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B978-3-437-41397-1.00012-2

10.1016/B978-3-437-41397-1.00012-2

978-3-437-41397-1

Abb. 12.1

[L253]

Das HI-Virus und seine Struktur

Abb. 12.2

[L253]

Das HI-Virus und sein Weg in der menschlichen Zelle

Abb. 12.3

[L253]

Funktion von siRNAs

Abb. 12.4

[G157]

Bakterienzelle und eukaryontische Zelle im Vergleich

Abb. 12.5

[L253]

Die drei Möglichkeiten des horizontalen Gentransfers: Transformation, Transduktion und Konjugation

Abb. 12.6

[L253]

Synthese von Insulin mithilfe von Bakterien

Abb. 12.7

[L253]

Restriktionsendonucleasen: Blunt Ends und Sticky Ends

Abb. 12.8

[L253]

Schema einer PCR

Abb. 12.9

[L253]

Prinzip der Gel-Elektrophorese

Abb. 12.10

[L253]

Western Blot

Abb. 12.11

[L253]

Färbung mit Erst- und Zweitantikörper

Abb. 12.12

[L253]

Färbung mit Zweitantikörper nach Bindung eines Moleküls mithilfe von befestigtem Erstantikörper

Abb. 12.13

[L253]

(Virale) Onkogene und Tumor-Suppressor-Gene

Im Labor

  • 12.1

    Die experimentelle Doktorarbeit291

  • 12.2

    Rund um Viren292

  • 12.3

    Rund um Bakterien295

  • 12.4

    Polymerase-Kettenreaktion299

  • 12.5

    Gel-Elektrophorese300

  • 12.6

    Onkogene303

  • 12.7

    Übungen304

Viele von euch werden im Rahmen ihrer DoktorarbeitDoktorarbeit, experimentelle früher oder später mal ein Labor betreten und kaum ein Medizinstudent kommt durch das Studium, ohne im Biochemiepraktikum ein paar Reagenzien pipettiert zu haben – Grund genug, einen Blick auf Methoden zu werfen, die im Labor häufig verwendet werden.

Die experimentelle Doktorarbeit

Bevor wir zu dem Stoff kommen, der auch im Physikum Punkte bringt, gibt es noch ganz schnell ein paar kleine Tipps, um später eurer Doktorarbeit zum Erfolg zu verhelfen. Vielleicht erinnert ihr euch in einigen Semestern zurück an dieses Kapitel und umgeht ein paar Dinge, die anderen Kommilitonen zum Verhängnis geworden sind! Falls eure Biochemieprüfung immer näher rückt und ihr in akuter Zeitnot steckt, überspringt diese Tipps – euch werden keine Punkte entgehen!
  • Thema → Fragestellung → Hypothese: DassArbeiten, wissenschaftliches wissenschaftliches Arbeiten nach diesem Schema funktioniert, wissen viele wahrscheinlich schon aus der Schule. Trotzdem bekommen viele Studenten Probleme, wenn sie diese Begriffe für ihre Doktorarbeit mit Inhalt füllen sollen.

Achtung

Beachtet besonders, dass die Hypothese so klar formuliert ist, dass es nur zwei Möglichkeiten gibt: Sie stimmt oder sie stimmt nicht! Wenn ihr euch beim Planen der Experimente fragt, wie sie euch helfen, die Hypothese zu veri- oder zu falsifizieren, stellt ihr sicher, dass eure Arbeit Struktur hat und ihr nicht nur unzusammenhängende Daten produziert.

  • Dokumentation: Macht euch zu jedem Experiment genug Notizen, sodass ihr auch in zwei Jahren noch genau wisst, was ihr gemacht habt. Verzögerungen passieren schnell und man vergisst noch schneller.

  • Sauberkeit: Gerade wenn ihr mit Zellen arbeitet, können euch Kontaminationen Unmengen Zeit (und die Abteilung Geld) kosten. Deshalb macht alles sauber, schaut, dass der Abzug eurer Hood funktioniert, und entsorgt euren Müll nach Vorschrift.

  • Betreuung: Da man als Mediziner meist wenig Ahnung von Laborarbeit hat, ist die Betreuung fast noch wichtiger als das eigentliche Thema. Besprecht, bevor ihr anfangt, wer im Labor für euch zuständig ist. Im Idealfall gibt es eine erfahrene MTA, die euch die Methoden beibringt, und einen Betreuer, der beim Projekt den Überblick behält.

