000/µl führen zu verfälschten Ergebnissen.
-
●
PFA-100®-Verschlusszeit (In-vitro-Blutungszeit) (11–13) eignet sich insbesondere zur Diagnose von schweren Störungen der Thrombozytenfunktion. Das Von-Willebrand-Syndrom und die Thrombasthenie Glanzmann führen zu einer Verlängerung der Verschlusszeit. Zu beachten ist, dass der Von-Willebrand-Faktor beim Neugeborenen, Schwangeren und anderen Zuständen (Akute-Phase-Protein!) erhöht ist. Bei Kindern mit rezidivierenden Infekten ist mit einer großen Variabilität der Verschlusszeiten zu rechnen. Grundvoraussetzung für die Testdurchführung ist eine Thrombozytenzahl über 100.000/µl und ein Hämatokrit (HKT) über 30 l/l. Verkürzte Verschlusszeiten werden durch Hämolyse, HKT > 50 l/l, Thrombozyten > 500.000/µl und verlängerte Verschlusszeiten durch Ikterus, Hämolyse, Anämie (HKT < 35l/l), Thrombozytopenie verursacht
und aufgrund der angewendeten Scherkräfte ist diese Methode grundsätzlich sensitiv zum Nachweis des Von-Willebrand-Syndroms, der Thrombasthenie Glanzmann und des Bernard-Soulier-Syndroms. Die PFA-100®-Verschlusszeit eignet sich auch zum Nachweis einer durch ASS induzierten Thrombozytenfunktionsstörung. Eine P2Y-Messzelle wurde zum Nachweis einer medikamentösen Hemmung der Thrombozytenfunktion durch den ADP-Rezeptorinhibitor Clopidogrel entwickelt. Ein verdächtiger oder pathologischer Befund bedarf einer weiteren Abklärung.1
Aufgrund des verwendeten Vollblutes kann eine Hämolyse/Ikterus nicht detektiert/ausgeschlossen werden. Hämatokrit und Zellzahlen haben einen direkten Einfluss auf die Fließeigenschaften des Blutes. Eine Bestimmung und Beurteilung des Blutbildes wird empfohlen.
-
●
Ungeeignete Methoden zur Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen sind die native Thrombelastografie, der Prothrombinverbrauchstest, der Rumpel-Leede-Test und der Thrombusretraktionstest.
-
●
Das für das Drugmonitoring entwickelte halbautomatische System Verify-Now® (Accumetrics) und das Impact-R® (Matis Medical) sind für die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen nicht evaluiert und daher nicht geeignet.
1.4
Aggregometrie
1.4.1
Lichttransmissionsaggregometrie (LTA)
Prinzip
-
●
Kontinuierliche Registrierung der im Verlauf der Aggregation sich ändernden Transmission langwelligen Lichts.
-
●
In einem in Bewegung gehaltenem plättchenreichen Zitratplasma oder in einer Suspension gewaschener Thrombozyten kommt es nach Zusatz von Agonisten zur Aggregation.
-
●
Zunehmende Aggregation führt zum Auftreten von Aggregaten und damit zur Zunahme der Lichttransmission, die fortlaufend fotometrisch registriert und in Kurvenform aufgezeichnet wird.
Präanalytik
Patient
-
●
Patient kurz ruhen lassen
. Kein Fasten2
Der Einfluss von den Punktionsschmerz lindernden Lokalanästhetika (EMLA®) auf das Testergebnis ist ungeklärt.
, aber aufgrund des potenziellen Störfaktors alimentäre Lipidämie vermeiden.3
Alimentäre Hyperlipidämie vermeiden – interagiert mit Probenanalyse.
-
●
Medikamentenanamnese laut Medikamentenliste (› Tab. K1-4).
-
●
Medikamente registrieren und nach Möglichkeit absetzen, sofern nicht dringend medizinisch indiziert. Gegebenenfalls bekannte Auswirkungen der Medikation bei Befundung berücksichtigen.