  • Mit offenen Karten spielen: Wenn ihr unbedingt magna oder gar summa cum laude wollt, solltet ihr euch über die Kriterien eurer Fakultät für die Vergabe dieser Noten informieren und mit eurem Betreuer besprechen, ob diesen Kriterien im Rahmen eurer Doktorarbeit entsprochen werden kann.

  • Strukturiert schreiben:

    • Material und Methoden könnt ihr schon schreiben, während ihr die Experimente macht (ansonsten Notizen machen!).

    • Wenn ihr mit den Experimenten fertig seid, erstellt ihr die Abbildungen und hangelt euch im Ergebnis-Teil an diesen entlang.

    • In der Diskussion werden die Ergebnisse diskutiert und im Anschluss die wichtigsten Erkenntnisse zusammengefasst.

    • Zum Abschluss schreibt ihr die Einleitung, in der ihr die relevanten Informationen zu den Themen eurer Doktorarbeit zusammenfasst.

Für Ahnungslose

Warum die Einleitung am Schluss schreiben? Weil ihr, bis ihr den Rest geschrieben habt, nicht wisst, welche Themen letztlich alle angesprochen werden, und ihr erst am Schluss wisst, wofür ihr den wissenschaftlichen Background liefern müsst!

Rund um Viren

Zurück zum Prüfungs-/Physikumsrelevanten:
Das Thema Viren wird eigentlich in der Biologie besprochen. Wir wollen an dieser Stelle aber trotzdem kurz auf die VirenViren eingehen, da es virale Bestandteile gibt, die euch im Labor und im Physikum begegnen werden. Und wenn man von viralen Bestandteilen spricht, ohne nicht zumindest mal ein paar Grundlagen zum Thema Viren zu kennen, wäre das doch etwas peinlich.

Allgemeines

Viren sind im Gegensatz zu Eukaryonten und Prokaryonten keine Lebewesen, sondern infektiöse Partikel. Als Nichtlebewesen verfügen Viren über keinen eigenen Stoffwechsel und sind deshalb zur Vermehrung auf andere Organismen angewiesen. In der Regel schaden sie diesen und man könnte sie daher als Parasiten bezeichnen, was aber umstritten ist, da Parasiten als Lebewesen definiert sind.
Da Viren normalerweise nur wenige hundert Nanometer groß sind, könnt ihr sie mit dem Lichtmikroskop (im Gegensatz zu Bakterien) nicht erkennen. Es gibt allerdings Ausnahmen wie die Megaviren oder die erst vor wenigen Jahren entdeckten Pandoraviren, die, was ihre Größe angeht, schon an kleine Bakterien heranreichen.

Aufbau

Im Inneren eines Virus befindet sich dessen Erbinformation. Dabei handelt es sich entweder um RNA oder DNA. Da DNAVirendas Genom geschützt werden muss, ist es von einer Proteinhülle, dem Capsid, umgeben. Einige Viren haben zusätzlich zum Capsid noch eine Lipidhülle. Als Beispiel ist in Abb. 12.1 der Aufbau eines HI-VirusHI-Virus (Human Immunodeficieny Virus) dargestellt.

Retroviren und reverse Transkriptase

Manche Viren besitzen eine Erbinformation aus RNARNAViren, die – sobald das Virus in die Wirtszelle gelangt – in DNA umgeschrieben wird. Diese DNA wird in das Genom der Wirtszelle integriert und die wiederum synthetisiert dann die mRNA. Man bezeichnet solche Viren als RetrovirenRetroviren. Einer der bekanntesten Vertreter dieser Familie ist das HI-Virus (Human Immunodeficieny Virus; Abb. 12.2).
Das Enzym, das bei Retroviren die DNA aus RNA herstellt, solltet ihr kennen. Es sind RNA-abhängige DNA-Polymerasen, die auch als reverse TranskriptasenTranskriptasen, reverse bezeichnet werden. Eine nichtvirale reverse Transkriptase kennt ihr bereits: die Telomerase (Kap. 5.4.1)!

Für Ahnungslose

Und was machen reverse Transkriptasen im Labor? Mit ihnen kann man aus fragiler RNA vergleichsweise stabile cDNA (copy DNA) herstellen. Außerdem hat die Herstellung von cDNAcDNA mit der mRNA eines bestimmten Gens einen weiteren Vorteil gegenüber genomischer DNA: Sie besitzt keine Introns, da die mRNA bereits gespleißt wurde.

siRNA

Pflanzen machen sich zur Virusabwehr ein spezielles System zunutze, das virale RNA abbaut. Ob dieses System beim Menschen ebenfalls der Virusabwehr dient, ist nicht abschließend geklärt; es wird aber auf jeden Fall eingesetzt, um die Expression von Genen zu regulieren.
Bei der siRNAsiRNA (small interfering RNA) handelt es sich um RNA, die vom Körper wie alle anderen RNAs auch hergestellt wird. Im Unterschied zur mRNA codiert diese aber nicht für ein Protein, sondern wird genutzt, um andere RNAs zielgerichtet abzubauen. Im Unterschied zu den meisten RNAs bildet sie zudem Doppelstränge aus.