-
○
NSAR mindestens 3 Tage (unterschiedliche HWZ beachten)
-
○
Irreversible Aggregationshemmer (ASS) mindestens 10 Tage
-
○
P2Y12-Hemmer (z.B. Clopidogrel) mindestens 7 Tage
-
○
GP-IIb/IIIa-Inhibitor (z.B. Abciximab) mindestens 3 Tage
-
Blutgewinnung
-
●
Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen (DIN/ISO 6710 – Vacutainer möglich).
-
●
Natriumzitrat 109 oder 129 mmol/l resp. 3,2 oder 3,8%.
-
●
Zitrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile.
-
●
Bei schlechten Venenverhältnissen und kleinen Kindern ggf. abtropfen lassen.
-
●
Nadel mit 19 bis 21 Gauge.
-
●
Nur leicht und nicht zu lange stauen – bei problematischer Punktion 1. Röhrchen unbedingt verwerfen.
-
●
3–4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden.
-
●
Folgeabnahmeröhrchen für Thrombozytenanalyse verwenden, unbedingt Schaumbildung vermeiden.
-
●
Über-/unterfüllte Proben ablehnen, Füllung der Röhrchen wie vom Hersteller gefordert.
-
●
Proben nicht kühlen, Transport bei Raumtemperatur, keine Rohrpost!
-
●
Angabe der Uhrzeit der Blutentnahme auf der Probe (als auch Analysezeitpunkt) verzeichnen. Thrombozytenzahl unbedingt vor Zentrifugation bestimmen.
Probenvorbereitung
-
●
Zentrifugation bei Raumtemperatur.
-
●
Bei Thrombozytenzahl in Ausgangsprobe < 100.000/µl Probe spontan sedimentieren lassen oder schonende Zentrifugation nach Laborspezifikation.
-
●
PRP
-
○
150 × g für 10 min.
-
○
Keine Bremse.
-
○
Thrombozytenzahl im PRP messen.
-
○
Keine Einstellung der Thrombozytenzahl erforderlich, wenn Thrombozytenzahl im PRP zwischen 150.000 und 500.000/µl.
-
○
Bei Thrombozytenzahl im PRP < 150.000/µl Kontrolle mit angepasster Thrombozytenzahl mitmessen. Niedrige Thrombozytenzahl bei z.B. Bernard-Soulier-Syndrom, VWS Typ 2B, Platelet-Type-VWS!
-
○
Bei hoher Thrombozytenzahl > 500.000/µl mit autologem PPP korrigieren und auf 250.000–300.000/µl einstellen.
-
○
Für Riesenplättchen: Sedimentation für ca. 45 min, 45°-Winkel für Sedimentation, nicht aufrichten und in 45°-Winkel belassen für PRP-Entnahme.
-
-
●
PPP
-
○
1.500 × g für 10 min.
-
○
Qualität der Proben kontrollieren.
-
○
Hämolytische Proben verwerfen.
-
○
Lipidämie berichten.
-
Methodik
-
●
Normalkontrolle als Qualitätsstandard mindestens 1 ×/Woche mitführen.
-
●
Eichung des Geräts mit plättchenarmen autologen Plasma als Markierung der Lichttransmission von 100%.
-
●
Plättchenreiches Plasma bezeichnet den Nullwert der Lichttransmission.
-
●
Rührgeschwindigkeit: 1.000 U/min.
-
●
Temperatur: 37 °C.
-
●
Kurve vor Induktorzugabe für mindestens 1 min beobachten (stabile Grundlinie, Spontanaggregation registrieren).
-
●
Agonistenmenge (wässrige Lösung) darf 10% des Probenvolumens nicht übersteigen.
-
●
Beobachtung der Kurve für mindestens 10 min bzw. bis zur maximalen Amplitude.
-
●
Abschluss der Untersuchung möglichst nach 2 h, spätestens 4 h nach Blutabnahme (Zeitpunkt dokumentieren!).
Agonisten
-
●
Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten.
-
●
Prinzip: Zunächst niedrige Agonistenkonzentration wählen, da hohe Konzentrationen Defekte verdecken können.
-
●
Keine sequenzielle Agonistenzugabe! Ausnahme: Ristocetin.
-
●
Ristocetin: 1,2–1,5 mg/ml (0,5–0,6 mg/ml zur Erfassung des VWS Typ 2B). Bei Neugeborenen sind niedrigere Endkonzentrationen der Agonisten erforderlich.
-
●
Arachidonsäure: 1,0–1,5 mmol/l.
-
●
ADP: 2–3 µmol/l (Verdopplung der Konzentration, falls keine Reaktion mit niedriger Konzentration) – Beurteilung der Second Wave. Eine Probe sollte bei einer Konzentration von 2–3 µmol/l reagieren. Nach Standzeit benötigen Proben höhere Konzentrationen: Erhöhung auf 4 µmol/l.
-
●
Epinephrin: 5 µmol/l (ggf. höhere Dosis, z.B. 10 µmol/l).
-
●
Kollagen: 0,5–2 (–4) µg/ml – je nach Art des Kollagens!
-
●
TRAP: 10 µmol/l.
Beurteilung von Aggregationskurven
-
●
Für jeden Agonisten und jede Konzentration sollen hauseigene Referenzwerte durch mindestens jeweils 20 Analysen erfolgen – besonders wichtig bei Kollagen aufgrund der unterschiedlichen Kollagenarten mit erheblichem Einfluss auf die Testergebnisse. Normalbereiche definieren – bei größeren Fallzahlen dafür auch Verwendung von Perzentilen möglich – als pathologisch sind alle Werte anzusehen, die außerhalb eines Bereichs von ± 2 SD liegen (Normalverteilung vorausgesetzt).
-
●
Visuelle Beurteilung der Kurven auf Plausibilität.
-
●
Obligatorischer Bericht: Latenzphase, maximale Aggregation, Beurteilung einer Desaggregation (vorhanden, bei >10%-Angabe).
-
●
Optionaler Bericht: Maximale Aggregationsgeschwindigkeit (Kurvenanstieg), Formenwandel (Shape Change), Bestimmung der Fläche unter der Aggregationskurve (› Tab. K1-2).
1.4.2
Impedanzaggregometrie im Vollblut – Whole Blood Aggregometry (WBA)
Prinzip
Präanalytik
Patient
Blutgewinnung
Geräte
-
●
Chronolog-Aggregometer® (Chronolog Corporation, Havertown, USA)
-
●
Multiplate® (Dynabyte, München, Deutschland)
Probenvorbereitung
-
●
Vor dem Test Blut für mindestens 10–30 min bei Raumtemperatur ruhen lassen.
-
●
Im Chronolog-Aggregometer Blut in die mit NaCl 0,9% vorgefüllten Küvetten im Verhältnis von 1 : 1 (Gesamtprobenmenge 1.000 µl : 500 µl Vollblut und 500 µl NaCl 0,9%) überführen und bei 37 °C für 15–20 min im Gerät vorwärmen.
-
●
Die Vollblutprobe für Multiplate laut Vorgabe (mit dem Gerät verbundene halb automatische Pipette) mit NaCl 0,9% verdünnen.
Agonisten (Chronolog-Aggregometer)
-
●
Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten.
-
●
Gleiches Prinzip wie bei LTA: mit niedriger Agonistenkonzentration beginnen.
-
●
ADP: 10 µmol/l (ggf. steigern auf 20 µmol/l).
-
●
Kollagen: 1 µg/ml (ggf. steigern auf 2 µg/ml).
-
●
Arachidonsäure: 0,5 mmol/l (ggf. steigern auf 1,0 mmol/l).
-
●
Ristocetin: 1,25 mg/ml (0,2–0,6 mg/ml bei Verdacht auf VWS Typ 2B).
Agonisten (Multiplate)
-
●
ASPI-Test (Arachidonsäure) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20 °C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
-
●
RISTO-Test (Ristocetin) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20 °C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
-
●
COL-Test (Kollagen) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, bei Kühlschranktemperatur (4–6 °C)
-
●
lagern!