Für die Klausur

Bei der Herstellung der siRNAs spielt häufig das Enzym DicerDicer eine Rolle.

Nach ihrer Synthese bildet die siRNA zusammen mit Proteinen den RNA-Indiced Silencing Complex (RISC). Dabei erkennen die Proteinbestandteile die Sequenz eines Strangs der siRNA und suchen nach RNAs (z. B. mRNAs), die eine komplementäre Sequenz besitzen. Wird eine solche komplementäre mRNA gefunden, wird sie abgebaut, sodass aus ihr kein Protein mehr entstehen kann (Abb. 12.3). Man spricht von posttranskriptionellem Gen-SilencingGen-Silencing, posttranskriptionelles, also dem Stopp der Genexpression nach der Transkription (aber noch vor der Translation), genauer gesagt von RNA-InterferenzRNA-Interferenz (die siRNA interferiert mit der Funktion der mRNA).

Für Ahnungslose

Ist es nicht ineffizient, wenn der Körper selbst mRNAs herstellt, um sie dann mithilfe von ebenfalls selbst hergestellten siRNAs wieder abbauen zu lassen? Ein bisschen! Eine menschliche Zelle hat so viele Gene, die an verschiedenste Situationen angepasst exprimiert werden müssen, dass sie kleine Effizienzverluste in Kauf nimmt, wenn sie dafür einen wirksamen Regulationsmechanismus erhält.

Und wie nutzt man das Ganze im Labor? Man kann z. B. mithilfe von Viren DNA-Sequenzen in das Genom einer Zelle einbauen, die für siRNAs codieren. Die Zelle beginnt nun, die siRNAs zu synthetisieren, was dazu führt, dass zu den siRNAs komplementäre mRNAs abgebaut werden, sodass aus ihnen keine Proteine entstehen. Wenn man weiß, welche mRNAs man abbauen lassen möchte, kann man passende siRNAs designen und so gezielt mRNAs zerstören, um zu schauen, wie die Zelle ohne bestimmte Proteine auskommt. Man bezeichnet dieses Vorgehen als Gen-Knock-downGen-Knock-down.

Rund um Bakterien

Auch die BakterienBakterien begegnen euch in der Biologie wesentlich detaillierter, sind aber aus der biologischen Grundlagenforschung nicht mehr wegzudenken. Nach einem kleinen Grundkurs zum Bakterienaufbau besprechen wir ihre Rolle im Labor.

Aufbau

Bakterien sind ProkaryontenProkaryonten, sie besitzen also keinen Zellkern, sondern ein Kernäquivalent (Nucleoid), d. h. ein geschlossenes, auf engem Raum gepacktes Bakterienchromosom (Abb. 12.4).

Für Ahnungslose

Kann man die Begriffe „Bakterien“ und „Prokaryonten“ synonym verwenden? Der Begriff Prokaryont beinhaltet die Bakterien, aber er umfasst zusätzlich noch die Archaeen. Da diese im Medizinstudium nicht relevant sind (es sind keine humanpathogenen Arten bekannt), braucht ihr über sie nicht mehr zu wissen. Nur so viel: Auch wenn ihr noch nie von ihnen gehört habt, habt ihr wahrscheinlich gerade welche im Mund.

DNA
Das Kernäquivalent ist nicht von einer Membran umgeben und besitzt keine Histone. Da das Chromosom ringförmig ist, reicht ein einzelner Origin of Replication (ORI) aus, um die gesamte DNADNABakterien zu replizieren. Eine weitere Besonderheit der Bakterien-DNA: Es gibt keine Introns und entsprechend muss auch nicht gespleißt werden!
Die Gene sind in Form von Funktionseinheiten organisiert, die OperonsOperon genannt werden. Auf diese Weise wird die Aktivität des Gens reguliert.
Bei Bakterien enthält eine mRNA häufig Informationen für mehrere verschiedene Proteine. Man bezeichnet sie dann als polycistronisch.
Plasmide
Bakterien Plasmidbesitzen nicht nur DNA in ihrem Kernäquivalent, sondern verfügen zusätzlich über extrachromosomale, ringförmige DNA, die im Zytoplasma schwimmt. Diese sogenannten Plasmide (es kann durchaus auch mehrere geben) werden unabhängig vom restlichen Genom repliziert und dann zufällig auf die Tochterzellen verteilt. Wofür codieren Plasmide? Sie enthalten z. B. Resistenzen gegen Antibiotika (R-Plasmid). Außerdem können Proteine produziert werden, welche die Virulenz des Bakteriums steigern oder es dem Bakterium ermöglichen, seine Plasmide an andere Bakterien weiterzugeben (FertilitätsplasmidFertilitätsplasmid, F-Plasmid). Wie Plasmide von einem Bakterium zum anderen gelangen, sodass sich Antibiotikaresistenzen ausbreiten können, werden wir später im Kapitel besprechen.