-
●
ADP-Test (ADP) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20 °C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
-
●
TRAP-Test (Thrombin Receptor Activating Peptide) mit 1 ml Aqua destillata auflösen, aliquotiert bei –20°C einfrieren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
Auswertungsmodus der Aggregationskurven (Chronolog-Aggregometer)
-
●
Vor Beginn der Messung Kalibration mit einer mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllten Küvette.
-
●
Charakterisierung der Aggregationskurven durch folgende Parameter:
-
○
Obligatorisch: maximale Aggregation (in Ohm) und Latenzphase (in s).
-
○
Optional: Aggregationsrate (in %/min) und Fläche unter der Kurve.
-
○
Altersabhängige Referenzbereiche beachten (16, 17).
-
Auswertungsmodus der Aggregationskurven (Multiplate)
-
●
Parameter: Fläche unter der Kurve (Area Under The Curve Units), maximale Aggregation (Aggregation Units), Aggregationsgeschwindigkeit (in U/min).
-
●
Altersabhängige Referenzbereiche (12).
1.5
Luminometrische Bestimmung der ATP-Freisetzung
Prinzip
-
●
Zitratantikoaguliertem Vollblut oder PRP wird das Luciferin-Luciferase-Reagenz (LLR) zugefügt, das in Gegenwart von ATP luminesziert.
-
●
Die bei der ATP-Freisetzung entstehende Lumineszens wird fotometrisch von einem Fotomultiplier erfasst.
-
●
Mithilfe eines externen ATP-Standards erfolgt die Auswertung der ATP-Freisetzungskurve.
Gerät
Agonisten
-
●
Gesamtprobenmenge 1.000 µl (450 µl Zitratblut, 450 µl NaCl 0,9% und 100 µl LLR).
-
●
Ansätze nach Zugabe von LLR bei 37 °C für 2 min vorwärmen.
-
●
Kollagen: 2 µg/ml.
-
●
Thrombin: 1 E/ml.
Auswertungsmodus der Freisetzungskurve
-
●
Freisetzungskurve bis zum Erreichen des Peaks aufzeichnen.
-
●
Parameter zur Charakterisierung der ATP-Freisetzungskurve:
-
○
Obligatorisch: maximale ATP-Freisetzung (Berechnung erfolgt unter Verwendung eines ATP-Standards mit definierter ATP-Menge, die einer separaten Probe zugegeben wird).
-
○
Optional: Reaktionszeit bis zum Erreichen des Peaks.
-
○
Altersabhängige Referenzwerte beachten (analog zur Literatur unter IA für das Chronolog-Aggregometer)!
-
1.6
Durchflusszytometrie
-
●
der Thrombasthenie Glanzmann,
-
●
des Bernard-Soulier-Syndroms und
-
●
der Storage-Pool-Erkrankung (α-/δ-Granuladefekte).
Prinzip
Präanalytik
Patient
-
●
Blutbild einschließlich Thrombozytenzahl bestimmen!
-
●
Kein Fasten.
-
●
Koffeinabstinenz mindestens 2 h.
-
●
Nikotinabstinenz mindestens 60 min.
-
●
Patient kurz ruhen lassen.
-
●
Medikamentenanamnese (› Tab. K1-4).
Blutgewinnung bei Indexpatient und gesundem Kontrollprobanden
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Nur leicht und nicht zu lange stauen.
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3–4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden.
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Unterdruck-Abnahmesysteme vermeiden (Vacutainer).
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Nadel mit 19 bis 21 Gauge.
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Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen.
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Natriumzitrat 109 oder 129 mmol/l resp. 3,2 oder 3,8%.
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Zitrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile.
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Probenverarbeitung 30–90 min nach Abnahme.
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Ausschließlich Analyse von Zitrat-antikoaguliertem Vollblut ohne Fixans oder Konservierung bis 3 h nach erfolgter Färbung
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Keine Lyse der Erythrozyten durchführen; cave: ATP- und ADP-Freisetzung.
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Proben bei Raumtemperatur transportieren und lagern, nie kühlen!
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Schütteln und mechanischen Stress (auch Rohrpost) für Thrombozyten vermeiden.
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Inkubation ca. 15 min im Dunkeln, dann mit Puffer (1% BSA auf PBS) verdünnen und messen.
Apparative Voraussetzung
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Durchflusszytometer; allgemeine Qualitätskontrollen werden vorausgesetzt.
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Thrombozytenzahl: Vollblutprobe benötigt im Regelfall keine Einstellung der Thrombozytenzahl. Cave: Gesamtzellzahl darf nicht über der „Auflösung“ des Geräts liegen (am FACS-Canto II z.B. 10.000 Events/s).
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Ansatz in Polypropylenröhrchen.
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Direkt mit Fluorochrom markierte AK verwenden.
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Schwach exprimierte Antigene mit stark fluoreszierenden Farben markieren (z.B. PE), stark exprimierte Antigene mit schwächeren Farben markieren (z.B. FITC).
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Positive immunologische Erkennung der Thrombozyten durch Färbung eines konstitutiv hochexprimierten Rezeptors mit einem PE- oder PE-Cy5-markierten AK gegen CD41 oder CD42 oder CD61.
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Sichere Erkennung von schwach exprimierten Rezeptoren oder aktivierungsabhängig exprimierten Rezeptoren durch Messung einer adäquaten Isotyp-Kontrolle vor der jeweiligen Rezeptormessung (IgG oder IgM beachten!). Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO-Kontrolle (Fluorescence Minus One) verwendet werden.
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Darstellung der FSC- und SSC-Signale in logarithmischer Skalierung
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Stopp-Kriterium der Messung: ca. 10.000 Thrombozyten im Gate. Es wird empfohlen alle Zellen aufzunehmen, um Makrothrombozyten und Thrombozytenaggregate identifizieren zu können.
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Falls Zähl-Beads verwendet werden – nicht mit Thrombozyten zusammen ansetzen.
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CD41a Fibrinogenrezeptor (GPIIb/IIIa) – gesamter Komplex (stöchiometrisch)
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CD41b Fibrinogenrezeptor (GPIIb)
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CD42a/b Von-Willebrand-Faktor-Rezeptor (GPIbα/IX)
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CD61 Fibrinogenrezeptor (GPIIIa)
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CD49b Kollagenrezeptor (GPIa/IIa)
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CD62 P P-Selectin (α-Granula)
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CD63 GP-53 (lysosomale und δ-Granula)
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CD107a/b LAMP-1/2 (lysosomale Granula)
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PAC1 aktivierter GPIIb/IIIa-Komplex-Fibrinogenrezeptor (Inside-out-Signaling) gemessen durch den spezifischen IgM Antikörper PAC-1.
Glanzmann-Diagnostik4
Vereinfachte Klassifizierung in Typ I und Typ II.
4
Vereinfachte Klassifizierung in Typ I und Typ II.
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CD41a (gesamten Rezeptorkomplex stöchiometrisch erkennend) Klon P2
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CD41b (GPIIb)
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CD61 (GPIIIa)
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Glanzmann-Typ I: CD41a < 10% (Fib. rez. homozygot verändert)
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Glanzmann-Typ II: CD41a > 10%
Bernard-Soulier-Diagnostik
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CD42a (GPIX) vermindert
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CD42b (GPIbα) vermindert
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CD42c (GPIbβ) vermindert
Vorschlag zum rationalen Einsatz der Durchflusszytometrie
Thrombasthenie Glanzmann
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IgG1–FITC/IgG1-PE
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CD41a-FITC oder CD41b-FITC/CD61-PE + FSC/SSC
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Normale Oberflächenpräsentation von CD62P und CD63 nach Stimulation
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Keine (erhöhte) Bindung von Fibrinogen oder dem Fibrinogen-simulierenden Anti-GPIIb/IIIa-Antikörper PAC1 nach Stimulation mit ADP, Kollagen, Thrombinrezeptor PAR-1 Aktivator (TRAP)
Bernard-Soulier-Syndrom
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IgG1–FITC/IgG1–PE oder korrekte Isotypkontrolle
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CD42a-FITC/ CD42b-PE/ CD42c + FSC/SSC (Shift wegen Größe)
Aktivierungsmarker
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1.