Für Ahnungslose

Was kann man sich unter „Resistenzen gegen Antibiotika“ vorstellen? Sie verhindern, dass das Bakterium von den Antibiotika getötet wird. So können die Plasmide z. B. für Proteine codieren, die das Antibiotikum aus der Zelle transportieren (Efflux-Pumpen) oder es durch Spaltung bestimmter Strukturen inaktivieren (β-Lactamasen).

Organellen
Zum Thema Organellen gibt es im Vergleich zu den Eukaryonten relativ wenig zu wissen. In der Prokaryontenzelle ist nämlich die Kompartimentierung, also die Untergliederung der Zelle in Reaktionsräume, wesentlich geringer ausgeprägt – Mitochondrien, Golgi-Apparat und ER fehlen. Findet in Bakterien dann keine Atmungskette statt? Nicht zwangsläufig, aber es ist möglich, denn die Enzyme der Atmungskette können in der Membran der Bakterienzelle lokalisiert sein, über die dann auch der Protonengradient aufgebaut wird.
Ribosomen
Wir haben bereits gelernt, dass sich die bakteriellen RibosomenRibosombakterielles von denen der Eukaryonten unterscheiden. Bakterien besitzen (wie die Mitochondrien) 70S-Ribosomen, die aus einer 50S- und einer 30S-Untereinheit bestehen. Diesen Unterschied macht man sich bei der Antibiotikatherapie zunutze.

Horizontaler Gentransfer

Wenn ein Plasmid Gentransferhorizontalerfür eine Antibiotikaresistenz codiert, ist es natürlich für eine Bakterienpopulation super, wenn Kopien des Plasmids ausgetauscht werden können, damit allen Bakterien diese Resistenz zugutekommt. Es gibt eine Möglichkeit, genetische Information auszutauschen, ohne dass dabei gleich Nachkommen erzeugt werden müssen. Man spricht von ParasexualitätBakterienParasexualität oder horizontalem Gentransfer.

Für Ahnungslose

Warum „horizontaler Gentransfer“? Die Gene werden innerhalb einer Generation transferiert. Der Begriff „vertikaler GentransferGentransfervertikaler“ beschreibt das, was wir Menschen machen: unsere Gene an unsere Nachkommen weitergeben.

Für horizontalen Gentransfer gibt es drei Möglichkeiten (Abb. 12.5):
  • TransformationBakterienTransformation: Bakterien können unter bestimmten Bedingungen freie DNA aufnehmen.

  • KonjugationBakterienKonjugation: Die Konjugation kommt unserer Vorstellung von Fortpflanzung noch am nächsten. Dabei bilden Bakterien, die über einen Fertilitätsfaktor verfügen (man bezeichnet sie auch als F+), einen Fertilitäts- bzw. Sexpilus aus, über den die Plasmide direkt von einem Bakterium zum nächsten gelangen können.

  • TransduktionBakterienTransduktion: Bei der Transduktion wird die Bakterien-DNA durch Viren übertragen. Dabei ist der BakteriophageBakteriophage (so bezeichnet man Viren, die sich auf Prokaryonten spezialisiert haben) in erster Linie darauf aus, seine eigene Erbinformation in das bakterielle Genom zu integrieren. Dass dabei gelegentlich auch Teile der bakteriellen DNA mitgenommen werden, ist ein eher für die Bakterien nützlicher Nebeneffekt.