ADP-Rezeptor-Stimulierbarkeit
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2.
Thrombinrezeptor-Stimulierbarkeit
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3.
Vorhandensein von Granula
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4.
Regelrechte Ausschüttung der Granula
Granuläre Aktivierungsmarker
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α-Granula: CD62P
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lysosomale Granula: CD63
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Dense-Granula: Mepacrine-Beladung oder Serotonin-Reuptake-Test
Rezeptorassoziierter Aktivierungsmarker
Storage-Pool-Disease-Diagnostik
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Standard: ADP und TRAP-6 (SFLLRN) – humaner Protease Activated Receptor-1 (PAR1-Peptid für basale Aktivierungsuntersuchungen)
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Weiterführend: Kollagen und Tx-A2-Agonisten (U-46619)
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ADP: 2–10 µmol/l
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TRAP-6: (1–) 10–100 µmol/l (Konzentration produktabhängig!)
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Nach mittlerer Fluoreszenzintensität und Vergleich gegenüber Normalkollektiv
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Nach MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) im Vergleich zur adäquaten Isotyp- oder FMO-Kontrolle
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Aktivierung auch als % positive Zellen (% over threshold)
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Deskriptive Angabe des Befundes (keine Zahlen)
Vorschlag zum rationalen Einsatz der Durchflusszytometrie mit Aktivierung
FITC | PE | PE-Cy5/PE-Cy7 | |
IgG1 | IgG1 | ||
unstimuliert | CD62P | CD63 | CD41 |
2 µmol/l ADP | CD62P | CD63 | CD41 |
1 µmol/l TRAP-6 | CD62P | CD63 | CD41 |
10 µmol/l TRAP-6 | CD62P | CD63 | CD41 |
5 µmol/l ADP | PAC-1 | CD63 | CD41 |
Beispiel aus der Arbeitsgruppe Harald Schulze (4 Farben)
Tube | Antikörper | Agonist | |||
FITC | PE | PE-Cy5/PerCP | APC | ||
K1 | CD61 | CD29 | CD42a | CD42b | – |
K2 | CD49b | CD49e | CD49f | CD41a | – |
K3 | PAC-1 | CD63 | CD41a | CD62P | – |
K4 | – | – | CD41a | CD62P | 2 µmol/l ADP |
K5 | PAC-1 | CD63 | CD41a | FMO* | 5 µmol/l ADP |
K6 | PAC-1 | FMO* | CD41a | CD62P | 1 µmol/l TRAP-6 |
K7 | FMO* | CD63 | CD41a | CD62P | 5 µmol/l TRAP-6 |
1.7
Molekulargenetische Methoden
Kommentar zur Leitlinie
Thrombozytenfunktionsteste
Leitlinie und technischer Report
1.8
Anhang
Verfahren zur Konsensbildung
Literatur
1.
1.Cox K, Price V, Kahr WH. Inherited platelet disorders: a clinical approach to diagnosis and management. Expert Rev Hematol 4: 455–472, 2011.
2.
2.Streif W, Olivieri M, Weickardt S et al. Testing for inherited platelet defects in clinical laboratories in Germany, Austria and Switzerland. Platelets 21: 470–478, 2010.
3.
3.Guidelines on platelet function testing. The British Society for Haematology BCSH Haemostasis and Thrombosis Task Force. J Clin Pathol 41: 1322–1330, 1988.
4.
4.Christie JD, Avari T, Carrington RL et al. H58-A – Platelet Function Testing by Aggregometry; Approved Guideline. Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008.
5.