Wie nutzt man horizontalen Gentransfer im Labor? Ganz einfach: Stellt euch vor, ihr erzeugt ein neues Plasmid, indem ihr ein Gen in ein bereits bestehendes Plasmid einfügt. Nun könnt ihr Bakterien dazu zwingen, dieses Plasmid via Transformation aufzunehmen. Die Bakterien vermehren sich nun und das aufgenommene Plasmid wird mitvermehrt. Nun müsst ihr nur noch eure Plasmide aus den Bakterien isolieren und habt eine enorme Anzahl von Plasmiden, für deren Synthese ihr sonst ewig gebraucht hättet. Die Bakterien wurden gewissermaßen als biologische Kopierer benutzt.
Man kann die Bakterien auch nutzen, um Proteine zu synthetisieren. So wird mittlerweile Insulin hergestellt, indem man die humane mRNA für Insulin mittels einer reversen Transkriptase in cDNA umschreibt, diese cDNA dann in ein Plasmid einfügt und dieses Plasmid in Bakterien gibt. Die Bakterien beginnen, die Proteine des Plasmids (und damit auch die Insulin-cDNA) in mRNAs umzuschreiben, und synthetisieren aus diesen mRNAs Proteine … darunter dann auch Insulin (Abb. 12.6).

Lerntipp

  • Bei der Konjugation sind die Bakterien (K)onnected, also über einen Fertilitätspilus verbunden.

  • Bei der TransFormation geht es um die Aufnahme Freier DNA.

  • Übrig bleibt die Transduktion, die mithilfe von Viren stattfindet.

Restriktionsendonucleasen

Die Fähigkeit eines Bakteriums, DNA aufnehmen zu können, ist nicht ohne Risiko: Wenn z. B. fremde DNA – also die einer anderen Spezies – in die Zelle gelangt, kann diese zum Problem werden. Aus diesem Grund besitzen Bakterien in ihrem Zytoplasma spezielle Enzyme, die RestriktionsendonucleasenRestriktionsendonucleasen.

Für Ahnungslose

Was verrät uns der Name „Restriktionsendonucleasen“? Nucleasen sind Enzyme, die DNA oder RNA spalten. Die Silbe „endo“ macht deutlich, dass die Spaltung mitten im Molekül und nicht nur an den Rändern stattfindet, was auch sinnvoll ist, wenn man die DNA zerstören möchte.

Die Restriktionsendonucleasen spalten die DNA an palindromischen Sequenzen. Palindromische Sequenzen sind Abschnitte der DNA, die sich auf beiden Strängen des Doppelstrangs gleich lesen.
Bei der Spaltung eines Doppelstrangs durch Restriktionsendonucleasen können Blunt oder Sticky Ends entstehen (Abb. 12.7).
  • Blunt EndsBlunt Ends: Bei der Entstehung von Blunt Ends schneidet das Enzym auf dem kürzesten Weg einmal durch den Doppelstrang. Die Chance, dass die zwei Fragmente wieder zusammenfinden, ist relativ gering.

  • Sticky EndsSticky Ends: Schneidet das Enzym Sticky Ends, entstehen an den Enden der Doppelstrangfragmente kleine Einzelstränge, die zueinander komplementär sind. Da sich zwischen ihnen erneut Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können, besteht die Chance, dass sich die Stränge wieder zusammenlagern. Dann muss nur noch eine DNA-Ligase das Zucker-Phosphat-Rückgrat verbinden und der Doppelstrang ist so gut wie neu. Schneidet man ein Gen und ein Plasmid mit den gleichen Restriktionsenzymen, kann man das Gen in das Plasmid einbauen, weshalb diese Enzyme auch im Labor von großer Bedeutung sind. So hätten wir unser Plasmid, das wir mittels der Bakterien vermehrt haben, sehr wahrscheinlich mithilfe von Restriktionsendonucleasen und Ligasen erzeugt.

Polymerase-Kettenreaktion

Unsere nächste Methode, die Polymerase-KettenreaktionPolymerase-Kettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) hat zwar nichts mit Bakterien und Viren zu tun, löst aber ein wichtiges Problem:
Stellt euch vor, ihr benötigt für ein Experiment große Mengen eines Gens aus bestimmten Zellen. Ihr könntet nun warten, bis sich die Zellen soweit vermehren, dass durch Replikation genug Kopien des Gens entstanden sind. Dabei entstehen natürlich nicht nur Kopien des Gens, für das ihr euch interessiert, sondern das gesamte Genom wird vervielfältigt. Es wäre also viel praktischer, wenn ihr nur das Gen vermehren würdet, an dem ihr auch interessiert seid. Und noch praktischer wäre es, wenn ihr das Ganze innerhalb von Stunden machen könntet und nicht tagelang warten müsstet.
Dafür gibt es die Polymerase Chain Reaction (Abb. 12.8), die wie folgt abläuft:
  • 1.