5.Schambeck CM. Blutungsneigung: Diagnostische Strategie zur Abklärung einer Thrombozytendysfunktion. Consensus-Papier der DGKL-Arbeitsgruppe „Hämostaseologische Labordiagnostik“. J Lab Med 28: 453–462, 2004.
6.
6.Cattaneo M, Hayward CP, Moffat KA et al. Results of a worldwide survey on the assessment of platelet function by light transmission aggregometry: a report from the platelet physiology subcommittee of the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 7: 1029, 2009.
7.
7.Duncan EM, Bonar R, Rodgers SE et al. Methodology and outcomes of platelet aggregation testing in Australia, New Zealand and the Asia-Pacific region. Int J Lab Hematol 31: 398–406, 2009.
8.
8.Harrison P, Mackie I, Mumford A et al. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function. Br J Haematol 155: 30–44, 2011.
9.
9.Hayward CP, Moffat KA, Plumhoff E, Van Cott EM. Approaches to investigating common bleeding disorders: an evaluation of North American coagulation laboratory practices. Am J Hematol 87 (Suppl 1): S45-S50, 2012.
10.
10.Rodgers RP. Bleeding time tables. A tabular summary of pertinent literature. Semin Thromb Hemost 16: 21–138, 1990.
11.
11.Hayward CP, Harrison P, Cattaneo M et al. Platelet function analyzer (PFA)-100 closure time in the evaluation of platelet disorders and platelet function. J Thromb Haemost 4: 312–319, 2006.
12.
12.Halimeh S, Angelis G, Sander A et al. Multiplate whole blood impedance point of care aggregometry: preliminary reference values in healthy infants, children and adolescents. Klin Pädiatr 222: 158–163, 2010.
13.
13.Favaloro EJ. Clinical utility of the PFA-100. Semin Thromb Hemost 34: 709–733, 2008.
14.
14.Born GV. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature 194: 927–929, 1962.
15.
15.Cardinal DC, Flower RJ. The electronic aggregometer: a novel device for assessing platelet behavior in blood. J Pharmacol Methods 3: 135–158, 1980.
16.
16.Bonduel M, Frontroth JP, Hepner M et al. Platelet aggregation and adenosine triphosphate release values in children and adults. J Thromb Haemost 5: 1782–1783, 2007.
17.
17.Knöfler R, Weissbach G, Kuhlisch E. Platelet function tests in childhood. Measuring aggregation and release reaction in whole blood. Semin Thromb Hemost 24: 513–521, 1998.
18.
18.Lundin A, Richardsson A, Thore A. Continuous monitoring of ATP-converting reactions by purified firefly luciferase. Anal Biochem 75: 611–620, 1976.
19.
19.George JN, Shattil SJ. The clinical importance of acquired abnormalities of platelet function. N Engl J Med 324: 27–39, 1991.
20.
20.Schmitz G, Rothe G, Ruf A et al. European Working Group on Clinical Cell Analysis: Consensus protocol for the flow cytometric characterisation of platelet function. Thromb Haemost 79: 885–896, 1998.
21.
21.Michelson AD. Evaluation of platelet function by flow cytometry. Pathophysiol Haemost Thromb 35: 67–82, 2006.
22.
22.Wall JE, Buijs-Wilts M, Arnold JT et al. A flow cytometric assay using mepacrine for study of uptake and release of platelet dense granule contents. Br J Haematol 89: 380–385, 1995.
23.
23.Israels SJ, Kahr WH, Blanchette VS et al. Platelet disorders in children: A diagnostic approach. Pediatr Blood Cancer 56: 975–983, 2011.
24.
24.Balduini CL, Cattaneo M, Fabris F et al. Inherited thrombocytopenias: a proposed diagnostic algorithm from the Italian Gruppo di Studio delle Piastrine. Haematologica 88: 582–592, 2003.
25.
25.Nurden A, Nurden P. Advances in our understanding of the molecular basis of disorders of platelet function. J Thromb Haemost 9 (Suppl 1): 76–91, 2011.