    Ihr braucht eine kleine Menge der DNA der Zellen, die ihr untersuchen wollt. Die DNA wird auf rund 95 °C erhitzt, sodass die Wasserstoffbrücken, die den DNA-Doppelstrang zusammenhalten, gelöst werden. Diesen Prozess bezeichnet man als Denaturierung.

  • 2.

    Nun braucht es PrimerPrimer, die euer Gen binden können. Da dieses Binden aber bei 95 °C unmöglich ist, wird das Ganze auf rund 60 °C abgekühlt, damit es zum Annealing der Primer kommt.

Achtung

Der Begriff Primer ist hier etwas irreführend, denn es handelt sich nicht wie bei der Replikation um kurze RNA-, sondern um kurze DNA-Sequenzen aus ca. 10–20 Nucleotiden. Diese können synthetisch hergestellt werden und überstehen die Denaturierung. Spätestens wenn ihr im Labor mal mit RNA arbeiten müsst, werdet ihr merken, dass diese derartige Temperaturen wahrscheinlich nicht so gut wegstecken würde.

  • 3.

    Eine hitzestabile DNA-PolymeraseDNA-Polymerase fängt – ausgehend von den Primern – an, freie Nucleotide (die müsst ihr natürlich vorher zu eurer DNA gegeben haben) zu einem komplementären Strang zu verknüpfen. Diese Elongation kann bei ca. 70 °C stattfinden, da die verwendeten Polymerasen aus Bakterien stammen, die in der Nähe von heißen Quellen leben und bei diesen Temperaturen ideal arbeiten.

Nun wurde die DNA bzw. euer Zielgen verdoppelt. Nach einem weiteren Zyklus habt ihr schon vier Kopien, danach acht usw. Die Zahl der Kopien wächst also exponentiell. Wenn ihr nicht nur ein Zielgen, sondern die gesamte DNA vervielfältigen wollt, müsst ihr lediglich Primer verwenden, die unspezifisch im gesamten Genom binden.

Gel-Elektrophorese

Bei dem Begriff Gel-Elektrophorese haben viele vermutlich schon irgendein Bild von einem Experiment im Kopf, aber wir wollen uns diesem Thema etwas systematischer nähren:
Bei der Gel-ElektrophoreseGel-Elektrophorese geht es grundsätzlich erst einmal darum, Moleküle voneinander zu trennen (Abb. 12.9). Dabei machen wir es uns zunutze, dass Moleküle unterschiedlich groß und unterschiedlich geladen sein können. Stellt euch vor, wir legen ein Gel mit Poren mit einer bestimmten Größe auf eine Platte und stellen diese in einen Elektrophoresepuffer mit geeigneten Elektrolyten, damit Strom fließen kann. Jetzt geben wir auf eine Seite des Gels ein Gemisch aus verschiedensten Molekülen. Wenn wir nun eine Spannung an dieses Gel anlegen, werden die positiv geladenen Moleküle zu der Seite des Gels mit dem negativ geladenen Pol wandern und umgekehrt. Wann wandert ein Molekül besonders schnell?
  • Wenn es sehr stark geladen ist, sodass die Kräfte, denen es im elektrischen Feld ausgesetzt ist, es quasi durch das Gel treiben.

  • Wenn es im Vergleich zu den Poren des Gels sehr klein ist, sodass das Gel ihm praktisch keinen Widerstand entgegensetzt.

Da es aber in der Praxis relativ unpraktisch ist, wenn sowohl die Ladung eines Moleküls als auch dessen Größe Einfluss auf das Wanderungsverhalten nehmen, sorgt man häufig dafür, dass alle Moleküle einer Probe gleich geladen sind. Hat man z. B. ein Proteingemisch, das man auftrennen möchte, versetzt man es mit negativ geladenem Natriumdodecylsulfat (SDS = Sodium Dodecyl Sulfate). Dieses bindet an die Proteine und überdeckt deren Eigenladung. Auf diese Weise weisen alle Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung auf und wandern somit zum positiv geladenen Pol. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt dann nur noch von der Größe der einzelnen Proteine ab. Wenn ihr die Spannung nach einiger Zeit stoppt, sind die kleinsten Proteine am weitesten gewandert. Aber aufpassen: Wenn ihr zu lange wartet, haben sowohl die kleinen als auch die großen Proteine den positiv geladenen Pol erreicht und ihr müsst eure Probe erneut auftrennen.
Wenn ihr DNA auftrennen wollt, kommt ihr ohne Reagenzien wie SDS aus, denn DNA-Fragmente verfügen dank des Phosphatrückgrats bereits über eine gleichmäßige negative Ladung.
Je nach Größe und Eigenschaften der zu trennenden Moleküle verwendet man unterschiedliche Materialien als Gele. Ihr solltet v. a. von Polyacrylamid (kleine Poren) und Agarose (große Poren) als Grundlage von Gelen gehört haben. Die genaue Porengröße kann man z. B. durch die Konzentration der Matrixmaterialien im Gel beeinflussen.

Auswertung

Nun haben wir also unsere zu trennenden Moleküle getrennt, aber wir wissen trotzdem nicht, was wo in unserem Gel liegt … schließlich steht nicht plötzlich irgendwo „Hallo, ich bin die Bande von Albumin“. Wir müssen also irgendwie dafür sorgen, dass unsere getrennten Moleküle sichtbar werden. Dafür gibt es zwei Möglichkeiten: Färben und Blotten.
Färben
Bei einer Gel-ElektrophoreseFärbungFärbung färben wir alle getrennten Moleküle an. Bei Nucleotiden verwendet man häufig Ethidiumbromid, bei Proteinen z. B. Coomassie-Brilliant-Blue oder Silber. Nun sehen wir zumindest, wie weit unsere Moleküle gewandert sind. Wenn wir nun auch noch ein Gemisch mit verschiedenen Molekülen bekannter Größe (Marker, „Ladder“) gleichzeitig auf unserem Gel aufgetrennt haben, können wir, indem wir die Lage der Banden mit denen des Markers vergleichen, zumindest abschätzen, wie groß unsere Moleküle sind.
Blotten
Angenommen, wir Blotwollen nun ganz genau wissen, ob Molekül XY eines unserer zu trennenden Moleküle war, dann reicht eine einfache Färbung natürlich nicht aus. Suchen wir ein bestimmtes Protein, könnten wir z. B. einen Antikörper einsetzen, der nur dieses Protein bindet. Wir können diesen Antikörper aber nicht einfach auf unser Gel geben, denn dann würde er gar nicht bis zum gesuchten Protein vordringen. Die Lösung: Wir übertragen die Moleküle aus dem Gel auf eine Membran, auf welcher der Antikörper problemlos das gesuchte Molekül anfärben kann. Dieses Übertragen der getrennten Stoffe wird auch Blotten/Blotting genannt. Je nach Art der Stoffe, nach denen gesucht wird, unterscheidet man:
  • Western BlotWestern Blot: Nachweis von Proteinen mittels Antikörper (Abb. 12.10).

  • Southern BlotSouthern Blot: Nachweis von DNA. Man verwendet komplementäre DNA- oder RNA-Sequenzen, um bestimmte DNA-Fragmente zu finden.

  • Northern BlotNorthern Blot: Nachweis von RNA ebenfalls mit komplementären DNA- oder RNA-Sequenzen.

Für Ahnungslose

Was haben Blots denn mit Himmelsrichtungen zu tun? Gar nichts. Der erste Blot wurde von Edward Southern zum Nachweis bestimmter DNA-Fragmente durchgeführt. Die Benennung der Blots zum Nachweis von RNA und Proteinen sind Wortspiele … Wer sagt, Wissenschaftler hätten keinen Humor!

Lerntipp

Wenn ihr Probleme bei der Zuordnung des entsprechenden Blots zum nachgewiesenen Molekül habt, denkt daran, dass Schnee fällt:

SNoW DRoPs – Southern Northern und Western Blot zum Nachweis von DNA, RNA und Protein

Aber BlotFärbenMoment mal: Nur weil man einen Antikörper an ein Protein bindet, kann man es doch noch lange nicht sehen! Man muss erst ein bisschen Farbe ins Spiel bringen und geht dafür folgendermaßen vor:
  • 1.

    Der Erstantikörper wird auf die Membran, auf der auch das gesuchte Molekül sitzt, gegeben und bindet dort nur die gesuchten Moleküle (Abb. 12.11). Überschüssiger Antikörper wird abgewaschen. Alternativ kann man auch Antikörper an eine Platte befestigen und ein Molekülgemisch darauf geben. In diesem Fall bleiben nur die gesuchten Moleküle hängen und der Rest wird abgewaschen.

  • 2.

    Nun gibt man den Zweitantikörper dazu. Dieser ist an ein Enzym gekoppelt und bindet den Erstantikörper (Abb. 12.11). Bei dem Verfahren, bei dem die Antikörper auf der Platte befestigt sind, richtet sich der Zweitantikörper nicht gegen den Erstantikörper, sondern direkt gegen das gesuchte Molekül.

  • 3.

    Das Enzym, das an den Antikörper gekoppelt ist, wandelt ein zugegebenes farbloses oder nicht leuchtendes Reagenz in ein farbiges oder leuchtendes Reagenz um (Abb. 12.12). Auf diese Weise entsteht dort, wo sich unser Molekül befindet, ein Farb- oder Lichtsignal und wir haben das gesuchte Molekül nachgewiesen.

Für Ahnungslose

Warum verwendet man erst einen Erst- und dann einen Zweitantikörper? Könnte man nicht auch einfach das Enzym direkt an den Erstantikörper hängen? Da Erstantikörper nur gegen ganz spezielle Strukturen gerichtet sind, ist ihre Herstellung recht kostenintensiv und es werden nicht so große Mengen eines Typs verkauft, weshalb sie vergleichsweise teuer sind (genau wie Fachbücher im Medizinstudium). Enzyme an viele verschiedene Erstantikörper zu hängen, ist ebenfalls teuer. Da man aber prinzipiell jedes erdenkliche Molekül mit dieser Methode nachweisen kann/will, nutzt man zunächst immer einen Antikörper, der selektiv das gesuchte Protein bindet, und nimmt dann einen enzymkonjugierten Antikörper, der eine bestimmte Struktur, die auf allen Antikörpern vorkommt, bindet. Auf diese Weise kann man von dem enzymkonjugierten Antikörper sehr große Mengen herstellen und spart Geld.

Onkogene

Zum Abschluss noch ein Thema, das auf den ersten Blick eigentlich gar nicht so wirklich hier hineinpasst. Manche Moleküle in unseren Zellen, z. B. die G-Proteine, spielen bei Wachstums- und Teilungsprozessen unserer Zellen eine wichtige Rolle. Problematisch wird es, wenn es in den Genen für diese Moleküle zu Mutationen kommt, sodass diese dauerhaft aktiv sind. Unkontrolliertes Wachstum und verstärkte Zellteilung sind die Folge und können zur Entstehung von Krebs führen. Die Gene, die für diese essenziellen, aber auch potenziell gefährlichen Moleküle codieren, werden Proto-Onkogene genannt. Kommt es zu einer Mutation, sodass das Gen nun die Krebsentstehung tatsächlich fördert, spricht man von OnkogenenOnkogen (Abb. 12.13).
Aufgrund dieser Gefahr werden die Produkte von (Proto-)Onkogenen im Normalfall von Proteinen kontrolliert, die von sogenannten Tumor-Suppressor-GenenTumor-Suppressor-Gene codiert werden (Abb. 12.13). Ihre Aufgabe ist es, veränderte Proteine, die zu einer malignen Transformation der Zelle, also zur Krebsentstehung, führen können, unschädlich zu machen oder sogar die Apoptose einzuleiten, wenn die Zelle nicht mehr zu retten ist. Auch in Tumor-Suppressor-Genen kann es zu Mutationen kommen, die das Risiko der Krebsentstehung steigern, weil plötzlich ein Kontrollmechanismus wegfällt.
Viren, wie etwa die Retroviren, die wir in diesem Kapitel kennengelernt haben, können die Krebsentstehung ebenfalls begünstigen: Baut ein Virus seine DNA ins Genom ein, kann es z. B. passieren, dass der virale Promotor, der eigentlich dafür sorgt, dass die Virus-DNA exprimiert wird, auch die verstärkte Expression anderer Gene auslöst, was wiederum vermehrtes Wachstum und Zellteilung nach sich ziehen kann. Man spricht von viralen Onkogenen (Abb. 12.13).

Übungen

  • 1.

    Reverse Transkriptasen sind _____________-abhängige _____________-Polymerasen.

  • 2.

    _____________RNAs können zum posttranskriptionellen Gen-silencing mittels RNA-Interferenz genutzt werden.

  • 3.

    Will man ein Gen in ein Plasmid einfügen, verwendet man zum Schneiden von Gen und Plasmid Enzyme namens _____________, und zwar am besten solche, die _____________ Ends schneiden.

  • 4.

    Die Aufnahme von freier DNA durch Bakterien heißt _____________.

  • 5.

    Bei der Gel-Elektrophorese werden Stoffe nach _____________ und _____________ aufgetrennt.

  • 6.

    Mit einem _____________ Blot weist man Proteine nach.

  • 7.

    Mit einem _____________ Blot weist man DNA nach.

  • 8.

    Mit einem Northern Blot weist man _____________ nach.

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